CN114540353B - 一种构建原位肝癌动物模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建原位肝癌动物模型的方法,属于动物模型领域。本发明通过筛选得到靶向AXIN1基因、PTEN基因和TP53基因并具有较好编辑能力的sgRNA,其中,特异性靶向AXIN1基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑3所示,特异性靶向PTEN基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4‑6所示以及特异性靶向TP53基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7‑9所示;将sgRNA通过串联基因编辑技术,注射到动物肝脏中构建原位肝癌动物模型。通过实验验证,发现将2‑3个上述抑癌基因组合构建的敲除模型,3‑4个月时已明显成瘤,成瘤率最高可达100%。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型领域,特别是涉及一种构建原位肝癌动物模型的方法。
背景技术
生物医药产业一直是国家重点发展的战略性新兴产业,支撑生物医药产业的发展离不开医学、药学的创新性前沿性基础科学研究,而作为“人类的替身”疾病动物模型,是研究疾病生物学特性、发病机理、药物筛选和疾病治疗的重要实验工具,可以说没有实验动物,就没有今天生物医学的发展和进步。在肝癌疾病研究方面,目前的试验肝癌动物模型仍存在诸多不足:(1)化学药物诱导模型存在的造模时间长达1年多,造模病死率高等缺陷;(2)皮下细胞移植瘤模型不能模拟临床肿瘤生长的环境;(3)原位种植瘤模型种植过程繁琐、技术要求高,另外种植模型多采用免疫缺陷鼠,不适合设计用于免疫系统的研究。因此,探索和建立更多能模拟临床肿瘤发生发展,易于获取且经济有效的肿瘤试验动物模型类型是未来发展方向。
基因工程编辑技术能精确靶向目的基因的敲除和插入,诱导肿瘤发生的基因背景清晰,有利于从遗传基因层面、时间空间层面阐明肝癌致病机理,有利于研究肿瘤微环境与基因突变交互作用对肿瘤发生发展的影响。目前国内及国外已有文献报道采用基因工程技术成功构建了小鼠肝癌动物模型,但是目前报道采用的基因主要有P53与PTEN基因联合敲除或增加过表达Myc基因等。而单用这几个基因编辑产生的动物模型品种单一,而且成瘤时间一般要6月以上,难以满足不同研究者探索不同基因编辑背景引发动物肿瘤研究的需求。因此,寻求一种构建肝癌动物模型的新方法对于解决现有肝癌动物模型所存在的缺陷非常关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建原位肝癌动物模型的方法,以解决上述现有技术存在的问题,能在3-4个月内完成肝癌动物模型的构建,并且成瘤率可高达100%,能明显缩短建模时间和提高成瘤率。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种sgRNA,其包括如SEQ ID NO:1-3所示的特异性靶向AXIN1基因的sgRNA,如SEQ ID NO:4-6所示的特异性靶向PTEN基因的sgRNA以及如SEQ ID NO:7-9所示的特异性靶向TP53基因的sgRNA。
本发明还提供一种同时靶向敲除AXIN1基因和PTEN基因的CRISPR/Cas9系统,包括所述的特异性靶向AXIN1基因的sgRNA和特异性靶向PTEN基因的sgRNA。
本发明还提供一种同时靶向敲除AXIN1基因和TP53基因的CRISPR/Cas9系统,包括所述的特异性靶向AXIN1基因的sgRNA和特异性靶向TP53基因的sgRNA。
本发明还提供一种同时靶向敲除PTEN基因和TP53基因的CRISPR/Cas9系统,包括所述的特异性靶向PTEN基因的sgRNA和特异性靶向TP53基因的sgRNA。
本发明还提供一种同时靶向敲除PTEN基因、TP53基因和AXIN1基因的CRISPR/Cas9系统,包括所述的特异性靶向PTEN基因的sgRNA、特异性靶向TP53基因的sgRNA和特异性靶向AXIN1基因的sgRNA。
本发明还提供一种利用所述的CRISPR/Cas9系统构建原位肝癌动物模型的方法,包括如下步骤:
以AXIN1基因、PTEN基因和TP53基因为靶基因设计sgRNA,并将所述sgRNA克隆到CRISPR/Cas9质粒系统中,通过转染动物肝癌细胞,筛选对靶基因产生编辑能力较强的sgRNA;然后,通过串联基因编辑技术,将至少两种基因的所述sgRNA采用注射法靶向动物肝脏,即能获取原位肝癌动物模型。
优选的是,所述动物为小鼠、树鼩或食蟹猴。
本发明还提供所述的sgRNA所述的CRISPR/Cas9系统在构建原位肝癌动物模型中的应用。
本发明还提供所述的sgRNA所述的CRISPR/Cas9系统在筛选治疗原位肝癌药物中的应用。
本发明公开了以下技术效果:
本发明通过筛选得到靶向AXIN1基因、PTEN基因和TP53基因并具有较好编辑能力的sgRNA,将sgRNA通过串联基因编辑技术,注射到动物肝脏中构建原位肝癌动物模型。通过对所构建的原位肝癌动物模型的肝脏标本进行分析,发现2-3个抑癌基因组合敲除模型,3-4个月时,肝脏变大,已明显成瘤,成瘤率最高可达100%,相比现有技术构建肝癌动物模型的方法,明显缩短了成瘤时间和提高了成瘤率,为探究肝癌致病机理,以及制定肝癌模式动物的标准化生产流程,提供了科学的指导。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施案例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施案例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Trp53靶点区SNP检测的PCR产物测序及SNP分析结果;A,PCA07613对应的测序结果;B,PCA07614对应的测序结果;C,PCA07615对应的测序结果;
图2为Pten靶点区SNP检测的PCR产物测序及SNP分析结果;A,PCA07616对应的测序结果;B,PCA07617对应的测序结果;
图3为Axin1靶点区SNP检测的PCR产物测序及SNP分析;A,PCA07619对应的测序结果;B,PCA07620对应的测序结果;C,PCA07621对应的测序结果;
图4为验证Puro在NIH/3T3中稳定表达的结果;
图5为GV391-U6-sgRNA(PTEN或AXIN1或TP53)-SV40-Neomycin慢病毒感染Cas9稳定表达的NIH/3T3细胞系,T7E1内切酶验证sgRNA基因编辑作用;
图6为利用LV-3gene慢病毒感染AML12细胞,T7E1内切酶鉴定基因编辑能力;
图7为LV-3gene活性鉴定结果;
图8为采用T7E1酶切活性筛选对靶基因编辑能力较强的sgRNA;PC为T7E1酶的阳性对照,KO为转染了重组sgRNA的CRISPR/Cas9质粒,NC为转染了无sgRNA的CRISPR/Cas9质粒,con为野生型的hep1-6肝癌细胞;
图9为GV391质粒图谱;
图10为CV025质粒谱图;
图11为pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒图谱;
图12为免疫荧光及WB技术验证sgRNA基因表达及基因编辑效果;A:带有EGFP的sgRNA/Cas9在鼠肝转染的免疫荧光图;B:正常野生型鼠肝;C、D:WB检测成瘤的肿瘤组织中相关基因编辑的表达情况;
图13为采用CRISPR/Cas9系统建立肝癌动物模型(基因编辑后14周大体解剖图)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1
1、靶基因sgRNA设计。
根据PTEN或AXIN1或TRP53基因序列,根据sgRNA的设计网站(http://crispr.mit.edu/)分别设计合成PTEN或AXIN1或TP53的sgRNA。各基因sgRNA序列具体如下,每个基因设计3条sgRNA,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1 sgRNA
根据sgRNA序列设计PCR引物以细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增,PCR产物进行测序,以判断sgRNA结合的靶基因组位置是否存在SNP位点,判断脱靶的可能性。具体如下:
1.1Trp53基因
(1)Trp53靶点设计
表1
(2)Trp53靶点区SNP检测引物
表2
(3)Trp53靶点区SNP检测的PCR反应体系
表3
试剂 | 用量(μL) |
上、下游引物(10μM) | 各1μL |
2×Taq Plus Master Mix | 25μL |
Genomic DNA | 2μL |
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 21μL |
注:Genomic DNA>200ng/μL
Trp53靶点区SNP检测的PCR反应条件:95℃,2min;95℃20s,55℃20s,72℃45s,35个循环;72℃5min。
(4)Trp53靶点区SNP检测的PCR产物测序及SNP分析
PCA07613、PCA07614、PCA07615对应的测序结果分别见图1A-C,从测序结果看,PCA07613,PCA07614,PCA07615靶点序列内及附近均不存在SNP位点。
1.2Pten基因
(1)Pten靶点设计
表4
(2)Pten靶点区SNP检测引物
表5
(3)Pten靶点区SNP检测的PCR反应体系同“Trp53靶点区SNP检测的PCR反应体系”。
Pten靶点区SNP检测的PCR反应条件:95℃,2min;95℃20s,55℃20s,72℃40s,35个循环;72℃5min。
(4)Pten靶点区SNP检测的PCR产物测序及SNP分析
PCA07616、PCA07617、对应的测序结果见图2A-B,从测序结果看,PCA07616,PCA07617靶点序列内及附近均不存在SNP位点。PCA07618测序失败。
1.3Axin1基因
(1)Axin1靶点设计
表6
(2)Axin1靶点区SNP检测引物
表7
(3)Axin1靶点区SNP检测的PCR反应体系同“Trp53靶点区SNP检测的PCR反应体系”。
Axin1靶点区SNP检测的PCR反应条件:95℃,2min;95℃20s,55℃20s,72℃40s,35个循环;72℃5min。
(4)Axin1靶点区SNP检测的PCR产物测序及SNP分析
PCA07619、PCA07620、PCA07621对应的测序结果见图3A-C,从测序结果看,PCA07619,PCA07620,PCA07621靶点序列内及附近均不存在SNP位点。
2、GV391-U6-sgRNA(PTEN或AXIN1或TP53)-SV40-Neomycin重组质粒构建
将上述合成的sgRNA分别重组到GV391-U6-SV40-Neomycin质粒中,获得GV391-U6-sgRNA(PTEN或Axin1或TP53)-SV40-Neomycin重组质粒。具体如下:
i)慢病毒载体线性化:GV391-U6-SV40-Neomycin,载体名称:GV391(见图9),元件顺序:U6-sgRNA-SV40-Neomycin,用BbsI酶对载体切割进行线性化。
ⅱ)对上述合成3个靶基因的9条sgRNA序列由吉凯基因设计合成,在其两端加入BbsI酶切位点。
表8
ⅲ)分别将合成的各个基因sgRNA(PTEN或AXIN1或TP53)与线性化载体混合,通过连接酶将sgRNA克隆到GV391多克隆位上,获得GV391-U6-sgRNA(PTEN或AXIN1或TP53)-SV40-Neomycin重组质粒。具体为:
把合成的sgRNA Oligo干粉溶解于退火缓冲液中,95℃水浴15min,然后自然冷却至室温,将退火产物稀释200倍后使用,引物退火形成带粘性末端的双链。
酶切连接反应体系:Vector plasmid(100ng/μl)1μl;Oligo双链DNA(稀释200倍)2μl;10×Buffer Tango 2μl;DTT(10mM)1μl;ATP(10mM)1μl;T7 DNA Ligase 0.5μl;BbsI 1μl;ddH2O 11.5μl。
将上述混合的反应物置于PCR仪,按下列程序进行酶切连接反应:37℃5min,21℃5min,6cycles;16℃30min;4℃∞。反应结束后可直接进行转化,再进行菌落PCR鉴定。菌落PCR鉴定体系:2×Taq plus master mix 10μl;上下游引物各0.5μl;ddH2O补充至20μL,其中以单菌落为模板。其中,菌落PCR引物一条采用质粒共有序列,一条采用sgRNA序列。菌落PCR鉴定反应程序:94℃5min;94℃30sec,55℃30sec,72℃30sec,22个循环;72℃5min。连入sgRNA片段的阳性克隆可得到大小为343bp的条带,选取阳性克隆测序。通过测序结果表明8个sgRNA已经克隆到GV391多克隆位上。
3、慢病毒包装GV391-U6-sgRNA(PTEN或AXIN1或TP53)-SV40-Neomycin重组质粒
1)转染前24h,用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞,以含10%血清的培养基调整细胞密度约5x 106细胞/15ml,重新接种于10cm细胞培养皿,37℃、5%CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70%~80%时即可用于转染;
2)转染前2h更换为无血清培养基;
3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(无内毒素的GV载体质粒20μg、pHelper 1.0载体质粒15μg、pHelper2.0载体质粒10μg),与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀,调整总体积为1ml,在室温下温育15min;
4)混合液缓慢滴加至293T细胞的培养液中,混匀,于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养;注:加入过程一定要均匀,尽可能地不要将细胞吹起。
5)培养6h后弃去含有转染混和物的培养基,加入10ml的PBS液清洗一次,轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃;
6)缓慢加入含10%血清的细胞培养基20ml,于37℃、含5%CO2培养箱内继续培养48-72h。
7)慢病毒浓缩与纯化,检测慢病毒滴度。
表9
4、构建Cas9稳定表达的NIH/3T3细胞系
将LV-Cas9-Puro病毒(购自上海吉凯,病毒滴度2.0E+08TU/mL)2.5μl转染NIH/3T3细胞系细胞。感染后72h,加入嘌呤霉素处理48h。嘌呤霉素工作终浓度:4.00μg/mL;嘌呤霉素维持终浓度:1.00μg/mL。细胞感染后qPCR检测Cas9的表达。
qPCR检测引物:
表9
qPCR反应体系:SYBR premix ex taq 6.0μL;引物mix(5μM)0.3μL;模板(反转录产物)0.6μL;RNase-Free H2O 5.1μL。条件:95℃30sec;95℃5sec,60℃30sec,95℃15sec,40cycles;60℃30sec;95℃15sec。
如图4所示,结果显示Puro在NIH/3T3中稳定表达。
5、GV391-U6-sgRNA(PTEN或AXIN1或TP53)-SV40-Neomycin慢病毒感染Cas9稳定表达的NIH/3T3细胞系,T7E1内切酶验证sgRNA基因编辑作用。
采用Surveyor法即错配内切酶检测法,在靶点两侧设计合适的引物,PCR扩增出含有错配突变位点的DNA条带,T7E1内切酶可以识别并切割错配的杂合DNA双链。将酶切产物通过琼脂糖电泳分析可以初度估计切割条带与未切割调带的比例,从而反映出CRISPR-Cas9的活性。具体操作步骤为:
表10
Trp53靶点区SNP检测的PCR反应体系:上、下游引物(10μM):各1μL;2×Taq PlusMaster Mix 25μL;Genomic DNA 2μL;ddH2O 21μL。Trp53靶点区SNP检测的PCR反应条件:95℃2min;95℃20s,55℃20s,72℃45s,35cycles;72℃5min。扩增产物酶切后进行电泳检测,如图5所示,PCR检测到目的大小条带KO1 KO2KO3均有活性。
6、构建CV025-U6-sgRNA(Trp53+Pten+AXIN1)-ApoE/hAAT promoter-CAS9-T2A-EGFP慢病毒质粒
将有编辑作用的(Trp53+Pten+AXIN1)三个基因sgRNA串联克隆到慢病毒核心质粒CV025质粒(克隆位点:PacI/BamHI,质粒图谱见图10)上。
化学合成目的基因序列:U6-sgRNA(Trp53+Pten+Axin1)-ApoE/hAAT promoter-CAS9-T2A-EGFP,将序列构建至T载体,再亚克隆到CV025质粒,由吉凯公司完成。
(1)CV025载体利用PacI/BamHI酶切,进行线性化。
(2)PCR扩增T载体中的目的基因
设计引物:
表11
引物说明:PCR引物5’端引入线性化质粒载体的末端序列,含交换配对碱基、酶切位点,含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因。
扩增产物鉴定:以T质粒载体为模板,PCR扩增U6-sgRNA(Trp53+Pten+Axin1)-ApoE/hAAT promoter-CAS9-T2A-EGFP目的基因(7127bp),电泳鉴定扩增产物。
(3)PCR产物胶回收,并用PacI/BamHI双酶切,DNA连接酶连接到CV025载体上(PacI/BamHI双酶切),转化感受态细胞TOP10。
(4)PCR鉴定重组阳性克隆
引物设计:
表12
利用上述引物PCR扩增并电泳鉴定,筛选阳性转化子。阳性转化子测序及比对结果分析目的基因的存在。
7、CV025-U6-sgRNA(Trp53+Pten+Axin1)-ApoE/hAAT promoter-CAS9-T2A-EGFP慢病毒质粒包装(LV-3gene)
由上海吉凯基因化学技术有限公司利用3个质粒体系进行慢病毒包装及滴度测定,病毒滴度4E+8TU/mL,命名为LV-3gene。
8、LV-3gene活性鉴定
1)利用LV-3gene慢病毒感染AML12细胞,T7E1内切酶鉴定基因编辑能力,发现有活性,见图6。
2)利用LV-3gene慢病毒感染AML12细胞,WB检测3个靶基因蛋白水平是否发生改变。结果发现相应的pten、AXIN1蛋白质水平下调。而TrP53水平增加。提示LV-3gene慢病毒发生基因编辑活性,见图7。
实施例2
构建pX330-U6-sgRNA(PTEN或Axin1或TP53)-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-T2A-mCherry质粒
1、改造pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒
将T2A-mCherry基因克隆到pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒(质粒图谱见图11)中。
(1)利用EcoRI酶酶切pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒为线性,电泳观察酶切结果是否为线性。
(2)PCR扩增T2A-mCherry目的基因
引物如下所示,引物端引入EcoRI酶切位点,:
表13
引物说明:含交换配对碱基、酶切位点,并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因。
以原带有T2A-mCherry的质粒为模板,利用上述引物扩增T2A-mCherry目的基因,PCR产物大小为820bp。
(3)重组质粒构建
将上述PCR产物与线性化表达载体通过连接酶连接,获得重组质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-T2A-mCherry。
(4)重组质粒PCR鉴定
设计引物,如下:
表14
以阳性重组质粒为模板进行PCR扩增,电泳鉴定重组克隆中目的基因的存在。
PCR鉴定反应程序:94℃5min;94℃30sec,55℃30sec,72℃30sec,22个循环;72℃5min。阳性转化子PCR产物大小为925bp。然后,在对筛选的阳性克隆进行测序分析目的基因的存在。
2、将sgRNA克隆到pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-T2A-mCherry质粒上
从实施例1已构建好的GV391-U6-sgRNA(PTEN或Axin1或TP53)--SV40-Neomycin质粒中扩增sgRNA,克隆到改构的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-T2A-mCherry质粒上。具体如下:
(1)根据酶切试剂盒说明,利用BbsI/XbaI酶酶切pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-T2A-mCherry质粒载体,进行线性化。
(2)从上述构建的GV391-U6-sgRNA(PTEN或Axin1或TP53)-SV40-Neomycin质粒中扩增目的基因片段
扩增sgRNA(TP53或PTEN或AXIN1)引物设计
表15 TP53引物
引物说明:含交换配对碱基、酶切位点,并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因。
表16 PTEN引物
引物说明:含交换配对碱基、酶切位点,并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因
表17 AXIN1引物
引物说明:含交换配对碱基、酶切位点,并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因。
以GV391-U6-sgRNA(PTEN或Axin1或TP53)-SV40-Neomycin质粒为模板,利用上述引物进行PCR扩增U6-sgRNA(TP53或PTEN或Axin1)基因。PCR鉴定反应程序:94℃5min;94℃30sec,55℃30sec,72℃30sec,22个循环;72℃5min。经电泳检测,显示TP53产物大小为221bp;PTEN产物大小为220bp;AXIN1产物大小为221bp。
将上述三个目的基因PCR产物分别与线性重组质粒用连接酶连接获pX330-U6-sgRNA(PTEN或AXIN1或TP53)-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-T2A-mCherry质粒。
(3)PCR鉴定重组质粒中目的基因
TP53基因PCR鉴定的引物如表9,阳性转化子PCR产物大小为519bp。
表18 TP53基因鉴定引物
PTEN基因PCR鉴定的引物如表10,阳性转化子PCR产物大小为519bp。
表19 PTEN基因鉴定引物
Axin1基因PCR鉴定的引物如表11,阳性转化子PCR产物大小为519bp。
表20 AXIN1基因鉴定引物
以pX330-U6-sgRNA(PTEN或AXIN1或TP53)-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-T2A-mCherry质粒为模板,利用上述引物扩增,其中,PCR鉴定条件为:94℃5min;94℃30sec,55℃30sec,72℃30sec,22个循环;72℃min。电泳鉴定扩增产物是否含有目的基因。
实施例3
按照上述实施例1和实施例2已经成功将PTEN或AXIN1或TP53基因的3个sgRNA,克隆到CRISPR/Cas质粒系统中,通过转染鼠肝癌细胞,采用T7核酸内切酶I(T7E1)酶切活性筛选对靶基因产生编辑能力较强的sgRNA。具体操作步骤如下:
(1)sgRNA编辑能力T7E1酶切鉴定
酶切体系:纯化产物4-7μL(纯化产物在500ng)、Detecase Buffer 2μL、Detecase0.5μL,ddH2O补足体积20μL。37℃反应60min后,立即向上述20μL体系内加入2μLStop Buffer。
(2)Trp53基因
表21 sgRNA编辑能力T7E1酶切
Trp53靶点区SNP检测的PCR反应体系:上、下游引物(10μM)各1μL;2×Taq PlusMaster Mix 25μL;Genomic DNA(>200ng/μL)2μL;ddH2O 21μL。
Trp53靶点区SNP检测的PCR反应条件:95℃2min;95℃20s;55℃20s,72℃45s,35个循环;72℃5min。
结果如图8所示,PCR检测到目的大小条带,KO1 KO2 KO3均有活性。
实施例4
C57小鼠(20-25g),玻利鸽牌带鲁尔锁2.5mL注射器配0.4*14mm针头,将质粒按照表12的基因串联方式以及注射方案通过小鼠尾静脉注入体内。然后用取暖灯加热小鼠30-60分钟。
表22注射方案和效果
注:前三种的质粒是指:pX330-U6-sgRNA(PTEN或AXIN1或TRP53)-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-T2A-mCherry质粒;最后一种是指CV025-U6-sgRNA(Trp53+Pten+AXIN1)-ApoE/hAAT promoter-CAS9-T2A-EGFP慢病毒质粒。
通过串联基因编辑技术,采用成熟的小鼠尾静脉高压注射法靶向肝脏,48h后取肝脏冰冻切片通过免疫荧光技术检测带有EGFP的sgRNA/Cas9质粒在小鼠肝脏的转染情况,结果显示在肝脏中有EGFP表达(见图12)。在2组小鼠中分别进行AXIN1+TP53、AXIN1+PTEN两两基因的联合sgRNA/Cas9编辑,3-4个月对小鼠解剖,发现肝脏变大,已经明显成瘤(见图13),成瘤率90%,有趣的是2组肿瘤形成的特点有明显区别见表13。肿瘤组织显示AXIN1和PTEN蛋白表达降低,显示sgRNA/Cas9质粒系统对目的基因进行了有效编辑。TP53表达变化不一致,结果还待研究(见图12)。
表23不同sgRNA组合建立基因工程肝癌动物模型的特点
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 广西医科大学
<120> 一种构建原位肝癌动物模型的方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagcttatt caccgtctag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacccctact acgtcaactc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgctgcttac ggatcctgta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accgccaaat ttaactgcag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcagcaattc actgtaaagc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgtcatcttc acttagccat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtgaagccc tccgagtgtc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacagatcgt ccatgcagtg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ataagcctga aaatgtctcc 20
Claims (4)
1.一种利用CRISPR/Cas9系统构建原位肝癌动物模型的方法,其特征在于,包括如下步骤:以AXIN1基因、PTEN基因和TP53基因为靶基因设计sgRNA,并将所述sgRNA克隆到CRISPR/Cas9质粒系统中,通过转染动物肝癌细胞,筛选对靶基因产生编辑能力较强的sgRNA;然后,通过串联基因编辑技术,将所述sgRNA采用注射法靶向动物肝脏,即能获取原位肝癌动物模型;所述基因的组合方式为:AXIN1基因和PTEN基因组合,或PTEN基因、TP53基因和AXIN1基因组合;所述动物为小鼠;
所述sgRNA为如SEQ ID NO:1-3所示的特异性靶向AXIN1基因的sgRNA,如SEQ ID NO:4-6所示的特异性靶向PTEN基因的sgRNA以及如SEQ ID NO:7-9所示的特异性靶向TP53基因的sgRNA。
2.一种同时靶向敲除AXIN1基因和PTEN基因的CRISPR/Cas9系统,其特征在于,包括权利要求1中所述的特异性靶向AXIN1基因的sgRNA和特异性靶向PTEN基因的sgRNA。
3.一种同时靶向敲除PTEN基因、TP53基因和AXIN1基因的CRISPR/Cas9系统,其特征在于,包括权利要求1中所述的特异性靶向PTEN基因的sgRNA、特异性靶向TP53基因的sgRNA和特异性靶向AXIN1基因的sgRNA。
4.如权利要求1中所述的sgRNA或权利要求2-3任一项所述的CRISPR/Cas9系统在构建原位肝癌动物模型中的应用,其特征在于,所述动物为小鼠。
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