CN114560727A - 一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的制备方法和应用 - Google Patents

一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质及其制备方法和应用，该方法包括：以茶麸、磷酸二氢钾、葡萄糖、硫酸铵和水为原料配制培养基；将枯草芽孢杆菌接种至灭菌处理后的LB肉汤培养液中恒温培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；将培养好的枯草芽孢杆菌种子液接种至步骤一中的培养基中，放入28‑35℃的恒温摇床中培养5‑7天，即得到生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质。采用本发明方法制得的有机质不仅提供丰富的营养成分以及氮、磷、钾等微量元素，而且抗菌抗病虫效果显著。该有机质可作为新型多功能有机肥料应用于农作物的生长过程；同时有望成为新型易降解包装材料，替代合成塑料减少污染、增加社会经济效益。

Description

一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及抗菌抗病虫材料技术领域，特别地，涉及一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的制备方法和应用。
背景技术
我国是世界上的农业大国，农业上大概每生产一斤粮食就要消耗一斤化肥；每公顷土地平均施加农药13.4公斤，其中土壤中农药残留量为60-70％。化肥和农药的使用使得土壤土质下降，农业生物存活率降低，农业生态环境遭到破坏。现有的有机肥一般研究为农业作物生长提供充足营养物质，很少有考虑到病虫防治，而农作物在生长期间免不了会受到病虫得干扰。
因此，需要寻找到一种能为农作物生长提高营养又能有抗菌抗病虫效果的材料，为进一步开发生态环境友好的抗菌抗病虫多功能有机肥料提供新的选择，也为抗菌生态友好包装材料开发提供新的思路。
发明内容
本发明目的在于提供一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的制备方法，以解决上述现有技术中有机肥料只是单一的为农作物提供所需的营养物质，而没有考虑到农作物的抗菌抗病虫方面的共性问题。采用本发明方法制得的一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质不仅仅营养成分高，而且有抗菌抗病虫效果，尤其是对植物致害病菌胶胞炭疽菌和灰葡萄胞菌的生长有显著的抑制效果。
为实现上述目的，本发明提供了一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、以茶麸、磷酸二氢钾、葡萄糖、硫酸铵和水为原料配制培养基；
步骤二、将枯草芽孢杆菌接种至灭菌处理后的LB肉汤培养液中恒温培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；
步骤三、将步骤二中培养好的枯草芽孢杆菌种子液接种至步骤一中的培养基中，放入恒温摇床中在28-35℃℃下培养5-7天，即得到生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质。
进一步的，步骤一中，培养基配制时，按重量百分比计包括：茶麸8-14wt％，磷酸二氢钾0.1-0.4wt％，葡萄糖1-5wt％，硫酸铵0.5-2wt％，其余为水。
进一步的，步骤一中，向按比例配制好的培养基加入KOH的稀溶液，调节PH为6.5-8.0。
进一步的，步骤一中，将配置好的培养基入高压灭菌锅中，在110-120℃下灭菌10-30分钟。
进一步的，步骤二中将枯草芽孢杆菌接种至灭菌处理后的LB肉汤培养液中恒温培养，具体为：将甘油冷冻保存的枯草芽孢杆菌接种至灭菌处理后的LB肉汤培养液中，放入28-35℃下的恒温摇床中，在160-180r/min的转速下培养20-28h。
进一步的，步骤三中枯草芽孢杆菌种子液与步骤一中的培养基的质量比为1:10～15。
进一步的，步骤一之前还包括对茶麸进行预处理，具体为：先将茶麸用去离子水和乙醇洗净并干燥，再进行粉碎处理。
本发明还提供了一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质，采用上述的方法制得。
本发明还提供了一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的应用，采用上述的方法制得的一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质用于抗胶胞炭疽菌和灰葡萄胞菌。
本发明还提供了一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的应用，采用上述的方法制得的一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质用于易降解包装材料。
本发明具有以下有益效果：
本发明采用农业废弃物茶麸经过微生物发酵的方法制得了营养丰富和具有良好抗菌性能的肥料，此肥料具有低经济成本，合成简单等优点，不仅减少了植物生长过程中患炭疽病和灰霉病的风险，保障了许多农作物的经济效应；同时也为生态友好型抗菌抗病虫多功能有机肥料的制备方法提供了参考方案。
茶麸，也被称为茶籽饼、茶渣，是油茶榨油后的残渣物。茶麸中含有大量纤维素，木质素，糖类，脂肪，蛋白质等有机物质，由于蛋白质含量较高，常被作为优质有机肥料，广泛应用在农作物及果树栽种中。此外，茶麸作为一种植物源农药，可用于某些病虫害的防治，其浸出液还是良好的农药助剂，可提高杀虫、杀菌效果。茶麸中含有有机碳，氮，磷，钾，钙，镁元素以及其他微量元素。微生物发酵过程中会降解茶麸中的有机物(主要是糖类和脂肪)，使茶麸中氮，磷，钾等元素相对含量增加，同时产生粗蛋白、氨基酸等含氮磷物质，经过微生物发酵之后，茶麸中氮，磷，钾等元素含量提高。茶麸经微生物液体发酵之后茶麸体内含有的茶皂素溶解于发酵液中，茶皂素具有良好的生物活性，对多种害虫都有一定的防护效果，尤其是对植物致害病菌胶胞炭疽菌和灰葡萄胞菌的生长有显著的抑制效果。而胶胞炭疽菌引起植物炭疽病，造成植物起枝枯，叶斑，烂果等。灰葡萄孢菌能引起多种双子叶植物感染灰霉病，导致农作物减产。胶胞炭疽菌和灰葡萄胞菌都会危害许多重要的经济作物，带来巨大的经济损失。本发明采用茶麸发酵后制得的有机质既含有丰富的营养物质成分且其发酵液对植物致害病菌胶胞炭疽菌和灰葡萄胞菌的生长有显著的抑制效果。此外，经过细菌微生物降解茶麸中有机物质，茶麸中的纤维素含量增加，而天然纤维素具有生态环保易降解的优点，因而发酵后的茶麸有望成为新型可降解包装材料的前驱体，减少对合成塑料的依赖、创造社会经济效益。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将对本发明作进一步详细的说明。
具体实施方式
以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
实施例1：
一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)先将茶麸用去离子水和乙醇洗净并干燥，再粉碎得到茶麸粉。配制培养基：茶麸10wt％，磷酸二氢钾0.2wt％，葡萄糖2wt％，硫酸铵1wt％，并调节PH至6.5-8.0，将其放入高压灭菌锅中，在110-120℃下灭菌10-30分钟。
(2)称取2.5g LB肉汤加入三角瓶中，并加入100ml去离子水，配成菌种培养液，再用耐高温封口膜封好三角瓶的口，将其放进高温灭菌锅中，在110-120℃下灭菌10-30分钟，得到灭菌处理后的LB肉汤培养液。
(3)将甘油冷冻保存的枯草芽孢杆菌接种至灭菌处理后的LB肉汤培养液中，放入28-35℃下的恒温摇床中，在160-180r/min的转速下培养20-28h，得到枯草芽孢杆菌种子液。
(4)将步骤(3)培养好的枯草芽孢杆菌种子液接种10ml至步骤(1)中的培养基中，然后将其放入28-35℃下的恒温摇床中，在160-180r/min的转速下培养5天，即得到生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质。其中，整个接种过程在超级净化工作台中进行。枯草芽孢杆菌种子液与步骤一中的培养基的质量比为1:10。
将得到生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质进行离心分离出发酵液和固体。
将得到的固体干燥后进行元素含量测试，把得到的发酵液进行高压灭菌处理。
实施例2：
一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)先将茶麸用去离子水和乙醇洗净并干燥，再粉碎得到茶麸粉。配制培养基：茶麸10wt％，磷酸二氢钾0.2wt％，葡萄糖2wt％，硫酸铵1wt％，并调节PH至6.5-8.0，将其放入高压灭菌锅中，在110-120℃下灭菌10-30分钟。
(2)称取2.5g LB肉汤加入三角瓶中，并加入100ml去离子水，配成菌种培养液，再用耐高温封口膜封好三角瓶的口，将其放进高温灭菌锅中，在110-120℃下灭菌10-30分钟，得到灭菌处理后的LB肉汤培养液。
(3)将甘油冷冻保存的枯草芽孢杆菌接种至灭菌处理后的LB肉汤培养液中，放入28-35℃下的恒温摇床中，在160-180r/min的转速下培养20-28h，得到枯草芽孢杆菌种子液。
(4)将步骤(3)培养好的枯草芽孢杆菌种子液接种10ml至步骤(1)中的培养基中，然后将其放入28-35℃下的恒温摇床中，在160-180r/min的转速下培养7天，即得到生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质。其中，整个接种过程在超级净化工作台中进行。枯草芽孢杆菌种子液与步骤一中的培养基的质量比为1:10。
将得到生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质进行离心分离出发酵液和固体。
将得到的固体干燥后测元素含量，把得到的发酵液进行高压灭菌处理。
实施例3：
一种生态友好型抗菌抗病虫多功能有机肥料的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)先将茶麸用去离子水和乙醇洗净并干燥，再粉碎得到茶麸粉。配制培养基：茶麸8wt％，磷酸二氢钾0.4wt％，葡萄糖1wt％，硫酸铵0.5wt％，并调节PH至7.0-7.8，将其放入高压灭菌锅中，在110-120℃下灭菌10-30分钟。
(2)称取2.5g LB肉汤加入三角瓶中，并加入100ml去离子水，配成菌种培养液，再用耐高温封口膜封好三角瓶的口，将其放进高温灭菌锅中，在110-120℃下灭菌10-30分钟，得到灭菌处理后的LB肉汤培养液。
(3)将甘油冷冻保存的枯草芽孢杆菌接种至灭菌处理后的LB肉汤培养液中，放入30-35℃下的恒温摇床中，在160-180r/min的转速下培养20-28h，得到枯草芽孢杆菌种子液。
(4)将步骤(3)培养好的枯草芽孢杆菌种子液接种10ml至步骤(1)中的培养基中，然后将其放入30-35℃下的恒温摇床中，在160-180r/min的转速下培养6天，即得到生态友好型抗菌抗病虫多功能有机肥料。其中，整个接种过程在超级净化工作台中进行。枯草芽孢杆菌种子液与步骤一中的培养基的质量比为1:12。
将得到生态友好型抗菌抗病虫多功能有机肥料进行离心分离出发酵液和固体。
将得到的固体干燥后进行元素含量测试，把得到的发酵液进行高压灭菌处理。
实施例4：
一种生态友好型抗菌抗病虫多功能有机肥料的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)先将茶麸用去离子水和乙醇洗净并干燥，再粉碎得到茶麸粉。配制培养基：茶麸14wt％，磷酸二氢钾0.1wt％，葡萄糖5wt％，硫酸铵2wt％，并调节PH至7.0-7.8，将其放入高压灭菌锅中，在110-120℃下灭菌10-30分钟。
(2)称取2.5g LB肉汤加入三角瓶中，并加入100ml去离子水，配成菌种培养液，再用耐高温封口膜封好三角瓶的口，将其放进高温灭菌锅中，在110-120℃下灭菌10-30分钟，得到灭菌处理后的LB肉汤培养液。
(3)将甘油冷冻保存的枯草芽孢杆菌接种至灭菌处理后的LB肉汤培养液中，放入30-35℃下的恒温摇床中，在160-180r/min的转速下培养20-28h，得到枯草芽孢杆菌种子液。
(4)将步骤(3)培养好的枯草芽孢杆菌种子液接种10ml至步骤(1)中的培养基中，然后将其放入30-35℃下的恒温摇床中，在160-180r/min的转速下培养7天，即得到生态友好型抗菌抗病虫多功能有机肥料。其中，整个接种过程在超级净化工作台中进行。
将得到生态友好型抗菌抗病虫多功能有机肥料进行离心分离出发酵液和固体。
将得到的固体干燥后测元素含量，把得到的发酵液进行高压灭菌处理。枯草芽孢杆菌种子液与步骤一中的培养基的质量比为1:15。
对比例1：(未发酵处理)
对比例1与实施例1的区别在于：对比例1仅采用步骤(1)处理，未进行后续的发酵处理。
对比例2：(发酵3天处理)
具体包括以下步骤：
(1)先将茶麸用去离子水和乙醇洗净并干燥，再粉碎得到茶麸粉。配制培养基：茶麸10wt％，磷酸二氢钾0.2wt％，葡萄糖2wt％，硫酸铵1wt％，并调节PH至6.5-8.0，将其放入高压灭菌锅中，在110-120℃下灭菌10-30分钟。
(2)称取2.5g LB肉汤加入三角瓶中，并加入100ml去离子水，配成菌种培养液，再用耐高温封口膜封好三角瓶的口，将其放进高温灭菌锅中，在110-120℃下灭菌10-30分钟，得到灭菌处理后的LB肉汤培养液。
(3)将甘油冷冻保存的枯草芽孢杆菌接种至灭菌处理后的LB肉汤培养液中，放入28-35℃下的恒温摇床中，在160-180r/min的转速下培养20-28h，得到枯草芽孢杆菌种子液。
(4)将步骤(3)培养好的枯草芽孢杆菌种子液接种10ml至步骤(1)中的培养基中，然后将其放入28-35℃下的恒温摇床中，在160-180r/min的转速下培养5天，即得到生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质。其中，整个接种过程在超级净化工作台中进行。枯草芽孢杆菌种子液与步骤一中的培养基的质量比为1:10。
将得到生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质进行离心分离出发酵液和固体。
将得到的固体干燥后进行元素含量测试，把得到的发酵液进行高压灭菌处理。
对比例3：(枯草芽孢杆菌种子液与步骤一中的培养基的质量比为1:25)
具体包括以下步骤：
(1)先将茶麸用去离子水和乙醇洗净并干燥，再粉碎得到茶麸粉。配制培养基：茶麸10wt％，磷酸二氢钾0.2wt％，葡萄糖2wt％，硫酸铵1wt％，并调节PH至6.5-8.0，将其放入高压灭菌锅中，在110-120℃下灭菌10-30分钟。
(2)称取2.5g LB肉汤加入三角瓶中，并加入100ml去离子水，配成菌种培养液，再用耐高温封口膜封好三角瓶的口，将其放进高温灭菌锅中，在110-120℃下灭菌10-30分钟，得到灭菌处理后的LB肉汤培养液。
(3)将甘油冷冻保存的枯草芽孢杆菌接种至灭菌处理后的LB肉汤培养液中，放入28-35℃下的恒温摇床中，在160-180r/min的转速下培养20-28h，得到枯草芽孢杆菌种子液。
(4)将步骤(3)培养好的枯草芽孢杆菌种子液接种10ml至步骤(1)中的培养基中，然后将其放入28-35℃下的恒温摇床中，在160-180r/min的转速下培养5天，即得到生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质。其中，整个接种过程在超级净化工作台中进行。枯草芽孢杆菌种子液与步骤一中的培养基的质量比为1:25。
将得到生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质进行离心分离出发酵液和固体。
将得到的固体干燥后进行元素含量测试，把得到的发酵液进行高压灭菌处理。
性能测试一：
将实施例1、实施例2以及对比例1-3中得到的固体干燥后进行元素含量测试，测试结果如表1所示：
表1元素含量数据：
Figure BDA0003599321510000071
由表1元素分析测试结果可知，发酵后的茶麸氮，钾，磷元素含量都有提升。对比例1即未经过发酵的茶麸氮含量0.37％，对比例2发酵3天氮含量为1.5％，对比例3中氮含量为1.20％。实施例1发酵5天和实施例2发酵7天的氮含量分别提升至2.84％和2.89％。同时对比例1中未经过发酵的茶麸磷，钾含量为0.56％和0.73％，对比例2发酵3天磷钾含量分别为0.89％和0.95％，对比例3中磷钾含量分别为0.72％和0.82％。实施例1中发酵5天增加到1.66％和1.25％，实施例2中发酵7天增加到1.71％和1.32。经微生物菌发酵后氮磷钾元素含量增加，是由于茶麸中本身含有一定量的有机碳，氮，磷，钾，钙，镁元素以及其他微量元素(对比例1所示)，而微生物发酵过程中会降解茶麸中的有机物(主要是糖类和脂肪)，使茶麸中氮，磷，钾等元素相对含量增加，同时产生粗蛋白、氨基酸等含氮磷物质，经过微生物发酵之后，茶麸中氮，磷，钾等元素含量提高。通过对比对比例2与实施例1-2可知，发酵5-7天元素含量增加较为明显，发酵3天元素含量稍有增加，说明发酵时间太短，微生物菌发酵不完全，发酵效果差。实施例1发酵5天与实施例2发酵7天相比，元素含量稍有增加但相差不大，说明发酵5-7天微生物菌发酵完全，发酵效果达到最佳。通过分析对比例3和实施例1的数据可知，枯草芽孢杆菌种子液与步骤一中的培养基的质量比过低时，由于微生物菌落的数量过少，不利于发酵过程，导致元素含量增加不明显，发酵效果差。
性能测试二(抑菌率测试)：
利用含药平板培养及抑菌圈测量法，测定实施例1和实施例2制得的发酵液对菌丝生长的抑制率。具体的：将胶孢炭疽菌/灰葡萄胞菌用PDA培养基于25℃下培养4天后备用(菌种活化)。将发酵液加入到PDA培养基中配成含1倍，2倍发酵液的带药培养基，混合均匀后铺板，待静置凝固。
从上述活化培养好的菌落边缘取直径为2-3mm的菌丝块，置于含设定发酵液浓度的PDA平板中央，菌丝面朝下，每个处理为3个平皿，试验重复3次。在25℃下培养4d后用十字交叉法测定菌落直径。
胶孢炭疽菌/灰葡萄胞菌用PDA培养基于25℃下培养4天后备用(菌种活化)，以纯PDA平板作为空白对照(CK)，在25℃下培养4d后用十字交叉法测定菌落直径。
计算抑菌率，其计算公式为：
抑菌率(％)＝[(CK直径-处理直径)/CK直径]×100％
试验1：
利用含药平板培养及抑菌圈测量法，测定发酵液对菌丝生长的抑制率。将胶孢炭疽菌用PDA培养基于25℃下培养4天后备用(菌种活化)。将实施例1制得的发酵液加入到PDA培养基中配成含1倍发酵液的带药培养基，混合均匀后铺板，待静置凝固。
从上述活化培养好的菌落边缘取直径为2-3mm的菌丝块，置于含设定发酵液浓度的PDA平板中央，菌丝面朝下，每个处理为3个平皿，试验重复3次。在25℃下培养4d后用十字交叉法测定菌落直径。
试验2：
利用含药平板培养及抑菌圈测量法，测定发酵液对菌丝生长的抑制率。将胶孢炭疽菌用PDA培养基于25℃下培养4天后备用(菌种活化)。将实施例1制得的发酵液加入到PDA培养基中配成含2倍发酵液的带药培养基，混合均匀后铺板，待静置凝固。
从上述活化培养好的菌落边缘取直径为2-3mm的菌丝块，置于含设定发酵液浓度的PDA平板中央，菌丝面朝下，每个处理为3个平皿，试验重复3次。在25℃下培养4d后用十字交叉法测定菌落直径。
空白对比1：
利用含药平板培养及抑菌圈测量法，将胶孢炭疽菌接种至PDA培养基于25℃下培养4天后备用(菌种活化)。后以纯PDA平板作为空白对照(CK)，在25℃下培养4d后用十字交叉法测定菌落直径。
试验3：
利用含药平板培养及抑菌圈测量法，测定发酵液对菌丝生长的抑制率。将胶孢炭疽菌用PDA培养基于25℃下培养4天后备用(菌种活化)。将实施例2制得的发酵液加入到PDA培养基中配成含1倍发酵液的带药培养基，混合均匀后铺板，待静置凝固。
从上述活化培养好的菌落边缘取直径为2-3mm的菌丝块，置于含设定发酵液浓度的PDA平板中央，菌丝面朝下，每个处理为3个平皿，试验重复3次。在25℃下培养4d后用十字交叉法测定菌落直径。
试验4：
利用含药平板培养及抑菌圈测量法，测定发酵液对菌丝生长的抑制率。将胶孢炭疽菌用PDA培养基于25℃下培养4天后备用(菌种活化)。将实施例2制得的发酵液加入到PDA培养基中配成含2倍发酵液的带药培养基，混合均匀后铺板，待静置凝固。
从上述活化培养好的菌落边缘取直径为2-3mm的菌丝块，置于含设定发酵液浓度的PDA平板中央，菌丝面朝下，每个处理为3个平皿，试验重复3次。在25℃下培养4d后用十字交叉法测定菌落直径。
空白对照2：
利用含药平板培养及抑菌圈测量法，将胶孢炭疽菌接种至PDA培养基于25℃下培养4天后备用(菌种活化)。后以纯PDA平板作为空白对照(CK)，在25℃下培养4d后用十字交叉法测定菌落直径。
试验5：
利用含药平板培养及抑菌圈测量法，测定发酵液对菌丝生长的抑制率。将灰葡萄孢菌用PDA培养基于25℃下培养4天后备用(菌种活化)。将实施例1制得的发酵液加入到PDA培养基中配成含1倍发酵液的带药培养基，混合均匀后铺板，待静置凝固。
从上述活化培养好的菌落边缘取直径为2-3mm的菌丝块，置于含设定发酵液浓度的PDA平板中央，菌丝面朝下，每个处理为3个平皿，试验重复3次。在25℃下培养4d后用十字交叉法测定菌落直径。
试验6：
利用含药平板培养及抑菌圈测量法，测定发酵液对菌丝生长的抑制率。将灰葡萄孢菌用PDA培养基于25℃下培养4天后备用(菌种活化)。将实施例1制得的发酵液加入到PDA培养基中配成含2倍发酵液的带药培养基，混合均匀后铺板，待静置凝固。
从上述活化培养好的菌落边缘取直径为2-3mm的菌丝块，置于含设定发酵液浓度的PDA平板中央，菌丝面朝下，每个处理为3个平皿，试验重复3次。在25℃下培养4d后用十字交叉法测定菌落直径。
空白对照3：
利用含药平板培养及抑菌圈测量法，将灰葡萄胞菌接种至PDA培养基于25℃下培养4天后备用(菌种活化)。后以纯PDA平板作为空白对照(CK)，在25℃下培养4d后用十字交叉法测定菌落直径.
试验7：
利用含药平板培养及抑菌圈测量法，测定发酵液对菌丝生长的抑制率。将灰葡萄孢菌用PDA培养基于25℃下培养4天后备用(菌种活化)。将发酵液加入到PDA培养基中配成含1倍发酵液的带药培养基，混合均匀后铺板，待静置凝固。
从上述活化培养好的菌落边缘取直径为2-3mm的菌丝块，置于含设定发酵液浓度的PDA平板中央，菌丝面朝下，每个处理为3个平皿，试验重复3次。在25℃下培养4d后用十字交叉法测定菌落直径。
试验8：
利用含药平板培养及抑菌圈测量法，测定发酵液对菌丝生长的抑制率。将灰葡萄孢菌用PDA培养基于25℃下培养4天后备用(菌种活化)。将发酵液加入到PDA培养基中配成含2倍发酵液的带药培养基，混合均匀后铺板，待静置凝固。
从上述活化培养好的菌落边缘取直径为2-3mm的菌丝块，置于含设定发酵液浓度的PDA平板中央，菌丝面朝下，每个处理为3个平皿，试验重复3次。在25℃下培养4d后用十字交叉法测定菌落直径。
空白对照4：
利用含药平板培养及抑菌圈测量法，将灰葡萄胞菌接种至PDA培养基于25℃下培养4天后备用(菌种活化)。后以纯PDA平板作为空白对照(CK)，在25℃下培养4d后用十字交叉法测定菌落直径。
试验1-8以及空白对照1-4测得的抑菌率实验结果如表2所示：
表2抑菌率数据：
Figure BDA0003599321510000101
Figure BDA0003599321510000111
注：灰葡萄胞菌和胶胞炭疽菌来自上海一研生物。
由表2可以看出：上述试验1和2中采用实施例1即茶麸发酵5天后，发酵液浓度为1倍时对胶胞炭疽菌的抑菌效果为72.5％，当发酵液浓度为2倍时对胶胞炭疽菌抑菌效果为90.7％。试验3和4，采用实施例2即茶麸发酵7天后，当发酵液浓度为1倍和2倍时对胶胞炭疽菌的抑菌率分别为81％，95％。试验5和6研究了采用实施例1即茶麸发酵5天后，当发酵液浓度为1倍和2倍时对灰葡萄胞菌的抑菌效果，抑菌率分别为73.7％和90％。实施例7和8的研究结果显示茶麸发酵7天后，发酵液浓度为1倍和2倍对灰葡萄孢菌的抑菌率为75％和91.8％。对于胶胞炭疽菌和灰葡萄胞菌的抑制生长效果，茶麸加长发酵时间和增大发酵液的浓度都使抑菌率上升，特别是采用实施例2即在茶麸发酵7天，发酵液浓度为2倍时，对胶胞炭疽菌和灰葡萄胞菌的生长表现出优异的抑制效果，抑菌率分别高达95％和96％。这是因为茶麸经微生物发酵之后产生的微生物发酵液中含有一定量的茶皂素，茶皂素具有良好的生物活性，对多种害虫都有一定的防护效果，尤其是对胶胞炭疽菌和灰葡萄孢菌而且发酵液浓度越高，其茶皂素含量也高，抑菌效果越好。此外，在发酵过程中茶皂素未对枯草芽孢杆菌的微生物活性产生影响。采用实施例3和实施例4得到的实验结果如实施例1和实施例2的实验结果相近，在此不再赘述。
综上可知：本发明采用农业废弃物茶麸经过微生物发酵的方法制得了营养丰富和具有良好抗菌性能的生态友好型易降解可堆肥有机质，此材料具有低经济成本，合成简单等优点，其拥有的抗菌性能可以减少植物生长过程中患炭疽病和灰霉病的风险，保障了许多农作物的经济效应，为生态友好型抗菌抗病虫多功能有机肥料的制备方法提供了参考方案。同时，经过细菌发酵分解有机物质过程，茶麸中的纤维素含量增加，有望成为新型易降解包装材料的前驱体，减少使用合成塑料、创造显著的社会经济效益。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、以茶麸、磷酸二氢钾、葡萄糖、硫酸铵和水为原料配制培养基；
步骤二、将枯草芽孢杆菌接种至灭菌处理后的LB肉汤培养液中恒温培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；
步骤三、将步骤二中培养好的枯草芽孢杆菌种子液接种至步骤一中的培养基中，放入恒温摇床中在28-35℃下培养5-7天，即得到生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质。
2.根据权利要求1所述的一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的制备方法，其特征在于，步骤一中，培养基配制时，按重量百分比计包括：茶麸8-14wt％，磷酸二氢钾0.1-0.4wt％，葡萄糖1-5wt％，硫酸铵0.5-2wt％，其余为水。
3.根据权利要求2所述的一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的制备方法，其特征在于，步骤一中，向按比例配制好的培养基加入KOH的稀溶液，调节PH为6.5-8.0。
4.根据权利要求3所述的一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的制备方法，其特征在于，步骤一中，将配置好的培养基入高压灭菌锅中，在110-120℃下灭菌10-30分钟。
5.根据权利要求1所述的一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的制备方法，其特征在于，步骤二中将枯草芽孢杆菌接种至灭菌处理后的LB肉汤培养液中恒温培养，具体为：将甘油冷冻保存的枯草芽孢杆菌接种至灭菌处理后的LB肉汤培养液中，放入28-35℃下的恒温摇床中，在160-180r/min的转速下培养20-28h。
6.根据权利要求1所述的一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的制备方法，其特征在于，步骤三中枯草芽孢杆菌种子液与步骤一中的培养基的质量比为1:10～15。
7.根据权利要求1所述的一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的制备方法，其特征在于，步骤一之前还包括对茶麸进行预处理，具体为：先将茶麸用去离子水和乙醇洗净并干燥，再进行粉碎处理。
8.一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质，其特征在于，采用如权利要求1-7任一所述的方法制得。
9.一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的应用，其特征在于，采用如权利要求1-7任一所述的方法制得的一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质用于抗胶胞炭疽菌和灰葡萄胞菌。
10.一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质的应用，其特征在于，采用如权利要求1-7任一所述的方法制得的一种生态友好型抗菌抗病虫易降解可堆肥有机质用于易降解包装材料。
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