CN114561368A

CN114561368A - 蛋白质ZmAAP6在调控玉米胚乳蛋白质和淀粉含量中的应用

Info

Publication number: CN114561368A
Application number: CN202210300142.4A
Authority: CN
Inventors: 金危危; 王天依; 李云飞; 黄伟; 王喜庆
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2022-03-25
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2042-03-25
Also published as: CN114561368B

Abstract

蛋白质ZmAAP6在调控玉米胚乳蛋白质和淀粉含量中的应用。蛋白质ZmAAP6的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。实验证明，在玉米中过表达ZmAAP6基因，得到的转基因玉米；该转基因玉米的胚乳中蛋白质含量增加和淀粉含量降低。在玉米中抑制ZmAAP6基因，得到敲除ZmAAP6基因水稻，即ZmAAP6突变株；该ZmAAP6突变株的胚乳中蛋白质含量降低和淀粉含量增加。因此，蛋白质ZmAAP6可以调控玉米胚乳中蛋白质含量和淀粉含量。本发明具有重要的应用价值。

Description

蛋白质ZmAAP6在调控玉米胚乳蛋白质和淀粉含量中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质ZmAAP6在调控玉米胚乳蛋白质和淀粉含量中的应用。

背景技术

玉米(Zea mays L.)是我国第一大粮食作物以及饲料作物，随着中国经济的发展和人口的不断增加、生活水平的逐步提高，对玉米的需求也呈现刚性增长。玉米籽粒富含丰富的淀粉、蛋白质和油脂等营养物质，其中蛋白质约占玉米籽粒的8-10％；蛋白质分为白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白四种，其中胚中的球蛋白约占10-20％，剩下的80-90％则存在于胚乳中。醇溶蛋白是种子中含量最多的贮藏蛋白，占胚乳蛋白的60-70％，分为α、β、γ和δ-醇溶蛋白四种，存在于蛋白体中，其余的蛋白统称为非醇溶蛋白。玉米醇溶蛋白对人类和动物的营养需求有深远影响。改良谷物蛋白含量也成为了玉米籽粒品质遗传改良最受关注的育种目标。

淀粉作为玉米籽粒最主要的组成部分，不仅为人类和动物提供重要的能量来源，还为各种工业生产加工提供原料。在过去的几十年里，对于影响籽粒淀粉合成和积累已经有了一些研究，但是直接参与调控玉米籽粒淀粉积累的基因很少被鉴定出来，因此，淀粉合成或积累相关基因的克隆对于解析玉米籽粒淀粉合成机理提供了遗传基础，并为通过分子育种改良玉米籽粒淀粉含量提供理论指导。

发明内容

本发明的目的是增加玉米胚乳中蛋白质含量。

本发明首先保护蛋白质ZmAAP6的应用，可为如下A1)-A4)中的至少一种：

A1)增加玉米胚乳中蛋白质含量；

A2)降低玉米胚乳中淀粉含量；

A3)培育胚乳中蛋白质含量增加的转基因玉米；

A4)培育胚乳中淀粉含量降低的转基因玉米。

上述任一所述蛋白质ZmAAP6，为如下b1)或b2)或b3)或b4)：

b1)氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

b2)在SEQ ID NO:1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、来源于玉米且与玉米胚乳中蛋白质含量和/或淀粉含量相关的蛋白质；

b4)与SEQ ID NO：1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，来源于玉米且与玉米胚乳中蛋白质含量和/或淀粉含量相关的蛋白质。

其中，SEQ ID NO：1由461个氨基酸残基组成。

为了使b1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO：1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述b3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述b3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述b3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO：3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还保护编码所述蛋白质ZmAAP6的核酸分子应用，可为如下A1)-A4)中的至少一种：

A1)增加玉米胚乳中蛋白质含量；

A2)降低玉米胚乳中淀粉含量；

A3)培育胚乳中蛋白质含量增加的转基因玉米；

A4)培育胚乳中淀粉含量降低的转基因玉米。

上述应用中，所述核酸分子可为c1)或c2)或c3)或c4)或c5)所示的DNA分子：

c1)编码区为SEQ ID NO：3所示的DNA分子；

c2)核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示的DNA分子；

c3)核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的DNA分子；

c4)与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于玉米且编码所述蛋白质ZmAAP6的DNA分子；

c5)在严格条件下与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列杂交，来源于玉米且编码所述蛋白质ZmAAP6的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO:2由6130个核苷酸组成，SEQ ID NO:3由1386个核苷酸组成。SEQID NO:3或SEQ ID NO:2的核苷酸编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质ZmAAP6的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的所述蛋白质ZmAAP6的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质ZmAAP6，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质ZmAAP6的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述任一所述的应用中，所述蛋白质含量增加可表现为蛋白体面积增加。所述淀粉含量降低可表现为淀粉粒面积减少。所述蛋白质含量可为总蛋白含量或醇溶蛋白含量。

本发明还保护一种培育转基因玉米甲的方法，包括如下步骤：提高受体玉米中上述任一所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性，得到转基因玉米甲；与受体玉米相比，转基因玉米甲胚乳中蛋白质含量增加和/或淀粉含量降低。

上述方法中，所述“提高受体玉米中上述任一所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到提高受体玉米中上述任一所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性的效果。

上述方法中，所述提高受体玉米中上述任一所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性可通过向受体玉米中导入编码所述蛋白质ZmAAP6的核酸分子实现。

上述方法中，编码所述蛋白质ZmAAP6的核酸分子可为c1)或c2)或c3)或c4)或c5)所示的DNA分子：

c1)编码区为SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

c2)核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

c3)核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

所述向受体玉米中导入编码所述蛋白质ZmAAP6的核酸分子具体可通过向受体玉米导入含有上述任一所述核酸分子的重组载体实现。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO:3所示的ZmAAP6基因，得到的重组质粒。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体具体可为重组质粒pBCXUN-UbiP-ZmAAP6。重组质粒pBCXUN-UbiP-ZmAAP6可为向植物表达载体pBCXUN-UbiP的限制性内切酶XcmI的识别位点插入核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的ZmAAP6基因，得到的重组质粒。

本发明还保护一种玉米育种方法，包括如下步骤：增加玉米中上述任一所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性，从而增加玉米胚乳中蛋白质含量和/或降低玉米胚乳中淀粉含量。

本发明还保护一种培育转基因玉米乙的方法，可包括如下步骤：抑制受体玉米中所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性，得到转基因玉米乙；与受体玉米相比，转基因玉米乙胚乳中蛋白质含量降低和/或淀粉含量增加。

上述方法中，所述抑制受体玉米中所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到抑制蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性的目的。

上述方法中，所述抑制受体玉米中所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性通过向受体玉米中导入抑制受体玉米中所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性的物质实现。

上述方法中，所述抑制受体玉米中所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性的物质可为实施例提及的重组质粒pBUE411-ZmAAP6。所述重组质粒pBUE411-ZmAAP6可为将SEQ IDNo：4所示的DNA双链分子插入pBUE411-BG载体的限制性内切酶BsaI的识别位点，得到的重组质粒。

上述任一所述方法中，所述蛋白质含量增加可表现为蛋白体面积增加。所述淀粉含量降低可表现为淀粉粒面积减少。所述蛋白质含量降低可表现为蛋白体面积减少。所述淀粉含量增加可表现为淀粉粒面积增加。所述蛋白质含量可为总蛋白含量或醇溶蛋白含量。

实验证明，在玉米中过表达ZmAAP6基因，得到的转基因玉米；该转基因玉米的胚乳中蛋白质含量增加和/或淀粉含量降低。在玉米中抑制ZmAAP6基因，得到敲除ZmAAP6基因水稻，即ZmAAP6突变株；该ZmAAP6突变株的胚乳中蛋白质含量降低和/或淀粉含量增加。因此，蛋白质ZmAAP6可以调控玉米胚乳中蛋白质含量和淀粉含量。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为ZmAAP6纯合突变株的鉴定和T₂代纯合转ZmAAP6基因玉米中ZmAAP6基因的相对表达量的检测。数值显示为平均值±标准差。

图2为玉米自交系B73-329、OE-1和KO-1的胚乳中蛋白体和淀粉粒观察结果。数值显示为平均值±标准差，采用双尾t检验分析显著性差异(**P<0.01，ns：无显著性)。

图3为ZmAAP6突变株和T₂代纯合转ZmAAP6基因玉米胚乳中总蛋白和醇溶蛋白的含量的分析结果。数值显示为平均值±标准差，3个技术重复，每个重复使用20个成熟籽粒。采用双尾t检验分析显著性差异(**P<0.01，*P<0.05)。

图4为ZmAAP6突变株和T₂代纯合转ZmAAP6基因玉米胚乳中总淀粉含量的统计结果。数值显示为平均值±标准差，3个技术重复，每个重复使用20个成熟籽粒。采用双尾t检验分析显著性差异(**P<0.01，*P<0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pBUE411-BG载体记载于如下文献中：Xing，H.L.，Dong，L.，Wang，Z.P.，Zhang，H.Y.，Han，C.Y.，Liu,B.，Wang,X.C.，and Chen，Q.J.(2014).A CRISPR/Cas9 toolkit formultiplex genome editing in plants.Bmc Plant Biology 14.pBUE411-BG载体具有抗膦丝菌素抗性(又称草胺磷抗性)。

玉米自交系B73-329记载于如下文献中：Zhang M，Cao Y，Wang Z，et al.Aretrotransposon in an HKT1 family sodium transporter causes variation of leafNa+exclusion and salt tolerance in maize[J].New Phytologist，2017.，在文献中的名称为玉米B73-329。

实施例1、蛋白质ZmAAP6及其编码基因的发现

本发明的发明人经过大量实验，从玉米自交系B73(以下简称玉米B73)中发现了ZmAAP6基因。

玉米B73的基因组DNA中，ZmAAP6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

玉米B73的cDNA中，ZmAAP6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

ZmAAP6基因编码蛋白质ZmAAP6。蛋白质ZmAAP6的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例2、蛋白质ZmAAP6在调控玉米胚乳中蛋白质和淀粉含量中的应用

一、ZmAAP6纯合突变株的获得及鉴定

本实施例选择一个靶点进行实验。靶点序列为：5’-GCACAGTACGCGATCCTCTGGG-3’(即SEQ ID No：2自5’末端起第4439-4460位)，对应靶基因为ZmAAP6基因。

1、重组质粒pBUE411-ZmAAP6的获得

(1)根据靶点设计并合成引物AAP6-CAS9-F：5’-GGCGGCACAGTACGCGATCCTCT-3’和引物AAP6-CAS9-R：5’-AAACAGAGGATCGCGTACTGTGC-3’，用去离子水分别将引物AAP6-CAS9-F和引物AAP6-CAS9-R稀释至100μM，得到引物AAP6-CAS9-F稀释液和引物AAP6-CAS9-R稀释液；然后进行退火反应，形成退火靶点片段。

退火程序为：95℃10min，89℃7-8min，83℃7-8min，77℃7-8min，71℃7-8min，16℃保存。

(2)将pBUE411-BG载体和退火靶点片段进行连接，得到重组质粒pBUE411-ZmAAP6。

连接体系为15μL，由2μL退火靶点片段、2μL pBUE411-BG载体、1.5μL 10×NEB T4Buffer、1.5μL 10×BSA、1μL限制性内切酶BsaI、1μL T4 Ligase和6μL ddH₂O组成。

连接程序为：37℃5h；50℃5min；80℃10min。

将重组质粒pBUE411-ZmAAP6进行测序。测序结果表明，重组质粒pBUE411-ZmAAP6为将SEQ ID No：4所示的DNA双链分子插入pBUE411-BG载体的限制性内切酶BsaI的识别位点，得到的重组质粒。

SEQ ID No：4：5’-GCACAGTACGCGATCCTCT-3’。

2、ZmAAP6纯合突变株的获得及鉴定

由于玉米是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，所以将一个植株中两个等位基因看成是两个基因编辑事件。纯合突变株指的是该植株的两条同源染色体的ZmAAP6基因发生了相同的突变。双等位基因突变株指的是该植株的两条同源染色体的ZmAAP6基因均发生了突变但突变形式不同。杂合突变株数指的是该植株的两条同源染色体中的一条同源染色体的ZmAAP6基因发生了突变、另一条同源染色体的ZmAAP6基因未发生突变。野生型指的是该植株的两条同源染色体中的ZmAAP6基因均未发生突变。

(1)将重组质粒pBUE411-ZmAAP6通过液氮冷冻法转至根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。

(2)将重组农杆菌转化至玉米自交系B73-329，经过筛选、分化和生根后，获得T₀代拟转基因玉米。具体转化方法参考如下文献：魏晓禹，邵诗迪，孙苏等，农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化体系的建立，吉林农业大学学报，2017(06)640-647；黄璐，卫志明，农杆菌介导的玉米遗传转化[J]，实验生物学报，1999(04).

(3)分别以T₀代拟转基因玉米叶片的基因组DNA为模板，采用引物F：5’-CCTACTTCACCGCCGTCCTCC-3’和引物R：5’-CCGAACGCCACCATGTACAC-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。分别将PCR扩增产物进行Sanger测序。测序结果与ZmAAP6基因(SEQ ID No：2所示)Cas9目标序列进行比对，统计突变类型。获得若干杂合突变株。

(4)分别将步骤(3)获得的杂合突变株进行自交，得到的种子即为T₁代种子，T₁代种子长成的植株即为T₁代植株；将T₁代植株自交，得到的种子即为T₂代种子，T₂代种子长成的植株即为T₂代植株。

(5)分别以T₂代植株叶片的基因组DNA为模板，采用引物F：5’-CCTACTTCACCGCCGTCCTCC-3’和引物R：5’-CCGAACGCCACCATGTACAC-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。分别将PCR扩增产物进行Sanger测序。测序结果与ZmAAP6基因(SEQ ID No：2所示)Cas9目标序列进行比对，统计突变类型。

检测结果见图1中A。获得3株ZmAAP6纯合突变株，分别命名为KO-1、KO-2和KO-3。

KO-1的两条同源染色体的ZmAAP6基因发生了相同的突变，具体为两条同源染色体上在ZmAAP6基因均发生了“TGTGGACTCGCACAGTACGCGATCC”25个核苷酸的缺失(即SEQ IDNo：2自5’末端起第4430至4454位缺失)，从而引起了移码，导致蛋白质ZmAAP6的功能缺失。

KO-2的两条同源染色体的ZmAAP6基因发生了相同的突变，具体为两条同源染色体上在ZmAAP6基因均发生了“T”1个核苷酸的插入(即SEQ ID No：2自5’末端起第4454至4456位插入了1个T)，从而引起了移码，导致蛋白质ZmAAP6的功能缺失。

KO-3的两条同源染色体的ZmAAP6基因发生了相同的突变，具体为两条同源染色体上在ZmAAP6基因均发生了“C”1个核苷酸的插入(即SEQ ID No：2自5’末端起第4454至4456位插入了1个C)，从而引起了移码，导致蛋白质ZmAAP6的功能缺失。

二、T₂代纯合转ZmAAP6基因玉米的获得及鉴定

植物表达载体pBCXUN-UbiP为将pBCXUN载体(记载于如下文献中：Chen Songbiao，SongkumarnPattavipha，Liu Jianli，et al.A versatile zero background T-vectorsystem for gene cloning and functional genomics.[J].Plant Physiol.，2009，150:1111-21.)中的HYG基因更换为Bar基因得到的重组质粒。Bar基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示。植物表达载体pBCXUN-UbiP中，启动子为Ubiquitin启动子，终止子为T-nos终止子。植物表达载体pBCXUN-UbiP具有抗膦丝菌素抗性(又称草胺磷抗性)。

1、向植物表达载体pBCXUN-UbiP的限制性内切酶XcmI的识别位点插入核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的ZmAAP6基因，得到重组质粒pBCXUN-UbiP-ZmAAP6。

重组质粒pBCXUN-UbiP-ZmAAP6表达SEQ ID NO:1所示的蛋白质ZmAAP6。

2、重组农杆菌的获得

(1)将重组质粒pBCXUN-UbiP-ZmAAP6导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为EHA105/pBCXUN-UbiP-ZmAAP6。

(2)将植物表达载体pBCXUN-UbiP导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为EHA105/pBCXUN-UbiP。

3、T₂代纯合转ZmAAP6基因玉米的获得

(1)采用农杆菌侵染玉米幼胚的方法将EHA105/pBCXUN-UbiP-ZmAAP6转化玉米自交系B73-329，获得T₀代拟转ZmAAP6基因玉米。

(2)分别提取T₀代拟转ZmAAP6基因玉米叶片的基因组DNA并以其作为模板，以5’-CCTCCTGTCCGACTGCTACCG-3’和5’-CTGGCCCTCTTCATCGTCACGTT-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果能够获得588bp的PCR扩增产物，则相应的T₀代拟转ZmAAP6基因玉米为T₀代转ZmAAP6基因玉米；如果不能获得588bp的PCR扩增产物，则相应的T₀代拟转ZmAAP6基因玉米不为T₀代转ZmAAP6基因玉米。

(3)将T₀代转ZmAAP6基因玉米自交，获得T₁代转ZmAAP6基因玉米；将T₁代转ZmAAP6基因玉米自交，获得T₂代纯合转ZmAAP6基因玉米。

将其中3个T₂代纯合转ZmAAP6基因玉米株系分别命名为OE-1、OE-2和OE-3。

参照上述步骤，将EHA105/pBCXUN-UbiP转化玉米自交系B73-329，获得T₂代纯合转空载体玉米。

4、实时定量PCR检测T₂代纯合转ZmAAP6基因玉米中ZmAAP6基因的相对表达量待测玉米为T₂代纯合转空载体玉米、玉米自交系B73-329、OE-1、OE-2或OE-3。

(1)提取待测玉米籽粒的总RNA，之后用逆转录酶进行反转录，得到待测玉米籽粒的cDNA。

(2)实时定量PCR检测待测玉米籽粒的cDNA中ZmAAP6基因的相对表达量(以Zm00001d010159基因为内参基因)。

检测ZmAAP6基因的引物为5’-TCGCCAACATCGCCGTGGTC-3'和5’-CAGCACCAGCTTGCACATCGT-3'。

检测Zm00001d010159基因的引物为5’-TCACCCTGTGCTGCTGACCG-3'和5’-GAACCGTGTGGCTCACACCA-3'。

以玉米自交系B73-329中ZmAAP6基因的相对表达量作为1，部分待测玉米中ZmAAP6基因的相对表达量见图1中B。

结果表明，T₂代纯合转空载体玉米和玉米自交系B73-329中ZmAAP6基因的相对表达量无显著差异；与玉米自交系B73-329相比，OE-1、OE-2和OE-3中ZmAAP6基因的相对表达量均显著增加(约40至100倍)。

三、ZmAAP6突变株和T₂代纯合转ZmAAP6基因玉米胚乳中蛋白体和淀粉粒观察

种植待测玉米(玉米自交系B73-329、OE-1或KO-1)，自交；授粉后15天，利用透射电镜观察胚乳，并统计距糊粉层第四层的每个胚乳细胞的蛋白体数目、蛋白体面积、淀粉粒数目和淀粉粒面积。

胚乳的透射电镜观察结果见图2中A(SG为淀粉粒；PB为蛋白体；DAP为授粉天数；Bar＝5μm)。

距糊粉层第四层的每个胚乳细胞的蛋白体数目和蛋白体面积的统计结果见图2中B(统计数据来自30个胚乳细胞)和C(统计数据来自于312个蛋白体)。结果表明，玉米自交系B73-329、OE-1和KO-1的胚乳细胞的蛋白体数目无显著差异；与玉米自交系B73-329相比，KO-1的胚乳细胞的蛋白体面积显著减少，OE-1的胚乳细胞的蛋白体面积显著增加。

距糊粉层第四层的每个胚乳细胞的淀粉粒数目和淀粉粒面积的统计结果见图2中D(统计数据来自30个胚乳细胞)和E(统计数据来自于215个淀粉粒)。结果表明，玉米自交系B73-329、OE-1和KO-1的胚乳细胞的淀粉粒数目无显著差异；与玉米自交系B73-329相比，KO-1的胚乳细胞的淀粉粒面积显著增加(即形成了更大的淀粉粒)，OE-1的胚乳细胞的淀粉粒面积显著减少(即形成的淀粉粒较小)。

四、ZmAAP6突变株和T₂代纯合转ZmAAP6基因玉米胚乳中总蛋白和醇溶蛋白含量测定

1、种植待测玉米(玉米自交系B73-329、OE-1、OE-2、OE-3、KO-1、KO-2或KO-3)，收获待测玉米成熟籽粒。

2、完成步骤1后，分别提取待测玉米成熟籽粒胚乳中的总蛋白和醇溶蛋白。具体步骤依次如下：

(1)取10粒以上待测玉米成熟籽粒，清水浸泡后去皮去胚，使用研磨器将籽粒磨碎，得到玉米粉。

(2)将步骤(1)得到的玉米粉装入2mL离心管中，在冷冻抽干机上抽干直至恒重，得到玉米粉末。

(3)取2mL离心管，加入80mg步骤(2)得到的玉米粉末和1mL石油醚，4℃振荡1h；4℃、13200rpm离心10分钟，弃上清。

(4)完成步骤(3)后，向所述离心管中加入1mL石油醚，4℃振荡1h；4℃、13200rpm离心10分钟，弃上清。

(5)完成步骤(4)后，真空抽干至恒重(约20分钟)，得到样品。

(6)取2mL离心管，加入50mg步骤(5)得到的样品、1mL硼酸钠抽提液和20μLβ-巯基乙醇，用封口膜将管口封严，37℃、200rpm培养10h。

硼酸钠抽提液：将4.767g Na₂B₄O₇.10H₂O和10g SDS溶于适量ddH₂O，之后用ddH₂O定容至1L，调节pH值至10.0。

(7)完成步骤(6)后，13200rpm离心10min，收集上清。

(8)取步骤(7)收集的上清，13200rpm离心10min，收集约300μL的上清。

(9)将步骤(8)收集的上清置于新的1.5mL离心管，冷冻抽干，获得总蛋白。

(10)将步骤(8)收集的上清和700μL无水乙醇混合，室温、200rpm培养2h。

(11)完成步骤(10)后，13200rpm离心10min，收集上清和沉淀。沉淀即为非醇溶蛋白。

(12)取步骤(11)收集的上清，13200rpm离心10min，收集约300μL的上清。

(13)将步骤(12)收集的上清置于新的1.5mL离心管，冷冻抽干，获得醇溶蛋白。

3、完成步骤2后，向待测玉米成熟籽粒胚乳中的总蛋白或醇溶蛋白中加入200μLIPG溶液，4℃溶解过夜，之后进行SDS-PAGE电泳。

IPG溶液：将24.024g尿素和1g CHAPS溶于适量去离子水，再用去离子水定容至50ml。

胚乳中总蛋白的SDS-PAGE检测结果见图3中A(WT为玉米自交系B73-329)。

胚乳中醇溶蛋白的SDS-PAGE检测结果见图3中B(WT为玉米自交系B73-329)。

4、完成步骤2后，利用BSA方法蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术公司，P0006C)分别检测成熟籽粒胚乳中总蛋白和醇溶蛋白的含量。

胚乳中总蛋白含量的检测结果见图3中C(WT为玉米自交系B73-329)。

胚乳中醇溶蛋白含量的检测结果见图3中D(WT为玉米自交系B73-329)。

结果表明，与玉米自交系B73-329相比，ZmAAP6突变株(如KO-1、KO-2、KO-3)胚乳中的总蛋白含量和醇溶蛋白含量显著降低，T₂代纯合转ZmAAP6基因玉米(如OE-1、OE-2、OE-3)胚乳中的总蛋白含量和醇溶蛋白含量显著增加。

五、ZmAAP6突变株和T₂代纯合转ZmAAP6基因玉米胚乳中总淀粉含量测定

1、种植待测玉米(玉米自交系B73-329、OE-1、OE-2、OE-3、KO-1、KO-2或KO-3)，收获成熟籽粒。

2、采用总淀粉测定试剂盒(Megazyme公司，货号K-TSTA)分别检测成熟籽粒胚乳中总淀粉含量。

胚乳中总淀粉含量的检测结果见图4(WT为玉米自交系B73-329)。结果表明，与玉米自交系B73-329相比，ZmAAP6突变株(如KO-1、KO-2、KO-3)胚乳中的总淀粉含量显著增加，T₂代纯合转ZmAAP6基因玉米(如OE-1、OE-2、OE-3)胚乳中总淀粉含量显著降低。

由此可见，蛋白质ZmAAP6正向调控玉米籽粒发育过程中蛋白质的积累(表现为蛋白体面积显著增加)，负向调控玉米籽粒发育过程中淀粉的积累(表现为淀粉粒面积减少)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

<110> 中国农业大学

<120> 蛋白质ZmAAP6在调控玉米胚乳蛋白质和淀粉含量中的应用

<160>5

<170> PatentIn version 3.5

<210>1

<211>461

<212>PRT

<213> Artificial sequence

<400>1

Met Asp Val Glu Arg Lys Val Val Glu Ala Asp Asp Asp Gly Arg Val

1 5 10 15

Arg Thr Gly Thr Val Trp Thr Ala Thr Thr His Ala Ile Thr Ala Val

20 25 30

Ile Gly Ser Gly Val Leu Ala Leu Pro Trp Ser Val Ala Gln Met Gly

35 40 45

Trp Val Leu Gly Pro Val Ala Leu Val Gly Cys Ala Tyr Ile Thr Tyr

50 55 60

Phe Thr Ala Val Leu Leu Ser Asp Cys Tyr Arg Thr Pro Asp Pro Val

65 70 75 80

His Gly Lys Arg Asn Arg Thr Tyr Met Asp Val Val Arg Ser Cys Leu

85 90 95

Gly Pro Arg Asp Val Val Val Cys Gly Leu Ala Gln Tyr Ala Ile Leu

100 105 110

Trp Gly Thr Met Val Gly Tyr Thr Ile Thr Thr Ala Thr Ser Ile Met

115 120 125

Ala Val Ala Arg Thr Asp Cys Arg His His Arg Gly His Asp Ala Ala

130 135 140

Cys Ala Ser Ser Gly Thr Val Tyr Met Val Ala Phe Gly Val Val Glu

145 150 155 160

Val Val Leu Ser Gln Phe Pro Ser Leu Glu Lys Leu Thr Ile Ile Ser

165 170 175

Val Val Ala Ala Val Met Ser Cys Thr Tyr Ser Phe Val Gly Leu Phe

180 185 190

Leu Ser Ala Ala Lys Leu Ala Ser Asn His Gly Ala Arg Gly Ser Leu

195 200 205

Leu Gly Val Lys Ile Ala Ala Gly Val Ser Ala Ser Thr Lys Thr Trp

210 215 220

His Ser Leu Gln Ala Leu Gly Asn Val Ala Phe Ala Tyr Thr Tyr Ser

225 230 235 240

Met Leu Leu Ile Glu Ile Gln Asp Thr Val Lys Ala Pro Pro Ser Glu

245 250 255

Asn Val Thr Met Lys Arg Ala Ser Phe Tyr Gly Ile Ser Val Thr Thr

260 265 270

Ile Phe Tyr Val Ser Leu Gly Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Phe Gly Asn

275 280 285

Ala Ala Pro Gly Asn Val Leu Thr Gly Phe Asp Glu Pro Phe Trp Leu

290 295 300

Val Asp Val Ala Asn Ile Ala Val Val Val His Leu Val Gly Ala Tyr

305 310 315 320

Gln Val Tyr Ala Gln Pro Ile Phe Ala Cys Tyr Glu Lys Trp Leu Gly

325 330 335

Ser Arg Trp Pro Asp Ser Ala Phe Phe His His Glu Tyr Ala Val Arg

340 345 350

Leu Pro Gly Cys Ala Val Arg Phe Thr Met Cys Lys Leu Val Leu Arg

355 360 365

Thr Ala Phe Val Ala Ala Thr Thr Val Val Ser Leu Met Leu Pro Phe

370 375 380

Phe Asn Ala Val Leu Gly Leu Leu Gly Ala Ile Ala Phe Trp Pro Leu

385 390 395 400

Thr Val Tyr Phe Pro Val Thr Met Tyr Ile Ala Gln Ala Lys Val Ala

405 410 415

Pro Gly Ser Arg Lys Trp Val Ala Leu Gln Ala Leu Asn Val Gly Ala

420 425 430

Leu Leu Val Ser Leu Leu Ala Ala Val Gly Ser Val Ala Asp Met Val

435 440 445

Gln Arg Leu Gly His Val Thr Ile Phe Gln Thr Gln Leu

450 455 460

<210>2

<211>6130

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400>2

tcccgatccc gtcgaccctg ccacatacag cctcgtttga gctctagact cgagagaggc 60

ggatagggag aggcagcacc gcagggagca gtgacagaga ggccgagcga gagagagaga 120

tggacgtgga gaggaaggtg gtggaggcgg acgacgacgg ccgcgtcaga acaggtaaca 180

gtcgtctgtg gactccgtac ttgcttcctc tagcttctag tcttctagtc ctgcacacac 240

atctcgttga gttaatttgt agcctctgat ttctggtctg tggtctccgt tgattcacca 300

tttatctgcc gttgtcatca acaccgtacc accaccatgc tttcctactc gcagtccgcc 360

gtgtccttgt cccgacgagg cgtagatttc tccatgcctc agaatgttcc tatggtgtgg 420

tggggggtag caaggccgtc agctcgttga gtaattcgcc gcagttgctc tacacgtcca 480

tggcgacatg aagatggagt tgctctactc tggatagggt cgacgtgagc tggtgctggt 540

gctgatcgtc tttctccgtt tccacagctg gggagacgtg ggggatttca gttgccagca 600

tataggaagc atgcgcttct cgtcttttta gacatcaggc ccttcccgtt tctctcttgc 660

atttccgcca tctttacacc gcaccttcta gcttttggtg ctaactacta gcaaggtgaa 720

gatgacggtt gatggagcca caaacactta catgcatagt tcaaaattta atgaatcgag 780

ttcccattta ataatagctc gtgcgctaag cctgacacac gcacatccat catataattt 840

ttgaaaataa atacataaat aaattttaac atactctctt gatgttttct gcaatgctgc 900

aaggcttgca agtaagaaat gctattcaat tcagagtggt tcctatgtca ccgatttaat 960

taggaaggca atatttagtg tgccattggt aaggttttta ggacctgttt ttgcttctca 1020

taaactaaaa gccaacccaa aggatgtaaa ccagaagcta ttgtttttca ggagcagtta 1080

attttgggca gttcaatctt aaaagcacct cacactctgc ttttgtattt ttggccttct 1140

gttttcgaaa tggtgaaaat aaagaactct tttacggttg tttcaaaaaa aaacagatat 1200

gatgtatctt taatacttat ctgaacataa atagcttata cctttttcat agaccataag 1260

atataccaat tttttcatac cacacacaca atttatatca agattcccag aagccacagc 1320

tcacccaaag ctaggcattc ttatacggca cgccaaacct gaggcgaact ttttttttct 1380

tttcggaaaa tagaaattac ttagaaaaat ggagttatca aactagccat aaatgtataa 1440

gtttgaggct gcctaaattg aatattaagt atttaatcgt tcacactcca tccaaacatt 1500

aattatttaa tcattcacag tttatctaat ttagggaggt aaaatcgaat attagtatag 1560

ggtgaatgga tctattccaa cgtggataaa cacccggatg aaacaaagcc aactttgctt 1620

atgatgatca gcaaacgtct taggcgagga tttccttcac ccgcatatgc ttttgcacgc 1680

gtcactcgtc gagatttaac gtctcttgag cgtatcgatt tccttcgaaa cagcatccgt 1740

gaaattgaag agaaatacaa tgtacatgta cctttgcagt ttgcaccatt aatccattat 1800

ctaaaaacag acacctttgc atatagcaca actgaataaa gctagcataa ctgaatgaag 1860

ctatagctag tgatcagcac ctgaatatgt gacatagata gagtgaaaaa gcttcttttg 1920

ccacaccttc atcaagctag gaagagccta agcggcatag tatcgatgca ggaactaggt 1980

cctcctcccc agttgcttgc agcaacaact gggctactcg aaagacacat aatgccagtg 2040

gtgacttggc agccactacc tttaacatac aaagaaacaa gagtgtatat agtgacaact 2100

ttctactcct gaacagctcc agctgtccaa tactagtcct ccagaattat attcaggcgt 2160

agttgcgttg cgtgtgagat catgcgccat tagatgtctg ttgcaattat tctcctatag 2220

atttatagga atcccgaaaa gggtggagag tattattcac ctcgaatcgg taatagtcta 2280

tcagaaagtg ttcagtgtgg gccaatagtg gtttgtatat gaatggatgg ctgcaagcta 2340

tgctctctcc acttccccat aattctagac tactagaggt ctttttcatg gcaccaaaat 2400

agtacataac taactgcata tggggtgcac agttgtggac ttgtggccct gaagaaggca 2460

tctgtgagtg tgagtggaca gttgagcagt cctgaacact ggctgactgg tgaagtgcaa 2520

ggatatgtat ggatgggact gttgttgaga cttgagatga tttatcacaa ccttgccaac 2580

agggtgtgtt aagctgtctc cagtaaccct cttatctcat tttctttctc accttctatt 2640

tcaaacttca ttatacaaac agtgttatct atagtacata gtgttttgca cgaccttgat 2700

ctgttggaca caacattaga ctatctccag caacttatcc atcgccatac ccatattcaa 2760

actccactct gcgaacagtg cagtttacgg tgtaattaaa acactgcaaa acagtatttt 2820

gggtgaccat atgggtgagg tgcagaacag agtcttatat tgccttaatg ggttatgatg 2880

agtttgacta gttaatgact caaagcaagt agttcctgaa ttctcaactg ttgcaaagtt 2940

tgttggatgc cacatcacgc tccacagata taagcaacct gtgtcgcagc ttccaaaaag 3000

gcctttcatg cttacacacg ttggtgaaaa gggttatata tgcagctcca actggactga 3060

catagcacga gtaacacacc aaatcttgct ttactatagc ctaggcaact ttaatttgtt 3120

aagcatgctt tagactattt ttagcagctt accatcatca tacccatatt caaactctac 3180

tctgcgaaca atgcagttta cggtgtaaaa cagtattttg ggtgaccata tgggtgagct 3240

actgaacata ttcttatatt gacttaatgc gttatgatga gtttgactag ttaataatga 3300

ctgaaagcaa gtagttcctg aattctcaac tgttgcaagt ttgttggatg ccacatcaca 3360

ctccacacag atataagcaa cctgtgttgc agcttccaaa aaggcctttc atgcttacac 3420

acgttggtga aaagggttat atatgcagct ccaattggac tgacacagca cgagtaacac 3480

accaaatctt gctttactat agcctaggca actttaattt gttaagcatg ctttagttgt 3540

ataattgcca ctgctttggt agtgcttaga ataagccaat ggagttgggg ttccatgacg 3600

cgatccaaac aatgggctat gcgtatgtca ttggggttcc atgacgatcc aaataatggg 3660

ctacgcatgc gtgtgtaaca ctggcagttc gagtcgcagc tgttggtttt gctttatgta 3720

atggtatcca gcgcatcagc agtagatcaa tgggctagct ttactcaact tgcttacgaa 3780

aattgaccca aaatggtaac gaattaccta gtggaaaaaa aaggagccat gagtcgttga 3840

cgactagctg aagacgacca tgtgaaagta taatgatgac ctcattcagt ggtgtaatcc 3900

aatagtctac ttctactgaa aatgctcaga gattgcaaca cgcatgcaac atgatcgatg 3960

gtgttctgta caacgccggc caggtggcga gcaggtcgtt aatagatgac gacctgaaca 4020

ctcctgttct tcgacaggga cggtgtggac ggcgacgacg cacgccatca ccgccgtgat 4080

aggctccggc gtgctggcgc tgccctggag cgtggcgcag atgggctggg tcctcggccc 4140

cgtcgccctc gtcggctgcg cctacatcac ctacttcacc gccgtcctcc tgtccgactg 4200

ctaccgcacg ccggaccccg tccacggcaa acggaaccgc acctacatgg acgtcgtccg 4260

ctcatgcctc ggtatccgca ccatgcgtgt ggcttttttt ttctgaattt ccatgggcaa 4320

cgagtcaacg acagtagtag cgtgttctga tcgtgatggg catggcaatg acaaggatgt 4380

tctctctgag catgtgtgta cgtgtgtagg gcctagagat gtggtggtgt gtggactcgc 4440

acagtacgcg atcctctggg ggacaatggt gggctacacc atcaccactg ccacgagcat 4500

catgtaagct ctaaaaattc ctgttcagtg gcgcacaaga caccgcacat tttttttagg 4560

tctgggctaa aaagaagttc gtcgttgggc gcgccgccgc cgcgtgcgtg aatgaatggc 4620

atgcagggcc gtcgcgcgca cggactgccg ccaccacagg ggccacgacg cggcctgcgc 4680

ctcgtccggg acggtgtaca tggtggcgtt cggcgtcgtc gaggtggtcc tgtcccagtt 4740

cccgagcctg gagaagctca cgatcatctc cgtggtcgct gccgtcatgt cgtgcaccta 4800

ctccttcgtc gggctgttcc tgagcgccgc caagctcgcg tcgaaccacg gggcgcgcgg 4860

cagcctcctc ggcgtcaaga tcgccgcggg cgtctccgcg tcgaccaaga cgtggcactc 4920

actgcaggca ctcggcaacg ttgccttcgc gtacacctac tccatgcttc tcatagaaat 4980

ccaggtacgt gcacgttgca ggcttttcag ctgtcagcta gcgtacagta tgtggcatgc 5040

atcatggttg cgacgactgt aatgtcattg gcaatgtggc tttgcccatg aacttaggac 5100

actgtgaagg caccgccatc agagaacgtg acgatgaaga gggccagctt ctacggcatc 5160

agcgtgacga ccatcttcta cgtctcgctc gggtgcatcg gctacgcggc cttcggcaac 5220

gccgcgccgg ggaacgtgct taccggcttc gacgagccgt tctggctcgt cgacgtcgcc 5280

aacatcgccg tggtcgtcca cttggttggg gcatatcagg tgagacccct tcttggttct 5340

tgcagatcgc atgctctgga cgctcgcagt tcgtttgcat gatgaatgcg cttaattgtg 5400

tcattgtgtg tggcaggtgt acgcgcagcc gatcttcgcg tgctacgaga agtggctggg 5460

gtcccggtgg ccggactcgg ccttcttcca ccacgagtac gcggtgcgcc tgcccggctg 5520

cgcggtgcgg ttcacgatgt gcaagctggt gctgcgcacg gcgttcgtgg ccgccacgac 5580

ggtggtgtcg ctgatgctgc ccttcttcaa cgccgtgctc gggctgctgg gcgccatcgc 5640

cttctggccg ctgacggtgt acttcccggt gaccatgtac atcgcgcagg ccaaggtggc 5700

gcccggcagc cgcaagtggg tggcgctgca ggcgctcaat gtgggcgcgc tcctggtttc 5760

gctgctcgcc gccgtgggct ccgtggccga catggtgcag cgcctgggcc atgtcaccat 5820

ctttcagacg cagctctgaa acaagtattc agatcttatg catgggaacg cgcttgcaga 5880

ggcatacatc atacacatgc ttgtgccgta tattcacctg tgatcttagt acattggttt 5940

tggaagaaca actaaaaatg gagcatgtaa gtcattccac ctagatttcg tgcattgcaa 6000

gagtgctttt tggggtgaaa tagcagacag tgcacactcc atgacacatt tgaagcccag 6060

ctaagcgttg ggctgaatta atgattatgt ttcttcaagg gaaaaatagc acttcacatt 6120

tttactcttt 6130

<210>3

<211>1386

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400>3

atggacgtgg agaggaaggt ggtggaggcg gacgacgacg gccgcgtcag aacagggacg 60

gtgtggacgg cgacgacgca cgccatcacc gccgtgatag gctccggcgt gctggcgctg 120

ccctggagcg tggcgcagat gggctgggtc ctcggccccg tcgccctcgt cggctgcgcc 180

tacatcacct acttcaccgc cgtcctcctg tccgactgct accgcacgcc ggaccccgtc 240

cacggcaaac ggaaccgcac ctacatggac gtcgtccgct catgcctcgg gcctagagat 300

gtggtggtgt gtggactcgc acagtacgcg atcctctggg ggacaatggt gggctacacc 360

atcaccactg ccacgagcat catggccgtc gcgcgcacgg actgccgcca ccacaggggc 420

cacgacgcgg cctgcgcctc gtccgggacg gtgtacatgg tggcgttcgg cgtcgtcgag 480

gtggtcctgt cccagttccc gagcctggag aagctcacga tcatctccgt ggtcgctgcc 540

gtcatgtcgt gcacctactc cttcgtcggg ctgttcctga gcgccgccaa gctcgcgtcg 600

aaccacgggg cgcgcggcag cctcctcggc gtcaagatcg ccgcgggcgt ctccgcgtcg 660

accaagacgt ggcactcact gcaggcactc ggcaacgttg ccttcgcgta cacctactcc 720

atgcttctca tagaaatcca ggacactgtg aaggcaccgc catcagagaa cgtgacgatg 780

aagagggcca gcttctacgg catcagcgtg acgaccatct tctacgtctc gctcgggtgc 840

atcggctacg cggccttcgg caacgccgcg ccggggaacg tgcttaccgg cttcgacgag 900

ccgttctggc tcgtcgacgt cgccaacatc gccgtggtcg tccacttggt tggggcatat 960

caggtgtacg cgcagccgat cttcgcgtgc tacgagaagt ggctggggtc ccggtggccg 1020

gactcggcct tcttccacca cgagtacgcg gtgcgcctgc ccggctgcgc ggtgcggttc 1080

acgatgtgca agctggtgct gcgcacggcg ttcgtggccg ccacgacggt ggtgtcgctg 1140

atgctgccct tcttcaacgc cgtgctcggg ctgctgggcg ccatcgcctt ctggccgctg 1200

acggtgtact tcccggtgac catgtacatc gcgcaggcca aggtggcgcc cggcagccgc 1260

aagtgggtgg cgctgcaggc gctcaatgtg ggcgcgctcc tggtttcgct gctcgccgcc 1320

gtgggctccg tggccgacat ggtgcagcgc ctgggccatg tcaccatctt tcagacgcag 1380

ctctga 1386

<210>4

<211>19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400>4

gcacagtacg cgatcctct 19

<210>5

<211>552

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400>5

atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg 60

gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg 120

caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc 180

gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc 240

aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg 300

ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag 360

agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc 420

ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac 480

gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt cctgcccgtc 540

accgagattt ga 552

Claims

1.蛋白质ZmAAP6的应用，为如下A1)-A4)中的至少一种：

A1)增加玉米胚乳中蛋白质含量；

A2)降低玉米胚乳中淀粉含量；

A3)培育胚乳中蛋白质含量增加的转基因玉米；

A4)培育胚乳中淀粉含量降低的转基因玉米；

所述蛋白质ZmAAP6，为如下b1)或b2)或b3)或b4)：

b1)氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

b4)与SEQ ID NO:1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，来源于玉米且与玉米胚乳中蛋白质含量和/或淀粉含量相关的蛋白质。

2.编码权利要求1中所述蛋白质ZmAAP6的核酸分子应用，为如下A1)-A4)中的至少一种：

A1)增加玉米胚乳中蛋白质含量；

A2)降低玉米胚乳中淀粉含量；

A3)培育胚乳中蛋白质含量增加的转基因玉米；

A4)培育胚乳中淀粉含量降低的转基因玉米。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为c1)或c2)或c3)或c4)或c5)所示的DNA分子：

c1)编码区为SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

c2)核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

c3)核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

c4)与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于玉米且编码权利要求1中所述蛋白质ZmAAP6的DNA分子；

c5)在严格条件下与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列杂交，来源于玉米且编码权利要求1中所述蛋白质ZmAAP6的DNA分子。

4.一种培育转基因玉米甲的方法，包括如下步骤：提高受体玉米中权利要求1中所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性，得到转基因玉米甲；与受体玉米相比，转基因玉米甲胚乳中蛋白质含量增加和/或淀粉含量降低。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述提高受体玉米中权利要求1中所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性通过向受体玉米中导入编码所述蛋白质ZmAAP6的核酸分子实现。

6.一种玉米育种方法，包括如下步骤：增加玉米中权利要求1中所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性，从而增加玉米胚乳中蛋白质含量和/或降低玉米胚乳中淀粉含量。

7.一种培育转基因玉米乙的方法，包括如下步骤：抑制受体玉米中权利要求1中所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性，得到转基因玉米乙；与受体玉米相比，转基因玉米乙胚乳中蛋白质含量降低和/或淀粉含量增加。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述抑制受体玉米中权利要求1中所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性通过向受体玉米中导入抑制受体玉米中权利要求1所述蛋白质ZmAAP6的表达量和/或活性的物质实现。

9.根据权利要求1或2所述的应用、权利要求4-8任一所述的方法，其特征在于：

所述蛋白质含量增加表现为蛋白体面积增加；

所述淀粉含量降低表现为淀粉粒面积减少；

所述蛋白质含量降低表现为蛋白体面积减少；

所述淀粉含量增加表现为淀粉粒面积增加。

10.根据权利要求1或2所述的应用、权利要求4-8任一所述的方法，其特征在于：所述蛋白质含量为总蛋白含量或醇溶蛋白含量。