CN105439782A - 癸二醇作为硝化抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

癸二醇作为硝化抑制剂的应用，本发明化合物能在低剂量下高效抑制亚硝化微生物的活性，减少农田土壤硝化过程造成的氮素损失和环境问题；本发明化合物是脂溶性化合物，化学结构稳定，在土壤和水体中不易流失，能保证应用的稳定性和高效性。本发明提供一类源于植物的“绿色”生物硝化抑制剂，可以解决常规化学合成硝化抑制剂时效短、效果差、易污染的问题，同时为构建高效抑制农田生态系统硝化过程、提高氮素利用率的生物生态技术提供新的方法和思路。

Description

癸二醇作为硝化抑制剂的应用

技术领域

本发明属于硝化抑制剂研究领域，具体涉及癸二醇作为硝化抑制剂的应用。

背景技术

世界范围内的氮肥有90％是以NH₄ ⁺的形式施用的，NH₄ ⁺在土壤中容易被硝化微生物转化为NO₃ ^-，后者不能被土壤吸附，易淋失，由此导致氮素的直接损失，同时还严重污染了地下水和地表水，造成面源污染等环境问题。同时，土壤反硝化微生物在厌氧或部分厌氧条件下通过反硝化作用将NO₃ ^-转变为气态N₂和N₂O，造成土壤氮素的进一步损失，而N₂O是一种温室气体，其增温潜势是CO₂的298倍，重要来源之一即农田生态系统中氮素的硝化、反硝化过程。

农业生态系统中平均氮肥利用率在30％左右，70％的氮肥损失主要来自上述硝化、反硝化过程，这些氮素损失均与硝化作用有直接或间接联系。一些氮肥管理措施与缓控释肥的使用在一定程度上减少了硝化作用的氮素损失，但其增加的人力、农资成本不可忽视，效果也不尽理想。配合氮肥使用硝化抑制剂，有助于减少氮素损失，提高氮素利用率。在诸多人工合成的硝化抑制物质中，仅2-氯-6-三氯甲基吡啶(Nitrapyrin)、双氰胺(DCD)和3,4-二甲基吡唑磷酸盐(DMPP)经过了详尽的大田评估，在一些农田中被投入使用。但包括上述物质在内的人工合成的硝化抑制物质，或多或少具有使用不方便、性能不稳定、价格过高、易造成地下水污染、影响自然生态系统的生物多样性等局限性。

生物硝化抑制剂的研究方兴未艾，与人工化学合成的硝化抑制剂相比，其来源于植物根系分泌物或者提取物，是天然的化合物，对生态环境影响小，从中提取效果良好的生物硝化抑制物质具有显著意义。已有文献报道在腐生臂形草和高粱中存在特定的硝化抑制物质，通过对这些物质的挖掘，不仅有助于研究和理解自然生态系统中一些硝化抑制现象，通过环境调控、育种等手段加强作物的硝化抑制能力和提高氮素利用率，还能对生物硝化抑制物质进行产品开发，研制新型高效的环境友好的硝化抑制剂产品。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供癸二醇作为硝化抑制剂的应用，物质包括1,9-癸二醇等。该类物质通过抑制亚硝化微生物活性来抑制土壤、植物根际的硝化过程，提高氮素利用率，减少硝态氮的淋失，进而减少反硝化过程的氮素损失和温室气体氧化亚氮的排放。本发明的硝化抑制物质是来源于植物的化学结构稳定的脂溶性物质，改善了传统硝化抑制剂具有的易流失、时效短以及可能造成环境污染的问题，提高了硝化抑制效率，节约了相对投入成本。

技术方案：癸二醇在抑制亚硝化微生物的亚硝化活性中的应用。

癸二醇的结构式为：或

所述亚硝化微生物为欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseuropaea)ATCC19718。

一种减少农田氮素损失和提高氮肥利用率的组合物，有效成分为所述的癸二醇。

对19个水稻品种的根系分泌物进行收集、浓缩，利用欧洲亚硝化单胞菌测定其亚硝化抑制活性。对其中具有显著效应的品种进一步筛选，挑选根系分泌物具有显著抑制效应的品种和具有相反效果的品种，对其组分进行GC/MS鉴定。通过两者组分对比，在具有显著抑制效应的水稻品种武运粳7的根系分泌物中，鉴定得到1,9-癸二醇(1,9-decanediol，分子量174.28)，具有显著的亚硝化抑制能力，其80％抑制浓度为90μg·mL^-1。

有益效果：

(1)本发明化合物能在低剂量下高效抑制亚硝化微生物的活性，减少农田土壤硝化过程造成的氮素损失和环境问题；

(2)本发明化合物是脂溶性化合物，化学结构稳定，在土壤和水体中不易流失，能保证应用的稳定性和高效性。

(3)本发明提供一类源于植物的“绿色”生物硝化抑制剂，可以解决常规化学合成硝化抑制剂时效短、效果差、易污染的问题，同时为构建高效抑制农田生态系统硝化过程、提高氮素利用率的生物生态技术提供新的方法和思路。

附图说明

图1为本发明的水稻品种武运粳7根系分泌物组分的GC/MS分析谱图。本发明抑制剂1,9-癸二醇为15.29min出峰的物质。

图2为本发明亚硝化抑制物质1,9-癸二醇的剂量-效应关系(mean±SE,n＝3)；

图3为1,9-癸二醇及其同分异构体(浓度100μg·mL^-1)的亚硝化抑制能力比较(mean±SE,n＝3),不同的小写字母表示组间有显著差异(P<0.05,Duncantest)。

具体实施方式

以下实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例11,9-癸二醇的剂量-效应关系

1.1实验设计

(1)标准品：1,9-癸二醇标准品，定制于药明康德新药开发有限公司(WuXiAppTec)，干冰冷冻过程中(常温下为粘稠状液态物质)称取固体粉末溶解于DMSO中。

(2)微生物菌株：欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseuropaea)(NBRC14298＝ATCC19718)，购于日本技术评价研究所生物资源中心(BiologicalResourceCenter,NITE,Japan)。

(3)微生物培养基：HEPES培养基，1L液体培养基中含(NH₄)₂SO₄2.5g，KH₂PO₄0.5g，HEPES11.92g，NaHCO₃0.5g，MgSO₄·7H₂O100mg，CaCl₂·2H₂O5mg，Fe-EDTA75mg,pH7.8-8.0。

(4)微生物的培养：将欧洲亚硝化单胞菌接种于HEPES培养基中，30℃、200rpm、黑暗条件下摇菌培养(好氧)，每次转接后7-9天进入稳定期。

(5)亚硝化活性抑制实验

收集培养7天的菌液，5000g离心20min，重新悬浮于新鲜无菌的HEPES培养基中直至OD600约为1.0，其浓缩倍数为40～50倍。取1.5mL灭菌离心管，依次加入195μL无菌水、5μL1,9-癸二醇的DMSO溶液(空白则仅加入DMSO)、100μL新鲜无菌HEPES培养基，以及200μL重悬菌液，25℃黑暗水浴培养2小时。随后往该混合体系中加入20μL0.1M烯丙基硫脲(Allylthiourea)以终止亚硝化反应。取反应后的混合液200-400μL加入10mL的比色管中，用去离子水稀释至约5mL，加入1mL对氨基苯磺酸溶液，摇匀后放置2-8min，再加入1mL盐酸N-(1-萘基)-乙二胺溶液，摇匀，用水稀释至10mL定容。以去离子水做参比，在540nm波长处测定吸光值。以同样的方法做NO₂ ^-的标线，借此定量样品体系中生成的NO₂ ^-，通过以下公式计算样品抑制率。该测定方法是改进的Griess法，可参考国标《大气降水中亚硝酸盐测定N-(1-萘基)-乙二胺光度法》。

1.2实验结果

实验结果见图2，1,9-癸二醇在20μg·mL^-1浓度时亚硝化抑制率大于20％，IC₅₀(半抑制浓度)为50μg·mL^-1，ED₈₀(80％抑制浓度)为90μg·mL^-1，150μg·mL^-1时抑制率达95％，其在20μg·mL^-1以上具有良好的抑制效果。

实施例21,9-癸二醇与其他硝化抑制剂的亚硝化抑制能力比较

1.1实验设计

(1)标准品：2-氯-6-三氯甲基吡啶(Nitrapyrin)、双氰胺(DCD)、2-氨基-4-氯-6-甲基嘧啶(AM)、对羟基苯丙酸甲酯、香豆酸甲酯、亚油酸、亚麻酸、亚油酸甲酯，其中香豆酸甲酯购于TCI公司(Tokyo,Japan)，其余试剂均购于Sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO,USA)。上述试剂，除DCD溶于水外，其余均溶于DMSO中。

(2)DCD溶于水，其空白中不加入DMSO，其他实验操作步骤同实施例1。

1.2实验结果

实验结果见表1，1,9-癸二醇的ED₈₀值与合成硝化抑制剂AM、相近，高于双氰胺，低于Nitrapyrin；与生物硝化抑制剂亚油酸、亚麻酸相近，高于亚油酸甲酯，低于对羟基苯丙酸甲酯和香豆酸甲酯。与其他硝化抑制剂相比，1,9-癸二醇具有可观的亚硝化抑制能力。

表1

实施例31,9-癸二醇及其同分异构体的亚硝化抑制能力比较

1.1实验设计

(1)标准品：1,10-癸二醇、1,2-癸二醇购于TCI公司(Tokyo,Japan)，溶于DMSO中。

(2)实验操作步骤同实施例1。

1.2实验结果

实验结果见图3，1,9-癸二醇的同分异构体在100μg·mL^-1浓度下均有较好的亚硝化抑制能力，1,9-癸二醇等中长链饱和醇作为硝化抑制剂，具有良好的应用前景。

Claims (4)

1.癸二醇在抑制亚硝化微生物的亚硝化活性中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于癸二醇的结构式为：

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述亚硝化微生物为欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseuropaea)。

4.一种减少农田氮素损失和提高氮肥利用率的组合物，其特征在于有效成分为权利要求2所述的癸二醇。