CN114544834A - 一种静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学分析检测，为了定量检测酱油中多种挥发性风味成分的含量，提供了一种静态顶空‑气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，包括如下制备步骤：(1)使用内标化合物配制内标工作溶液；(2)样品前处理：移取酱油样品至顶空瓶中，并加入步骤(1)中的内标工作溶液后密封；(3)将步骤(2)中装有样品的顶空瓶顶空进样后，进行气相色谱检测并对结果进行分析。本发明的静态顶空‑气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，能够高效且准确检测酱油中多种挥发性物质的含量。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析检测的技术领域，具体而言，涉及一种静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法。
背景技术
酱油是用大豆、小麦、麸皮酿造的一种传统调味品，在中国、日本、韩国及东南亚等地区广泛使用。其主体成分包括水分、无机盐、蛋白质、氨基酸、糖类、有机酸和微量香味成分等。酱油的发酵生产工艺主要为高盐稀态发酵和低盐固态发酵，其中高盐稀态发酵生产的酱油因周期长、酱香浓郁、口味好，是目前主要的市售类型。
20世纪60年代以来，随着色谱技术逐渐成熟，气相色谱仪、气相色谱-质谱联用仪不断普及，酱油中挥发性风味成分的研究逐渐增多。现有报道中，定性鉴别酱油中挥发性风味成分的主要方法是：固相微萃取-气相色谱质谱法和液液萃取-气相色谱质谱法，所鉴别获得的酱油中挥发性香味成分超过100种，主要包括以乙醇、异丁醇、苯乙醇为代表的醇类，以乙酸乙酯、乳酸乙酯为代表的酯类，以乙醛、异丁醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛为代表的醛类，以乙酸、丁酸为代表的酸类，及一些吡咯、吡嗪类化合物。
然而，在定量研究方面，现有研究多采用液液萃取或固相微萃取-气相色谱质谱-面积归一化法、吹扫捕集或固相微萃取-气相色谱质谱-内标法。面积归一化法，尽管操作简单，却未校正质谱检测器上不同组分间的灵敏度差异，结果不准确；现有报道的内标法，实质多为采用2-辛醇或3-辛醇为内标物的一种半定量方法，未见系统的分析方法学研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，其能够高效且准确检测酱油中多种挥发性物质的含量。
本发明的实施例通过以下技术方案实现：本发明的静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，包括如下制备步骤：
(1)使用内标化合物配制内标工作溶液；
(2)样品前处理：移取酱油样品至顶空瓶中，并加入步骤(1)中的内标工作溶液后密封；
(3)将步骤(2)中的顶空瓶顶空进样后，进行气相色谱检测并对结果进行分析。
进一步地，所述步骤(1)中的内标工作溶液的配制包括如下步骤：
(a)称取内标化合物0.5-1.5g，置于容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀，作为内标化合物内标贮备溶液；
(b)准确吸取内标化合物内标贮备溶液于容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀，得到每mL含0.08-0.12mg内标化合物的内标工作溶液。
更优地，所述步骤(1)中的内标工作溶液的配制包括如下步骤：
(a)称取内标化合物1g，置于容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀，作为内标化合物内标贮备溶液；
(b)准确吸取内标化合物内标贮备溶液于容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀，得到每mL含0.1mg内标化合物的内标工作溶液。
进一步地，所述步骤(1)中的内标化合物为叔丁醇和叔戊醇中的一种。其中现有文献和结果显示，酱油中含量最高的挥发性成分是乙醇，因此最适宜的内标物是与乙醇沸点接近的醇类化合物。试验筛查了酱油中已报道的挥发性物质，发现两个物质(叔丁醇、叔戊醇)尚未在酱油中报道。因此，本申请使用叔丁醇、叔戊醇为内标物化合物。
进一步地，所述步骤(2)中，移取4-6mL酱油样品至20mL顶空瓶中，并加入所述步骤(1)中的内标工作溶液0.8-1.2mL。
进一步地，所述步骤(3)中的顶空进样条件为，平衡温度：60-80℃；平衡时间：30-60min。
更优地，所述步骤(3)中的顶空进样条件为，平衡温度：70℃；平衡时间：45min。
进一步地，所述步骤(3)中的气相色谱条件为，色谱柱：以6％氰丙基苯基和94％二甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱；载气：高纯N2；流速：0.8-1.2mL/min，恒流模式；进样口：210-250℃，分流比为8-12:1；进样量：0.8-1.2mL；柱温：40-50℃，恒温20-30min，以4-6℃/min升温至140-160℃，保持5-7min，再以10-20℃/min升温至180-240℃，保持4-6min；氢火焰离子化检测器：220-260℃，氢气：25-35mL/min，空气：250-350mL/min，尾吹气：25-35mL/min。
更优地，所述步骤(3)中的气相色谱条件为，载气：高纯N2；流速：1.0mL/min，恒流模式；进样口：230℃，分流比为10:1；进样量：1.0mL；柱温：45℃，恒温25min，以5℃/min升温至150℃，保持6min，再以15℃/min升温至210℃，保持5min；氢火焰离子化检测器：240℃，氢气：30mL/min，空气：300mL/min，尾吹气：30mL/min。
本发明实施例的技术方案至少具有如下优点和有益效果：本发明的静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，不仅操作简单，可检测酱油中多种挥发性风味成分，并且检测效率高，准确率高。可为对酱油中挥发性物质进行定量提供新的思路。
附图说明
图1为本发明实验例2中的ZB-WAX柱分离19种混合标准品及三种酱油的色谱图；
图2为本发明实验例2中的DB-624柱分离19种混合标准品及三种酱油的色谱图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，其特征在于，包括如下制备步骤，
(1)使用叔丁醇配制内标工作溶液：称取叔丁醇0.5g，置于100mL棕色容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀，作为叔丁醇内标贮备溶液；准确吸取叔丁醇内标贮备溶液于100mL棕色容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀，得到每mL含0.08mg叔丁醇的内标工作溶液。
(2)样品前处理：移取4mL酱油样品至20mL顶空瓶中，并加入步骤(1)中的内标工作溶液0.8mL。
(3)将步骤(2)中的顶空瓶顶空进样后，进行气相色谱检测并对结果进行分析；
其中顶空进样条件为，平衡温度：60℃；平衡时间：30min；
气相色谱条件为，色谱柱：以6％氰丙基苯基和94％二甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱；载气：高纯N2；流速：0.8mL/min，恒流模式；进样口：210℃，分流比为8:1；进样量：0.8mL；柱温：40℃，恒温20min，以4℃/min升温至140℃，保持5min，再以10℃/min升温至180℃，保持4min；氢火焰离子化检测器：220℃，氢气：25mL/min，空气：250mL/min，尾吹气：25mL/min。
(4)使用标准溶液绘制标准曲线，将步骤(3)中的气相色谱结果代入标准曲线中得到酱油样品中挥发性有机物的含量。
实施例2
本实施例的静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，其特征在于，包括如下制备步骤，
(1)使用叔丁醇配制内标工作溶液：称取叔丁醇1.5g，置于100mL棕色容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀，作为叔丁醇内标贮备溶液；准确吸取叔丁醇内标贮备溶液于100mL棕色容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀，得到每mL含0.12mg叔丁醇的内标工作溶液。
(2)样品前处理：移取6mL酱油样品至20mL顶空瓶中，并加入步骤(1)中的内标工作溶液1.2mL。
(3)将步骤(2)中的顶空瓶顶空进样后，进行气相色谱检测并对结果进行分析；
其中顶空进样条件为，平衡温度：80℃；平衡时间：60min；
气相色谱条件为，色谱柱：以6％氰丙基苯基和94％二甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱；载气：高纯N2；流速：1.2mL/min，恒流模式；进样口：250℃，分流比为12:1；进样量：1.2mL；柱温：50℃，恒温30min，以6℃/min升温至160℃，保持7min，再以20℃/min升温至240℃，保持6min；氢火焰离子化检测器：260℃，氢气：35mL/min，空气：350mL/min，尾吹气：35mL/min。
(4)使用标准溶液绘制标准曲线，将步骤(3)中的气相色谱结果代入标准曲线中得到酱油样品中挥发性有机物的含量。
实施例3
本实施例的静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，其特征在于，包括如下制备步骤，
(1)使用叔丁醇配制内标工作溶液：称取叔丁醇1g，置于100mL棕色容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀，作为叔丁醇内标贮备溶液；准确吸取叔丁醇内标贮备溶液于100mL棕色容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀，得到每mL含0.1mg内标化合物的内标工作溶液。
(2)样品前处理：移取5mL酱油样品至20mL顶空瓶中，并加入步骤(1)中的内标工作溶液1.0mL。
(3)将步骤(2)中的顶空瓶顶空进样后，进行气相色谱检测并对结果进行分析；
其中顶空进样条件为，平衡温度：70℃；平衡时间：45min；
气相色谱条件为，色谱柱：以6％氰丙基苯基和94％二甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱；载气：高纯N2；流速：1.0mL/min，恒流模式；进样口：230℃，分流比为10:1；进样量：1.0mL；柱温：45℃，恒温25min，以5℃/min升温至150℃，保持6min，再以15℃/min升温至210℃，保持5min；氢火焰离子化检测器：240℃，氢气：30mL/min，空气：300mL/min，尾吹气：30mL/min。
(4)使用标准溶液绘制标准曲线，将步骤(3)中的气相色谱结果代入标准曲线中得到酱油样品中挥发性有机物的含量。
实施例4
实施例4的步骤与实施例3基本相同，不同之处在于本实施例将实施例3中的叔丁醇替换为叔戊醇。
实验例1
定量组分的确定
试验首先借助固相微萃取-气相色谱质谱技术，采用ZB-WAX柱分离，对试验用市售酱油的挥发性成分进行了初步定性，共鉴别出55种化合物。同时，参考现有文献报道的酱油中挥发性成分的定性结果，从组分沸点低、易挥发和相应标准物质易获得两个角度考虑，确定了本试验定量研究的17种组分，分别为：醇类8种：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、异戊醇；酯类1种：乙酸乙酯；酮类1种：丙酮；酸类1种：乙酸；醛类6种：乙醛、正丙醛、正丁醛、异丁醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛。
实验例2
色谱分离条件的确定。
本实验例选用3种常见市售酱油，分别为低盐固态酱油、高盐稀态酱油(生抽)以及高盐稀态酱油(老抽)。
气相色谱法分离和定量研究酱油中挥发性组分多基于非极性色谱柱(SPB-1、HP-5型)和极性色谱柱(ZB-WAX、HP-FFAP)完成。实验首先分析了19种组分(17种待测组分和2种内标物)在HP-5柱和ZB-WAX上的分离行为。结果发现：即使在较低温度(40℃)下，19种组分均很快流出HP-5柱，无法满足定量分析的基本要求；ZB-WAX柱对组分的保留和分离能力明显提高，但是异丁醛和丙酮间分离度较差(分离度R为0.7)，甲醇、2-甲基丁醛和3-甲基丁醛亦未完全分离(分离度R依次为1.3、1.1)，内标物(叔丁醇)和2-甲基丁醛共洗脱，无法分离。混合标准品和三种不同类型酱油在ZB-WAX柱上的分离行为见附图1。附图1中，组分的出峰顺序及保留时间为1：乙醛(7.75min)2：甲醇(17.46min)3：乙醇(22.32min)4：正丙醛(10.18min)5：丙酮(11.30min)6：异丙醇(21.28min)7：叔丁醇(18.08min)8：异丁醛(11.08min)9：正丙醇(36.69min)10：正丁醛(14.88min)11：乙酸乙酯(15.87min)12：异丁醇(41.58min)13：叔戊醇(34.06min)14：3-甲基丁醛(18.54min)15：2-甲基丁醛(18.08min)16：乙酸(52.59min)17：正丁醇(44.85min)18：异戊醇(47.29min)19：正戊醇(48.57min)。
实验进一步考查了中等极性色谱柱(DB-624)分离该19种组分的效果，结果发现：在易获得的柱温(45℃)条件下，19种待测组分均能完全分离，内标物(叔丁醇)出峰靠前(保留时间为7.4min)，在异丙醇和异丁醛之间，三者完全分离(分离度R均大于2.0)，内标物(叔戊醇)出峰靠后(保留时间为16.4min)，在异丁醇和3-甲基丁醛之间，三者刚好基线分离(分离度R为1.5)；相同色谱条件下，分析三种不同类型酱油的挥发性组分，在叔丁醇、叔戊醇出峰位置处均无干扰峰。
因此，实验从分析方法适用性、重现性的角度考虑，选择以分离能力更好的DB-624柱，抗干扰能力更强的叔丁醇和叔戊醇为内标物，进行下一步方法研究。混合标准品和三种不同类型酱油在DB-624柱上的分离行为见附图2。附图2中，组分的出峰顺序及保留时间为1：乙醛(3.67min)2：甲醇(3.87min)3：乙醇(5.18min)4：正丙醛(5.80min)5：丙酮(6.00min)6：异丙醇(6.34min)7：叔丁醇(7.40min)、8：异丁醛(8.40min)9：正丙醇(9.63min)10：正丁醛(10.66min)11：乙酸乙酯(11.82min)12：异丁醇(15.94min)13：叔戊醇(16.40min)14：3-甲基丁醛(16.91min)15：2-甲基丁醛(17.92min)16：乙酸(19.30min)17：正丁醇(21.27min)18：异戊醇(31.46min)19：正戊醇(34.00min)。
实验例3
精密度试验，试验对仪器精密度和方法精密度进行了考查。
配制挥发性组分标准贮备溶液：
标准贮备溶液-a：依次称取乙醇40.0g、甲醇2.4g、正丙醇80mg、异丙醇80mg、正丁醇80mg、异丁醇80mg、正戊醇80mg、异戊醇80mg、乙酸乙酯270mg、丙酮200mg、40％乙醛500mg、正丙醛24mg、正丁醛24mg、异丁醛24mg、2-甲基丁醛24mg、3-甲基丁醛24mg，置100mL棕色容量瓶，加入去离子水定容，摇匀，即得。
标准贮备溶液-b：称取乙酸500mg，置10mL棕色容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀，即得。
仪器精密度试验：分别取本实验例中制备的标准贮备溶液-a和标准贮备溶液-b，各1.0mL至50mL容量瓶，加入蒸馏水定容；准确移取该溶液5.0mL置已预先加入1.0g氯化钠的20mL顶空瓶中，再加入叔丁醇内标工作溶液1.0mL，密封，平行六份，在实施例3的顶空进样条件下进样分析。分析结果为：17种待测组分的峰面积(As)与内标物的峰面积(Ai)比值的RSD％均小于5％，表明仪器设备的精密度良好，见下表1。
表1仪器精密度试验
方法精密度试验：按照实施例3中步骤(2)的操作要求，分别准确移取实验例2中的三种酱油(1#、2#、3#)各5.0mL置20mL顶空瓶中，加入叔丁醇内标工作溶液1.0mL，密封，平行六份，在实施例3的顶空进样条件下进样分析。分析结果为：酱油中检出组分的峰面积(As)与内标物的峰面积(Ai)比值的RSD％均小于5％，表明该方法精密度良好，见表2～4，其中ND表示未检出。
表2方法精密度试验-1#(低盐固态酱油)
表3方法精密度试验-2#(生抽酱油)
表4方法精密度试验-3#(老抽酱油)
实验例4
样品分析，本实验例中测定了不同厂家，不同批次的14份酱油样品挥发性有机物的含量。
首先绘制标准曲线：取实验例3中的标准贮备溶液-a和标准贮备溶液-b，各0.1、0.2、0.5、1.0、2.0至50mL容量瓶，加入蒸馏水定容(浓度由低到高依次标记为梯度-1#～5#)；准确移取上述溶液各5.0mL置已预先加入1.0g氯化钠的20mL顶空瓶中，再加入叔丁醇内标工作溶液1.0mL，密封，平行两份，在实施例3的步骤(3)的条件下进样分析。分析结果为：以顶空瓶中待测组分含量(Ms)与内标物含量(Mi)的比值为横坐标，待测组分的峰面积(As)与内标物的峰面积(Ai)的比值为纵坐标，线性回归，拟合获得的17种待测组分(实验例1中的17种)的标准工作曲线，见表5。
表5拟合获得的各组分的标准工作曲线、检出限和定量限
按照实施例3的实验步骤，对14份酱油样品进行检测，并将色谱结果代入本实验例的标准曲线中，得到14分酱油样品中的挥发性成分，结果如表6-表7所示。从表6-7可以看出，14份酱油样品中醛类成分主要以乙醛、异丁醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛为主，基本不含正丙醛、正丁醛；醇类成分以乙醇为主(乙醇含量为156～12653μg/mL)，甲醇次之(甲醇含量为8～45μg/mL)，异丙醇、正丙醇、异丁醇、正丁醇和异戊醇的含量在0～5μg/mL间，未发现酱油中含正戊醇；乙酸乙酯的含量在0～4μg/mL间，丙酮的含量在2～10μg/mL间；乙酸含量在150～1500μg/mL间。
表6 14份酱油样品中挥发性成分的含量结果-1
表7 14份酱油样品中挥发性成分的含量结果-2
综上，各实验结果表明，本发明的静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，不仅操作简单，可检测酱油中多种挥发性风味成分，并且检测效率高，准确率高。可为对酱油中挥发性物质进行定量提供新的思路。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
(1)使用内标化合物配制内标工作溶液；
(2)样品前处理：移取酱油样品至顶空瓶中，并加入所述步骤(1)中的内标工作溶液后密封；
(3)将所述步骤(2)中的顶空瓶顶空进样后，进行气相色谱检测并对结果进行分析。
2.根据权利要求1所述的静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的内标工作溶液的配制包括如下步骤：
(a)称取内标化合物0.5-1.5g，置于容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀，作为内标化合物内标贮备溶液；
(b)准确吸取内标化合物内标贮备溶液于容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀，得到每mL含0.08-0.12mg内标化合物的内标工作溶液。
3.根据权利要求2所述的静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的内标工作溶液的配制包括如下步骤：
(a)称取内标化合物1g，置于容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀，作为内标化合物内标贮备溶液；
(b)准确吸取内标化合物内标贮备溶液于容量瓶中，加入去离子水定容，摇匀，得到每mL含0.1mg内标化合物的内标工作溶液。
4.根据权利要求1-3任一所述的静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的内标化合物为叔丁醇和叔戊醇中的一种。
5.根据权利要求1所述的静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，移取4-6mL酱油样品至20mL顶空瓶中，并加入所述步骤(1)中的内标工作溶液0.8-1.2mL。
6.根据权利要求1所述的静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的顶空进样条件为，平衡温度：60-80℃；平衡时间：30-60min。
7.根据权利要求6所述的静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的顶空进样条件为，平衡温度：70℃；平衡时间：45min。
8.根据权利要求1所述的静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的气相色谱条件为，色谱柱：以6％氰丙基苯基和94％二甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱；载气：高纯N2；流速：0.8-1.2mL/min，恒流模式；进样口：210-250℃，分流比为8-12:1；进样量：0.8-1.2mL；柱温：40-50℃，恒温20-30min，以4-6℃/min升温至140-160℃，保持5-7min，再以10-20℃/min升温至180-240℃，保持4-6min；氢火焰离子化检测器：220-260℃，氢气：25-35mL/min，空气：250-350mL/min，尾吹气：25-35mL/min。
9.根据权利要求1所述的静态顶空-气相色谱法测定酱油中挥发性风味成分的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的气相色谱条件为，载气：高纯N2；流速：1.0mL/min，恒流模式；进样口：230℃，分流比为10:1；进样量：1.0mL；柱温：45℃，恒温25min，以5℃/min升温至150℃，保持6min，再以15℃/min升温至210℃，保持5min；氢火焰离子化检测器：240℃，氢气：30mL/min，空气：300mL/min，尾吹气：30mL/min。
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