CN114560745A - 盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑制剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑制剂的应用，抑制亚硝化微生物的亚硝化活性，所述盐地碱蓬叶片提取物的有效组分包括原儿茶醛，所述盐地碱蓬叶片提取物的制备方法包括以下步骤：将盐地碱蓬叶片冷冻干燥，并研磨成粉末。通过本发明的技术方案，能够高效抑制亚硝化微生物的活性，减少农田土壤在硝化过程中所造成的氮素损失和环境问题，不但可以充分利用湿地资源，而且还能替代人工合成硝化抑制剂，克服了人工合成硝化抑制剂价格高、效果慢、易污染等缺点，并为农业生产提高氮素利用率提供了新的方法和思路。

Description

盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑制剂的应用
技术领域
本发明涉及硝化抑制剂技术领域，具体而言，涉及一种盐地碱蓬叶片 提取物作为硝化抑制剂的应用。
背景技术
氮是植物生长的必需元素，植物生长发育离不开氮，氮素能够提高农 作物产量。抑制硝化作用和减少土壤氮肥的投入是提高农业系统氮肥利用 的关键方法。
硝化抑制剂是一种通过抑制土壤中的硝化细菌活性起到延缓NH4+转 换成NO3－的氧化过程从而提高氮肥利用率的化合物。硝化抑制剂能够减少 土壤氮素淋溶和提高氮素利用率，是农业系统调节硝化作用的一项重要战 略。从来源上讲，硝化抑制剂可分为人工合成硝化抑制剂和生物硝化抑制 剂。人工合成硝化抑制剂主要有氰胺类化合物、含氮杂环化合物、含硫化 合物、烃类及其衍生物等，但只有少数可应用于农业生产，如氯甲基吡啶、双氰胺(DCD)和3,4-二甲基吡唑磷酸盐(DMPP)等。虽然目前的人工硝化抑 制剂能够抑制土壤中的硝化过程，成为增产减肥的有效手段，但在实际使 用的过程中往往会受到多种因素的制约，比如成本过高、效率低、易对环 境产生二次污染等问题。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术或相关技术中存在的技术问题之一。
为此，本发明的一个目的在于提出盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑制 剂的应用，盐地碱蓬叶片提取物从盐地碱蓬叶片中获得，价格低廉，硝化 抑制效率高，成本效益高，能够高效抑制亚硝化微生物的活性，进而减少 农田土壤在硝化过程中所造成的氮素损失和环境问题。盐地碱蓬作为黄河 三角洲地区常见的盐生植物，其分布较为广泛，容易获取，成活率高、适 应性强、生长周期短，种植简单，对种植技术要求低，不但环境友好，而 且成本较低。
为了实现上述目的，本发明的第一方面的技术方案提供了一种盐地碱 蓬叶片提取物作为硝化抑制剂的应用，抑制亚硝化微生物的亚硝化活性， 所述盐地碱蓬叶片提取物的有效组分包括原儿茶醛，所述盐地碱蓬叶片提 取物的制备方法包括以下步骤：将盐地碱蓬叶片冷冻干燥，并研磨成粉末。
在该技术方案中，盐地碱蓬叶片提取物中包含的原儿茶醛，可以通过 影响电子传递过程影响氧化磷酸化过程，通过干扰细胞呼吸链上的电子传 递来抑制细菌的氧化磷酸化过程，达到抑制细菌生长的目的，通过调控TCA 循环来调控硝化细菌的内部供能，在一定程度上对卡尔文循环产生影响， 具体影响了细菌的碳同化过程和下游的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的合成， 进而影响细菌的功能和相关蛋白质的合成，对蛋白质的生物合成产生了一 定的抑制作用，影响细菌自身相关酶的合成，进而影响细胞其他功能，原 儿茶醛影响细菌对铁铜离子的吸收，进而影响其他酶的活性，具体地，原 儿茶醛对亚硝化细菌的作用机理如图1所示。
此外，盐地碱蓬叶片提取物除了含有原儿茶醛外，可能还含有其他丰 富的功能性物质，能够高效抑制亚硝化微生物的活性，亚硝化抑制率可达 80％以上，进而减少农田土壤在硝化过程中所造成的氮素损失和环境问题。
在上述技术方案中，优选地，盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑制剂应 用于抑制欧洲亚硝化单胞菌Nitrosomonas europaea的亚硝化活性。
在上述任一项技术方案中，优选地，盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑 制剂的应用时适宜pH值为6.0～8.0。
在技术方案中，pH值为6.0-8.0时，原儿茶醛更容易进入细胞，对细 胞膜上的AMO产生抑制效应，从而进一步保障了对亚硝化细菌生长的显 著生长抑制效果。
在上述任一项技术方案中，优选地，盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑 制剂适用于盐碱土、褐土、红壤。
本发明的第二方面的技术方案还提出了一种盐地碱蓬叶片提取物作为 硝化抑制剂的应用中所采用的盐地碱蓬叶片提取物的制备方法，包括以下 步骤：将盐地碱蓬叶片冷冻干燥，并研磨成粉末；
将盐地碱蓬叶片粉末与水混合振荡后，将待澄清液于室温下静置24h， 固液分离，所得液体即为盐地碱蓬叶片提取物。
在上述技术方案中，优选地，冷冻干燥的工艺参数：冷冻干燥温度为 -50℃～-40℃，冷冻时间为24h～48h；
研磨的工艺参数：研磨频率为30Hz，研磨时间为1.5min；
振荡的工艺参数：振荡温度为25℃，振荡频率为150rpm，振荡时间为 1h。
在上述任一项技术方案中，优选地，盐地碱蓬叶片粉末与水的重量比 为1:10。
在该技术方案中，盐地碱蓬叶片提取物的制备方法简单可靠，无污染， 成本低。
本发明的第二方面的技术方案还提出了一种原儿茶醛作为硝化抑制剂 的应用，抑制亚硝化微生物的亚硝化活性，原儿茶醛的结构式为：
Figure BDA0003553297960000031
在该技术方案中，原儿茶醛，可以通过影响电子传递过程影响氧化磷 酸化过程，通过干扰细胞呼吸链上的电子传递来抑制细菌的氧化磷酸化过 程，达到抑制细菌生长的目的，通过调控TCA循环来调控硝化细菌的内部 供能，在一定程度上对卡尔文循环产生影响，具体影响了细菌的碳同化过 程和下游的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的合成，进而影响细菌的功能和相 关蛋白质的合成，对蛋白质的生物合成产生了一定的抑制作用，影响细菌自身相关酶的合成，进而影响细胞其他功能，原儿茶醛影响细菌对铁铜离 子的吸收，进而影响其他酶的活性，具体地，原儿茶醛对亚硝化细菌的作 用机理如图1所示。
原儿茶醛能够高效抑制亚硝化微生物的活性，原儿茶醛浓度为580 mg·L-1对亚硝化微生物的亚硝化抑制率就可达80％以上，进而减少农田土 壤在硝化过程中所造成的氮素损失和环境问题。
原儿茶醛作为硝化抑制剂应用于抑制欧洲亚硝化单胞菌Nitrosomonas europaea的亚硝化活性。
在上述技术方案中，优选地，原儿茶醛作为硝化抑制剂的应用时pH 值为6.0～8.0。原儿茶醛作为硝化抑制剂适用于盐碱土、褐土、红壤。
在上述任一项技术方案中，优选地，所述原儿茶醛的用量为500 mg·kg-1～1000mg·kg-1。
在该技术方案中，原儿茶醛的用量为500mg·kg-1～1000mg·kg-1，具有 较理想的硝化抑制效果，尤其是在1000mg·kg-1浓度下对褐土和盐碱土的 硝化抑制率超过70％。
有益技术效果：
(1)本发明提出了盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑制剂的新应用，而 且是一种生物型硝化抑制剂，易获得，成本低。
(2)本发明充分利用了湿地植物资源，其叶片提取液中富含丰富的生 物活性物质，能够对亚硝化细菌产生明显的抑制效果。
(3)本发明提出了盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑制剂来源于植物， 能够有效避免人工合成硝化抑制剂价格高、效果慢、易污染等缺点，为农 业生产提高氮素利用率提供新的方法和思路。
(4)本发明提出了盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑制剂，利用盐地碱 蓬叶片提取物中富含原茶儿醛等物质，能够对亚硝化细菌产生明显的抑制 效果，硝化抑制率可达80％以上。
(5)本发明提出了原儿茶醛作为硝化抑制剂的新应用，而且可以从植 物中获得，来源广泛易获得，且原儿茶醛的化学结构稳定，可以有效解决 人工合成硝化抑制剂价格高、效果慢、易污染等缺点，并为农业生产提高 氮素率提供新的方法和思路。
(6)本发明提出了原儿茶醛作为硝化抑制剂能在低剂量下高效抑制亚 硝化微生物的活性，能在一定程度上影响亚硝化细菌对Fe3+和Cu2+的吸收， 进而影响其电子传递和氧化磷酸化过程，导致细菌因供能不足而受到抑制， 此外原儿茶醛还可以作用于细菌核糖体，通过影响其蛋白质的合成而影响 其生长，施加原儿茶醛作为硝化抑制剂，原儿茶醛浓度为580mg·L-1对亚 硝化微生物的亚硝化抑制率就可达80％以上，可以有效减少农田土壤在硝 化过程中所造成的氮素损失和环境问题。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述部分中给出，部分将从下面 的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描 述中将变得明显和容易理解，其中：
图1示出了原儿茶醛对亚硝化细菌的作用机理图；
图2示出了盐地碱蓬叶片提取物对欧洲亚硝化单胞菌的作用效果图；
图3示出了盐地碱蓬叶片提取物对土壤的硝化作用效果图；
图4示出了亚硝化抑制率与原儿茶醛(PA)的浓度的关系图。
具体实施方式
本发明公开了一种盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑制剂的应用，本领 域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的 是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都 被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描 述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方 法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
盐地碱蓬叶片提取物对亚硝化细菌生长情况的影响
(1)微生物菌株：欧洲亚硝化单胞菌Nitrosomonas europaea(ATCC 19718)购于美国The Global Bioresource Center。
(2)微生物的培养：以欧洲亚硝化单胞菌N.europaea作为供试菌株， 购于美国模式菌种收集中心(The Global Bioresource Center)。该菌株是研 究氨氧化过程的模式菌，前人筛选BNI也多采用此菌种。菌株活化和培养采 用该公司推荐的ATCC培养基。培养基成分如下(1.5L)：(NH4)2SO4 4.95g， KH2PO4 8.82g，NaH2PO4 0.7g，Na2CO3 0.6g，MgSO4·7H2O0.27g，CuSO4·5H2O 0.2mg，CaCl2·2H2O 0.04g，FeSO4(30mM in 50mM EDTA at pH 7.0)0.5mL，pH 7.8～8.0，在121℃高温灭菌。吸取200μL无菌水将菌株冻干 粉悬浮，加入到20mLATCC培养基中，在30℃、180rpm、黑暗条件下振 荡培养,当NO2 -含量达到200mg·L-1时(大约7d)可进行转接，3～4代后细 菌的生长情况稳定，可以进行后续的试验。
(3)盐地碱蓬叶片提取物的制备：对于红色叶片和绿色叶片两种表型 的盐地碱蓬叶片，分别用超纯水反复冲洗干净后冷冻干燥并除去多余水分， 冷冻干燥温度为-50℃～-40℃，冷冻时间为24h～48h，之后研磨成粉末，研 磨频率为30Hz，研磨时间为1.5min。准确称量1.0g叶片粉末并将其溶解 在10mL蒸馏水中，在25℃、150rpm条件下振荡1h。振荡后将待澄清液 于室温下静置24小时，固液分离，所得液体即为盐地碱蓬叶片提取物。
(4)亚硝化活性抑制实验：收集培养7d的N.europaea菌液，10000g 条件下离心10min，用PBS缓冲液洗涤3～5次除去所有残留的NH4+和NO2-。 将菌液重新悬浮于新鲜无菌的ATCC培养基中直至OD600≥1.0，其浓缩倍 数约为100倍，另取容量为1.5mL的离心管，依次加入400μL叶片浸提液 (对照加入400μL超纯水)、500μL新鲜无菌ATCC培养基和100μL的重 悬菌液，在28℃黑暗条件下水浴加热9h后，取100μL加入50mL的比色管 中，加入1mLGriess显色剂，摇匀后静置5min左右，用水稀释至50mL定 容，参考国标《大气降水中亚硝酸盐测定N-(1-萘基)-乙二胺光度法》测定 样品中的NO2 -。根据如下公式计算样品的亚硝化抑制率：
Figure BDA0003553297960000061
盐地碱蓬叶片提取物对欧洲亚硝化单胞菌的作用效果如图2所示，其中 绿色表型的亚硝化抑制率可达70％，红色表型的亚硝化抑制率可达33％。
实施例2
盐地碱蓬叶片粉末在土壤中的应用
(1)盐地碱蓬叶片粉末的制备：对于红色叶片和绿色叶片两种表型的 盐地碱蓬，用超纯水反复冲洗干净冷冻干燥除去多余水分，并研磨成粉末。
(2)盐碱土采集于山东省东营市，取地表0～20cm的土壤，并将其风 干研磨过2mm筛，取10g土于200mL塑料培养瓶中，每克风干土加入 10mg盐地碱蓬叶片固体粉末，用封口膜封住培养瓶瓶口，置于25℃的 培养箱中黑暗培养。每10g土需加入3.0mL水以保持60％土壤孔隙含水量， 每天对培养体系补充一次水分，在培养7d后，对其进行破坏性取样，测定土壤中NO3 --N，通过NO3 --N含量表征硝化作用的强度，根据如下公式计 算盐地碱蓬叶片提取物对土壤的硝化抑制率：
Figure BDA0003553297960000071
盐地碱蓬叶片粉末对土壤的硝化作用效果如图3所示，盐碱土在绿色 和红色盐地碱蓬叶片添加下其NO3 --N含量分别为0.12μg·g-1和0.27μg·g -1，其硝化抑制率分别为82％和60％，且绿色叶片粉末对盐碱土的硝化抑制 效果优于红色叶片粉末。
实施例3
原儿茶醛的剂量对亚硝化细菌生长情况的影响
(1)标准品：原儿茶醛标准品，购买于Sigma-Aldrich(USA)公司，常 温下称取固体粉末溶解于超纯水中。
(2)微生物菌株：欧洲亚硝化单胞菌Nitrosomonas europaea(ATCC 19718)购于美国The Global Bioresource Center。
(3)微生物的培养：以欧洲亚硝化单胞菌N.europaea作为供试菌株， 购于美国模式菌种收集中心(The Global Bioresource Center)。该菌株是研 究氨氧化过程的模式菌，前人筛选BNI也多采用此菌种。菌株活化和培养采 用该公司推荐的ATCC培养基。培养基成分如下(1.5L)：(NH4)2SO4 4.95g, KH2PO4 8.82g,NaH2PO4 0.7g,Na2CO3 0.6g,MgSO4·7H2O0.27g,CuSO4· 5H2O 0.2mg,CaCl2·2H2O 0.04g,FeSO4(30mM in 50mM EDTA at pH 7.0)0.5mL，pH 7.8～8.0，在121℃高温灭菌。吸取200μL无菌水将菌株冻 干粉悬浮，加入到20mLATCC培养基中，在30℃、180rpm、黑暗条件下 振荡培养,当NO2 -含量达到200mg·L-1时(大约7d)可进行转接。培养3～4 代后亚硝化细菌的生长情况趋于稳定，可以进行后续的试验。
(4)亚硝化活性抑制实验：收集培养7d的N.europaea菌液，10000g 条件下离心10min，用PBS缓冲液洗涤3～5次除去所有残留的NH4 +和NO2 -。 将菌液重新悬浮于新鲜无菌的ATCC培养基中直至OD600≥1.0，其浓缩倍 数约为100倍，另取容量为1.5mL的离心管，依次加入100μL原儿茶醛标准 品溶液(对照加入100μL超纯水)、800μL新鲜无菌ATCC培养基和100μ L的重悬菌液，在28℃黑暗条件下水浴加热9h后，取100μL加入50mL的 比色管中，加入1mL Griess显色剂，摇匀后静置5min左右，用水稀释至50 mL定容，参考国标《大气降水中亚硝酸盐测定N-(1-萘基)-乙二胺光度法》 测定样品中的NO2 -。根据如下公式计算样品的亚硝化抑制率：
Figure BDA0003553297960000081
亚硝化活性抑制实验中原儿茶醛的浓度依次控制在200mg·L-1，400 mg·L-1，600mg·L-1，800mg·L-1，亚硝化抑制率与原儿茶醛(PA)的浓度 的关系图如图4所示。由图4可见，原儿茶醛在200mg·L-1浓度时其硝化 抑制率接近20％，ED80(80％抑制浓度)为580mg·L-1。
实施例4
原儿茶醛在土壤中的应用
(1)标准品：原儿茶醛标准品，购买于Sigma-Aldrich(USA)公司，常温下 称取固体粉末溶解于超纯水中。
(2)褐土、盐碱土和红壤分别采集于河北省保定市、山东省东营市和广 东省茂名市，取地表0～20cm的土壤，并将其风干研磨过2mm筛，取10g土于200 mL塑料培养瓶中，每克风干土加入200μg NH4 +-N((NH4)2SO4)，用封口膜封 住培养瓶瓶口，置于25℃的培养箱中黑暗培养。原儿茶醛的添加浓度分别为 500和1000mg·kg-1，每10g土需加入3.0mL水以保持60％土壤孔隙含水量，每 天对培养体系补充一次水分，在培养14d后，对其进行破坏性取样，测定土壤 中NO3 --N，通过NO3 --N含量表征硝化作用的强度，根据如下公式计算原儿茶醛对土壤的硝化抑制率：
Figure BDA0003553297960000091
河北省保定市的褐土(B)、山东省东营市的盐碱土(D)和广东省茂名市 的红壤(M)为供试土壤，其理化性质如表1所示。
表1三种土壤的基本性质
Figure BDA0003553297960000092
原儿茶醛在土壤中的应用效果如下：对于保定褐土而言，原儿茶醛在500 mg·kg-1和1000mg·kg-1条件下其硝化抑制率分别为57％和70％；对于东营盐碱 土而言，原儿茶醛在500mg·kg-1和1000mg·kg-1条件下其硝化抑制率分别为 67％和95％；对于茂名红壤而言，原儿茶醛在500mg·kg-1和1000mg·kg-1条件下 其硝化抑制率分别为5％和15％。

Claims (10)

1.一种盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑制剂的应用，其特征在于，抑制亚硝化微生物的亚硝化活性，所述盐地碱蓬叶片提取物的有效组分包括原儿茶醛，所述盐地碱蓬叶片提取物的制备方法包括以下步骤：
将盐地碱蓬叶片冷冻干燥，并研磨成粉末。
2.根据权利要求1所述的盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑制剂的应用，其特征在于，抑制欧洲亚硝化单胞菌Nitrosomonas europaea的亚硝化活性。
3.根据权利要求1所述的盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑制剂的应用，其特征在于，适宜pH值为6.0～8.0。
4.根据权利要求1所述的盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑制剂的应用，其特征在于，适用于盐碱土、褐土、红壤。
5.一种权利要求1至4中任一项所述的盐地碱蓬叶片提取物作为硝化抑制剂的应用中所采用的盐地碱蓬叶片提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将盐地碱蓬叶片冷冻干燥，并研磨成粉末；
将盐地碱蓬叶片粉末与水混合振荡后，将待澄清液于室温下静置24h，固液分离，所得液体即为盐地碱蓬叶片提取物。
6.根据权利要求5所述的盐地碱蓬叶片提取物的制备方法，其特征在于，冷冻干燥的工艺参数：冷冻干燥温度为-50℃～-40℃，冷冻时间为24h～48h；研磨的工艺参数：研磨频率为30Hz，研磨时间为1.5min；
振荡的工艺参数：振荡温度为25℃，振荡频率为150rpm，振荡时间为1h。
7.根据权利要求5所述的盐地碱蓬叶片提取物的制备方法，其特征在于，盐地碱蓬叶片粉末与水的重量比为1:10。
8.一种原儿茶醛作为硝化抑制剂的应用，其特征在于，抑制亚硝化微生物的亚硝化活性，原儿茶醛的结构式为：
Figure FDA0003553297950000021
9.根据权利要求8所述的原儿茶醛作为硝化抑制剂的应用，其特征在于，
适宜pH值为6.0～8.0，适用于盐碱土、褐土、红壤。
10.根据权利要求8所述的原儿茶醛作为硝化抑制剂的应用，其特征在于，
所述原儿茶醛的用量为500mg·kg-1～1000mg·kg-1。
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