CN114555836A - 第三方病毒特异性t细胞组合物及其制备和在抗病毒预防中使用的方法 - Google Patents

Abstract

本公开包括用于在受试者中预防病毒感染并且/或者预防潜伏病毒再激活的组合物和方法。该方法涉及预防性地向受试者施用来自第三方供者和/或供者微型库和/或供者库的至少一种抗原特异性T细胞系。所述受试者可以是接受移植(例如，组织、实体器官或骨髓移植)或者需要这种移植或者被免疫抑制或需要免疫抑制疗法的患者。

Description

第三方病毒特异性T细胞组合物及其制备和在抗病毒预防中 使用的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年8月16日提交的美国临时申请第62/887,806号的优先权，该申请通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本公开的实施方案至少涉及细胞生物学、分子生物学、免疫学和医学领域。

技术背景

病毒感染是作为多种病症的治疗选择的同种异体造血干细胞移植(allo-HSCT)后发病率和死亡率的一个严重原因。然而，移植后，移植物抗宿主病(GVHD)、原发性疾病复发和病毒感染仍然是发病率和死亡率的主要原因。与病毒病原体相关的感染包括但不限于CMV、BK病毒(BKV)和腺病毒(AdV)。在大多数同种异体移植受者中检测到病毒感染。尽管抗病毒药物对某些病毒有效，但并不总是有效，这突出了对新型疗法的需求。治疗这些病毒感染的一种策略是采用过继免疫疗法，例如过继T细胞转移。

过继免疫疗法包括将疾病特异性和/或工程化细胞诸如T细胞(例如，抗原特异性T细胞或嵌合抗原受体(CAR)表达T细胞)植入或输注到个体中，目的是识别、靶向和破坏疾病相关细胞。过继免疫疗法已经成为治疗许多疾病和病症的一种有前途的方法，所述疾病和病症包括癌症、移植后淋巴增生性病症、感染性疾病(例如，病毒和其它病原性感染)和自身免疫性疾病。

有两种主要类型的过继免疫疗法。自体免疫疗法涉及从患者中分离、产生和/或扩增细胞，诸如T细胞(例如，抗原特异性T细胞)，并储存患者收获的细胞，用于根据需要再次向同一患者施用。同种异体免疫疗法涉及两种个体：患者和健康的供者。从健康供者中分离出细胞，诸如T细胞(例如，抗原特异性T细胞)，然后进行生产并且/或者扩增并储存，用于向具有基于一些HLA等位基因的匹配(或部分匹配)人白细胞抗原(HLA)类型的患者。HLA也被称为人主要组织相容性复合物(MHC)。通过这种方法，可以从干细胞供者中提取细胞，离体扩增病毒特异性群体，以及最后，将T细胞产物注入干细胞移植受者中，以治疗受者的病毒感染。例如，靶向Adv、EBV、CMV、BK、HHV6的体外扩增的供者来源的病毒特异性T细胞在被过继转移至患有病毒感染的干细胞移植患者时被证明是安全和有效的(Gerdemann等人，2012)。靶向此类病毒的第三方供者来源的病毒特异性T细胞也被证明是安全的，但仅被认为适合于治疗正在进行的病毒感染。这是因为由第三方细胞产生的第三方病毒特异性T细胞和其它细胞疗法被受者免疫系统识别为非自身的，并且预期会被排斥。

诸如Adv、EBV、CMV、BK、HHV6、HSV-1、HSV-2、HHV8、HBV、流感病毒、副流感病毒、HMPV、VZV等病毒感染也是因移植疗法以外的原因(诸如年龄(年轻或年老)、免疫缺陷或利用免疫抑制疗法对某些癌症或自身免疫性疾病的治疗)而免疫受损的患者所关注的问题。本领域需要更好地控制或预防由于病毒感染而在免疫受损的患者中发生的各种发病和死亡的原因的疗法。本公开解决了这个和其它需求。

发明内容

本公开包括用于通过预防性施用第三方同种异体T细胞疗法来预防或控制病毒感染或潜伏病毒再激活的方法。在一些实施方案中，该方法包括向患者预防性施用第一抗原特异性T细胞系，其为多克隆的第三方T细胞系，所述T细胞系包含针对一种或多种病毒抗原的抗原特异性。在一些实施方案中，所述T细胞系包含在2个或多个HLA等位基因上与患者的HLA类型相匹配的HLA类型。在一些实施方案中，预防性施用使得当施用T细胞系时，患者不显示活性病毒感染或潜伏病毒再激活的证据。例如，在一些实施方案中，向患者施用具有对一种或多种病毒特异的T细胞的多克隆第三方T细胞系，其中患者不具有关于所述一种或多种病毒的活性感染，或者其中患者不具有任何活性病毒感染。在一些实施方案中，当施用所述T细胞系时，患者不具有可检测的病毒血症或病毒尿症。

在一些实施方案中，患者比一般人群中的普通人具有更高的感染病毒感染或发生潜伏病毒再激活的风险。例如，在一些实施方案中，病毒感染对患者健康或生命造成的风险比这种感染对一般人群中的普通人造成的风险更大。在一些实施方案中，患者的淋巴细胞绝对计数少于约1200个淋巴细胞/μL血液、少于约1000个淋巴细胞/μL血液、少于约900个淋巴细胞/μL血液、少于约800个淋巴细胞/μL血液、少于约700个淋巴细胞/μL血液、少于约600个淋巴细胞/μL血液或少于约500个淋巴细胞/μL血液。在一些实施方案中，患者缺乏内源性T细胞。在一些实施方案中，患者对AdV、BKV、CMV、EBV、HHV6、HHV8、RSV、流感病毒、副流感病毒(PIV)、人偏肺病毒(hMPV)、SARS-CoV-2和HBV中的任一种或多种呈血清阳性。

在一些实施方案中，患者是免疫受损的。在一些实施方案中，所述患者由于疾病或疾患、由于所述患者为治疗疾病或疾患而接受的治疗或由于年龄而免疫受损。在一些实施方案中，患者计划接受或者已经接受造血干细胞移植(HSCT)、实体器官移植或组织移植。在一些实施方案中，受试者需要HSCT疗法、实体器官移植或组织移植。例如，在一些实施方案中，患者需要或已经进行了肾脏、肝脏、心脏、心脏瓣膜、肺、胰腺、肠、角膜、肌肉骨骼、结缔组织、皮肤、手或面部移植。在一些实施方案中，患者正在接受免疫抑制疗法以防止移植排斥。在一些实施方案中，受试者患有癌症，例如白血病、骨髓瘤或淋巴瘤。在一些实施方案中，受试者患有癌症并且需要HSCT。在一些实施方案中，受试者患有一种或多种非恶性疾病，并且需要HSCT。例如，在一些实施方案中，受试者患有再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征或免疫缺陷综合征。在一些实施方案中，受试者正在接受免疫抑制或化学治疗疗法作为癌症治疗。

在一些实施方案中，患者为治疗疾病或疾患而接受的治疗选自减低强度预处理(reduced intensity conditioning)、清髓性调理(myeloablative conditioning)、非清髓性调理、化学疗法和免疫抑制药物。

在一些实施方案中，患者由于年龄，例如由于年轻或年老而免疫受损。在一些实施方案中，患者小于1岁、小于9个月、小于6个月、小于3个月或小于1个月。在一些实施方案中，患者的年龄超过65岁、超过70岁、超过75岁或超过80岁。

在一些实施方案中，患者患有免疫缺陷疾病。例如，在一些实施方案中，受试者患有原发性免疫缺陷，例如原发性免疫缺陷病(PIDD)。在一些实施方案中，患者患有获得性免疫缺陷疾患。在一些实施方案中，受试者患有人免疫缺陷病毒(HIV)感染，并且/或者受试者患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。

在一些实施方案中，本文提供的通过预防性施用第三方同种异体T细胞疗法来预防或控制病毒感染或潜伏病毒再激活的方法包括预防性施用第一多克隆第三方抗原特异性T细胞，其中向患者多次(例如，2、3、4、5、6或更多次)施用所述T细胞系。例如，在一些实施方案中，在第一次施用后4-12周，经第二次施用向患者施用第一抗原特异性T细胞系。在一些实施方案中，在第一次施用后约4-12周，经第二次施用向患者施用第一抗原特异性T细胞系。在一些实施方案中，每4-12周，例如每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周、每10周、每11周或每12周，向患者施用第一抗原特异性T细胞系。在一些实施方案中，约每4-12周，例如约每4周、约每5周、约每6周、约每7周、约每8周、约每9周、约每10周、约每11周或约每12周，向患者施用第一抗原特异性T细胞系。在一些实施方案中，第一抗原特异性T细胞系的各次施用之间的时间不同。例如，在一些实施方案中，在第一次施用第一抗原特异性T细胞系后，对患者监测T细胞系的持久性并且/或者对患者监测病毒血症和/或病毒尿症，并相应地在随后的施用中施用第一抗原特异性T细胞系。在一些实施方案中，反复向受试者施用第一抗原特异性T细胞系，在受试者处于病毒感染或潜伏病毒再激活的风险和/或高风险期间持续进行，并且/或者直至患者不再免疫受损。

在一些实施方案中，作为多次施用第一抗原特异性T细胞系的替代或补充，向患者施用包含肽或全抗原的组合物，所述肽或全抗原对应于第一抗原特异性T细胞系对于其是特异的抗原。在一些实施方案中，在第一抗原特异性T细胞系后施用所述组合物。在一些实施方案中，在施用第一抗原特异性T细胞系后4至12周，向受试者施用包含所述肽或全抗原的组合物。在一些实施方案中，在施用第一抗原特异性T细胞系后约4至约12周，向受试者施用包含所述肽或全抗原的组合物。在一些实施方案中，在第一抗原特异性T细胞系后多次施用组合物。例如，在一些实施方案中，在施用第一抗原特异性T细胞系后，每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周、每10周、每11周或每12周向受试者施用包含所述肽或全抗原的组合物。在一些实施方案中，在施用第一抗原特异性T细胞系后，约每4周、约每5周、约每6周、约每7周、约每8周、约每9周、约每10周、约每11周或约每12周向受试者施用包含所述肽或全抗原的组合物。在一些实施方案中，施用包含所述肽或全抗原的组合物2、3、4、5、6或更多次。在一些实施方案中，在向受试者施用第一抗原特异性T细胞系后施用包含所述肽或全抗原的组合物，并且反复施用所述组合物，在受试者处于病毒感染或潜伏病毒再激活的风险和/或高风险期间持续进行，并且/或者直至患者不再免疫受损。在一些实施方案中，包含所述肽或全抗原的组合物还包含佐剂。

在一些实施方案中，本文提供的方法还包括向患者施用一种或多种第二抗原特异性T细胞系；或者向患者施用2、3、4、5、6、7、8、9或10种以上的第二抗原特异性T细胞系。在一些实施方案中，同时或依次向患者施用所述第一和第二抗原特异性T细胞系。在一些实施方案中，多次向患者施用所述一种或多种第二抗原特异性T细胞系。例如，在一些实施方案中，每4-12周，例如每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周、每10周、每11周或每12周向患者施用所述一种或多种第二抗原特异性T细胞系。在一些实施方案中，约每4-12周，例如约每4周、约每5周、约每6周、约每7周、约每8周、约每9周、约每10周、约每11周或约每12周，向患者施用所述一种或多种第二抗原特异性T细胞系。在一些实施方案中，施用所述一种或多种第二抗原特异性T细胞系，直至患者不再免疫受损。在一些实施方案中，所述第二抗原特异性T细胞系包含与所述第一抗原特异性T细胞系相同的抗原特异性，但产生自不同的供者。在一些实施方案中，所述第二抗原特异性T细胞系与所述第一抗原特异性T细胞系包含一些相同的抗原特异性。在一些实施方案中，第二抗原特异性T细胞系与所述第一抗原特异性T细胞系包含不同的抗原特异性。在一些实施方案中，在患者与第一抗原特异性T细胞系和/或任何第二抗原特异性T细胞系之间匹配的所述2个或更多个HLA等位基因包括至少2个HLA I类等位基因；至少2个HLA II类等位基因；或至少1个HLA I类等位基因和至少1个HLA II类等位基因。在一些实施方案中，所述HLA类型是HLA-A、HLA-B、HLA-DR和/或HLA-DQ。

在一些实施方案中，所述第三方VST未曾被遗传修饰。在一些实施方案中，所述第三方VST未被修饰以减少被宿主免疫细胞识别和排斥。例如，在一些实施方案中，所述第三方VST未被修饰以从VST细胞表面去除HLA和/或TCR分子。

在一些实施方案中，本公开提供了通过预防性施用第三方同种异体T细胞疗法来预防或控制病毒感染或潜伏病毒再激活的方法，其包括预防性施用第一多克隆第三方抗原特异性T细胞，其中所述病毒感染来自选自以下病毒的病毒：EBV、CMV、腺病毒、BK、JC病毒、HHV6、RSV、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、冠状病毒(例如，SARS-CoV-2)、LCMV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、人偏肺病毒、细小病毒B、轮状病毒、默克尔细胞病毒、单纯疱疹病毒、HPV、HIV、HTLV1、HHV8以及西尼罗病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒。在一些实施方案中，所述第一和/或第二抗原特异性T细胞系包含针对来自单一病毒的至少一种抗原或其部分的抗原特异性。在一些实施方案中，所述单一病毒选自EBV、CMV、腺病毒、BK、JC病毒、HHV6、RSV、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、冠状病毒、LCMV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、人偏肺病毒、细小病毒B、轮状病毒、默克尔细胞病毒、单纯疱疹病毒、HPV、HIV、HTLV1、HHV8以及西尼罗病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒。在一些特定的实施方案中，所述单一病毒是HBV或HHV8。在一些实施方案中，所述第一抗原特异性T细胞系包含针对来自该单一病毒的两种或多种抗原或其部分的特异性。

在一些实施方案中，本发明提供了通过预防性施用第三方同种异体T细胞疗法来预防或控制病毒感染或潜伏病毒再激活的方法，其包括预防性施用第一多克隆第三方抗原特异性T细胞，其中所述第一抗原特异性T细胞系包含针对来自1-10种不同病毒的至少一种抗原或其部分的抗原特异性。在一些实施方案中，所述第一抗原特异性T细胞系包含针对来自至少两种不同病毒的每一种的2-5种抗原或来自至少两种不同病毒的每一种的2-5种抗原的至少一部分的抗原特异性。在一些实施方案中，所述第二抗原特异性T细胞系包含针对来自1-10种不同病毒的至少一种抗原或其部分的抗原特异性。在一些实施方案中，所述第二抗原特异性T细胞系包含针对来自至少两种不同病毒的每一种的2-5种抗原或来自至少两种不同病毒的每一种的2-5种抗原的至少一部分的抗原特异性。

在一些实施方案中，所述抗原是来自选自下述的病毒的病毒抗原：EBV、CMV、腺病毒、BK、JC病毒、HHV6、RSV、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、冠状病毒、LCMV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、人偏肺病毒(HMPV)、细小病毒B、轮状病毒、默克尔细胞病毒、单纯疱疹病毒、HPV、HIV、HTLV1、HHV8、西尼罗病毒、寨卡病毒和埃博拉病毒。在一些实施方案中，所述第一和/或第二抗原特异性T细胞包含针对来自以下病毒的每种病毒的至少一种抗原的特异性：RSV、流感病毒、副流感病毒和HMPV。在一些实施方案中，所述流感病毒抗原选自甲型流感病毒抗原NP1、MP1及其组合；所述RSV抗原选自N、F及其组合；所述hMPV抗原选自F、N、M2-1、M及其组合；以及所述PIV抗原选自M、HN、N、F及其组合。

在一些实施方案中，所述第一和/或第二抗原特异性T细胞包含针对来自以下病毒的每种病毒的至少一种抗原的特异性：EBV、CMV、腺病毒、BK、HHV6。在一些实施方案中，EBV抗原选自LMP2、EBNA1、BZLF1及其组合；CMV抗原选自IE1、pp65及其组合；腺病毒抗原选自六邻体、五邻体及其组合；BK病毒抗原选自VP1、大T及其组合；以及HHV6抗原选自U90、U11、U14及其组合。

在一些实施方案中，所述第一和/或第二抗原特异性T细胞包含针对来自HBV的至少一种抗原的特异性。在一些实施方案中，来自HHV8的抗原选自LANA-1(ORF3)；LANA-2(vIRF3,K10.5)；vCYC(ORF72)；RTA(ORF50)；vFLIP(ORF71)；Kaposin(ORF12,K12)；gB(ORF8)；MIR1(K3)；SSB(ORF6)；TS(ORF70)及其组合。

在一些实施方案中，第一和/或第二抗原特异性T细胞包含针对来自HHV8的至少一种抗原的特异性。在一些实施方案中，所述来自HBV的抗原选自HBV核心抗原、HBV表面抗原以及HBV核心抗原与HBV表面抗原的组合。

在一些实施方案中，于本文提供的方法的抗原特异性T细胞是通过在所述抗原或其部分存在的情况下，培养来自合适供者的单核细胞而产生的，所述合适供者具有在2个或更多个HLA等位基因上与患者的HLA类型相匹配的HLA类型。在一些实施方案中，所述抗原特异性T细胞通过在跨越所述抗原或其部分的肽混合物(pepmix)存在的情况下培养来自合适供者的单核细胞而产生，所述供者具有在2个或更多个HLA等位基因上与患者的HLA类型相匹配的HLA类型。在一些实施方案中，培养是在IL4和IL7存在的情况下进行的。在一些实施方案中，所述肽混合物包含15聚体肽。在一些实施方案中，所述肽混合物中跨越所述抗原的肽在序列上重叠11个氨基酸。在一些实施方案中，本文提供的用于本文提供的方法的抗原特异性T细胞是通过在所述抗原或其部分存在的情况下，培养来自合适供者的外周血单核细胞(PBMC)而产生的，所述合适供者具有在2个或更多个HLA等位基因上与患者的HLA类型相匹配的HLA类型。在一些实施方案中，所述抗原特异性T细胞通过在跨越所述抗原或其部分的肽混合物存在的情况下培养来自合适供者的PBMC而产生，所述供者具有在2个或更多个HLA等位基因上与患者的HLA类型相匹配的HLA类型。在一些实施方案中，培养是在IL4和IL7存在的情况下进行的。在一些实施方案中，所述肽混合物包含15聚体肽。在一些实施方案中，肽混合物中跨越抗原的肽在序列上重叠11个氨基酸。在一些实施方案中，本公开提供了通过预防性施用第三方同种异体T细胞疗法来预防或控制病毒感染或潜伏病毒再激活的方法，其包括预防性施用第一多克隆第三方抗原特异性T细胞和任选地一种或多种第二多克隆第三方抗原特异性T细胞系，其中所述第一T细胞系和/或一种或多种每个第二T细胞系在体内持续至少约4周、至少约6周、至少约8周、至少约10周或至少约12周。在一些实施方案中，所述第一T细胞系和/或一种或多种每种第二T细胞系在体内持续至少约4周、至少约6周、至少约8周、至少约10周或至少约12周，而患者没有任何活动性感染。例如，在一些实施方案中，第一T细胞系和/或一种或多种第二T细胞系在体内持续4周、6周、8周、10周、12周或超过12周。在一些实施方案中，第一T细胞系和/或一种或多种第二T细胞系在体内持续4周、6周、8周、10周、12周或超过12周，而患者中没有任何活动性感染。

附图说明

以下附图构成了本说明书的一部分，并且被包括进来以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅，结合本文给出的说明书实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1是显示抗原特异性T细胞系的一般生产概念的示意图。

图2是生产抗原特异性T细胞系的流程图。

图3A-图3D。产生的CMVST细胞系的特征和与筛选的受试者的匹配程度。(3A)基于使用台盼蓝拒染法的细胞计数，在20天的时期内实现了CMVST的T细胞扩增。(n＝8)。(3B)在冷冻保存当天扩增的CMVST细胞系的表型(平均值±SEM，n＝8)和(3C)抗原特异性T细胞的频率，如用跨IE1和pp65抗原的肽混合物过夜刺激CMVST后通过IFN-γ ELISpot测定法所测定的。结果报告为每2xl0⁵个铺板的VST的斑点形成细胞(SFC)。具有2:30 SFC/2xl0⁵的总数的CMVST系被视为阳性。(n＝8)。(3D)经鉴定用于临床应用的CMVST细胞系的相匹配的HLA抗原的数目(总共8个)与筛选的患者的受者HLA(n＝29)。

图4。感染了巨细胞病毒的个体患者的治疗结果。CMVST输注前2周(最接近第-2周的病毒载量水平)、即将输注时(前(pre))和输注后(后)(第2周、第4周和第6周)患者血浆CMV病毒载量(IU/mL)的描述。箭头表示输注时间点。

图5A-图5B。体内巨细胞病毒特异性T细胞的频率。(5A)输注前(前)和输注后(后)外周血中CMVST的频率，如在用IE1和pp65病毒肽混合物刺激过夜后通过IFN-γELISpot测定测量的。结果表示为每5x10⁵个输入细胞的斑点形成细胞(SFC)(平均值±SEM，n＝10)。(5B)个体患者中输注的CMVST的持久性。用对CMVST细胞系专用的或受体与CMVST系之间共享的HLA抗原具有限制性的表位特异性CMV肽刺激后，通过IFN-γELISpot测定法测量的外周血中T细胞的频率。

图6显示了在VST输注后2周和4周，针对HLA-A2(CMV特异性的)、DR13(仅第三方VST)和DR3(仅患者)的背景中存在的肽的免疫反应的相对存在。

图7显示了在输注VST以治疗患者的BKV感染后，与BK特异性T细胞扩增(条块)相对应的BKV尿病毒载量(虚线)的降低。

图8显示了VST输注后2周时CMV的再激活(虚线；尿病毒载量)、CMV特异性第三方VST的扩增(条块)和随后到第12周病毒载量的消退。

图9A-图9E显示接受其它病毒的治疗的患者中持续存在的第三方VST的检测。图9A显示，在接受BK治疗的患者中，在VST输注后至少3周内可检测到EBV和/或HHV6特异性细胞。图9B显示，在接受BK治疗的第二名患者中，CMV特异性T细胞在1周后扩增，并在VST输注后持续至少4周。图9C显示在接受AdV治疗的患者中，CMV特异性T细胞在VST输注后至少3周是可检测的。图9D显示对于另一位接受AdV治疗的患者，CMV特异性T细胞在2周后扩增，并且在VST输注后至少4周是可检测的。图9E显示在接受BK治疗的患者中，CMV-特异性T细胞扩增，并且在VST输注后至少6周是可检测的。

图10是免疫受损个体中由VST T细胞介导的预防性保护的示意性描述。

具体实施方式

本发明的细节在以下伴随的描述中阐述。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但是现在描述说明性的方法和材料。根据说明书和权利要求书，本发明的其它特征、目的和有利方面将变得显而易见。在说明书和所附权利要求中，除非上下文另有明确规定，否则单数形式也包括复数形式。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本说明书中引用的所有专利和出版物均通过此用以其整体并入本文。

HSCT是对威胁生命的造血系统恶性肿瘤(包括急性白血病)以及非恶性疾病(包括再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征和免疫缺陷综合征)的一种潜在治愈性疗法。然而，与HSCT相关的预备方案导致免疫系统的细胞以及体液组分的严重不足，使患者易受病毒感染。感染风险和感染综合征的范围因移植类型(同种异体移植的风险较高)；同种异体供者的类型(不相关或不匹配的供者的风险较高)；调理方案的类型(重度清髓方案的风险更高)；干细胞移植物的类型(脐带血风险较高)；移植操作的类型(T细胞耗竭的风险较高)和免疫抑制药物如抗胸腺细胞球蛋白(ATG)的使用而变化。然而，病毒并发症仍然是同种异体HSCT(同种异体HSCT)受者发病和非复发性死亡的主要原因之一。

HSCT受者的抗病毒预防是稀少的、有毒的，且不能解决潜在的缺陷-即缺乏内源性免疫-因此任何赋予的益处都倾向于暂时，使患者有复发的风险。Cutler等人2005。因此，对安全有效的新型预防策略的需求仍未得到满足。干细胞供者来源的VST的过继转移已被用于尝试为同种异体-HSCT受者提供抗感染的预防性治疗。然而，在本领域中众所周知，对于第三方同种异体VST(即，源自第三方供者而非干细胞供者的VST)，只有治疗活动性病毒感染的方法而不是预防方法是可行的，因为第三方细胞预计会被迅速排斥，并且不能在受者中持续存在。

本发明人惊奇地发现，在缺乏VST对其具有特异性的活动性病毒感染的情况下，第三方同种异体VST在受者中持续存在，并保持扩增的能力。事实上，第三方同种异体VST能够持续数周，然后在感染它们对其具有特异性的病毒时或者所述病毒再激活时立即扩增。因此，本发明提供了通过第三方同种异体T细胞疗法预防或控制病毒感染或潜伏病毒再激活的一种意想不到的高效方法。具体而言，本文提供的方法和组合物为高危患者提供了针对危险病毒感染的即时可用、安全且有效的保护。此类患者群体包括同种异体HSCT的受者以及免疫受损且由于其它原因处于危险病毒感染的高风险中的患者。

一般方法

除非另有说明，否则本发明的实践将采用细胞培养、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术都在本领域的技术范围内。此类技术诸如以下文献中进行了详尽解释：Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第3版(Sambrook等人，2001)Cold Spring Harbor Press；OligonucleotideSynthesis(P.Herdewijn编辑，2004)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)编辑，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of ExperimentalImmunology(D.M.Weir&C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors for MammalianCells(J.M.Miller&M.P.Calos编辑，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑，1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编辑，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑，1991)；ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley和Sons,1999)；Manual of ClinicalLaboratory Immunology(B.Detrick,N.R.Rose和J.D.Folds编辑，2006)；ImmunochemicalProtocols(J.Pound编辑，2003)；Lab Manual in Biochemistry:Immunology andBiotechnology(A.Nigam和A.Ayyagari编辑，2007)；Immunology Methods Manual:TheComprehensive Sourcebook of Techniques(Ivan Lefkovits,ed.,1996)；UsingAntibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane编辑，1988)等等。

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所述的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，以下术语定义如下。

如本文中所用，当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，词语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”的使用可以表示“一个”，但是其也与“一或多个(种)”、“至少一个(种)”和“一个(种)或多于一个(种)”的含义一致。举例来说，“一个/种(an)元件”意味着一个/种元件或不止一个/种元件。本发明的一些实施方案可以由或基本上由本发明的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成。预期本文所述的任何方法或组合物可以相对于本文所述的任何其它方法或组合物来实施。

术语“约”当紧接在数值之前时表示±该数值的0％至10％、±0％至10％、0％至9％、0％至8％、0％至7％、0％至6％、0％至5％、0％至4％、0％至3％、0％至2％、0％至1％、0％至小于1％，或其中的任何其它值或值的范围。例如，“约40”是指±40的0％至10％(即从36至44)。

除非另有说明，否则术语“和/或”在本公开中用于表示“和”或“或”。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包括所陈述的步骤或要素或者步骤或要素的组，但不排除任何其它步骤或要素或者步骤或元素的组。“由...组成”意味着包括并限于短语“由...组成”之后的任何内容。因此，短语“由......组成”表示所列出的要件是必需的或强制性的，并且不存在其它要素。“基本上由......组成”意味着包括在该短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于所列要素的公开中指定的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由......组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的，但是其它要素是任选的，并且可以存在或可以不存在，这取决于它们是否实质上影响所列出的元素的活性或作用。

除非另有说明，否则术语“病症”在本公开中用于表示术语疾病、疾患或病患，并且可与术语疾病、疾患或病患互换使用。

当与治疗剂(例如，本文公开的抗原特异性T细胞产物或细胞系)结合使用时，“有效量”是对于治疗或预防本文所述受试者的疾病或病症有效的量。

术语“例如(e.g.)”在本文中用于表示“例如”，并且将被理解为暗示包括所陈述的步骤或要素或者步骤或要素的组，但不排除任何其它步骤或元素或步骤或元素的组。

“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或者可能不发生，并且该描述包括事件或情况发生的情形和事件或情况不发生的情形。

如本文中所用，术语“病毒抗原”是指本质上是蛋白质并且与病毒颗粒密切相关的抗原。在一些具体实施方案中，病毒抗原是衣壳蛋白。

病毒抗原的一些具体实例至少包括来自选自以下的病毒的抗原：爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒(AdV)、BK病毒(BKV)、JC病毒(JCV)、人疱疹病毒6(HHV6)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、冠状病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、腮腺炎病毒、麻疹病毒、人偏肺病毒(HMPV)、细小病毒B、轮状病毒、默克尔细胞病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、人疱疹病毒8型(HHV8)、西尼罗河病毒、寨卡病毒和埃博拉病毒。

术语“病毒特异性T细胞”或“VST”或“病毒特异性T细胞系”或“VST细胞系”在本文中可互换使用，是指已在受试者体外扩增和/或制造，并且具有针对一种或多种目标病毒的特异性和效力的T细胞系(例如，如本文所述的)。本文提供的VST是第三方VST。在一些实施方案中，VST可以是单克隆的或寡克隆的。在特定的实施方案中，VST是多克隆的。如本文所述，在一些实施方案中，一种或数种病毒抗原被呈递至外周血单核细胞中的天然T细胞或记忆T细胞，并且对所述一种或多种病毒抗原具有特异性的天然CD4+和/或CD8+T细胞群在应答中扩增。例如，从合适的供者获得的PBMC样品中针对EBV的病毒特异性T细胞可以识别(结合)EBV抗原(例如，来自EBV抗原的肽表位，任选地由MHC呈递)，这可以触发对EBV特异的T细胞的扩增。在另一个实例中，从合适的供者获得的PBMC样品中针对BK病毒的病毒特异性T细胞、PBMC样品中针对腺病毒的病毒特异性T细胞可以分别识别并结合BK病毒抗原和腺病毒抗原(例如，分别来自BK病毒抗原和腺病毒抗原的肽表位，任选地由MHC呈递)，这可以触发针对BK病毒的特异性T细胞和针对腺病毒的特异性T细胞的扩增。

如本文中所用，术语“细胞疗法产品”是指在受试者体外扩增和/或制造的细胞系(例如，如本文所述的)。例如，术语“细胞疗法产品”涵盖在培养物中产生的细胞系。所述细胞系可以包含效应细胞或基本上由其组成。所述细胞系可以包含T细胞或基本上由其组成。例如，术语“细胞疗法产品”涵盖在培养物中产生的抗原特异性T细胞系。此类抗原特异性T细胞系在一些情况下包括记忆性T细胞的扩增群体，以及通过刺激原初T细胞产生的T细胞的扩增群体。具体而言，一些实施方案中的术语“细胞疗法产品”包括病毒特异性T细胞系。所述细胞系可以是单克隆或寡克隆的。在一些特定的实施方案中，所述细胞系是多克隆的。在一些实施方案中，此类多克隆细胞系包含具有不同抗原特异性的多种扩增的细胞(例如，抗原特异性T细胞)群。例如，术语“细胞疗法产品”所涵盖的细胞系的一个非限制性实例包括病毒特异性T细胞的多克隆群体，其包含T细胞的多种扩增克隆群体，其中至少两种分别对不同的病毒抗原具有特异性。此类多克隆病毒特异性T细胞在本领域中是已知的，并且公开于包括WO2011028531,WO2013119947,WO2017049291和PCT/US2020/024726(所述专利申请的每一篇通过引用以其整体并入本文)在内的发明人提交的各种专利申请中。

如本文中所用，术语“供者微型库”是指包含多种细胞疗法产品(例如，抗原特异性T细胞系)的细胞库，所述细胞疗法产品共同源自不同的供者池，使得供者微型库包含用于目标患者群体中确定百分比的患者的至少一种良好匹配的细胞疗法产品(例如，抗原特异性T细胞系)。例如，在某些实施方案中，本文所述的供者微型库包括至少一种用于至少95％的目标患者群体(诸如，同种异体造血干细胞移植受者或免疫受损受试者)的完全匹配的细胞疗法产品(例如，抗原特异性T细胞系)。如本文中所用，术语“供者库”是指多个供者微型库。在各种实施方案中，创建几个非冗余的微型库以包含在“供者库”中是有益的，从而确保为每个预期患者提供两种或更多种匹配良好的细胞疗法产品。可以冷冻保存细胞库。冷冻保存方法是本领域已知的，并且可以包括例如将细胞疗法产品(例如，抗原特异性T细胞系)在-70℃储存，例如储存在受控进入区域的气相液氮中。可以制备细胞疗法产品的分开的等分试样，并将其储存在多个经验证的液氮杜瓦瓶中的容器(例如，小瓶)中。容器(例如，小瓶)可以用唯一的识别号来标记，以便检索。

如本文中所用，术语“患者”或“受试者”可互换使用，指任何哺乳动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园、运动和宠物动物，诸如狗、马、猫、牛、绵羊、猪、山羊、大鼠、豚鼠，或非人灵长类动物，诸如猴子、黑猩猩、狒狒或恒河猴。一种优选的哺乳动物是人，包括成人、儿童和老年人。

如本文中所用，术语“潜在供者”是指对本文公开的细胞疗法产品(例如，抗原特异性T细胞)所靶向的所述一种或多种抗原具有血清阳性的个体(例如，健康个体)。在一些实施方案中，所有有资格包括在供者池中的潜在供者都经过预筛选并且/或者被认为对所述一种或多种靶抗原呈血清阳性。

术语“目标患者群体”在本文的实施方案中用于描述多个需要本文所述细胞疗法产品(例如，抗原特异性T细胞产品)的患者(或可互换地“受试者”)。在一些实施方案中，该术语涵盖全世界范围的同种异体HSCT群体。在一些实施方案中，该术语涵盖全美国同种异体HSCT群体。在一些实施方案中，该术语涵盖可在万维网地址bioinformatics.bethematchclinical.org上获得的国家骨髓捐献者计划(National Marrow Donor Program)(NMDP)数据库中包括的所有患者。在一些实施方案中，该术语涵盖所有包含在可在万维网地址：ebmt.org/ebmt-patient-registry上获得的欧洲血液和骨髓移植协会(European Societyfor Blood and Marrow Transplantation)(EBMT)数据库中的患者。在一些实施方案中，该术语涵盖年龄≤16岁的全世界同种异体HSCT儿童群体。在一些实施方案中，该术语包括年龄≤16岁的全美国同种异体HSCT儿童群体。在一些实施方案中，该术语涵盖年龄≤5岁的全世界同种异体HSCT儿童群体。在一些实施方案中，该术语包括年龄≤5岁的全美国同种异体HSCT儿童群体。在一些实施方案中，该术语包括年龄≥65岁的全世界范围的个体同种异体HSCT群体。在一些实施方案中，该术语包括年龄≥65岁的全美国的个体同种异体HSCT群体。

关于受试者的术语“预防”或“防止”是指防止疾病或病症折磨受试者，或者降低受试者中原本会发生的疾病或病症的严重性。预防性治疗涵盖预防。例如，预防可以包括在受试者患有疾病、被病毒感染或经历潜伏病毒感染的再激活之前，向受试者施用本文公开的化合物。在一些实施方案中，预防意指施用预防性治疗将使受试者免于患病，使受试者免于感染病毒，或使潜伏病毒免于再激活。预防性治疗还涵盖控制。例如，控制病毒感染意指在病毒感染之前施用预防性治疗，其中所述预防性治疗在随后的病毒感染引起显著的疾病、发病率或死亡率之前控制和/或解决其。控制病毒感染也意味着预防性治疗的施用先于潜伏病毒的再激活，并且将在再激活的病毒引起显著的疾病、发病率或死亡率之前控制和/或消除其。因此，本文提供的用于“控制”病毒感染的方法意指通过先前施用的、用本文提供的第三方VST进行的预防性治疗来预防或容易清除病毒感染。

除非另有说明，否则如本文中所用,术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等是指逆转、减轻该术语所适用的疾病、病症或疾患或者该疾病、病症或疾患的一种或多种症状、抑制所述疾病、病症或疾患的进程或预防所述疾病、病症或疾患，并且包括施用本文所述的任何组合物、药物组合物或剂型，以预防症状或并发症的发作，或者减轻症状或并发症，或者消除所述疾病、疾患或病症。在某些情况下，治疗是治愈性或改善性的。

本文中对术语“第三方”的提及是指与供者不同的受试者(例如，患者)。因此，例如，向受试者施用“第三方抗原特异性T细胞产物”(例如，第三方VST产品)意指该产品源自供者组织(例如，从供者血液中分离的PBMC)，并且受试者(例如，患者)与供者不是同一受试者。在一些实施方案中，第三方抗原特异性T细胞产品是“现成的”产品，因为其是前瞻性地产生的，并且可以储存(例如，冷冻保存)直至使用。与自体细胞产品或个体化供者细胞产品(即，由向受试者捐献细胞或组织或器官的同一供者或原本为特定水平的HLA匹配选择的供者的细胞产生的细胞产品)相反，此类产品可立即用于有需要的受试者。因此，此类产品是有利的，因为它们可以毫不延迟地给需要立即治疗的患者施用。在各种实施方案中，同种异体细胞疗法(例如，同种异体抗原特异性T细胞疗法)是“第三方”细胞疗法。如本文中所用，术语“VST”指病毒特异性T细胞(virus-specific T cell)。

如本文中所用，术语“施用(administering)”、“施用(administer)”、“施用(administration)”等是指将治疗剂转移、递送、引入或输送至需要用这种剂治疗的受试者的任何方式。此类方式包括但不限于眼内、口服、局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮内、鼻内和皮下施用。

在各种实施方案中，术语“良好匹配”在本文中用于指给定患者和给定细胞疗法产品(例如，抗原特异性T细胞系)以描述患者和细胞疗法产品共享(即匹配)至少两个HLA等位基因时的情况。

根据下面的详细描述中，本发明的其它目的、特征和有利方面将变得显而易见。然而，应该理解的是，详细描述和具体实例虽然指示了本发明的具体实施方案，但仅仅是以说明的方式给出的，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

以下论述针对本发明的各种实施方案。术语“发明”不旨在指代任何特定的实施方案或者以其它方式限制本公开的范围。尽管这些实施方案中的一个或多个可能是优选的，但是所公开的实施方案不应该被解释为或者以其它方式被用来限制包括权利要求在内的本公开的范围。此外，本领域技术人员将理解，以下描述具有广泛的应用，并且任何实施方案的论述仅意味着是该实施方案的实例，而不旨在暗示包括权利要求在内的本公开的范围限于该实施方案。

概述

长期以来，人们已经理解免疫系统的进化目的是识别和消除体内的病原体。免疫系统通过区分“自身”和“非自身”来实现这一点。免疫细胞只对它们识别为非自身的分子、蛋白质、细胞或组织作出反应。非自身涵盖任何外来物质，包括病原体以及在免疫学上与免疫细胞不匹配(HLA不匹配，如上所述的)的生物物质。因此，来自非免疫匹配供者的细胞或组织，如果被输注到它们被免疫细胞识别为非自身的机体内，将被这些免疫细胞排斥(即，攻击、破坏并且/或者清除)。

因此，预期仅与免疫受损的干细胞移植受者部分匹配的细胞疗法产品，例如第三方VST，将仅循环至供者细胞植入并开始在受者中重新集群化f的时间，此时细胞治疗产品(例如VST)将被患者重建的免疫系统排斥。由于预期会排斥第三方VST，它们仅用于治疗活动性病毒感染，诸如新感染或已经重新激活的潜伏病毒感染。也就是说，当在患者中检测到感染或再激活时，可以输注已经扩增并对感染或再激活的病毒具有特异性的第三方VST，以立即产生针对该病毒的反应，在这种情况下，不需要担心对第三方VST的排斥。第三方细胞在能够在任何其它宿主环境中用于任何保护目的之前预期将会受到排斥在本领域中已被充分认识，并且事实上，其它同种异体现成细胞产品(例如，嵌合抗原受体(CAR)T细胞或抗肿瘤T细胞移植物)通常被修饰以减少被宿主免疫细胞识别和排斥(Liu等人，CellResearch(2017)；Kagoya等人2020)。令人惊讶的是，本发明人发现，本文提供的第三方VST可以以预防性方法向患者施用，并且即使没有任何减少被宿主免疫细胞识别的修饰，仍然在循环中保留数周。此外，VST在感染病毒时或施用后数周潜伏病毒再激活时能够扩增。因此，本发明提供了现成的第三方VST产品，该产品既能有效预防或控制病毒感染(包括再激活的潜伏病毒)，又具有立即可用、标准化和可多次再给药的有利方面。

在一些实施方案中，VST在受者中循环至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少13周、至少14周、至少15周、至少16周、至少17周或至少18周，包括其间的所有范围和子范围。在一个实施方案中，VST在受者体内循环至少12周。

本公开包括供者微型库(和包含多个此类供者微型库的供者库)，所述供者微型库包括源自从此类合适的第三方血液供者收集的血液样品的此类细胞疗法产品，以及制备、施用和使用此类细胞疗法产品(包括，例如抗原特异性T细胞系产品，例如VST产品)预防疾病或病症的方法。因此，在各种实施方案中，此类供者微型库包括多种细胞疗法产品(例如，抗原特异性T细胞系)，其源自通过本文公开的方法从供者获得的样品(例如，单核细胞诸如PBMC)，用作预防性过继免疫疗法以预防并且/或者控制病毒感染、疾病和/或病症。

在各种实施方案中，基于患者匹配方法，向需要这种疗法的良好匹配的受试者施用本文公开的供者微型库中包含的一种或多种细胞疗法产品。在一些实施方案中，基于患者匹配方法，向良好匹配的受试者施用包括在供者微型库中的多种此类细胞疗法产品。在一些实施方案中，用于构建本文公开的供者微型库的供者经过血清阳性预筛选并且/或者供者是健康的。本公开提供了前瞻性地产生这些抗原特异性T细胞系，然后将其冷冻保存，使得它们可以作为“现成”产品立即获得，所述产品具有针对一种或多种病毒的可证实的预防效用。

在一些实施方案中，本公开提供了可以在制造过程中无需活病毒或重组DNA技术的存在而制备多克隆VST。在一些实施方案中，扩增和针对病毒特异性富集T细胞群体，结果导致同种异型反应性T细胞的损失。在一些实施方案中，细胞疗法(例如，VST)供者库和供者微型库是HLA充分匹配的，以介导针对病毒感染细胞的抗病毒作用。例如，HLA充分匹配表示至少2个等位基因匹配。在一些实施方案中，所述2个或更多个等位基因包括至少2个HLA I类等位基因。在一些实施方案中，所述2个或更多个等位基因包括至少2个HLA II类等位基因。在一些实施方案中，所述2个或更多个等位基因包括至少1个HLA I类等位基因和至少1个HLA II类等位基因。

在一些实施方案中，构建抗原特异性T细胞系的第一供者微型库的方法包括从获自供者微型库中包括的每个相应供者的血液中分离MNC，或使MNC从中分离。可以采集包括在供者库中的每个供者的血液。在一些实施方案中，收集来自包括在供者库中的每个供者的采集血液中的单核细胞(MNC)。通过使用本领域技术人员已知的方法分离MNC和PBMC。举例来说，密度离心(梯度)(Ficoll-Paque)可用于分离PBMC。在其它实例中，具有新鲜收集的血液的细胞制备管(CPT)和SepMate管可用于分离PBMC。举例来说，PBMC可以包括淋巴细胞、单核细胞和树突细胞。举例来说，淋巴细胞可以包括T细胞、B细胞和NK细胞。在一些实施方案中，培养或冷冻保存本文所用的MNC。在一些实施方案中，培养或冷冻保存所述细胞的过程可以包括在合适的培养条件下将培养物中的细胞与一种或多种抗原接触，以刺激和扩增抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种抗原可以包括一种或多种病毒抗原。

在一些实施方案中，培养或冷冻保存细胞的过程可以包括在合适的培养条件下将培养的细胞与来自一种或多种抗原的一种或多种表位接触。在一些实施方案中，将MNC或PBMC与一种或多种抗原或来自一种或多种抗原的一种或多种表位的接触将刺激并扩增来自各个供者的MNC或PMBC的抗原特异性T细胞的多克隆群体。在一些实施方案中，可以冷冻保存所述抗原特异性T细胞系。

在一些实施方案中，所述一种或多种抗原可呈完整蛋白质的形式。在一些实施方案中，所述一种或多种抗原可以是肽混合物，其包含跨越每种抗原的一部分或整个序列的一系列重叠肽。在一些实施方案中，所述一种或多种抗原可以是完整蛋白和肽混合物的组合，所述肽混合物包含跨越每种抗原的一部分或整个序列的一系列重叠肽。

在一些实施方案中，PBMC或MNC的培养是在包含气体可渗透培养表面的容器中进行的。在一个实施方案中，所述容器是具有透气部分的输液袋或刚性容器。在一个实施方案中，所述容器是GRex生物反应器。在一个实施方案中，所述容器可以是适于培养本文所述PBMC或MNC的任何容器、生物反应器等。

在一些实施方案中，在一种或多种细胞因子存在的情况下培养PBMC或MNC。在一些实施方案中，细胞因子是IL4。在一些实施方案中，细胞因子是IL7。在一些实施方案中，细胞因子是IL4和IL7。在一些实施方案中，细胞因子包括IL4和IL7，但不包括IL2。在一些实施方案中，细胞因子可以是适于培养本文所述PBMC或MNC的细胞因子的任意组合。

在一些实施方案中，培养MNC或PBMC可以在至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种或更多种不同肽混合物存在的情况下进行。肽混合物，即多种肽，包含跨越抗原的一部分或整个序列的一系列重叠肽。在一些实施方案中，可以在多种肽混合物存在下的情况下培养MNC或PBMC。在这种情况下，每种肽混合物覆盖至少一种抗原，该抗原不同于所述多种肽混合物中每种另外的肽混合物所覆盖的抗原。在一些实施方案中，所述多种肽混合物覆盖了至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种或更多不同的抗原。在一些实施方案中，来自至少2种不同病毒的至少一种抗原被多种肽混合物覆盖。图1和图2显示了构建抗原特异性T细胞系的一般GMP生产方案的实例。

在一些实施方案中，所述肽混合物包含15聚体肽。在一些实施方案中，所述肽混合物包含适用于本文所述方法的肽。在一些实施方案中，所述肽混合物中跨越抗原的肽在序列上重叠8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽混合物中跨越抗原的肽在序列上重叠11个氨基酸。

在一些实施方案中，所述一种或多种肽混合物中的病毒抗原来自选自以下病毒的病毒：EBV、CMV、腺病毒、BK、JC病毒、HHV6、RSV、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、冠状病毒(例如，SARS-CoV-2)、LCMV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、人偏肺病毒、细小病毒B、轮状病毒、默克尔细胞病毒、单纯疱疹病毒、HPV、HIV、HTLV1、HHV8和西尼罗病毒、寨卡病毒和埃博拉病毒。在一些实施方案中，至少一种肽混合物覆盖来自RSV、流感病毒、副流感病毒、人偏肺病毒(HMPV)的抗原。在一些实施方案中，至少一种肽混合物覆盖来自EBV、CMV、BKV和HHV6的抗原。在一些实施方案中，至少一种肽混合物覆盖来自HHV8或HBV的抗原。在一些实施方案中，所述病毒可以是任何合适的病毒。

在一些实施方案中，流感抗原可以是甲型流感抗原NP1。在一些实施方案中，流感抗原可以是甲型流感抗原MP1。在一些实施方案中，流感抗原可以是NP1和MP1的组合。在一些实施方案中，RSV抗原可以是RSV N。在一些实施方案中，RSV抗原可以是RSV F。在一些实施方案中，RSV抗原可以是RSV N和F的组合。在一些实施方案中，hMPV抗原可以是F。在一些实施方案中，hMPV抗原可以是N。在一些实施方案中，hMPV抗原可以是M2-1。在一些实施方案中，hMPV抗原可以是M。在一些实施方案中，hMPV抗原可以是F、N、M2-1和M的组合。在一些实施方案中，PIV抗原可以是M。在一些实施方案中，PIV抗原可以是HN。在一些实施方案中，PIV抗原可以是N。在一些实施方案中，PIV抗原可以是F。在一些实施方案中，PIV抗原可以是M、HN、N和F的组合。

在一些实施方案中，在跨越甲型流感抗原NP1和甲型流感抗原MP1、RSV抗原N和F、hMPV抗原F、N、M2-1和M以及PIV抗原M、HN、N和F的肽混合物存在的情况下培养PBMC或MNC。在一些实施方案中，在跨越EBV抗原LMP2、EBNA1和BZLF1、CMV抗原IE1和pp65、腺病毒抗原六邻体和五邻体、BK病毒抗原VP1和大T以及HHV6抗原U90、U11和U14的肽混合物存在的情况下培养PBMC或MNC。在一些实施方案中，测试所述抗原特异性T细胞的抗原特异性细胞毒性。

在其它实施方案中，至少一种肽混合物覆盖来自EBV、CMV、腺病毒、BK和HHV6的抗原。在一些实施方案中，所述EBV抗原来自LMP2、EBNA1、BZLF1及其组合。在一些实施方案中，所述CMV抗原来自IE1、pp65及其组合。在一些实施方案中，所述腺病毒抗原来自六邻体、五邻体及其组合。在一些实施方案中，所述BK病毒抗原来自VP1、大T及其组合。在一些实施方案中，所述HHV6抗原来自U90、U11、U14及其组合。

在一些实施方案中，至少一种肽混合物覆盖来自HHV8的抗原。在一些实施方案中，所述来自HHV8的抗原选自LANA-1(ORF3)；LANA-2(vIRF3,K10.5)；vCYC(ORF72)；RTA(ORF50)；vFLIP(ORF71)；Kaposin(ORF12,K12)；gB(ORF8)；MIR1(K3)；SSB(ORF6)；TS(ORF70)及其组合。

在一些实施方案中，至少一种肽混合物覆盖来自HBV的抗原。在一些实施方案中，所述来自HBV的抗原选自HBV核心抗原、HBV表面抗原以及HBV核心抗原与HBV表面抗原的组合。

在一些实施方案中，所述肽混合物覆盖来自SARS-CoV-2的抗原。在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2包含选自由以下组成的组的一种或多种抗原：(i)nsp1；nsp3；nsp4；nsp5；nsp6；nsp10；nsp12；nsp13；nsp14；nsp15和nsp16；(ii)刺突(S)；包膜蛋白(E)；基质蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)；以及(iii)SARS-CoV-2(AP3A)；SARS-CoV-2(NS7)；SARS-CoV-2(NS8)；SARS-CoV-2(ORF10)；SARS-CoV-2(ORF9B)和SARS-CoV-2(Y14)。

本公开提供了预防或控制疾病或疾患的方法，其包括向患者施用来自本文所述的微型库的一种或多种合适的抗原特异性T细胞系。在一些实施方案中，鉴定抗原特异性T细胞系是否可施用于患者的唯一标准是患者与从中分离用于制备抗原特异性T细胞系的MNC或PBMC的供者共享至少两个HLA等位基因。在一些实施方案中，本公开包括用于从供者微型库中鉴定最合适的细胞疗法产品(例如，抗原特异性T细胞系)以用于向给定患者施用的方法。在一些实施方案中，患者接受了造血干细胞移植。在一些这样的实施方案中，鉴定抗原特异性T细胞系是否可施用于患者的唯一标准是患者与患者的造血干细胞供者共享至少两个匹配的HLA等位基因，其中用于制备抗原特异性T细胞系的MNC或PBMC是从所述供者分离的。

在一些实施方案中，通过本文提供的方法预防的疾病是病毒感染。在一些实施方案中，所预防的疾病与受试者的免疫缺陷相关或由其引起。在一些实施方案中，所述免疫缺陷是原发性免疫缺陷。

在一些实施方案中，患者比一般人群中的普通人具有更高的发生病毒感染或具有潜伏病毒再激活的风险。在一些实施方案中，病毒感染或潜伏病毒的再激活对患者健康造成的风险比这种感染或再激活对一般人群中的普通人造成的风险更大。在一些实施方案中，患者是免疫受损的。如本文中所用，免疫受损是指具有减弱的免疫系统。例如，免疫受损的患者抵抗感染和其它疾病的能力降低。在一些实施方案中，由于患者接受的治疗疾病或疾患或另一种疾病或疾患的治疗，患者是免疫受损的。在一些实施方案中，免疫受损的原因是由于年龄。在一个实施方案中，免疫受损的原因是由于年幼。例如，在一些实施方案中，患者小于1岁。在一个实施方案中，患者因年老而免疫受损。例如，在一些实施方案中，患者的年龄超过60岁、超过65岁、超过70岁、超过75岁、超过80岁或超过85岁。在一些实施方案中，患者由于年幼或年老加上免疫缺陷而免疫受损。在一些实施方案中，患者需要移植疗法。

本公开提供了从微型库或从包括在供者库中的微型库中选择和使用第一抗原特异性T细胞系，以用于在同种异体T细胞疗法中向患者施用，所述患者在移植过程中从移植供者接受了移植材料或需要接受所述移植材料。在一个实施方案中，施用是为了预防病毒感染或者预防由病毒感染或潜伏病毒的再激活引起的疾病或病症。在一个实施方案中，施用用于移植前的原发性免疫缺陷。在一些实施方案中，移植材料包括干细胞。在一些实施方案中，移植材料包括实体器官或组织。在一些实施方案中，移植材料包括骨髓。在一些实施方案中，移植材料包括干细胞、实体器官和骨髓。

在一些实施方案中，所述原发性免疫缺陷病(PIDD)可以是遗传病症。示例性PIDD包括自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫性多腺体综合征1型(APS-1)、BENTA病、胱天蛋白酶8缺乏状态、CARD9缺乏、慢性肉芽肿性疾病(CGD)、常见可变免疫缺陷、先天性中性粒细胞减少综合征、CTLA4缺乏、DOCK8缺乏、GATA2缺乏、糖基化病症、高免疫球蛋白E综合征、高免疫球蛋白M综合征、细胞因子缺乏、白细胞粘附缺乏、LRBA缺乏、PI3激酶病、PCLG2相关抗体缺乏和免疫失调(PLAID)、严重联合免疫缺陷(SCID)、STAT3显性阴性病、STAT3功能获得性疾病、WHIM综合征、Wiskott-Aldrich综合征、X连锁丙种球蛋白缺乏症、X连锁淋巴组织增生性疾病、XMEN疾病、补体缺乏症、选择性IgA缺乏症、DiGeorge综合征和共济失调-毛细血管扩张症。在一些实施方案中，患者患有非PIDD的免疫缺陷疾病，例如HIV感染和/或获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。

在一些实施方案中，向患者多次施用第一抗原特异性T细胞系。例如，在一些实施方案中，可向患者施用第一抗原特异性T细胞系2次、3次、4次、5次或更多次。在一些实施方案中，向患者施用第二抗原特异性T细胞系。在一些实施方案中，第二抗原特异性T细胞系与第一抗原特异性T细胞系选自相同的微型库。在一些实施方案中，第二抗原特异性T细胞系选自与从其获得第一抗原特异性T细胞系的微型库不同的微型库。在一些实施方案中，向患者施用第二抗原特异性T细胞系多次，例如2次、3次、4次、5次或更多次。在一些实施方案中，向患者施用多种额外的抗原特异性T细胞系。例如，在一些实施方案中，本文提供的方法包括施用2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的抗原特异性T细胞系。在一些实施方案中，所述抗原特异性T细胞系包含彼此相同的抗原特异性，但产生自不同的供者。在一些实施方案中，所述抗原特异性T细胞系包含不同的特异性，并且从同一供者产生。在一些实施方案中，所述抗原特异性T细胞系包含不同的特异性，并且产生自不同的供者。

在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用多克隆的抗原特异性T细胞系，然后施用抗原组合物以增强对所述多克隆抗原特异性T细胞对其具有特异性的一种或多种病毒或抗原的反应。例如，在一些实施方案中，所述方法包括在施用多克隆抗原特异性T细胞系后约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更多周施用抗原组合物以增强反应。在一些实施方案中，所述抗原组合物包含一种或多种肽，或一种或多种全抗原(例如，本文提供的任何病毒抗原)。在一些实施方案中，所述抗原组合物包含用于产生所述多克隆抗原特异性T细胞系的所述一种或多种肽混合物，或包含在用于产生多克隆抗原特异性T细胞系的所述一种或多种肽混合物中的一种或多种所述抗原性肽。在一些实施方案中，所述抗原组合物还包含佐剂。示例性佐剂包括但不限于铝盐，诸如氢氧化铝((Al(OH)₃)、氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙盐、铁盐或锌盐；弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、Merck佐剂65、toll样受体4型(TLR-4)激动剂(例如，单磷酰脂质A(MPL)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物)、铝盐、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、cochleate、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、水包油乳剂、MF59、3DMPL、QS21和角鲨烯。

本发明提供了预防疾病或疾患或病毒感染或潜伏病毒的再激活的方法，其包括向患者施用一种或多种第三方同种异体T细胞疗法，包括向患者施用一种或多种多克隆抗原特异性T细胞系。在一些实施方案中，所述T细胞系包含针对一种或多种病毒抗原的抗原特异性。在一些实施方案中，所述T细胞系包含在2个或更多个HLA等位基因上与患者的HLA类型相匹配的HLA类型。例如，所述T细胞系包含在2、3、4、5或6个等位基因上与患者的HLA类型相匹配的HLA类型。在一些实施方案中，所述患者已经接受了HSCT，并且所述T细胞系在2个或更多个HLA等位基因上与患者和HSCT供者二者相匹配。

炎症反应可通过观察以下一种或多种症状或体征来检测：(i)选自发热、寒战、头痛、不适、疲劳、恶心、呕吐、关节痛的全身症状；(ii)包括低血压在内的血管症状；(iii)包括心律失常在内的心脏症状；(iv)呼吸功能不全；(v)包括肾衰竭和尿毒症在内的肾症状；和(vi)包括凝血病和噬血细胞淋巴组织细胞增生症样综合征在内的实验室症状。在一些实施方案中，可通过观察任何已知或常见的体征来检测炎症反应。

在一些实施方案中，在施用抗原特异性T细胞系后测量所述预防性方法的功效。在一些实施方案中，基于患者样品中病毒载量来测量所述预防性方法的功效。在一些实施方案中，通过监测患者外周血中可检测的病毒载量来测量所述预防性方法的功效。在一些实施方案中，所述预防性方法的功效包括减少或维持肉眼可见的血尿。在一些实施方案中，所述预防性方法的功效包括减少或维持出血性膀胱炎症状，如通过CTCAE-PRO或检查患者和/或临床医生报告的结果的类似评估工具所测量的。在一些实施方案中，通过监测患者外周血/血清中可检测的疾病负担的标志物来测量所述预防性方法的功效。

所述样品选自患者的组织样品。所述样品选自患者的流体样品。所述样品选自患者的脑脊液(CSF)。所述样品选自患者的BAL。所述样品选自患者的粪便。

示例性的临床上重要的病毒

病毒感染是同种异体造血干细胞移植(allo-HSCT)或实体器官移植后发病率和死亡率的一个严重原因。病毒再激活可能在发育不全的相对或绝对免疫缺陷期间和在allo-HSCT后的免疫抑制疗法期间发生。与包括巨细胞病毒(CMV)、BK病毒(BKV)和腺病毒(AdV)在内的病毒病原体相关的感染，在allo-HSCT后变得越来越成问题，并与显著的发病率和死亡率相关联。

在常见的感染当中，CMV仍然是同种异体造血干细胞移植(HSCT)后临床上最显著的感染，也是实体器官移植后显著的感染。国际血液和骨髓移植研究中心(CIBMTR)数据显示，早期移植后CMV再激活发生在超过30％的CMV血清阳性HSCT受者中，并且可以导致结肠炎、视网膜炎、肺炎和死亡。尽管包括更昔洛韦、缬更昔洛韦、来替莫韦、膦甲酸盐和西多福韦在内的抗病毒剂已经被用于预防和治疗，但它们并不总是有效，并且与包括骨髓抑制、肾毒性和最终的非复发死亡率在内的显著毒性相关联。由于免疫重建对感染控制仍然至关重要，所以离体扩增/分离的CMV特异性T细胞(CMV ST)的过继转移已经成为提供抗病毒益处的有效手段。

靶向CMV的早期免疫疗法集中在干细胞供者来源的T细胞产品上，这在一系列跨越20多年的I/II期学术研究中被证明是安全有效的。然而，疗法的个体化性质以及对病毒免疫供者的需求(考虑到使用更可能是首次接受病毒的年轻供者的益处的重要问题)已经成为阻碍广泛实施的障碍。因此，最近，部分HLA匹配的第三方来源的病毒特异性T细胞(VST)已经作为一种治疗方式进行了研究，所述病毒特异性T细胞可以在临床需要之前预先制备和储存。在超过150名患有药物难治性感染/疾病的HSCT或实体器官移植(SOT)受者中，这些VST已被证明在对抗一系列病毒(包括爱泼斯坦-巴尔病毒、CMV、腺病毒、HHV6病毒和BK病毒)方面是安全有效的。这些研究激发了将“现成的”病毒特异性T细胞推向关键研究和随后商业化的兴趣，剩下的问题涉及(i)适应不同移植群体所需的细胞系的数量，和(ii)建立细胞系选择标准以确保临床益处。

另外，由潜伏的BKV(多瘤病毒家族的成员)的再激活引起的感染的出现，在HSCT患者以及肾移植受者中引起严重的临床疾病。BKV感染的主要临床表现是出血性膀胱炎(BK-HC)。这种情况发生在高达25％的同种异体HSCT受者中，并且表现为严重的血尿，伴有严重的、通常使人虚弱的腹痛，需要连续麻醉剂输注。在健康个体中，T细胞免疫防御病毒。在allo-HSCT受者中，使用强效的免疫抑制方案(以及随后相关的免疫受损)会使患者易受严重的病毒感染。

AdV可以在具有已知危险因素的同种异体HSCT后引起显著的发病率和死亡率，所述危险因素包括小儿HSCT、不匹配的供者、T细胞耗尽、脐带血移植、GVHD III-IV级和淋巴细胞减少。总之，较年幼的年龄与AdV感染的发病率升高相关联。在欧洲对在50个中心移植的1,738名患者的评述之后，Voigt及其同事报道了3名小儿同种异体-HSCT受者中的1名(33％)在移植后的前6个月内发展了AdV感染(定义为血浆中的AdV DNA)。在高达40％的感染患者中，AdV感染可以发展为严重的和延长的系统性病患，诸如肺炎、结肠炎、出血性膀胱炎、肝炎和脑炎，导致在小儿同种异体HSCT受者中，HSCT后AdV感染的总死亡率在19％与83％之间。另外，在小儿同种异体-HSCT中的AdV感染与显著的医疗资源利用相关联，如通过住院持续时间所测量的。在520例小儿同种异体-HSCT受者的多中心多国研究中，患有AdV病毒血症的那些患者(定义为血液中AdV DNA＞1000拷贝/mL)比无AdV感染的那些患者多住院22天。在一项单独的研究中，小儿同种异体HSCT受者中AdV感染的经济负担(抗病毒费用和患者住院)估计为每个患者$31,500，而相比之下无AdV感染的患者为$1,120。西多福韦的适应症外抗病毒疗法是无效的且有肾毒性。重要的是，这些抗病毒剂具有抑制病毒活性，而对促进T细胞免疫重建没有影响，而T细胞免疫重建对于从AdV感染中恢复是至关重要的。AdV特异性免疫的重建对于感染清除仍然是最重要的，包括Viraly-M在内的第三方AdV特异性T细胞已经成功地用于治疗活动性AdV感染和疾病。

在高达40％的同种异体造血干细胞移植(allo-HSCT)受者中检测到由包括呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒、副流感病毒(PIV)和人偏肺病毒(hMPV)在内的社区获得性呼吸道病毒(CARV)引起的呼吸道病毒感染，在所述受者中，它们可能导致严重疾病，诸如可能致命的细支气管炎和肺炎。RSV诱导的细支气管炎是不到1岁的儿童住院的最常见原因，而疾病控制中心(CDC)估计，每年，流感在全球范围内导致多达3560万例疾病，140,000至710,000人住院治疗，仅在美国，疾病管理的年度成本约为871亿美元，死亡人数在12,000至56,000人之间。

本公开提供了通过施用离体扩增的、非遗传修饰的病毒特异性T细胞(VST)来恢复T细胞免疫，以控制病毒感染并消除症状，持续至移植患者自身免疫系统恢复的时间。不希望受任何理论的束缚，VST能够循环至少6周或至少12周，并且预防性地防止病毒感染或预防性地防止潜伏病毒的再激活。在一些实施例中，VST通过它们的天然T细胞受体(TCR)识别并杀伤病毒感染的细胞，所述受体与呈递病毒来源的肽的靶细胞上表达的主要组织相容性复合物(MHC)分子结合。

在一些实施方案中，来自外周血单核细胞(PBMC)的VST从健康的、预筛选的、血清阳性的供者获得，其可作为部分HLA匹配的“现成”产品获得。在一些实施方案中，本文所述的VST对EBV、CMV、AdV、BKV、HHV6、HHV8、乙型肝炎病毒(HBV)、RSV、流感病毒、PIV、hMPV和SARS-COV-2中的任何一种或多种有反应。在一些实施方案中，本文所述的VST至少对EBV、CMV、AdV、BKV和HHV6作出反应。在一些实施方案中，本文所述的VST对HBV或HHV8作出反应。在一些实施方案中，本文所述的VST对SARS-CoV-2作出反应。在一些实施方案中，本文所述的VST对RSV、流感病毒、PIV和hMPV作出反应。在一些实施方案中，VST被设计成在受者患者中循环直至患者例如在HSCT移植物植入和免疫系统再生后患者恢复免疫活性。不希望受理论束缚，在一些实施方案中，本文所述的VST和方法是“免疫桥疗法(immunologic bridgetherapy)”，其为免疫受损的患者提供T细胞免疫，直至患者移植并能产生内源性免疫反应。在一些实施方案中，VST被设计为在受者体内循环，至少直至VST的进一步施用，例如在前一剂量后约4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周或更多周的VST的后续剂量。在一些实施方案中，在施用VST后约2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周或更多周，对患者加强施用肽或全抗原。

在本公开的一些实施方案中，将产生的抗原特异性T细胞提供给患有病原性感染(包括病毒、细菌或真菌感染)或有患所述病原性感染的风险的个体。所述个体可能具有或可能没有缺陷型免疫系统。在一些情况下，例如，个体处于在器官或干细胞移植(包括造血干细胞移植)后患有病毒、细菌或真菌感染的风险中，或者患有癌症或已接受或将接受癌症治疗。在一些情况下，个体具有获得性免疫系统缺陷。

个体中的感染可以是任何类型的，但在具体实施方案中，感染是一种或多种病毒的结果。致病病毒可以是任何类型的，但在具体实施方案中，其来自以下科之一：腺病毒科、细小RNA病毒科、冠状病毒、疱疹病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳多空病毒科(Papovaviridae)、多瘤病毒科、弹状病毒科或披膜病毒科。在一些实施方案中，病毒产生免疫显性或亚显性抗原，或者产生这两种抗原。在特定情况下，病毒选自EBV、CMV、腺病毒、BK病毒、HHV6、RSV、流感病毒、副流感病毒、HHV8、HBV、博卡病毒、冠状病毒(例如，SARS-CoV-2)、LCMV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、偏肺病毒、细小病毒B、轮状病毒、西尼罗病毒、西班牙流感病毒及其组合。

在一些方面，感染是由病原菌引起的，并且本发明适用于任何类型的病原菌。示例性的致病菌至少包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、普氏立克次体(Rickettsiaprowazekii)、链球菌属(Streptococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、志贺菌属(Shigella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和沙门菌属(Salmonella)。

在一些方面，感染是病原真菌的结果，并且本发明适用于任何类型的病原真菌。示例性致病真菌至少包括念珠菌属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、隐球菌属(Cryptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、肺囊虫属(Pneumocystis)或葡萄穗霉属(Stachybotrys)。在一些实施方案中，病毒抗原可以是适用于本公开中所述用途的任何抗原。

肽混合物文库的生成

在本发明的一些实施方案中，向PBMC提供肽文库，最终产生抗原特异性T细胞。在特定情况下，所述文库包含跨越同一抗原的一部分或全部的肽混合物(“肽混合物”)。在某些方面，本发明中使用的肽混合物可以来自商购可得的肽文库，其由15个氨基酸长并且彼此重叠11个氨基酸的肽组成。在一些情况下，它们可通过人工合成。实例包括来自PTTechnologies(Springfield,VA)或Miltenyi Biotec(Auburn,Ca)的那些产品。在一些特定的实施方案中，肽的长度例如为至少7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个或35个或更多个氨基酸，并且在特定的实施方案中，例如存在长度为至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个或34个氨基酸的重叠。

在一些实施方案中，肽混合物中使用的氨基酸具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99、至少99.9％(包括其间的所有范围和子范围)的纯度。在一些实施方案中，此处在肽混合物中使用的氨基酸具有至少90％的纯度。

不同肽的混合物可以包括任何比例的不同肽，尽管在一些实施方案中，每种特定肽在混合物中以与另一种特定肽基本相同的数量存在。在US2018/0187152(其通过引用以其整体并入本文)中描述了制备和生产用于具有广泛特异性的多病毒抗原特异性T细胞的肽混合物的方法。

多克隆的病毒特异性T细胞组合物

本公开包括从血清阳性供者(例如，通过本文公开的供者选择方法选择的)产生的多克隆病毒特异性T细胞组合物，其具有针对临床上重要的病毒的特异性。在一些实施方案中，所述临床上重要的病毒可以包括但不限于EBV、CMV、AdV、BKV和HHV6。在一些实施方案中，所述临床上重要的病毒包括但不限于RSV、流感病毒、副流感病毒和HMPV。在一些实施方案中，所述临床上重要的病毒是HBV病毒。在一些实施方案中，所述临床上重要的病毒是HHV8病毒。在一些实施方案中，所述临床上重要的病毒是SARS-CoV-2。

本公开提供了包含抗原特异性T细胞的多克隆群体的组合物。在一些实施方案中，抗原特异性T细胞的多克隆群体可以识别多种病毒抗原。在一些实施方案中，抗原特异性T细胞的多克隆群体可以识别来自单一病毒的两种或更多种或多种病毒抗原。例如，在一些实施方案中，抗原特异性T细胞的多克隆群体可以识别来自HHV8、HBV、AdV、CMV、BKV、EBV、HHV6、JCV、RSV、流感病毒、PIV、HPMV或SARS-CoV-2的两种或更多种或多种病毒抗原。在一些实施方案中，抗原特异性T细胞的多克隆群体可以识别来自不止一种，例如来自2种、3种、4种、5种、6种或更多种不同病毒的两种或更多种或多种病毒抗原。

在一些实施方案中，所述多种病毒抗原可以包含至少一种来自副流感病毒3型(PIV-3)的第一抗原。在一些实施方案中，所述多种病毒抗原可以包含来自一种或多种第二病毒的至少一种第二抗原。

在一些实施方案中，多克隆病毒特异性T细胞组合物对任何临床上重要的或相关的病毒具有特异性。例如，多克隆病毒特异性T细胞组合物可包含选自CMV、BKV、EBV、AdV、HHV6、HHV8、HBV、JCV、PIV3、RSV、HMPV、流感病毒和SARS-CoV-2或其任意组合的病毒抗原。

在一些实施方案中，本公开提供了识别多种病毒抗原的抗原特异性T细胞的多克隆群体以及如本文所述的包含含有此类抗原特异性T细胞的多种细胞系的供者微型库，所述多种病毒抗原包含来自3型副流感病毒(PIV-3)呼吸道合胞病毒、流感病毒和人偏肺病毒中的每一种的至少一种抗原。在一些实施方案中，本公开提供了识别含有所述多种病毒抗原的多种病毒抗原的抗原特异性T细胞的多克隆群体以及如本文所述的包含含有此类抗原特异性T细胞的多个细胞系的供体微型库，所述多种病毒抗原包含来自3型副流感病毒(PIV-3)呼吸道合胞病毒、流感病毒和人偏肺病毒中的每一种的至少两种抗原。

在一些实施方案中，所述多种抗原包括PIV-3抗原M、PIV-3抗原HN、PIV-3抗原N、PIV-3抗原F、流感病毒抗原NP1、流感病毒抗原MP1、RSV抗原N、RSV抗原F、hMPV抗原M、hMPV抗原M2-1、hMPV抗原F和hMPV抗原N。在一些实施方案中，所述多种抗原可以选自PIV-3抗原M、PIV-3抗原HN、PIV-3抗原N、PIV-3抗原F、流感病毒抗原NP1、流感病毒抗原MP1、RSV抗原N、RSV抗原F、hMPV抗原M、hMPV抗原M2-1、hMPV抗原F和hMPV抗原N中的任一种。

在一些实施方案中，第一抗原可以是PIV-3抗原M。在一些实施方案中，第一抗原可以是PIV-3抗原HN。在一些实施方案中，第一抗原可以是PIV-3抗原N。在一些实施方案中，第一抗原可以是PIV-3抗原F。在一些实施方案中，第一抗原可以是PIV-3抗原M、PIV-3抗原HN、PIV-3抗原N和PIV-3抗原F的任意组合。在一些实施方案中，所述组合物包含1种第一抗原。在一些实施方案中，所述组合物可以包含2种第一抗原。在一些实施方案中，所述组合物可以包含3种第一抗原。在一些实施方案中，所述组合物可以包含4种第一抗原。在一些实施方案中，所述4种第一抗原可以包括PIV-3抗原M、PIV-3抗原HN、PIV-3抗原N和PIV-3抗原F。

在一些实施方案中，所述一种或多种第二病毒可以是呼吸道合胞病毒(RSV)。在一些实施方案中，所述一种或多种第二病毒可以是流感病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种第二病毒可以是人偏肺病毒(hMPV)。在一些实施方案中，所述一种或多种第二病毒可以包括呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒和人偏肺病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种第二病毒可以由呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒和人偏肺病毒组成。在一些实施方案中，所述一种或多种第二病毒可以选自本文所述的任何合适的病毒。

在一些实施方案中，所述组合物可以包含两种或三种第二病毒。在一些实施方案中，所述组合物可以包含三种第二病毒。在一些实施方案中，所述三种第二病毒可以包括流感病毒、RSV和hMPV。在一些实施方案中，所述组合物包含至少两种第二抗原/每种第二病毒。在一些实施方案中，所述组合物包含1种第二抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含2种第二抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含3种第二抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含4种第二抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含5种第二抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含6种第二抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含7种第二抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含8种第二抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含9种第二抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含10种第二抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含11种第二抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含12种第二抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含任何数量的适用于本文所述组合物的第二抗原。

在一些实施方案中，所述第二抗原可以是流感病毒抗原NP1。在一些实施方案中，所述第二抗原可以是流感病毒抗原MP1。在一些实施方案中，所述第二抗原可以是RSV抗原N。在一些实施方案中，所述第二抗原可以是RSV抗原F。在一些实施方案中，所述第二抗原可以是hMPV抗原M。在一些实施方案中，所述第二抗原可以是hMPV抗原M2-1。在一些实施方案中，所述第二抗原可以是hMPV抗原F。在一些实施方案中，所述第二抗原可以是hMPV抗原N。在一些实施方案中，所述第二抗原可以是流感病毒抗原NP1、流感病毒抗原MP1、RSV抗原N、RSV抗原F、hMPV抗原M、hMPV抗原M2-1、hMPV抗原F和hMPV抗原N的任意组合

在一些实施方案中，所述第二抗原包括流感病毒抗原NP1。在一些实施方案中，所述第二抗原包括流感病毒抗原MP1。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述第二抗原包括流感病毒抗原NP1和流感病毒抗原MP1。在一些实施方案中，所述第二抗原包括RSV抗原N。在一些实施方案中，所述第二抗原包括RSV抗原F。在一些实施方案中，所述第二抗原包括RSV抗原N RSV抗原F。

在一些实施方案中，所述第二抗原包括hMPV抗原M。在一些实施方案中，所述第二抗原包括hMPV抗原M2-1。在一些实施方案中，所述第二抗原包括hMPV抗原F。在一些实施方案中，所述第二抗原包括hMPV抗原N。在一些实施方案中，所述第二抗原包括hMPV抗原M、hMPV抗原M2-1、hMPV抗原F和hMPV抗原N的组合。

在一些实施方案中，所述第二抗原包括流感病毒抗原NP1、流感病毒抗原MP1、RSV抗原N、RSV抗原F、hMPV抗原M、hMPV抗原M2-1、hMPV抗原F、hMPV抗原N中的每一种。在一些实施方案中，所述多种抗原包括PIV-3抗原M、PIV-3抗原HN、PIV-3抗原N、PIV-3抗原F、流感病毒抗原NP1、流感病毒抗原MP1、RSV抗原N、RSV抗原F、hMPV抗原M、hMPV抗原M2-1、hMPV抗原F和hMPV抗原N。在一些实施方案中，所述多种抗原由PIV-3抗原M、PIV-3抗原HN、PIV-3抗原N、PIV-3抗原F、流感病毒抗原NP1、流感病毒抗原MP1、RSV抗原N、RSV抗原F、hMPV抗原M、hMPV抗原M2-1、hMPV抗原F和hMPV抗原N组成。在一些实施方案中，所述多种抗原基本上由PIV-3抗原M、PIV-3抗原HN、PIV-3抗原N、PIV-3抗原F、流感病毒抗原NP1、流感病毒抗原MP1、RSV抗原N、RSV抗原F、hMPV抗原M、hMPV抗原M2-1、hMPV抗原F和hMPV抗原N。在一些实施方案中，所述第二抗原可以包括用于本文所述组合物的任何合适的抗原。

在一些实施方案中，临床上重要的病毒可以包括但不限于HHV8。在一些实施方案中，病毒抗原跨越来自HHV8的免疫原性抗原。在一些实施方案中，来自HHV8的抗原选自LANA-1(ORF3)；LANA-2(vIRF3,K10.5)；vCYC(ORF72)；RTA(ORF50)；vFLIP(ORF71)；Kaposin(ORF12,K12)；gB(ORF8)；MIR1(K3)；SSB(ORF6)；TS(ORF70)及其组合。

在一些实施方案中，临床上重要的病毒可以包括但不限于HBV。在一些实施方案中，病毒抗原跨越来自HBV的免疫原性抗原。在一些实施方案中，来自HBV的抗原选自(i)HBV核心抗原，(ii)HBV表面抗原和(iii)HBV核心抗原和HBV表面抗原。

在一些实施方案中，临床上重要的病毒可以包括但不限于冠状病毒。在一些实施方案中，冠状病毒是α-冠状病毒(α-CoV)。在一些实施方案中，冠状病毒是β-冠状病毒(β-CoV)。在一些实施方案中，β-CoV选自SARS-CoV、SARS-CoV-2、MES-CoV、HCoV-HKU1和HCoV-OC43。在一些实施方案中，冠状病毒是SARS-CoV2。在一些实施方案中，SARS-CoV-2抗原包括选自由以下组成的组的一种或多种抗原：((i)nsp1；nsp3；nsp4；nsp5；nsp6；nsp10；nsp12；nsp13；nsp14；nsp15；and nsp16；(ii)Spike(S)；包膜蛋白(E)；基质蛋白(M)；和核衣壳蛋白(N)；和(iii)SARS-CoV-2(AP3A)；SARS-CoV-2(NS7)；SARS-CoV-2(NS8)；SARS-CoV-2(ORF10)；SARS-CoV-2(ORF9B)；和SARS-CoV-2(Y14)。

在一些实施方案中，组合物中的抗原特异性T细胞可以通过将外周血单核细胞(PBMC)与多个肽混合物文库接触来产生。在一些实施方案中，每个肽混合物文库包含跨越病毒抗原的至少一部分的多个重叠肽。在一些实施方案中，多个肽混合物文库中的至少一个跨越来自PIV-3的第一抗原。在一些实施方案中，多个肽混合物文库中的至少一个附加的肽混合物文库跨越每种第二抗原。

在一些实施方案中，抗原特异性T细胞可以通过将T细胞与用至少一种DNA质粒核感染的树突细胞(DC)接触来产生。在一些实施方案中，DNA质粒可以编码PIV-3抗原。在一些实施方案中，至少一种DNA质粒编码每种第二抗原。在一些实施方案中，质粒编码至少一种PIV-3抗原和第二抗原中的至少一种。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。在一些实施方案中，组合物包含表达αβT细胞受体的抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，组合物包含MHC限制性抗原特异性T细胞。

在一些实施方案中，可以在IL-7和IL-4存在的情况下离体培养抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，多病毒抗原特异性T细胞在培养的9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天(包括其间的所有范围和子范围)内已被充分扩增，使得它们准备用于向患者施用。在一些实施方案中，多病毒抗原特异性T细胞在适于本文所述组合物的任意天数内已被充分扩增。

本发明提供了包含抗原特异性T细胞的组合物，所述T细胞表现出可忽略的同种异体反应性。在一些实施方案中，所述组合物包含抗原特异性T细胞，所述抗原特异性T细胞与从相同患者收获的相应抗原特异性T细胞相比，表现出更少的对从所述患者收获的抗原特异性T细胞的激活诱导的细胞死亡。在一些实施方案中，不在IL-7和IL-4都存在的情况下培养组合物。在一些实施方案中，包含抗原特异性T细胞的组合物表现出大于70％的存活力。

在一些实施方案中，所述组合物在培养中至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天对细菌和真菌呈阴性。在一些实施方案中，所述组合物在培养物中至少7天对细菌和真菌呈阴性。在一些实施方案中，所述组合物表现出低于1EU/ml、低于2EU/ml、低于3EU/ml、低于4EU/ml、低于5EU/ml、低于6EU/ml、低于7EU/ml、低于8EU/ml、低于9EU/ml、低于10EU/ml的内毒素。在一些实施方案中，组合物表现出低于5EU/ml的内毒素。在一些实施方案中，所述组合物对支原体呈阴性。

在一些实施方案中，化学合成用于构建抗原特异性T细胞的多克隆群体的肽混合物。在一些实施方案中，所述肽混合物的纯度任选地>10％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％(包括其间的所有范围和子范围)。在一些实施方案中，所述肽混合物的纯度任选地>90％。

在一些实施方案中，抗原特异性T细胞是Th1极化的。在一些实施方案中，所述抗原特异性T细胞能够裂解表达病毒抗原的靶细胞。在一些实施方案中，所述抗原特异性T细胞能够裂解其它合适类型的表达抗原的靶细胞。在一些实施方案中，组合物中的抗原特异性T细胞不会显著裂解未感染的自体靶细胞。在一些实施方案中，组合物中的抗原特异性T细胞不会显著裂解未感染的自体同种异体靶细胞。

本公开提供了药物组合物，其包含配制用于静脉内递送的任何组合物(例如，配制用于静脉内递送的包含来自本文所述供者微型库的抗原特异性T细胞系的药物组合物)。在一些实施方案中，所述组合物在培养中至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天对细菌呈阴性。在一些实施方案中，组合物在培养中至少7天对细菌呈阴性。在一些实施方案中，组合物在培养中至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天对真菌呈阴性。在一些实施方案中，组合物在培养中至少7天对真菌呈阴性。

本发明的药物组合物表现出低于1EU/ml、低于2EU/ml、低于3EU/ml、低于4EU/ml、低于5EU/ml、低于6EU/ml、低于7EU/ml、低于8EU/ml、低于9EU/ml或低于10EU/ml的内毒素。在一些实施方案中，本发明的药物组合物对支原体呈阴性。

本公开提供了裂解靶细胞的方法，其包括将靶细胞与本文所述的组合物或药物组合物(例如，抗原特异性T细胞系或配制用于静脉内递送的包含这种T细胞系的药物组合物)接触。在一些实施方案中，靶细胞与组合物或药物组合物之间的接触发生在受试者体内。在一些实施方案中，靶细胞与组合物或药物组合物之间的接触通过向受试者施用抗原特异性T细胞而在体内发生。在一些实施方案中，受试者是人。

本公开提供了控制或预防病毒感染的方法，其包括向有需要的受试者施用本文所述的组合物或药物组合物(例如，抗原特异性T细胞系或配制用于静脉内递送的包含这种T细胞系的药物组合物)。在一些实施方案中，施用的抗原特异性T细胞的量的范围在5x10³与5x10⁹个抗原特异性T细胞/m²之间、5x10⁴与5x10⁸个抗原特异性T细胞/m²之间、5x10⁵与5x10⁷个抗原特异性T细胞/m²之间、5x10⁴与5x10⁸个抗原特异性T细胞/m²之间、5x10⁶与5x10⁹个抗原特异性T细胞/m²之间，包括其间的所有范围和子范围。在一些实施方案中，向受试者施用抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，受试者是免疫受损的。在一些实施方案中，受试者患有急性髓性白血病。在一些实施方案中，受试者患有急性淋巴母细胞性白血病。在一些实施方案中，受试者患有慢性肉芽肿疾病。

在一些实施方案中，受试者可以患有一种或多种医学疾患。在一些实施方案中，受试者在接受抗原特异性T细胞之前接受具有强度降低的预处理的匹配的相关供者移植。在一些实施方案中，受试者在接受抗原特异性T细胞之前接受具有清髓性预处理的匹配的无关供者移植。在一些实施方案中，受试者在接受抗原特异性T细胞之前接受具有强度降低的预处理的单倍相合移植(haplo-identical transplant)。在一些实施方案中，受试者在接受抗原特异性T细胞之前接受具有清髓性预处理的匹配的相关供者移植。在一些实施方案中，受试者接受了实体器官移植。在一些实施方案中，受试者已接受了化学疗法。在一些实施方案中，受试者患有HIV感染和/或AIDS。在一些实施方案中，受试者具有遗传免疫缺陷，例如原发性免疫缺陷疾病(PIDD)。在一些实施方案中，受试者接受了同种异体干细胞移植。在一些实施方案中，受试者具有不止一种本段落中所述的医学状况。在一些实施方案中，受试者具有本段落中描述的所有医学状况。在一些实施方案中，受试者由于年龄而免疫受损(例如，受试者是老年人，例如，超过60岁、超过65岁、超过70岁、超过75岁或超过80岁；或者是年幼的，例如1岁以下、6个月以下、3个月以下或1个月以下)。在一些实施方案中，除了本文所述的一种或多种医学状况之外，受试者还由于年龄而免疫受损。

在一些实施方案中，向受试者多次施用本文所述的组合物。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物超过一次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物超过两次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物超过三次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物超过四次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物超过五次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物超过六次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物超过七次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物超过八次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物超过九次。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的组合物超过十次。在一些实施方案中，以适合于受试者的次数向受试者施用本文所述的组合物。

在一些实施方案中，在受试者处于病毒感染高风险期间，以本文提供的周期性剂量向受试者施用所述组合物。在一些实施方案中，在受试者免疫受损期间，以本文提供的周期性剂量向受试者施用所述组合物。

在一些实施方案中，所述组合物的施用有效预防受试者的病毒感染并且/或者预防受试者中潜伏病毒的再激活。在一些实施方案中，组合物的施用有效控制受试者中的病毒感染，或者有效控制受试者中潜伏病毒的再激活，其中所述受试者在施用组合物时没有关于该病毒的活动性感染或再激活。例如，在一些实施方案中，所述受试者没有病毒血症或病毒尿症或相对于给定病毒的其它可检测的病毒，并且预防性地施用本文提供的组合物，其中所述受试者随后变成暴露于给定的病毒并且/或者感染给定病毒并且/或者再激活给定病毒，并且其中所述组合物的预防性施用防止感染、控制感染、使感染消退并且/或者防止原本由感染引起的严重疾病或并发症。在一些实施方案中，病毒感染是副流感病毒。在一些实施方案中，病毒感染是副流感病毒3型。在一些实施方案中，病毒感染是RSV。在一些实施方案中，病毒感染是流感。在一些实施方案中，病毒感染是HMPV。在一些实施方案中，病毒感染是HHV8。在一些实施方案中，病毒感染是HBV。在一些实施方案中，病毒感染是BKV。在一些实施方案中，病毒感染是CMV。在一些实施方案中，病毒感染是EBV。在一些实施方案中，病毒感染是HHV6。在一些实施方案中，病毒感染是AdV。在一些实施方案中，病毒感染是SARS-CoV-2。

在一些实施方案中，本发明提供了配制用于静脉内递送的包含本文所述的组合物的药物组合物。在一些实施方案中，本文所述的组合物对细菌呈阴性。在一些实施方案中，本文所述的组合物对真菌呈阴性。在一些实施方案中，本文所述的组合物在培养中至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天对细菌或真菌呈阴性。在一些实施方案中，本文所述的组合物在培养中至少7天对细菌或真菌呈阴性。

在一些实施方案中，配制用于静脉内递送的药物组合物表现出低于1EU/ml、低于2EU/ml、低于3EU/ml、低于4EU/ml、低于5EU/ml、低于6EU/ml、低于7EU/ml、低于8EU/ml、低于9EU/ml或低于10EU/ml的内毒素。在一些实施方案中，配制用于静脉内递送的药物组合物对于支原体呈阴性。

上述论述涉及本发明的各种实施方案。术语“发明”不意指任何特定的实施方案或以其它方式限制本公开的范围。尽管这些实施方案中的一个或多个可以是优选的，但是所公开的实施方案不应被解释为或以其它方式用作限制包括权利要求的本公开的范围。另外，本领域技术人员将理解，以下描述具有广泛的应用，并且任何实施方案的论述仅意味着该实施方案的实例，而不旨在暗示包括权利要求的本公开的范围限于该实施方案。

实施例

实施例1.CMV特异性VST(CMVST)的供者库的构建

使用第三方T细胞进行临床试验以治疗CMV-一种普遍存在的病毒，其仍然是移植后发病率和死亡率的主要原因。

用于CMVST产生的供者的选择：为了确保能够为大多数同种异体HSCT患者群体提供临床有效的细胞系，对在Houston地区(休斯顿卫理公会或德克萨斯儿童医院)接受治疗的666例同种异体HSCT受者的HLA类型进行了分析，所述地区具有与作为整体的美国相似的多元种族构成。然后将这些HSCT受体HLA与不同的、健康的、合格的CMV血清阳性供者池的HLA类型进行比较。在初始步骤中，鉴定了其HLA谱适应最多数量的利用CMVST产品的患者的健康供者。将该供者从一般供者池中移除；并且将该供者所适应的所有患者也从未匹配的患者群中移除。随后，第二次、第三次等重复这些步骤，每次鉴定出最佳覆盖剩余患者的供者，然后将该供者和所适应的患者排除在进一步考虑之外，直至产生了覆盖所分析的患者的至少95％的一小组供者。然后第二次重复该程序，以确保患者具有不止一个潜在的供者选择。使用该模型，发现只要8个精心选择的供者将为>95％的患者群体提供在至少2种HLA抗原上匹配的T细胞产品；进一步增加供者池不会显著增加匹配的数量。然后选择这些供体中的八个，目的是向2:95％的该同种异体HSCT受体的不同群体提供具有经确认的CMV活性的覆盖合适的CMVST系(2:2个共享的HLA抗原)。

第三方CMVST库制备：所有供者都在IRB批准的方案上提供了书面知情同意书，并符合血库资格标准。对于生产，通过外周血抽取收集单位血液，并通过Ficoll梯度分离PBMC。将10x10⁶个PBMC接种在G-Rex 5生物反应器(Wilson Wolf,Minneapolis,MN)中，所述生物反应器包括由透气材料构成的底部和以高达10cm的高度容纳介质的主体，并在含有800U/ml IL4和20ng/ml IL7(R&D Systems,Minneapolis,Mn)和IE1、pp65肽混合物(2ng/肽/ml)(JPT Peptide Technologies Berlin,Germany)的T细胞培养基[Advanced RPMI1640(HyClone Laboratories Inc.Logan,Utah),45％Click’s(Irvine Scientific,SantaAna,CA),2mM GlutaMAX^TM]TM-I(Life Technologies Grand Island,Ny)和10％胎牛血清(Hyclone)]中进行培养。在开始后的第9-12天，收获T细胞，计数并在G-Rex-lOOM中用自体肽混合物脉冲的经照射的PBMC[1:4效应子:靶标(E:T)–4x10⁵个CMVST:1.6x10⁶个照射的PBMC/cm2]与IL4(800U/ml)和IL7(20ng/ml)再次刺激。在培养的第3-4天，用200ng/ml的IL2(Prometheus Laboratories,San Diego,CA)饲喂细胞，在第二次刺激后的第9-12天，收获T细胞用于冷冻保存。在冷冻保存时，对每个细胞系进行微生物学测试、免疫分型[CD3,CD4,CD8,CD14,CD16,CD19,CD25,CD27,CD28,CD45,CD45RA,CD56,CD62L CD69,CD83,HLADR和7AAD(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)]，并通过IFN_γ酶联免疫斑点(ELISpot)测定评估病毒特异性。当通过IFNγELISpot测定测得的反应性细胞的频率>30个斑点形成细胞(SFC)/2x10⁵个输入病毒特异性T细胞时，细胞系被定义为“反应性的”。

临床试验设计：这是由美国食品和药物管理局(FDA)的IND进行并且由贝勒医学院机构审查委员会(IRB)批准的单中心I期研究(NCT02313857)。该研究对患有持续至少7天的CMV感染或疾病的同种异体HSCT受者开放，尽管标准疗法定义为利用更昔洛韦、膦甲酸盐或西多福韦的治疗。排除标准包括利用2:0.5mg/kg的泼尼松(或等效物)的治疗、室内空气中氧饱和度<90％的呼吸衰竭、其它不受控制的感染和活动性GVHD≥II级。在建议施用日期的28天内接受ATG、Campath、其它T细胞免疫抑制性单克隆抗体或供者淋巴细胞输注(DLI)的患者也被排除在参与研究之外。患者最初同意寻找合适的VST系(具有2:2个共享HLA抗原)，如果可用且患者符合资格标准，他们可以参加研究的治疗部分。每位患者接受2x10⁷个部分HLA匹配的VST/m2的单次静脉内输注，并可选择在4周后接受第二次输注，此后以每两周的间隔接受另外的输注。治疗医生可自行决定施用标准抗病毒药剂进行治疗。

安全性终点：这项初步研究的主要目的是确定CMVST在患有持续CMV感染/疾病的HSCT受者中的安全性。根据NCI不良事件通用术语标准(CTCAE)(4.X版)对毒性进行分级。安全性终点包括最后一次CMVST给药后42天内的急性GvHD III-IV级、输注24小时内的输注相关毒性或最后一次CMVST给药后28天内与T细胞产品相关的3-5级非血液学不良事件，且不归因于预先存在的感染、原发恶性肿瘤或预先存在的合并症(co-morbidity)。根据标准临床定义对急性和慢性GVHD(如果存在的话)进行分级。1,2该研究由Dan L.Duncan癌症中心数据审查委员会进行监测。

结果评估：在临床实验室改进修正案(CLIA)批准的实验室中，通过定量PCR(qPCR)监测外周血中的CMV载量。病毒对治疗的完全反应(complete response,CR)定义为病毒载量降低至qPCR检测阈值以下，以及组织疾病的临床体征和症状(如果在基线时存在)的消退。部分反应(partial response,PR)被定义为病毒载量从基线下降至少50％。在CMVST输注后第6周指定临床和病毒学反应。

免疫监测：ELISpot分析用于确定响应于CMV抗原和肽而分泌IFN_γ的循环T细胞的频率。在输注前以及输注后第1周、第2周、第3周、第4周、第6周和第12周收集临床样品。作为阳性对照，用葡萄球菌肠毒素B(1μg/ml)(Sigma-Aldrich Corporation,St Louis,MO)刺激PBMC。稀释至1000ng/肽/ml的IE1和pp65肽混合物(JPT Technologies,Berlin,Germany)用于追踪输注后供者来源的CMVST。当可用时，代表已知表位的肽(Genemed Synthesis Inc.,San Antonio,TX，稀释至1250ng/ml)也用于ELISpot测定。对于ELISpot分析，将PBMC以5x10⁶/ml重悬于T细胞培养基中，并铺在96孔ELISpot平板上。以一式两份运行每个条件。孵育20小时后，如前所述对平板进行显影，在室温下于黑暗中干燥过夜，然后送至ZellnetConsulting(New York,NY)进行定量。将干扰素-_γ斑点形成细胞(SFC)和输入细胞数绘制成图，对每种抗原特异性的T细胞的频率表示为每输入细胞数的特异性SFC。

统计分析：计算描述性统计数字以总结数据。对抗病毒反应进行了总结，并根据确切的95％二项置信区间估计反应率。将病毒载量和T细胞频率数据绘制成图，以图解说明免疫反应随时间的模式。使用Wilcoxon符号秩检验比较输注前后病毒载量和T细胞频率的变化。用SAS系统(Cary,Nc)9.4版和R 3.2.1版分析数据。p值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

第三方CMVST库：从8名CMV血清阳性供者中产生CMVST的库，所述供者被选择来代表移植群体的不同HLA谱(表1)。从单次抽血(中值为425ml)中分离出中值为7.7x10⁸个(范围为4.6-8.8x10⁸)的PBMC。为了扩增CMVST，将PBMC暴露于跨越pp65和IE1的肽混合物，并且培养超过20天，实现了102±12的平均倍数扩增(图3A)。所得的细胞几乎全部是CD3+(99.3±0.4％)，包括CD4+(21.3±7.5％)和CD8+(74.7±7.8％)亚组，它们表达中央CD45RA-/62L+(58.5±4.8％)和效应子CD45RA-/62L-(35.3±4.6％)记忆标志物(图3B)。所有8个细胞系对刺激性CMV抗原都具有反应性((IE1 419±100 SFC/2x10⁵和pp65 1069±230，图3C)。表1概述了细胞系的特征。在这8个细胞系当中，有6种产品被施用于10名接受治疗的研究患者。

筛选：29名患有CMV感染的同种异体HSCT受者由其主要BMT提供者转介参与研究，并从8个细胞系的库中鉴定了适合的产品(最小2/8HLA匹配阈值)用于在28个病例中进行输注(96.6％；95％CI:82.2％-99.9％)。基于对之前第三方研究进行的回顾性分析确定了2/8的HLA配型阈值，所述研究证明了与施用此类HLA匹配的产品相关的临床益处。HLA I类或II类匹配似乎不影响结果。值得注意的是，在当前研究中，大多数产品在≥4种抗原上匹配(图1D)。在28名有可用细胞系的患者中，17名患者没有接受细胞，因为他们对标准抗病毒治疗有反应，1名患者因近期DLI而不合格。

接受治疗的患者的特征：表2概述了10名接受持续感染治疗的患者(儿童n＝7，成人n＝3)的特征，所述患者包括2名非裔美国人受者、3名西班牙裔白人患者和5名非西班牙裔高加索人受者。10名患者中有3名已确诊病毒相关疾病[CMV视网膜炎(n＝1)，CMV结肠炎引起的腹泻(n＝2)]。在移植后第46天与第365天(中值第133天)之间施用CMVST(在2-6/8HLA抗原上匹配)。7名患者出现了中位时间为24天(平均48天；范围为14至211天)的标准抗病毒治疗难治性的感染，3名患者携带具有对常规抗病毒药物产生了耐药性的突变的病毒。在进行免疫治疗干预之前，这些患者中有6位经历了与常规抗病毒药物相关的严重不良事件(SAE),包括急性肾损伤(n＝4)、膦甲酸盐诱导的肾小管病(n＝1)和严重的膦甲酸盐相关胰腺炎(n＝1),其中3例排除任何常规药物的进一步治疗。

临床安全性：所有的输注都被良好地耐受。除了一名患者在输注后8小时出现短暂的孤立性发热外，未观察到直接毒性。一名患者的躯干出现轻度斑丘疹，这似乎表明是病毒性皮疹，在没有局部或全身治疗的情况下，几天内自行消退。没有观察到细胞因子释放综合征(CRS)或其它与输注的CMVST相关的毒性的病例，并且没有患者出现移植物衰竭、自身免疫性溶血性贫血或移植相关微血管病。对于急性GvHD，对患者随访6周，对于慢性GvHD，对患者随访12个月。尽管患者与输注的细胞之间存在HLA差异，但没有患者在治疗后复发或从头发生急性或慢性GvHD(表3)，包括3名具有急性GvHD既往病史[II级(n＝2)或III级(n＝1)]的患者。

临床反应：到第6周，所有10名接受输注的患者对CMVST均有反应，其中7例CR，3例PR，累积反应率为100％(95％CI:69.2-100.0％)。第6周的平均血浆病毒载量减少为89.8％(+/-21.4％)。图4概述了基于连续病毒载量测量的所有接受治疗的患者的病毒学结果。值得注意的是，不仅在难治性感染的患者中，而且在3名患有组织疾病[CMV视网膜炎(n＝1)，由CMV结肠炎引起的腹泻(n＝2)]的个体中也获得了临床益处。

8名患者接受了单次CMVST输注，1名患者(3976)接受了2次输注，1名患者(4201)接受了3次CMVST输注。患者3976在第6周具有CR，但在第10周复发，病毒载量增加。第一次输注后80天，他接受了使用相同的CMVST系的第二次输注，这导致了持续的CR。患者4201在首次施用后28天接受了相同CMVST的第二次输注，但没有反应，因此，2周后用不同的CMVST系进行了第三次输注，并获得了持续的CR。在这些患者中实现的临床和病毒学反应与10名接受治疗的患者中的8名患者的病毒反应性CMVST增加[从输注前的平均126±84 SFC增加到443±178/5x10⁵个PBMC的峰值(p＝0.023；图5A)]相关联。

T细胞持久性：为了评估CMVST输注是否有助于在这些患者中观察到的保护作用，并评估这些部分HLA匹配的VST的体内寿命，在输注之前和之后，使用限制于输注细胞系的HLA限制性表位肽，在患者PBMC中检测CMVST的特异性。在5例可获得HLA-限制性肽试剂的患者中检测到确认的第三方来源的功能性T细胞，这种情况持续了长达12周；在所有8名患者中，观察到患者与CMVST细胞系之间共享的HLA等位基因限制的抗病毒反应(图5B)。因此，可以推断，输注的CMVST诱导了抗病毒作用，从而导致对CMV感染的控制。

在I期试验中，施用第三方CMVST来治疗在用更昔洛韦和/或膦甲酸盐治疗至少14天已经失败了或不能耐受标准抗病毒药剂的同种异体HSCT受者的CMV感染/疾病。值得注意的排除标准是患有活动性GvHD或接受中等或高剂量皮质类固醇的患者。CMVST的库由仅8名健康供者产生，所述供者是根据其HLA谱精心选择的，以广泛覆盖不同种族和民族的同种异体HSCT患者群体。实际上，在筛选参与研究的29名患者中，鉴定出了对28名(96.6％；95％CI:82.2-99.9％)合适的细胞系(最小2个共享HLA抗原阈值)，证明了用小的、良好选择的细胞库提供宽患者覆盖范围的可行性。在这28名患者中，10名来自不同背景的患者(2名非洲裔美国人，3名西班牙裔白人和5名非西班牙裔高加索人)接受了治疗，并且均获得了病毒学和临床益处，没有出现急性或慢性GvHD或其它毒性。这是值得注意的，因为6名患者之前经历过与常规抗病毒药物相关的严重不良事件，包括急性肾损伤、肾小管病和胰腺炎。该I期试验展示了使用第三方病毒反应性T细胞治疗难治性CMV感染的安全性和临床益处，所述T细胞来自精心设计的小型供者库。

尽管近几十年来发病率下降，但CMV仍然是同种异体HSCT后的主要发病原因；在最近的CIBMTR报告中，对9469名患者[从2003年至2010年针对AML(n＝5310)、ALL(n＝1883)、CML(n＝1079)和MDS(n＝1197)移植的]的数据进行了询问，CMV再激活与所有4种疾病类别中较高的非复发死亡率以及较低的总存活率相关联。此外，在最近一项对2008年至2013年间移植的208名患者的研究中，发现CMV再激活患者的平均住院时间延长了26天，而超过一次CMV再激活事件的发生使同种异体HSCT的费用增加了25-30％(p<0.0001)，这突显了CMV管理的经济负担。

膦甲酸盐和更昔洛韦经常用于治疗HSCT后的CMV感染。然而，除了更昔洛韦用于治疗CMV视网膜炎外，它们的使用是非适应症的(off-label)，并且这两种药物都与显著的副作用，特别是肾脏疾病和移植物抑制相关联。在预防性使用时，乐特莫韦(letermovir)(一种巨细胞病毒DNA终止酶复合物抑制剂)降低了移植后CMV感染/再激活的发生率6，并且自2017年FDA批准(用于成年HSCT患者的CMV预防)以来，越来越多地用于高危患者。然而，多学科CMV药物开发论坛的CMV耐药性工作组预计，如果CMV突破性感染确实发生，则乐特莫韦的更广泛地预防性使用将增加对常规抗病毒药物具有耐药性的生物体出现。事实上，越来越多的报道称存在对乐特莫韦耐药的CMV株，这些耐药患者的临床结果很差，并且与进行性组织疾病和死亡相关。

正如我们小组和其他人先前报道的，CMVST提供了靶向初始再激活以及耐药病毒株的替代策略。事实上，在目前的研究中，接受CMVST治疗的患者中有30％感染了被确认对一种或多种常规抗病毒药物具有耐药性的病毒株。

当前研究的一个目标是制备具有足够多样性以覆盖大多数接受治疗的同种异体HSCT受者的CMV特异性T细胞库。因此，前瞻性地将＞600名同种异体HSCT受者的HLA类型与多个健康的合格(CMV血清阳性)供者池的HLA类型进行比较，从所述供者池中可以产生CMVST以鉴定将为患者提供良好匹配的产品的最小队列。使用该模型，发现只有8个精心挑选的供者将为>95％的患者群体提供在至少2种HLA抗原上相匹配的T细胞产品；进一步增加供者池不会显著增加匹配的数量。目前的研究(其为29名接受临床参与筛查的患者中的28名(96.5％)确定了合适的细胞系)支持这样的理论，即这样的供体库可以有效地供应大多数同种异体HSCT患者群体。

将移植患者群体与美国移植群体的种族和民族多样性进行了比较(表4)。结果表明我们的患者群体的多样性与美国群体相似，如果不是比其稍微更多样的话。这表明为当前研究开发的小型细胞库可以在全国范围内广泛应用于临床用途。由于能够从单个供者集合中产生足够的材料来产生>2,000次输注的细胞，因此在移植中心普遍使用经过测、试的CMVST变得更加可行。因此，人们可以设想“现成的”第三方病毒反应性T细胞的分散分布模式，确保细胞的按需可用性。

总之，数据表明，从仅8个精心选择的第三方供者制备的良好表征的CMV反应性T细胞库可以为大多数患有难治性CMV感染的患者提供适当匹配的细胞系，所述细胞系可以提供安全有效的抗病毒活性。

表1.产生的VST系的特征。

SFC＝斑点形成细胞；*＝表示VST系被确定为最适合用于筛查患者的细胞系的频率。

表2.患者特征

AML:急性髓性白血病，ALL：急性淋巴母细胞性白血病，HLH：噬血细胞性淋巴组织细胞增多症，CTCL：皮肤T细胞淋巴瘤，SCID：严重联合免疫缺陷，MRD：匹配的相关供者，UCB：脐带血，MUD：匹配的无关供者，MMUD：错配的无关供者，Haplo：单倍相合的，R/D：受者/供者，AKI：急性肾损伤，CR：完全反应，PR：部分反应，AdV：腺病毒

表3.输注前后的GvHD

aGvHD：急性移植物抗宿主病，cGvHD：慢性移植物抗宿主病，GI：胃肠，Rx：治疗，PPx：预防。

表4.同种异体HSCT受者的种族多样性。在美国的分析中，共有174个项目移植中心。在2013年1月1日至2015年12月31日的三年时间窗内，这些中心中的每一个都至少进行了一次无关或相关的供者移植。

实施例2.第三方T细胞的预防活性：用于预防allo-HSCT后感染的多病毒特异性T淋巴细胞

在健康个体中，T细胞免疫防御BKV病毒和其它病毒。在allo-HSCT受者中，使用强效的免疫抑制方案(以及随后相关的免疫受损)会使患者易受严重的病毒感染。因此，我们的方法是通过施用离体扩增的、非遗传修饰的病毒特异性T细胞(VST)来恢复T细胞免疫，以控制病毒感染并消除症状，持续一段时间，直至恢复移植患者的自身免疫系统。为了实现这一目标，我们从健康的、预筛选的血清阳性的供者获得的外周血单核细胞(PBMC)中前瞻性地制造了VST，所述VST可作为部分HLA匹配的“现成”产品使用。Viralym-M是一种这样的“现成”产品。

Viralym-M专门针对五种病毒[EBV、CMV、AdV、BKV和人疱疹病毒6(HHV6)]。如实施例1所述构建供者微型库，用于制备Viralym-M细胞系。我们的目标是产生足够多样化的微型库，以覆盖大多数推荐治疗的同种异体HSCT受者。

Viralym-M制造工艺是如本发明人先前在WO2013/119947和Tzannou等人，J ClinOncol.2017年11月1日；35(31:3547-3557中所描述的(所述文献中的每一篇均通过引用以其整体并入本文)，并概述于图1中。简言之，从健康血清阳性供者中分离PBMC，并在G-Rex100M培养系统(Wilson Wolf,Saint Paul,MN)中，在完全培养基、覆盖Viralym M抗原(腺病毒、CMV、EBV、BKV和HHV6)的肽混合物、IL-4和IL-7存在的情况下，在37℃、5％CO₂下培养250x10⁶个PBMC约7-14天(尽管在一些情况下，培养时间可能延长至约18天)。培养后，收获Viralym M细胞系，洗涤，并等分用于在液氮中冷冻保存，直至用于质量控制测试或用作治疗剂。

在2期开放性标签的概念验证试验(open-label proof-of-concept trial)中评估了Viralym-M，其中向58名患有难治性感染的同种异体HSCT患者施用了VST。该试验被称为CHARMS。CHARMS(其优越性或重要性没有统计学依据)的主要目的是确定在患有持续性病毒再激活或感染的HSCT患者中施用对五种病毒特异的部分HLA匹配的多-VST疗法的可行性和安全性。如果患者患有BKV、CMV、AdV、EBV、HHV-6和/或JCV感染，尽管进行了标准抗病毒疗法，但所述感染仍然复发、被重新激活或持续，则患者具有接受任何类型同种异体移植的资格。

为了评估多病毒特异性T细胞(Viralym-M细胞)的同种异体反应潜力，我们首先用跨越源自每种病毒的免疫原性抗原的肽混合物直接活化PBMC；-Adv(六邻体和五邻体)、CMV(IE1和pp65)、EBV(LMP2、EBNA1、BZLF1)、BK病毒(VP1和大T)和HHV6(U90、U11和U14)。然后，我们将细胞转移到补充有IL4+7的T细胞培养基中的G-Rex装置并评估其针对HLA错配靶标的细胞毒性活性。这些细胞表现出最小的/检测不到的同种异体反应性，支持这些细胞作为“现成的”部分HLA匹配的产品在施用时的潜在安全性。

我们随后探索了部分HLA匹配的Viralym-M细胞用于在同种异体HSCT后治疗儿童和成人的难治病毒感染的安全性和临床效果(Tzannou等人，JCO，2017)。所有的输注都被良好地耐受。除3名患者在输注后24小时内出现短暂发热和1名患者出现淋巴结疼痛外，未观察到任何急性毒性。患者均未出现细胞因子释放综合征(CRS)。在输注后接下来的几周内，1例患者在类固醇快速减量后出现复发性III级胃肠道(GI)GVHD，8例患者出现复发性(n＝4)或从头出现(n＝4)I-II级皮肤GVHD，所述GVHD在施用局部治疗(n＝7)和逐渐减量后重新开始施用皮质类固醇(n＝1)后得以消退。

对于提供可评估数据的52名接受治疗的患者中的60例感染，在Viralym-M输注后第6周，累积临床反应率为93％，如下所概述的：

·BKV：22名患者接受了Viralym-M以治疗持续性病毒BKV感染和组织疾病(20名患有BK出血性膀胱炎，2名患有BKV相关肾炎)。在接受Viralym-M治疗后，所有20名BK-HC患者的临床症状均消退，其中9例完全反应(CR),11例部分反应(PR),6周累计反应率为100％。

·CMV：20名患者接受Viralym-M以治疗持续性CMV。19名患者对Viralym-M有反应，其中7名为CR，12名为PR，1名为无反应(NR)，6周累计反应率为95％。响应者包括3名结肠炎患者中的2名和1名脑炎患者。

·AdV：11名患者接受了Viralym-M以治疗持续AdV，输注产生了7名CR、2名PR和2名NR，6周累积反应率为81.8％。

·EBV：三名患者接受了Viralym-M以治疗持续性EBV。两名患者获得病毒学CR，一名患者获得PR。

·HHV6：四名患者接受了Viralym-M以治疗HHV6再激活，所述患者包括一名难治性脑炎患者，三名患者在输注后6周内出现PR(包括那名脑炎患者)，而一名患者对治疗无反应。

·双重感染：8名患者接受了Viralym-M以治疗两种病毒感染，单次输注后总体经历12次CR和4次PR。CMV、AdV和EBV在所有病例中均被清除，所有BKV HC患者均有临床改善(n＝3)或疾病消退(n＝2)，HHV6脑炎患者也有临床改善。

我们检查了来自我们的I/II期Viralym-M研究的可用数据，以确定是否存在与临床功效相关的HLA匹配阈值。在我们的临床试验中，临床使用的产品在1/8(n＝2)、2/8(n＝10)、3/8(n＝11)、4/8(n＝14)、5/8(n＝14)、6/8(n＝4)或7/8(n＝5)HLA等位基因上匹配。为了确定临床结果是否与HLA匹配程度相关，我们将患者分为完全反应(CR)、部分反应(PR)和无反应(NR)，但如图35中所概述的，结果表明基于HLA匹配等位基因数量的结果没有差异。

接下来，我们研究了基于仅在HLA I类上、仅在II类上或两者的组合上匹配的细胞系的施用是否结果有差异。值得注意的是，大多数患者接受了I类和II类等位基因都匹配的细胞系，并且结果再次表明结果不受等位基因匹配程度的影响。

此外，重要的是，CHARMS研究表明，使用不止一种不同的VST产品(Viralym M)是安全有效的，即使第二细胞系高度错配。例如，如Tzannou(2017)中所报告的，数名患者接受了两个单独细胞系的施用，具有有益反应：

表5：选定的患者反应(修改自Tzannou(2017))。

此外，如下面表6(修改自Tzannou(2017))所示，接受至少两种细胞系的施用的这些患者到治疗的第6周时未显示或几乎未显示GVHD或者在1年的治疗内未显示或几乎未显示cGVHD。

表6：选定的患者反应。

缩写：GVHD：移植物抗宿主病；aGVHD：急性GVHD；cGVHD：慢性GVHD；N/A：不适用。

因此，来自该I/II期数据的这些结果表明，>95％的患者接受了在≥2个HLA等位基因上匹配的产品，这与临床益处相关。HLA I类或II类上匹配似乎不会影响结果，也不会影响细胞的安全性谱，对给定患者施用不止一种细胞系也不会影响结果，即使当第二细胞系是高度不匹配的亦如此。

然后检查数据，寻找第三方T细胞具有预防潜力的证据。

首先，在总共4名患者中证实了具有针对患者没有再激活的病毒的特异性的第三方VST的持续性。例如，一名患者(在2个等位基因上与用于治疗的VST系有HLA匹配；见表7)接受BK HC治疗。输注的VST系具有在HLA-A2(共享等位基因)的背景下介导的BKV和CMV活性。通过分析在DR3(VST系独有的)的背景下出现的免疫反应来追踪VST的持续性。通过追踪对B40和DR13(患者特有的等位基因)呈递的肽的免疫反应来监测内源性免疫重建。

表7.患者和第三方VST细胞系的等位基因

患者	A2,3	B40	C3	DR13	DQ6
						VST系	A2	B8,15	C3,7	DR3,4	DQ2,3

甚至在输注后4周，可以检测到针对HLA-A2的背景下呈递的肽的肽特异性免疫反应，其是CMV特异性的。(图6)。还可检测到DR3的背景下的CMV特异性反应，表明存在第三方VST(图6)。因此，该研究表明，令人惊讶的是，在接受BK HC治疗的患者中输注第三方VST提供了预防性CMV覆盖，其防止了CMV再激活。如下文详细描述的，在其它患者中观察到类似的模式，证实了VST在体内持续至输注后12周。

此外，在输注后出现病毒再激活的患者中检测到第三方VST。所述患者接受VST治疗BKV HC。随后，患者再激活了CMV。图7显示了患者的BK反应。观察到输注后对应于BKV特异性T细胞扩增的病毒载量降低的典型特征谱(图7)。CMV再激活发生在VST输注后两周。病毒载量和T细胞扩增如图8所示。病毒在VST输注后2周一旦再活化，CMV特异性T细胞就产生反应，在没有其它药物的情况下控制病毒。在第4周的时间点，使用上述持续性分析证实了第三方VST的存在。CMV特异性细胞至少保留至第12周，并且在第12周检测不到CMV病毒载量。

图9A-图9E中提供了在受者中持续存在的Viralym-M来源的T细胞的额外证据。例如，在一名接受BK感染治疗的患者中，在输注后至少3周(最后一个测试时间点)仍可检测到Viralym-M来源的HHV6和EBV特异性T细胞。在该患者中检测到的肽反应性是EBV-LMP2 HLA-A1限制性反应和HHV6-U90 HLA-A1限制性反应。这些特异性对于输注的细胞系是独特的，并且患者不表达HLA-A1。因此，检测到的活性源自持续至少3周的输注的VST系(图9A)。在第二个接受BK感染治疗的患者中，在输注后4周(最后一个测试时间点)检测到了Viralym-M来源的CMV特异性T细胞。在该患者中检测到的肽反应性是CMV-IE1 HLA-B限制性反应和CMV-pp65HLA-DR4限制性反应，这两种反应对于输注的细胞系都是独特的，并且患者不表达HLA-B8或DR4；从而证实了检测到的活性源自输注的VST系(图9B)。在接受AdV感染治疗的一名患者中，在第二次输注后3周(最后一个测试时间点)检测到了Viralym-M来源的CMV特异性T细胞。检测到的肽反应性是CMV-pp65 HLA-DR4限制性反应，该反应对于输注的细胞系是独特的，并且患者不表达HLA-DR4。因此，检测到的活性源自输注的VST系(图9C)。在另一名接受AdV感染治疗的患者中，在输注后4周(最后一个测试时间点)检测出Viralym-M来源的CMV特异性T细胞。检测到的肽反应性是CMV-IE1 HLA-B8限制性反应，该反应对于输注的细胞系是独特的，并且患者不表达HLA-H8。因此，在该患者中检测到的活性源自输注的VST系(图9D)。最后，在另一名接受BKV感染治疗的患者中，在输注后12周(最后一个测试时间点)检测出了Viralym-M来源的CMV特异性T细胞。检测到的肽反应性是CMV-pp65 HLA-DR4限制性反应和DR15限制性反应，这两种反应对于输注的细胞系都是独特的，并且患者不表达HLA-DR4或DR15。因此，在至少12周内所述活性是可检测的，并且源自输注的VST系(图9E)。

表8总结了使用Viralym-M进行预防性保护的证据。在使用Viralym-M治疗活动性BKV或AdV的患者中，至少在所指示的3周、4周或12周内检测到CMV VST。在上面和图7中论述的患者中，无需进一步治疗即可消除再激活的CMV，并且在施用Viralym-M后至少12周检测到CMV特异性VST。在受评估的其他四名患者中，没有发生针对其检测到对第三方T细胞的病毒的再激活。

表8.第三方VST在受者中的持续性和预防性保护。

*VST检测的持续时间表示在每个受试者中测试的最后时间点。因此，VST至少持续了每名患者的指定持续时间，并且可能持续更长时间。

因此，引人注目的是，第三方VST的输注除了靶向活动性感染之外，还提供了针对尚不存在或尚未再激活的病毒的预防性保护。因此，第三方VST组合物和方法可用于在体内预防性地提供广谱保护。对于因任何原因而免疫受损的患者来说，这是一个特别重要的临床优势。所述预防方法的示意图如图10所示。

实施例3.针对第三方VST的预防性治疗的临床研究

进行了Viralym-M用于在同种异体HSCT之后的高危患者中预防临床上显著的病毒感染(AdV、BKV、CMV、EBV和HHV6)的II期双盲安慰剂对照试验。研究目标包括功能性Viralym-M T细胞的持续性；需要治疗的AdV、BKV、CMV、EBV和/或HHV6感染的减少或疾病发展的减少；供者移植的成功；移植后1年的全因死亡率和无复发死亡率。纳入标准包括任何年龄的allo-HSCT受者，所述受者处于临床上显著的病毒感染的高风险(例如，定义为使用来自无关供者或单倍相合供者的骨髓、单/双脐带血或外周血干细胞接受清髓性allo-HSCT的患者；接受T细胞耗尽的移植物的患者或接受移植后环磷酰胺的患者)中，其对于AdV、BKV、CMV、EBV和/或HHV6是血清反应阳性的。患者在筛查时必须无症状。排除标准：正在接受皮质类固醇(泼尼松剂量>0.5mg/kg/日或等效剂量)的治疗；在招募筛选的28天内，使用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、阿仑珠单抗(Campath-1H)或其它免疫抑制性T细胞单克隆抗体的既往治疗；在招募筛选的28天内接受了供者淋巴细胞输注(DLI)或CD34+干细胞补充；>2级急性GVHD的证据；存在其它进行性感染(可以是病毒、真菌或细菌引起的；进行性感染被定义为可归因于脓毒症的血液动力学不稳定性或可归因于感染的新症状、恶化的体征或放射影像学发现)；脑炎的存在；要求FiO2>0.5以保持动脉血氧饱和度>90％；尽管输注了RBC，但血红蛋白仍<8gm/dL；肾功能不全定义为估计的肾小球滤过率(GFR)<30ml/min/1.73m2；怀孕或哺乳以及原发性恶性肿瘤复发的女性。

移植前将征得患者同意并对其进行筛选。如果患者符合资格标准，他们将被招募并随机分组。随机化后，患者将在移植后28天接受2x10⁷个Viralym-M细胞(体重≤40kg)或4x10⁷个Viralym-M细胞(体重>40kg)(或)安慰剂的固定细胞剂量输注(前提是他们在输注时符合资格标准)。将监测患者的病毒血症和病毒尿症，并且/或者监测病毒特异性第三方VST的持续性。一些受试者可以接受相同和/或不同第三方VST的多次输注。例如，可以向患者施用第一剂量的第三方VST，然后在约6周、约8周、约10周或约12周后施用第二剂量。在研究期间和/或直至患者不再免疫受损，一些受试者可以约每6周一次、约每8周一次、约每10周一次或约每12周一次继续接受第三方VST。该研究将表明，在免疫受损的患者中，通过施用第三方VST可以预防AdV、BKV、CMV、EBV和/或HHV6感染，即使第三方VST是在任何病毒感染或病毒再激活之前施用的。

进行了类似的研究，以评估利用HHV8、HBV或SARS-CoV-2专用第三方VST的预防性疗法。向不具有可检测的病毒的患者施用HHV8、HBV或SARS-CoV-2专用第三方VST，并监测患者体内的病毒载量和/或病毒特异性第三方VST的持续性。一些受试者可以接受相同和/或不同的指定病毒专用第三方VST的多次输注。例如，可以向患者施用第一剂量的HHV8、HBV或SARS-CoV-2专用第三方VST，然后在约6周、约8周、约10周或约12周后施用第二剂量。在研究期间和/或直至患者不再免疫受损，一些受试者可以约每6周一次、约每8周一次、约每10周一次或约每12周一次继续接受第三方VST，。该研究将表明，通过施用第三方VST，即使在任何病毒感染或再激活之前施用第三方VST的情况下，也可以在免疫受损患者中相应地预防并且/或者容易地控制HHV8、HBV和SARS-CoV-2。

进行了类似的研究，以评估利用RSV、流感病毒、PIV和hMPV专用第三方VST的预防性治疗。向不具有可检测的病毒的患者施用RSV、流感病毒、PIV和hMPV专用第三方VST，并监测受者体内病毒载量和/或病毒特异性第三方VST的持续性。一些受试者可以接受相同和/或不同的指定病毒专用第三方VST的多次输注。例如，可以向患者施用第一剂量的RSV、流感病毒、PIV和hMPV专用第三方VST，然后在约6周、约8周、约10周或约12周后施用第二剂量。

在研究期间和/或直至患者不再免疫受损，一些受试者可以约每6周一次、约每8周一次、约每10周一次或约每12周一次继续接受第三方VST。例如，可以向患者施用第一剂的RSV、流感病毒、PIV和hMPV专用第三方VST，然后在6周、8周、10周或12周后施用第二剂量。在研究期间和/或直至患者不再免疫受损，一些受试者可以每6周一次、每8周一次、每10周一次或每12周一次继续接受第三方VST。该研究将表明，通过施用第三方VST，即使在任何病毒感染或再激活之前施用第三方VST情况下，也可以在免疫受损患者中相应地预防并且/或者容易地控制RSV、流感病毒、PIV和hMPV。

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Claims (58)

1.一种通过第三方同种异体T细胞疗法预防病毒感染或潜伏病毒再激活的方法，所述方法包括向患者预防性施用第一抗原特异性T细胞系，所述第一抗原特异性T细胞系是多克隆的第三方T细胞系，所述T细胞系包含针对一种或多种病毒抗原的抗原特异性，并且所述T细胞系包含在2个或更多个HLA等位基因上与所述患者的HLA类型相匹配的HLA类型。

2.一种通过第三方同种异体T细胞疗法控制病毒感染或潜伏病毒再激活的方法，所述方法包括向患者预防性施用第一抗原特异性T细胞系，所述第一抗原特异性T细胞系是多克隆的第三方T细胞系，所述T细胞系包含针对一种或多种病毒抗原的抗原特异性，并且所述T细胞系包含在2个或更多个HLA等位基因上与所述患者的HLA类型相匹配的HLA类型。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述患者比一般人群中的普通人具有更高的发生病毒感染或发生潜伏病毒再激活的风险。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述病毒感染对所述患者的健康或生命造成的风险大于此类感染对一般人群中的普通人造成的风险。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中当施用所述T细胞系时，所述患者未显示出活动性病毒感染或潜伏病毒再激活的证据。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中当施用所述T细胞系时，所述患者不具有可检测到的病毒血症或病毒尿症。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述患者的淋巴细胞绝对计数小于800个淋巴细胞/μL血液。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述患者缺乏内源性T细胞。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述患者对AdV、BKV、CMV、EBV、HHV6、HHV8、RSV、流感病毒、PIV、hMPV HBV和SARS-CoV-2中的任一种或多种呈血清阳性。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中向所述患者多次施用所述第一抗原特异性T细胞系。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在第一次施用后约4-12周，在第二次施用中向所述患者施用所述第一抗原特异性T细胞系。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中约每4-12周向所述患者施用所述第一抗原特异性T细胞系。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述患者是免疫受损的，并且其中约每4-12周向所述患者施用所述第一抗原特异性T细胞系，直至所述患者不再是免疫受损的。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中向所述患者施用包含肽或全抗原的组合物，所述肽或全抗原对应于所述第一抗原特异性T细胞系对其具有特异性的抗原，并且其中在施用所述第一抗原特异性T细胞系后约4到12周向所述受试者施用所述肽或全抗原。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述组合物还包含佐剂。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中

(a)还包括向所述患者施用一种或多种第二抗原特异性T细胞系；或者

(b)还包括向所述患者施用2、3、4、5、6、7、8、9或10种以上的第二抗原特异性T细胞系。

17.如权利要求16所述的方法，其中同时向所述患者施用所述第一和所述第二抗原特异性T细胞系。

18.如权利要求16所述的方法，其中依次向所述患者施用所述第一和所述第二抗原特异性T细胞系。

19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其中向所述患者多次施用所述一种或多种第二抗原特异性T细胞系。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述患者是免疫受损的，并且其中约每6-12周向所述患者施用所述一种或多种第二抗原特异性T细胞系，直至所述患者不再是免疫受损的。

21.如权利要求16-20中任一项所述的方法，其中至少一种、以及任选地每种第二抗原特异性T细胞系与所述第一抗原特异性T细胞系包含相同的抗原特异性，但产生自不同的供者。

22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中在所述患者与所述第一抗原特异性T细胞系和/或如果施用的话任何第二抗原特异性T细胞系之间匹配的所述2个或更多个HLA等位基因包括至少2个HLAI类等位基因；至少2个HLAII类等位基因；或至少1个HLA I类等位基因和至少1个HLAII类等位基因。

23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述病毒感染来自选自以下的病毒：EBV、CMV、腺病毒、BK、JC病毒、HHV6、RSV、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、冠状病毒、LCMV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、人偏肺病毒、细小病毒B、轮状病毒、默克尔细胞病毒、单纯疱疹病毒、HPV、HIV、HTLV1、HHV8、HBV、西尼罗病毒、寨卡病毒和埃博拉病毒。

24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二抗原特异性T细胞系包含针对来自单一病毒的至少一种抗原或其部分的抗原特异性。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述单一病毒选自EBV、CMV、腺病毒、BK、JC病毒、HHV6、RSV、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、冠状病毒、LCMV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、人偏肺病毒、细小病毒B、轮状病毒、默克尔细胞病毒、单纯疱疹病毒、HPV、HIV、HTLV1、HHV8、HBV、西尼罗病毒、寨卡病毒和埃博拉病毒。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述单一病毒是HBV病毒或HHV8病毒。

27.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述第一抗原特异性T细胞系包含针对来自所述单一病毒的两种或更多种抗原或者其部分的特异性。

28.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述第一抗原特异性T细胞系包含针对来自至少两种不同病毒的至少一种抗原或其部分的抗原特异性。

29.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述第一抗原特异性T细胞系包含针对来自1-10种不同病毒的至少一种抗原或其部分的抗原特异性。

30.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述第一抗原特异性T细胞系包含针对来自至少两种不同病毒中每一种的2-5种抗原或来自至少两种不同病毒中每一种的2-5种抗原的至少一部分的抗原特异性。

31.如权利要求13-30中任一项所述的方法，其中所述第二抗原特异性T细胞系包含针对来自1-10种不同病毒的至少一种抗原或其部分的抗原特异性。

32.如权利要求13-31中任一项所述的方法，其中所述第二抗原特异性T细胞系包含针对来自至少两种不同病毒中每一种的2-5种抗原或来自至少两种不同病毒中每一种的2-5种抗原的至少一部分的抗原特异性。

33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述抗原是来自选自以下的病毒的病毒抗原：EBV、CMV、腺病毒、BK、JC病毒、HHV6、RSV、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、冠状病毒、LCMV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、人偏肺病毒(HMPV)、细小病毒B、轮状病毒、默克尔细胞病毒、单纯疱疹病毒、HPV、HIV、HTLV1、HHV8、HBV、西尼罗病毒、寨卡病毒和埃博拉病毒。

34.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述第一和/或所述第二抗原特异性T细胞包含针对来自以下病毒中每一种的至少一种抗原的特异性：RSV、流感病毒、副流感病毒和HMPV。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述流感病毒抗原选自甲型流感病毒抗原NP1、MP1及其组合；所述RSV抗原选自N、F及其组合；病毒hMPV抗原选自F、N、M2-1、M及其组合；并且所述PIV抗原选自M、HN、N、F及其组合。

36.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述第一和/或所述第二抗原特异性T细胞包含针对来自以下病毒中每一种的至少一种抗原的特异性：EBV、CMV、腺病毒、BK、HHV6。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述EBV抗原选自LMP2、EBNA1、BZLF1及其组合；所述CMV抗原选自IE1、pp65及其组合；所述腺病毒抗原选自六邻体、五邻体及其组合；所述BK病毒抗原选自VP1、大T及其组合；以及所述HHV6抗原选自U90、U11、U14及其组合。

38.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述第一和/或所述第二抗原特异性T细胞包含针对来自HBV的至少一种抗原的特异性。

39.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述第一和/或所述第二抗原特异性T细胞包含针对来自HHV8的至少一种抗原的特异性。

40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原特异性T细胞通过在所述抗原或其部分存在的情况下，培养来自合适供者的单核细胞而产生，所述供者具有在2个或更多个HLA等位基因上与所述患者的HLA类型相匹配的HLA类型。

41.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原特异性T细胞通过在跨越所述抗原或其部分的肽混合物存在的情况下培养来自合适供者的单核细胞而产生，所述供者具有在2个或更多个HLA等位基因上与所述患者的HLA类型相匹配的HLA类型。

42.如权利要求40或41所述的方法，其中所述培养在IL4和IL7存在的情况下进行。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述肽混合物包含15聚体肽。

44.如权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述肽混合物中跨越所述抗原的所述肽在序列上重叠11个氨基酸。

45.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者是免疫受损的。

46.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者由于所述患者为治疗疾病或疾患而接受的治疗而免疫受损。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述治疗是造血干细胞移植、实体器官移植或抗癌剂。

48.如权利要求46所述的方法，其中所述患者为治疗疾病或疾患而接受的治疗选自由减低强度预处理、清髓性调理、非清髓性调理、化学疗法和免疫抑制药物。

49.如权利要求45所述的方法，其中所述患者因年龄而免疫受损。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述患者的年龄小于1岁。

51.如权利要求49所述的方法，其中所述患者的年龄超过65岁。

52.如权利要求45所述的方法，其中所述受试者患有免疫缺陷疾患。

53.如权利要求45所述的方法，其中所述免疫缺陷是原发性免疫缺陷。

54.如权利要求45所述的方法，其中所述受试者患有HIV感染。

55.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者需要移植疗法。

56.如权利要求45所述的方法，其中所述患者患有白血病、骨髓瘤或淋巴瘤，并且需要造血干细胞移植疗法。

57.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一T细胞系和/或一种或多种第二T细胞系在体内持续至少12周。

58.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述患者中无任何活动性感染的情况下，所述第一T细胞系和/或一种或多种每种第二T细胞系在体内持续至少12周。

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