CN114560903A - 一种阿比特龙衍生物的简易制备方法及其细胞毒性评价 - Google Patents

一种阿比特龙衍生物的简易制备方法及其细胞毒性评价 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种阿比特龙衍生物的简易制备方法及其细胞毒性评价，以简单易得的17‑碘‑雄甾‑5,16‑二烯‑3β‑醇为起始原料，在钯催化下与二乙基(3‑吡啶基)‑硼烷进行Suzuki偶联反应得到阿比特龙。在光诱导下，加入4，4‑二溴二苯甲酮、五氟丙酸钠与氯化铵，阿比特龙与1，3‑二氧戊环直接脱氢偶联生成阿比特龙衍生物。本发明合成路线简短，反应条件温和，操作简单，制备成本低，也为吡啶类药物提供了新的结构修饰方法。

Description

一种阿比特龙衍生物的简易制备方法及其细胞毒性评价
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种阿比特龙衍生物的简易制备方法及其细胞毒性评价。
背景技术
前列腺癌是发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，是全球男性发病率仅次于肺癌的第二大癌症。阿比特龙是一种前列腺癌治疗药，主要是通过选择性、不可逆地抑制孕烯醇酮与孕酮转化为睾酮过程中的限速酶CYP17以抑制患者体内雄激素的生成从而发挥治疗作用。该药物是由美国强生公司研发的甾体类CYP17选择性抑制剂，由于溶解性差，生物可利用度较低，临床使用的是它的一种衍生物—醋酸阿比特龙，其作用机理是口服后通过肠胃吸收，然后在肝中降解成为活性成分阿比特龙。醋酸阿比特龙商品名为ZYTIGA，于2011年获得美国FDA上市批准，临床上主要与泼尼松联合用于治疗既往接受含多烯紫杉醇化疗后的转移去势难治性前列腺癌患者。另外，醋酸阿比特龙用于乳腺癌适应症、肠癌适应症已进人临床研究阶段。随着新适应症的研究，阿比特龙及其衍生物的开发将有巨大的市场潜力。
对药物进行结构修饰优化，合成出一些药物衍生物，以寻找疗效更好的药物的研究近年来发展较快，已成为抗肿瘤药物研究开发的重要组成部分。目前，通过对阿比特龙的结构进行化学改造从而增加其抗肿瘤活性的研究非常少见。因此，亟需开发更加简单、经济的阿比特龙衍生物的制备方法，并得到抗癌细胞活性更好的阿比特龙衍生物。
发明内容
本发明的目的在于，一种合成路线简易、操作简单、成本较低的阿比特龙衍生物的制备方法，并对制得的阿比特龙与阿比特龙衍生物进行细胞毒性评价。
为达成上述目的，本发明提供如下技术方案：一种阿比特龙衍生物的简易制备方法，包括如下步骤：
S1、在17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇、二乙基(3-吡啶基)-硼烷、双三苯基磷二氯化钯及碳酸钠的混合物中加入四氢呋喃和水，抽真空，再通入氮气，反应液在80-90℃下反应18-24h，冷却至室温，萃取后浓缩，柱层析纯化得到阿比特龙；
S2、在五氟丙酸钠、二苯甲酮类光敏剂、氯化铵和阿比特龙的混合物中加入1，3-二氧戊环，光诱导下室温反应18-24h，通过柱层析法提纯得到阿比特龙衍生物。
按上述方案，步骤1中17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇、二乙基(3-吡啶基)-硼烷、碳酸钠加入量按摩尔比为1:(1.1-1.5)：(3-5)。
按上述方案，步骤1中双三苯基磷二氯化钯、17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇加入量按摩尔比为1:(5-20)。
按上述方案，步骤1中水和四氢呋喃的体积比为1:(2-4)；17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇在其中的浓度为0.06mol/L-0.2mol/L。
按上述方案，步骤2中五氟丙酸钠、二苯甲酮类光敏剂、氯化铵和阿比特龙的加入量按摩尔比为1:(2-5):(5-10):(5-10)；阿比特龙在1，3-二氧戊环中的浓度为0.05mol/L-0.1mol/L。
按上述方案，步骤2中所述二苯甲酮类光敏剂为二苯甲酮、4，4’-二溴二苯甲酮或4，4’-二甲氧基二苯甲酮。
按上述方案，步骤2中光诱导所用光源为紧凑型荧光灯(CFL)30-40W，波长为365-380nm。
本发明提供的另一技术方案：上述制备方法制得的阿比特龙衍生物的细胞毒性评价，包括：
用制得的阿比特龙、阿比特龙衍生物分别与细胞培养液配置四种浓度的样品溶液，加入到细胞贴壁生长的96孔板中，置于培养箱中继续培养20-24h；
在避光条件下，向每孔中加入配置好的CCK-8溶液，用锡纸包裹避光，置于培养箱1-2h后，用酶标仪分别检测450nm波长吸光度值，用公式计算细胞存活率：
Cell viability％＝((A1-A0)/(A2-A0))×100％
式中，A0为空白对照，即有细胞培养液而无细胞的孔的OD值；A1为样品组，即具有细胞、细胞培养液和药物溶液的孔的OD值；A2为对照组，即具有细胞、细胞培养液而没有药物溶液的孔的OD值。
按上述方案，所述96孔板中生长的细胞为MCF7细胞、MG63细胞；
阿比特龙或阿比特龙衍生物样品溶液的浓度分别为0.4μmol/L-0.5μmol/L、0.8μmol/L-1μmol/L、1.6μmol/L-2μmol/L、3.2μmol/L-4μmol/L。
按上述方案，所述CCK-8溶液用CCK-8试剂与细胞培养液配制，体积比为1：(8.5-9.5)。
本发明与现有技术相对比，其有益效果在于：
本发明提供了一种阿比特龙衍生物的简易制备方法及其细胞毒性评价，以简单易得的17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇为起始原料，在钯催化下与二乙基(3-吡啶基)-硼烷进行Suzuki偶联反应得到阿比特龙。在光诱导下，加入4，4-二溴二苯甲酮、五氟丙酸钠与氯化铵，阿比特龙与1，3-二氧戊环直接脱氢偶联生成阿比特龙衍生物，该化合物首次被公开报道。随后，用CCK-8法对制得的阿比特龙、阿比特龙衍生物进行了细胞毒性评价，测定了其对MCF7细胞和MG63细胞存活率的影响。随着阿比特龙、阿比特龙衍生物浓度的增大，对细胞活力的抑制效果也逐渐增大。
本发明将近年来发展迅速的光催化反应方法与传统的化学反应方式联合应用以成功制得阿比特龙衍生物，证明了光催化反应方法的广泛适用性。该合成路线简短，反应条件温和，操作简单，制备成本低，也为吡啶类药物提供了新的结构修饰方法。CCK-8实验的灵敏度高，以该方法对所制得的阿比特龙、阿比特龙衍生物进行细胞毒性评价，为阿比特龙及其衍生物的拓展应用提供参考。
附图说明
图1为实施例1的反应过程示意图。
图2为实施例1步骤2所得阿比特龙衍生物的核磁共振氢谱图；
图3为实施例1步骤2所得阿比特龙衍生物的核磁共振碳谱图；
图4为实施例1步骤3中96孔板的设计图(PBS为磷酸缓冲盐溶液)；
图5为实施例1步骤4中MCF7细胞存活率实验结果；
图6为实施例2步骤4中MG63细胞存活率实验结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
选用的光敏剂为4，4’-二溴二苯甲酮，选用的细胞为MCF7细胞。具体步骤如下：
1)在17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇398.3mg(1mmol)、二乙基(3-吡啶基)-硼烷191.1mg(1.3mmol)、双三苯基磷二氯化钯70.2mg(0.1mmol)及碳酸钠424mg(4mmol)的混合物中加入4mL四氢呋喃和1.5mL水，抽真空，再通入氮气，反应液在80℃下反应24h，冷却至室温，乙酸乙酯萃取，再将有机相用无水硫酸钠干燥，加入硅胶粉旋干乙酸乙酯。然后，以石油醚：乙酸乙酯＝2：1为洗脱剂，通过柱层析法提纯产物，再次旋干溶剂抽真空得到白色固体阿比特龙181.7mg，产率52％。
2)将阿比特龙69.9mg(0.2mmol)、4,4'-二溴二苯甲酮13.6mg(0.04mmol)、五氟丙酸钠3.7mg(0.02mmol)与氯化铵5.3mg(0.1mmol)的混合物中加入2mL的1，3-二氧戊环，在通空气条件下搅拌，并用紧凑型荧光灯(CFL)40W灯照射，同时风扇吹反应装置以保持温度为25℃，反应24h后，通过TLC监测反应进程，判断反应是否反应完全，或者某一反应物已经全部反应，停止反应。然后，加入硅胶粉旋干溶剂，以二氯甲烷：甲醇＝25：1为洗脱剂，通过柱层析法提纯产物，再次旋干溶剂抽真空得到白色固体阿比特龙衍生物29.5mg，产率35％。取10mg步骤2所得提纯后的产品溶解在0.10mL的CDCl3中，做核磁共振氢谱和碳谱。
图2为步骤2所得产物核磁共振氢谱；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.62(d,J＝1.7Hz,1H),7.69(dd,J＝8.1,2.2Hz,1H),7.46(d,J＝8.1Hz,1H),6.01(dd,J＝3.2,1.8Hz,1H),5.85(s,1H),5.41–5.37(m,1H),4.20–4.16(m,2H),4.10–4.07(m,2H),3.57–3.51(m,1H),2.35–2.23(m,3H),2.10–2.01(m,3H),1.86(s,1H),1.85–1.83(m,1H),1.78–1.73(m,1H),1.68–1.60(m,6H),1.53-1.46(m,2H),1.14–1.09(m,1H),1.07(s,3H),1.04(s,3H).
图3为步骤2所得产物核磁共振碳谱图；13C NMR(126MHz,CDCl3)δ154.9,151.4,147.5,141.2,134.5,133.4,129.7,121.3,120.1,103.6,71.7,65.6,57.5,50.4,47.4,42.3,37.2,36.7,35.3,31.9,31.6,31.5,30.5,20.9,19.3,16.6.
3)用制得的阿比特龙、阿比特龙衍生物分别与细胞培养液配置3.2μmol/L、1.6μmol/L、0.8μmol/L、0.4μmol/L四种浓度的样品溶液，加入到MCF7细胞完全贴壁生长的96孔板中，置于培养箱中继续培养24h(如图4，第一列为空白对照组，无细胞，加入等量细胞培养液,第二列为对照组，有细胞，加入等量培养液)；
4)在避光条件下，向每孔中加入100μl配置好的CCK-8溶液(比例为90％培养液，10％CCK-8试剂)，用锡纸包裹避光，置于培养箱1h后，用酶标仪分别检测吸光度值(OD值)，用公式计算细胞存活率Cell viability％＝((A1-A0)/(A2-A0))×100％(A0：空白对照，A1：样品组A2：对照组)。图5为阿比特龙、阿比特龙衍生物分别对MCF7细胞存活率的影响实验结果，从图中可以看出，随着样品浓度的升高，阿比特龙、阿比特龙衍生物对MCF7细胞活性的影响逐渐升高，在浓度为3.2μmol/L时，阿比特龙衍生物的抑制效果明显比阿比特龙更佳。
实施例2
选用的光敏剂为4，4’-二溴二苯甲酮，选用的细胞为MG63细胞。具体步骤如下：
1)在17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇199.2mg(0.5mmol)、二乙基(3-吡啶基)-硼烷88.2mg(0.6mmol)、双三苯基磷二氯化钯35.1mg(0.05mmol)及碳酸钠212mg(2mmol)的混合物中加入2mL四氢呋喃和0.75mL水，抽真空，再通入氮气，反应液在80℃下反应24h，冷却至室温，乙酸乙酯萃取，再将有机相用无水硫酸钠干燥，加入硅胶粉旋干乙酸乙酯。然后，以石油醚：乙酸乙酯＝2：1为洗脱剂，通过柱层析法提纯产物，再次旋干溶剂抽真空得到白色固体阿比特龙96.1mg，产率55％。
2)将阿比特龙69.9mg(0.2mmol)、4,4'-二溴二苯甲酮13.6mg(0.04mmol)、五氟丙酸钠3.7mg(0.02mmol)与氯化铵5.3mg(0.1mmol)的混合物中加入2mL的1，3-二氧戊环，在通空气条件下搅拌，并用紧凑型荧光灯(CFL)40W灯照射，同时风扇吹反应装置以保持温度为25℃，反应24h后，通过TLC监测反应进程，判断反应是否反应完全，或者某一反应物已经全部反应，停止反应。然后，加入硅胶粉旋干溶剂，以二氯甲烷：甲醇＝25：1为洗脱剂，通过柱层析法提纯产物，再次旋干溶剂抽真空得到白色固体阿比特龙衍生物29.5mg，产率35％。
3)用制得的阿比特龙、阿比特龙衍生物分别与细胞培养液配置3.2μmol/L、1.6μmol/L、0.8μmol/L、0.4μmol/L四种浓度的样品溶液，加入到MG63细胞完全贴壁生长的96孔板中，置于培养箱中继续培养24h；
4)在避光条件下，向每孔中加入100μl配置好的CCK-8溶液(比例为90％培养液，10％CCK-8试剂)，用锡纸包裹避光，置于培养箱1h后，用酶标仪分别检测吸光度值(OD值)，用公式计算细胞存活率Cell viability％＝((A1-A0)/(A2-A0))×100％(A0：空白对照，A1：样品组A2：对照组)。图6为阿比特龙、阿比特龙衍生物分别对MG63细胞存活率的影响实验结果，从图中可以看出，随着样品浓度的升高，阿比特龙、阿比特龙衍生物对MG63细胞活性的影响逐渐升高，在浓度为3.2μmol/L时，阿比特龙衍生物的抑制效果明显比阿比特龙更佳。
实施例3
选用的光敏剂为二苯甲酮，选用的细胞为MCF7细胞。具体步骤如下：
1)在17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇199.2mg(0.5mmol)、二乙基(3-吡啶基)-硼烷102.9mg(0.7mmol)、双三苯基磷二氯化钯35.1mg(0.05mmol)及碳酸钠265mg(2.5mmol)的混合物中加入3mL四氢呋喃和1mL水，抽真空，再通入氮气，反应液在80℃下反应24h，冷却至室温，乙酸乙酯萃取，再将有机相用无水硫酸钠干燥，加入硅胶粉旋干乙酸乙酯。然后，以石油醚：乙酸乙酯＝2：1为洗脱剂，通过柱层析法提纯产物，再次旋干溶剂抽真空得到白色固体阿比特龙96.1mg，产率55％。
2)将阿比特龙69.9mg(0.2mmol)、二苯甲酮14.6mg(0.08mmol)、五氟丙酸钠3.7mg(0.02mmol)与氯化铵10.6mg(0.2mmol)的混合物中加入2mL的1，3-二氧戊环，在通空气条件下搅拌，并用紧凑型荧光灯(CFL)40W灯照射，同时风扇吹反应装置以保持温度为25℃，反应24h后，通过TLC监测反应进程，判断反应是否反应完全，或者某一反应物已经全部反应，停止反应。然后，加入硅胶粉旋干溶剂，以二氯甲烷：甲醇＝25：1为洗脱剂，通过柱层析法提纯产物，再次旋干溶剂抽真空得到白色固体阿比特龙衍生物26.9mg，产率32％。
3)用制得的阿比特龙、阿比特龙衍生物分别与细胞培养液配置3.2μmol/L、1.6μmol/L、0.8μmol/L、0.4μmol/L四种浓度的样品溶液，加入到MCF7细胞完全贴壁生长的96孔板中，置于培养箱中继续培养24h。
4)在避光条件下，向每孔中加入100μl配置好的CCK-8溶液(比例为90％培养液，10％CCK-8试剂)，用锡纸包裹避光，置于培养箱1h后，用酶标仪分别检测吸光度值(OD值)，用公式计算细胞存活率Cell viability％＝((A1-A0)/(A2-A0))×100％(A0：空白对照，A1：样品组A2：对照组)。
实施例4
选用的光敏剂为4，4’-二甲氧基二苯甲酮，选用的细胞为MG63细胞。具体步骤如下：
1)在17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇398.3mg(1mmol)、二乙基(3-吡啶基)-硼烷191.1mg(1.3mmol)、双三苯基磷二氯化钯56.16mg(0.08mmol)及碳酸钠424mg(4mmol)的混合物中加入4mL四氢呋喃和1.5mL水，抽真空，再通入氮气，反应液在80℃下反应24h，冷却至室温，乙酸乙酯萃取，再将有机相用无水硫酸钠干燥，加入硅胶粉旋干乙酸乙酯。然后，以石油醚：乙酸乙酯＝2：1为洗脱剂，通过柱层析法提纯产物，再次旋干溶剂抽真空得到白色固体阿比特龙174.8mg，产率50％。
2)将阿比特龙69.9mg(0.2mmol)、4,4'-二甲氧基二苯甲酮19.4mg(0.08mmol)、五氟丙酸钠3.7mg(0.02mmol)与氯化铵10.6mg(0.2mmol)的混合物中加入2mL的1，3-二氧戊环，在通空气条件下搅拌，并用紧凑型荧光灯(CFL)40W灯照射，同时风扇吹反应装置以保持温度为25℃，反应24h后，通过TLC监测反应进程，判断反应是否反应完全，或者某一反应物已经全部反应，停止反应。然后，加入硅胶粉旋干溶剂，以二氯甲烷：甲醇＝25：1为洗脱剂，通过柱层析法提纯产物，再次旋干溶剂抽真空得到白色固体阿比特龙衍生物26.1mg，产率31％。
3)用制得的阿比特龙、阿比特龙衍生物分别与细胞培养液配置3.2μmol/L、1.6μmol/L、0.8μmol/L、0.4μmol/L四种浓度的样品溶液，加入到MG63细胞完全贴壁生长的96孔板中，置于培养箱中继续培养24h。
4)在避光条件下，向每孔中加入100μl配置好的CCK-8溶液(比例为90％培养液，10％CCK-8试剂)，用锡纸包裹避光，置于培养箱1h后，用酶标仪分别检测吸光度值(OD值)，用公式计算细胞存活率Cell viability％＝((A1-A0)/(A2-A0))×100％(A0：空白对照，A1：样品组A2：对照组)。
通过以上实施案例的总结，我们发现：在光诱导下，加入五氟丙酸钠、氯化铵与二苯甲酮类光敏剂，阿比特龙与1，3-二氧戊环直接脱氢偶联生成阿比特龙衍生物。用CCK-8法对制得的阿比特龙、阿比特龙衍生物进行了细胞毒性评价，实验结果证明了在一定浓度下，阿比特龙衍生物比阿比特龙具有更佳的MCF7细胞和MG63细胞活力抑制作用。该发明创新的反应体系反应简便易于操作，反应性较好，纯度很高，所制得的药物衍生物对MCF7细胞和MG63细胞存活率有明显影响。
本发明的主要创新性在于：1.该制备方法以17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇通过传统方法制得阿比特龙，再以光催化反应方式合成了新的阿比特龙衍生物；2.该合成路线简短，反应条件温和，起始原料廉价易得，操作简单，制备成本低，为吡啶类药物提供了新的结构修饰方法；3.所制得的阿比特龙衍生在一定程度上具有比阿比特龙更佳的MCF7细胞和MG63细胞活力抑制作用，为阿比特龙及其衍生物的拓展应用提供参考。
本发明所列举的各原料，以及本发明各原料的上下限、区间取值，以及工艺参数(如温度、时间等)的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种阿比特龙衍生物的简易制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、在17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇、二乙基(3-吡啶基)-硼烷、双三苯基磷二氯化钯及碳酸钠的混合物中加入四氢呋喃和水，抽真空，再通入氮气，反应液在80-90℃下反应18-24h，冷却至室温，萃取后浓缩，柱层析纯化得到阿比特龙；
S2、在五氟丙酸钠、二苯甲酮类光敏剂、氯化铵和阿比特龙的混合物中加入1，3-二氧戊环，光诱导下室温反应18-24h，通过柱层析法提纯得到阿比特龙衍生物。
2.根据权利要求1所述的一种阿比特龙衍生物的简易制备方法，其特征在于，步骤S1中17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇、二乙基(3-吡啶基)-硼烷、碳酸钠加入量按摩尔比为1:(1.1-1.5)：(3-5)。
3.根据权利要求1所述的一种阿比特龙衍生物的简易制备方法，其特征在于，步骤S1中双三苯基磷二氯化钯、17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇加入量按摩尔比为1:(5-20)。
4.根据权利要求1所述的一种阿比特龙衍生物的简易制备方法，其特征在于，步骤S1中水和四氢呋喃的体积比为1:(2-4)；17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇在其中的浓度为0.06mol/L-0.2mol/L。
5.根据权利要求1所述的一种阿比特龙衍生物的简易制备方法，其特征在于，步骤S2中五氟丙酸钠、二苯甲酮类光敏剂、氯化铵和阿比特龙的加入量按摩尔比为1:(2-5):(5-10):(5-10)；阿比特龙在1，3-二氧戊环中的浓度为0.05mol/L-0.1mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种阿比特龙衍生物的简易制备方法，其特征在于，步骤S2中所述二苯甲酮类光敏剂为二苯甲酮、4，4’-二溴二苯甲酮或4，4’-二甲氧基二苯甲酮。
7.根据权利要求1所述的一种阿比特龙衍生物的简易制备方法，其特征在于，步骤S2中光诱导所用光源为紧凑型荧光灯(CFL)30-40W，波长为365-380nm。
8.如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的阿比特龙衍生物的细胞毒性评价，其特征在于，包括：
用制得的阿比特龙、阿比特龙衍生物分别与细胞培养液配置四种浓度的样品溶液，加入到细胞贴壁生长的96孔板中，置于培养箱中继续培养20-24h；
在避光条件下，向每孔中加入配置好的CCK-8溶液，用锡纸包裹避光，置于培养箱1-2h后，用酶标仪分别检测450nm波长吸光度值，用公式计算细胞存活率：
Cell viability％＝((A1-A0)/(A2-A0))×100％
式中，A0为空白对照，A1为样品组，A2为对照组。
9.根据权利要求8所述的细胞毒性评价，其特征在于，所述96孔板中生长的细胞为MCF7细胞、MG63细胞；阿比特龙或阿比特龙衍生物样品溶液的浓度分别为0.4μmol/L-0.5μmol/L、0.8μmol/L-1μmol/L、1.6μmol/L-2μmol/L、3.2μmol/L-4μmol/L。
10.根据权利要求8所述的细胞毒性评价，其特征在于，所述CCK-8溶液用CCK-8试剂与细胞培养液配制，体积比为1：(8.5-9.5)。
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