CN114540323A

CN114540323A - 一种具有4,3/6-α-葡萄糖基转移酶活性的GtfB酶

Info

Publication number: CN114540323A
Application number: CN202210155835.9A
Authority: CN
Inventors: 柏玉香; 董晶晶; 金征宇; 王艳丽; 纪杭燕; 李晓晓
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-02-21
Filing date: 2022-02-21
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2042-02-21
Also published as: WO2023155404A1; CN114540323B

Abstract

本发明公开了一种具有4,3/6‑α‑葡萄糖基转移酶活性的GtfB酶，属于淀粉改性技术领域。本发明以此酶制备了一种(α1→4)和(α1→6)交替并伴有(α1→3,4)和(α1→4,6)分支的α‑葡聚糖。迄今为止，该活性未在任何GtfB酶中被发现，此外，键型组合的α‑葡聚糖未在任何野生型葡聚蔗糖酶(GSs)或GtfB酶中被合成。因此，该产物的特异性扩大了α‑葡聚糖的多样性，同时N1GtfB酶以直链淀粉为底物制备的高支化且低分子量聚合物为以淀粉合成新型葡聚糖开辟了新的前景。

Description

一种具有4,3/6-α-葡萄糖基转移酶活性的GtfB酶

技术领域

本发明涉及一种具有4,3/6-α-葡萄糖基转移酶活性的GtfB酶，属于淀粉改性技术领域。

背景技术

α-葡聚糖是由若干个葡萄糖以α-1,2、α-1,3、α-1,4或α-1,6糖苷键连接而成的寡/多糖。α- 葡聚糖在分枝程度、分子质量和构象方面的差异可以导致α-葡聚糖表现出不同的功能性质，从而具有多种多样的工业应用前景。例如，由乳酸菌(LAB)合成的α-葡聚糖在健康和食品行业中可用作增韧剂、增稠剂和乳化剂。

GtfB酶是一种以麦芽糖糊精/淀粉为底物，合成α-葡聚糖的糖基转移酶，属于糖基水解酶 GH70家族的亚家族。目前报道的GtfB酶主要展现4,6-α-葡萄糖基转移酶活性，能够切断麦芽糖糊精/淀粉的(α1→4)糖苷键，合成(α1→6)糖苷键。迄今只有来自发酵乳杆菌NCC 2970的 GtfB酶展现4,3-α-葡萄糖基转移酶活性，可以切断麦芽糖糊精/淀粉的(α1→4)糖苷键，合成 (α1→3)糖苷键。缺乏能够合成多种糖苷键组合的新型GtfB酶限制了以淀粉为底物合成结构不同的α-葡聚糖。因此，挖掘具有独特键型组合的新型GtfB酶，将有助于利用淀粉合成新型α-葡聚糖。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是目前报道的GtfB酶主要展现4,6-α-葡萄糖基转移酶活性，只有来自发酵乳杆菌NCC 2970的GtfB酶展现4,3-α-葡萄糖基转移酶活性，可以在葡聚糖产物中引入新的α-1,3键，缺乏能够合成多种糖苷键组合的新型GtfB酶，限制了以淀粉为底物合成不同结构的α-葡聚糖。

[技术方案]

本发明提供序列如SEQ ID NO.1所示的N1 GtfB酶，能够切断麦芽糖糊精或淀粉的(α1→4) 糖苷键，合成(α1→3)和(α1→6)糖苷键，可以用于合成具有(α1→4)、线性(α1→6)糖苷键、 (α1→3,4)分支糖苷键和(α1→4,6)分支糖苷键的α-葡聚糖。

所述N1 GtfB酶来自罗伊氏乳杆菌N1，底物和产物特异性实验分析的结果表明N1GtfB 酶具有4,3/6-α-葡聚糖转移酶活性，能够以淀粉为底物合成具有(α1→4)和(α1→6)交替，并伴有(α1→3,4)和(α1→4,6)分支的α-葡聚糖。迄今为止，该活性未在任何GtfB酶中被报道，同时该键型组合的α-葡聚糖未在任何野生型葡聚蔗糖酶(GSs)或GtfB酶中被合成。该产物的特异性扩大了α-葡聚糖的多样性，这为以淀粉合成新型葡聚糖开辟了新的前景。

本发明提供一种利用所述来自罗伊氏乳杆菌N1的新型GtfB(N1 GtfB)酶制备结构独特的α-葡聚糖的方法，是以淀粉或糊精为底物，以淀粉为底物时，将直链淀粉先用氢氧化钠溶液溶解，再用盐酸中和后，加缓冲液，再添加N1 GtfB酶进行改性，得到合成的α-葡聚糖；以糊精为底物时，加缓冲液，再添加N1 GtfB酶进行改性，得到合成的α-葡聚糖。所合成的产物中存在(α1→4)、(α1→6)、(α1→3,4)和(α1→4,6)糖苷键。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉为直链淀粉，底物浓度为0.6％；所述糊精为麦芽七糖，底物浓度为1％。

在本发明的一种实施方式中，所使用的缓冲体系浓度可以是10～50mM、pH 4～6的缓冲液，例如25mM、pH为6的醋酸钠缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，改性反应的温度为37～40℃，24h～48h，例如37℃、24 h。

在本发明的一种实施方式中，N1 GtfB酶的添加量为12-20U/g干基淀粉或糊精。

[有益效果]

本发明通过底物和产物特异性实验分析，发现N1 GtfB酶具有4,3/6-α-葡聚糖转移酶活性，能够以淀粉为底物合成具有(α1→4)和(α1→6)交替，并伴有(α1→3,4)和(α1→4,6)分支的α-葡聚糖。迄今为止，该活性未在任何已报道的GtfB酶中发现，且该键型组合的α-葡聚糖产物未在任何野生型葡聚蔗糖酶(GSs)或GtfB酶中被合成。

本发明的方法以淀粉或糊精为底物，经N1 GtfB酶改性后，合成一种结构独特的α-葡聚糖。该产物中的同时存在(α1→4)、(α1→6)、(α1→3,4)和(α1→4,6)四种糖苷键。该产物的特异性扩大了α-葡聚糖的多样性，为以淀粉合成新型葡聚糖开辟了新的前景，提供了新的思路。

附图说明

图1为实施例1中N1 GtfB酶的底物特异性分析。G1代表葡萄糖，G2-G8分别代表麦芽糖至麦芽八糖，AML和AMP分别代表直链淀粉和支链淀粉。

图2为实施例2中以分别以麦芽七糖和直链淀粉为底物反应24h反应所得产物分子量分布图。G7代表麦芽七糖，amylose代表直链淀粉。

图3为实施例3中N1 GtfB酶和直链淀粉反应24h反应所得产物分子量¹HNMR图。

图4为实施例4中N1 GtfB酶分别改性麦芽七糖和直链淀粉实时合成的寡糖情况。G1为葡萄糖，G2-G7分别麦芽糖至麦芽七糖，IsoG2、IsoG3和Panose分别为异麦芽糖、异麦芽三糖和潘糖。

图5为实施例6中N1 GtfB酶改性直链淀粉合成的产物二维核磁谱图(¹H-¹H COSY和¹³C-¹H HSQC)。

图6为实施例7中构建的N1 GtfB酶改性直链淀粉产物的结构模型。

具体实施方式

来自罗伊氏乳杆菌N1的GtfB酶的制备及纯化：

人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的N1 GtfB酶的基因片段，以pET-15b构建重组质粒，利用E.coli BL21(DE3)表达菌株进行表达。将其置于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200r/min的条件下培养，直至OD600值为0.4-0.6。取出后，冰浴15min，加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为1mM，于16℃、160r/min的条件下培养 20h诱导产酶。在4℃、10 000r/min的条件下离心10min，收集菌体。按照1g菌体溶于10 mL 25mMTris-HCl(250mM NaCl，pH 8)将菌体重悬，于冰浴中超声破碎20min。破碎后的菌液在4℃、10 000r/min的条件下离心30min，收集上清液即为粗酶液。利用镍亲和层析对粗酶液进行纯化，依次用20mM Tris-HCl(250mM NaCl，pH 8)和含有不同浓度咪唑的 20mM Tris-HCl(250mM NaCl，pH 8)进行洗脱，收集每部分的流穿液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳条带验证。

N1 GtfB酶的比酶活的检测计算：

准确称量100mg直链淀粉溶于2mL的2mol/L的NaOH溶液中，待直链淀粉完全溶解后加入适量的1M的HCl调节pH至7，再补足去离子水定容至10mL，配置成1％的直链淀粉溶液。250μL的0.25％的直链淀粉溶液，加入纯化的N1 GtfB酶(终浓度为90nM)用pH 6的缓冲液(25mM Tris-HCl)补足至1mL，于40℃保温10min。分别在1、2、4、6、8min 取出100μL反应液，分别加入50μL 0.4M的NaOH溶液中进行碱灭活，然后加入50μL 0.4M 的HCl溶液进行酸中和。取上述混合液150μL与预先配制好的15μL的碘溶液(将0.2g I₂和2g KI溶解在100ml蒸馏水中以制备20倍浓缩液，使用前稀释20倍)进行显色反应，测量反应液在660nm处吸光值。

酶活力定义：每分钟消耗1mg直链淀粉所需的酶定义为1U。

实施例1：N1 GtfB酶的底物特异性分析

将麦芽低聚糖(G3-G7)溶于pH 6、25mM的醋酸钠缓冲体系中，配制成1％(即1g/100mL) 的溶液，加入N1 GtfB酶，使其终浓度为20μg/mL，于37℃下反应24h，沸水浴终止反应。

直链淀粉和支链淀粉在反应前提前需要进行预处理。直链淀粉需先进行碱溶(NaOH, 1M)，再进行酸中和，然后加入醋酸钠缓冲液(pH 6、25mM)，配制成0.6％(即0.6g/100mL) 的溶液，再加N1 GtfB酶，使其终浓度为20μg/mL，于37℃下反应24h，沸水浴终止反应。支链淀粉则是溶于醋酸钠缓冲液(pH 6、25mM)，配制成0.6％(即0.6g/100mL)溶液，涡旋后进行糊化处理，然后冷却至37℃，加入N1 GtfB酶，使其终浓度为20μg/mL，于37℃下反应24h，沸水浴终止反应。

反应结束后，利用薄层色谱(TLC)监测反应中麦芽低聚糖合成情况。测定结果如图1 所示。N1 GtfB酶能够作用于DP≥3的麦芽糊精和淀粉类底物，当底物为麦芽糊精时，产物中合成了大量DP≥2的寡/多糖及其微量的葡萄糖，当底物为直链淀粉和支链淀粉时，产物中合成的寡/多糖的量要明显小于以麦芽糊精为底物时产生的量。总的来说，改性产物中均生成了一系列较底物更短和更长的寡糖/多糖，表明N1 GtfB酶对DP≥3的糊精或淀粉类底物同时具有水解酶和转糖基酶(歧化)活性。

实施例2：N1 GtfB酶作用产物分子量分析

将麦芽七糖溶于pH 6、25mM的醋酸钠缓冲体系中，配制成1％的溶液，加入N1 GtfB酶，使其终浓度为20μg/mL，于37℃下反应24h，沸水浴终止反应。

将直链淀粉先进行碱溶(NaOH,1M)，再进行酸中和，然后加入醋酸钠缓冲液(pH 6、25mM)，配制成0.6％的溶液，再加N1 GtfB酶，使其终浓度为20μg/mL，于37℃下反应 24h，沸水浴终止反应，然后进行冻干处理，得酶合成的改性产物。

冻干样品用超纯水配制成5mg/mL，利用高效凝胶渗透色谱监测反应中产物分子量的情况。测定结果如图2所示。麦芽七糖和直链淀粉经N1 GtfB修饰后的分子量分别为3.4×10³Da 和5.7×10³Da，麦芽七糖的分子量较酶处理前的1.2×10³Da有了明显增大，直链淀粉分子量较酶处理前的5.7×10³Da略微减少，但产物分子量数量级都在10³Da，这说明N1 GtfB酶在反应过程中展现出显著的转糖基活力。

实施例3：N1 GtfB酶作用产物一维核磁氢谱分析

将直链淀粉先进行碱溶(NaOH,1M)，再进行酸中和，然后加入醋酸钠缓冲液(pH 6、25mM)，配制成6mg/mL的溶液。加入N1 GtfB酶，使其终浓度20μg/mL，在37℃、pH 6.0 条件下反应24h，沸水浴终止反应，冻干。取样品20mg，加入1mL D₂O，煮沸1h，立即冻干。冻干后再加入1mL D₂O，煮沸1h，立即冻干备用。最后此样品溶于D₂O，在沸水浴中煮1h，然后在AVANCE-600MHz光谱仪(Bruker,Germany)上记录一维核磁共振氢谱结果，测试探针温度为65℃。在δ5.40-5.35ppm处的存在5个分裂峰，表明在(-)α-D-Glcp-(1→4)- 结构中至少存在5个不同结构单元。在δ～4.97ppm的两个分裂峰，表明在(-)α-D-Glcp-(1→6)- 结构中存在至少存两个不同结构单元。Rα(δ5.237ppm)和Rβ(δ4.653ppm)代表4-取代还原末端葡萄糖的异头氢信号。Gα(δ5.231ppm)和Gβ(δ4.640ppm)是游离葡萄糖的异位信号。δ3.40 ～3.45ppm之间的t4信号佐证了(α1→4,6)分支的存在。总的来说，¹H NMR的结果清楚地证实了产物中存在(α1→6)键。

实施例4：N1 GtfB酶分别改性麦芽七糖和直链淀粉实时合成的寡糖分析

将直链淀粉先进行碱溶(NaOH,1M)，再进行酸中和，然后加入醋酸钠缓冲液(pH6、25mM)，配制成0.6％的溶液，再加N1 GtfB酶，使其终浓度为20μg/mL，于37℃下反应 24h，沸水浴终止反应。

用高压阴离子色谱(HPAEC-PAD)分别记录反应0min、10min、1h、24h时合成的寡糖的情况。用商业标准低聚糖鉴定了合成产物谱峰的性质。如图4所示，当底物在24h后几乎耗尽时，异麦芽糖和潘糖的合成明显表明(α1→6)键的形成。同时图中可见，产物中还存在了一些系列出峰时间不符合麦芽低聚糖的寡/多糖的峰，这说明这些产物中可能含有(α1→3)或 (α1→6)糖苷键。N1 GtfB酶改性直链淀粉的情况与改性G7大致相同，仅仅只是产量相对较小。

实施例5：N1 GtfB酶改性直链淀粉实时合成的产物的甲基化分析

N1 GtfB酶改性直链淀粉的方法与实施例2中相同，改性反应结束后，将反应液直接进行冻干处理，备用。取20mg冻干样品在60℃下溶于20mL DMSO中，然后加入20mL溶于DMSO的NaOH溶液反应1h，再逐滴滴加CH₃I液体在室温下甲基化反应2h。反应结束后，甲基化产物用1000Da透析袋进行透析，然后用氯仿萃取，硫酸钠除水，再进行氮吹干。接着依次用三氟乙酸(2M)水解，用NaBH₄还原，然后用乙酸酐和吡啶(1:1)乙酰化。最后用 GC-MS分析甲基化糖产物。将得到的离子片段与CCRC光谱数据库-PMAA进行比较，以确定糖苷键的类型和比例。如表1所示，甲基化糖产物的分子碎片峰片段验证了(α1→6)、(α1→3,4) 和(α1→4,6)糖苷键的存在。4-取代、6-取代、3,4-二取代和4,6-二取代葡萄糖基的摩尔百分比为53：8：6：12。

表1 GC-MS分析甲基化糖产物

*分子碎片是不同甲基化糖产物的GC-MS特征片段。

实施例6：N1 GtfB酶改性直链淀粉合成的产物二维核磁谱图分析

N1 GtfB酶改性直链淀粉以及核磁谱图测定前样品前处理方法的方法与实施例3中相同。通过¹H NMR、2D ¹H COSY和2D ¹³C-¹H HSQC谱结果分析改性产物中的不同糖基结构单元。如图5和表2所示，产物中存在7个不同取代的葡萄糖单元，即A：-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-；B：-(1→3,4)α-D-Glcp-(1→4)-；C：α-D-Glcp-(1→4)-；D：-(1→6)α-D-Glcp-(1→4)-；E： -(1→4,6)α-D-Glcp-(1→4)-；F：-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4,6)；G：-(1→4)-α-D-Glcp-(1→6)。

表2 N1 GtfB改性直链淀粉产物中结构单元的¹H和¹³C化学位移

实施例7：构建N1 GtfB酶改性直链淀粉产物的结构模型

结合一/二维核磁，高压离子色谱实时检测寡糖结果以及甲基化实验分析，根据鉴定出的结构元素对N1 GtfB酶改性产物的结构构建了相应的模型，结果如图6所示。

对比例1：

将实施例1中的底物分别调整为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、黑曲霉糖或潘糖，其余反应条件或者参数与实施例1一致。同样将这些底物溶于pH 6、25mM的醋酸钠缓冲体系中，分别配制成1％的溶液，加入N1 GtfB酶，使其终浓度为(20μg/mL)，于37℃下反应24h，沸水浴终止反应。反应结束后，利用薄层色谱(TLC)监测反应情况，发现N1GtfB酶对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、黑曲霉糖、潘糖无活性。

对比例2：

将实施例2中的加酶处理调整为无酶处理。其余反应条件或者参数与实施例2一致。将麦芽七糖溶于pH 6、25mM的醋酸钠缓冲体系中，配制成1％的溶液。直链淀粉先进行碱溶 (NaOH，1M)，再进行酸中和，然后加入醋酸钠缓冲，配制成0.6％的溶液。分别利用高效凝胶渗透色谱监测反应中产物分子量的情况。测定结果如图2所示。麦芽七糖和直链淀粉的分子量分别为1.2×10³Da和5.7×10³Da，

对比例3：

将实施例4中的加酶处理调整为无酶处理。其余反应条件或者参数与实施例4一致，将麦芽七糖溶于pH 6、25mM的醋酸钠缓冲体系中，配制成1％的溶液。直链淀粉先进行碱溶 (NaOH，1M)，再进行酸中和，然后加入醋酸钠缓冲，配制成0.6％的溶液。分别利用高压离子色谱监测样品中寡糖的情况。结果中可见麦芽七糖标品中含一定量的麦芽五糖和麦芽六糖，而直链淀粉标品中寡糖含量很少。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种具有4,3/6-α-葡萄糖基转移酶活性的GtfB酶

<130> BAA220087A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 857

<212> PRT

<213> 罗伊氏乳杆菌N1

<400> 1

Met Lys Asn Leu Val Ala Lys Pro Gln Gly Asn Gln Leu Asn Ile Tyr

1 5 10 15

Asn Gly Asn Thr Val Leu Lys Thr Leu Gly Pro Gly Thr Trp Glu Asn

20 25 30

Met Ala Phe Ala Gln Asp Ser Ser Ala Ile Asn Asn Ile Asn Gly Tyr

35 40 45

Leu Ser Tyr Thr Gly Trp Tyr Arg Pro Tyr Gly Thr Ser Gln Asp Gly

50 55 60

Lys Thr Trp Tyr Pro Thr Thr Val Ala Asp Trp Arg Pro Ile Leu Met

65 70 75 80

Tyr Val Trp Pro Ser Lys Asp Val Gln Val Lys Phe Ile Gln Tyr Phe

85 90 95

Val Asn His Gly Tyr Glu Asn Ser Asn Tyr Gly Leu Thr Ala Gly Ser

100 105 110

Val Lys Asp Leu Ser Glu Asn Thr Ala Ser Ile Asn Leu Asn Glu Val

115 120 125

Ala Gln Asn Leu Arg Tyr Val Ile Glu Gln His Ile Val Ala Ala Lys

130 135 140

Ser Thr Ser Gln Leu Ala Asn Asp Ile Asn Asn Phe Ile Thr Thr Ile

145 150 155 160

Pro Glu Leu Ser Ala Ser Ser Glu Leu Pro Asp Glu Ser Gly Tyr Gly

165 170 175

Gln Val Ile Phe Val Asn Asn Asp Asn Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Lys

180 185 190

Tyr Arg Leu Met Ser Arg Thr Ile Asn Asn Gln Thr Gly Asn Asp Asn

195 200 205

Ser Gly Asp Asn Gly Tyr Glu Phe Leu Thr Gly Ile Asp Ile Asp Asn

210 215 220

Ser Asn Pro Val Val Gln Ala Glu Asn Leu Asn Trp Glu Tyr Phe Leu

225 230 235 240

Leu Asn Tyr Gly Lys Leu Met Gly Tyr Asn Pro Asp Gly Asn Phe Asp

245 250 255

Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Asp His Ile Asp Ala Asp Val Leu Asp

260 265 270

Gln Met Gly Gln Leu Met Asp Asp Met Tyr His Met Lys Gly Asn Pro

275 280 285

Gln Asn Ala Asn Asn His Leu Ser Tyr Asn Glu Gly Tyr Arg Ser Ser

290 295 300

Ala Ala Arg Met Leu Asn Lys Lys Gly Asn Pro Gln Leu Tyr Met Asp

305 310 315 320

Tyr Val Gly Ser Thr Leu Gly Asn Val Leu Gly Arg Ala Asn Asn Arg

325 330 335

Asp Thr Ile Ser Asn Leu Ile Thr Gly Ser Ile Val Asn Arg Gln Asn

340 345 350

Asp Val Thr Glu Asn Glu Ala Thr Pro Asn Trp Ser Phe Val Thr Asn

355 360 365

His Asp Gln Arg Ala Asn Leu Ile Asn Gly Leu Ile Ile Lys Asp His

370 375 380

Pro Gly Ala Tyr Lys Ala Glu Tyr Ala Asn Gln Ala Trp Gln Glu Phe

385 390 395 400

Tyr Ala Asp Gln Lys Lys Thr Asp Lys Gln Tyr Ala Gln Tyr Asn Val

405 410 415

Pro Ala Gln Tyr Ala Ile Leu Leu Ser Asn Lys Asp Thr Val Pro Gln

420 425 430

Ile Tyr Tyr Gly Asp Leu Tyr Asn Glu Thr Ala Gln Tyr Met Gln Glu

435 440 445

Lys Ser Ile Tyr Tyr Asp Ala Ile Thr Thr Leu Met Lys Ala Arg Lys

450 455 460

Gln Phe Val Ser Gly Gly Gln Thr Met Thr Lys Leu Ser Asp Asn Leu

465 470 475 480

Ile Ala Ser Val Arg Tyr Gly Lys Gly Val Ala Asn Ala Asn Ser Glu

485 490 495

Gly Thr Asp Ser Leu Ser Arg Thr Ser Gly Met Ala Val Ile Val Gly

500 505 510

Asn Asn Pro Gln Met Ala Glu Gln Thr Ile Ser Ile Asn Met Gly Arg

515 520 525

Ala His Ala Asn Glu Gln Tyr Arg Asn Leu Leu Asp Thr Thr Asp Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Tyr Asn Ala Asp Gly Ala Glu Asn Pro Glu Thr Leu Thr

545 550 555 560

Thr Asp Asp Asn Gly Ile Leu Lys Val Thr Val Lys Gly Tyr Ser Asn

565 570 575

Pro Tyr Val Ser Gly Tyr Leu Gly Val Trp Val Pro Val Val Ser Val

580 585 590

Asn Gln Asp Val Thr Thr Asn Ala Ala Thr Val Ser Ala Asp Ser Asn

595 600 605

Lys Ile Phe Glu Ser Asn Ala Ala Leu Asp Ser His Met Ile Tyr Gln

610 615 620

Asp Phe Ser Leu Tyr Gln Pro Glu Pro Ile Ser Thr Glu Asn His Ala

625 630 635 640

Tyr Asn Ile Ile Ala Gln Asn Ala Glu Leu Phe Asn Asn Leu Gly Ile

645 650 655

Thr Asp Phe Trp Met Ala Pro Pro Tyr Thr Gln Tyr Ser Glu Ser Arg

660 665 670

Tyr Asn Asp Gly Tyr Ser Val Thr Asp Arg Tyr Asn Leu Gly Thr Asn

675 680 685

Ala Asn Pro Thr Lys Tyr Gly Ser Gly Glu Glu Leu Ala Asn Ala Ile

690 695 700

Ala Ala Leu His Ser Ala Gly Leu Lys Ala Gln Val Asp Ile Val Met

705 710 715 720

Asn Gln Met Ile Gly Leu Pro Gly Gln Glu Ala Val Thr Val Thr Arg

725 730 735

Ala Asp Asn Arg Gly Met Gln Thr Asp Val Asn Gly Lys Thr Tyr Ala

740 745 750

Asn Gln Met Tyr Phe Ala Tyr Thr Thr Gly Gly Gly Asn Gly Gln Glu

755 760 765

Thr Tyr Gly Gly Lys Tyr Leu Ser Glu Leu Gln Ser Lys Tyr Pro Asp

770 775 780

Leu Phe Thr Thr Arg Ala Ile Ser Thr Gly Val Ala Pro Asp Pro Thr

785 790 795 800

Thr His Ile Thr Lys Trp Ser Ala Lys Tyr Glu Asn Gly Thr Ser Leu

805 810 815

Gln Asn Ile Gly Ile Gly Leu Ala Val Lys Leu Pro Asn Gly Glu Tyr

820 825 830

Ala Tyr Leu Arg Ser Ser Asp Asn Lys Ser Phe Asn Thr Leu Leu Pro

835 840 845

Ser Glu Ile Ser Ala Lys Phe Asn Asn

850 855

<210> 2

<211> 2574

<212> DNA

<213> 罗伊氏乳杆菌N1

<400> 2

atgaagaacc tcgtagctaa gcctcaagga aaccagctaa atatctataa tgggaataca 60

gtcttaaaga cactcggacc gggaacctgg gaaaatatgg catttgccca ggatagtagc 120

gctattaata atatcaatgg ttatctgagt tacactggct ggtatcgtcc ttatggtaca 180

agccaggatg gtaagacttg gtatccaacc acagtagctg attggcgtcc aattctaatg 240

tacgtttggc ctagcaaaga tgttcaagtt aaatttattc agtactttgt aaatcatggt 300

tatgaaaata gtaattatgg tttaacagct ggttcagtta aagatttgtc tgaaaacact 360

gcttctatta acttgaatga agttgctcaa aacttacgtt atgtaattga acaacatatt 420

gtagcagcta agagcacaag tcagcttgct aatgatataa ataattttat aactacaatt 480

ccggaactat cggcttcatc tgaattacct gatgaaagcg gatacggtca agtaatcttc 540

gttaataatg ataatactag ttacgctgat agtaagtatc gcttaatgag ccgtacgatc 600

aataaccaaa ctggtaatga taatagcggc gataacggtt atgagttttt gactggaatt 660

gatattgata actctaatcc ggtggtacaa gctgaaaacc ttaactggga atacttcttg 720

ttaaattatg gtaagctgat gggttataac ccggatggta attttgacgg tttccggatt 780

gatgctgctg atcatattga tgctgatgtg ctcgaccaga tgggacaatt aatggatgat 840

atgtaccata tgaagggtaa cccgcaaaat gctaataatc acttaagcta taacgaagga 900

taccgttcaa gtgctgcccg gatgttgaac aagaagggta atccacaatt gtacatggat 960

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aatttgatta ctggtagtat tgttaaccgg caaaatgacg ttacagaaaa tgaagctact 1080

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actcatatta ctaagtggtc tgctaaatac gaaaacggta catcacttca aaatattgga 2460

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aaatcattta atactttatt accaagtgaa atatctgcaa agttcaacaa ctag 2574

Claims

1.GtfB酶在制备α-葡聚糖中的应用，其特征在于，所述GtfB酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述α-葡聚糖具有(α1→4)、线性(α1→6)糖苷键、(α1→3,4)分支糖苷键和(α1→4,6)分支糖苷键。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以淀粉或糊精为底物，所述淀粉包括支链淀粉、直链淀粉，所述糊精包括麦芽糊精、麦芽低聚糖(聚合度≥3)。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以直链淀粉为底物时，将淀粉先用碱溶解，再用酸中和，加缓冲液，再添加N1 GtfB酶进行改性，得到合成的α-葡聚糖。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以支链淀粉为底物时，向淀粉中加缓冲液，再添加N1 GtfB酶进行改性，得到合成的α-葡聚糖。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以糊精为底物时，加缓冲液，再添加N1GtfB酶进行改性，得到合成的α-葡聚糖。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，加入缓冲液后，底物浓度为0.6％～1.0％。

7.根据权利要求3～5任一所述的应用，其特征在于，所使用的缓冲体系浓度是10～50mM、pH 4～6的缓冲液，包括25mM、pH为6的醋酸钠缓冲液。

8.根据权利要求3～5任一所述的应用，其特征在于，反应的温度为37～40℃，24h～48h。

9.GtfB酶的应用，其特征在于，所述GtfB酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，能够切断麦芽糖糊精或淀粉的(α1→4)糖苷键，合成(α1→3)和(α1→6)糖苷键。

10.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的GtfB酶或其合成的α-葡聚糖在食品、保健品、饮料、医药和饲料添加剂方面的应用。