CN114517195B - 一种微生物组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物组合物及其制备方法,微生物组合物,包括主体和微生物;微生物附着于主体上;主体包括骨架和助剂;骨架包括聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和聚乙二醇二丙烯酸酯中的至少一种;助剂包括硅藻土、粉煤灰、改性活性炭和二氧化硅中的至少一种;制备方法,包括:混合步骤:将微生物菌液与助剂混合,然后加入骨架试剂,得到混合液;交联步骤:在混合液中加入交联剂和引发剂,得到待凝固溶液,将待凝固溶液凝固成型,得到微生物组合物;微生物组合物,为将微生物固定在碳基材料上,使微生物富集效率更高,生长更稳定,从而提高污水处理效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物组合物及其制备方法,属于微生物技术领域。
背景技术
污水处理一直是改善居住环境的重要课题,也是当今人们生活的刚性需求。生物法污水处理技术是当前主要的污水处理方法之一,其利用微生物的生化反应,将水体中的污染物去除。然而,处理过程会产生大量的污泥,该污泥的处理不但增加了污水处理的成本,也带来了由于需要妥善处理而造成的其他环境污染问题。不产泥或者少产泥,是微生物污水处理技术工艺改进的切入点之一。但是废水中微生物种类繁多,将分离筛选的高效降解菌直接运用于废水处理时,容易受到本地土著菌群的干扰,难以生长和稳定增殖,在实际应用中具有很大的不确定性。如果可以提高微生物的固定性,则可以增强其适应性和耐冲击能力,实现废水的高效处理。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明的第一个目的在于提供一种微生物组合物,为将微生物固定在碳基材料上,使微生物富集效率更高,生长更稳定,从而提高污水处理效果。
本发明的第二个目的在于提供一种上述微生物组合物的制备方法。
实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到:一种微生物组合物,包括主体和微生物;微生物附着于主体上;主体包括骨架和助剂;骨架包括聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和聚乙二醇二丙烯酸酯中的至少一种;助剂包括硅藻土、粉煤灰、改性活性炭和二氧化硅中的至少一种。
进一步地,微生物的附着量为≥50mg微生物/g主体。
进一步地,微生物为铜绿假单胞菌和代尔夫特菌中的至少一种。
实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到:一种微生物组合物的制备方法,包括:
混合步骤:将微生物菌液与助剂混合,然后加入骨架试剂,得到混合液;
助剂包括硅藻土、粉煤灰、改性活性炭和二氧化硅中的至少一种;骨架试剂包括聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和聚乙二醇二丙烯酸酯中的至少一种;
交联步骤:在混合液中加入交联剂和引发剂,得到待凝固溶液,将待凝固溶液凝固成型,得到微生物组合物。
进一步地,微生物菌液与助剂的质量比为100:(2.5-15),微生物菌液的浓度为25-110mg干细胞/mL;
进一步地,混合步骤中,将微生物菌液与助剂混合,在温度为28-35℃的条件下震荡培养1-2h。
进一步地,混合步骤中,将微生物菌液与助剂混合,在温度为30℃、200rpm的条件下培养。
进一步地,混合步骤中,骨架试剂在混合液中的比例为8-25wt%。
进一步地,交联步骤中,交联剂为N,N,N',N'-四甲基乙二胺;引发剂为过硫酸钾。
进一步地,交联步骤中,交联剂在待凝固溶液中的比例为0.1-0.5wt%;引发剂在待凝固溶液中的比例为0.1-0.3wt%。
进一步地,交联步骤中,将待凝固溶液在温度为20-30℃,时间30-60min的条件下凝固成型。
进一步地,还包括切割步骤:将待凝固溶液凝固成型后,切割为边长为2-5mm的立方体,得到微生物组合物。
相比现有技术,本发明的有益效果在于:
1、本发明微生物组合物,主体以二醇甲醚甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和聚乙二醇二丙烯酸酯的至少一种作为骨架材料,结合碳族元素硅藻土、粉煤灰、改性活性炭和二氧化硅中的至少一种作为助剂进行修饰,提高材料的机械性能和吸附性能;为细菌的增殖提供更多的内部空间,有利于细菌在内部形成稳定的生物膜,增强其耐受性能;
2、本发明微生物组合物的主体材料可将组合物内的微生物与外界隔离,但微孔结构使营养物质和微生物代谢物可自由通过,为组合物内的微生物增殖提供一个稳定和营养物充足的内环境;显著提高了材料的机械性能、传质性能和使用寿命;
3、本发明微生物组合物的主体材料的化学稳定性好,柔韧性高,提高微生物的抗冲击负荷能力,从而提高了污水、废水的处理效率;
4、本发明微生物组合物的制备方法,骨架试剂能快速聚合且形成均一稳定的多孔网状结构,结合助剂碳族元素的多孔结构配合,为微生物附着提供了更多位点和比表面积,使得微生物具有稳定良好的增殖环境。
附图说明
图1为实施例1微生物组合物示意图;
图2为实施例1微生物组合物的SEM图;
图3为实施例2微生物组合物示意图;
图4为实施例2微生物组合物的SEM图;
图5为实施例3微生物组合物示意图;
图6为实施例3微生物组合物的SEM图;
图7为NO3--N还原性能曲线图;
图8为C8-HSL降解性能检测的平板显色圈图示。
具体实施方式
下面,结合附图以及具体实施方式,对本发明做进一步描述:
一种微生物组合物的制备方法,包括:
混合步骤:将微生物菌液与助剂混合,微生物菌液与助剂的质量比为100:(2.5-15),微生物菌液的浓度为100mg干细胞/mL,在温度为28-35℃的条件下200rpm培养1-2h,然后加入骨架试剂,得到混合液,骨架试剂在混合液中的比例为8-25wt%;
助剂包括硅藻土、粉煤灰、改性活性炭和二氧化硅中的至少一种;骨架试剂包括聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和聚乙二醇二丙烯酸酯中的至少一种;
交联步骤:在混合液中加入N,N,N',N'-四甲基乙二胺和过硫酸钾,得到待凝固溶液,N,N,N',N'-四甲基乙二胺在待凝固溶液中的比例为0.1-0.5wt%,过硫酸钾在待凝固溶液中的比例为0.1-0.3wt%,将待凝固溶液在温度为20-30℃,时间30-60min的条件下凝固成型;
切割步骤:将待凝固溶液凝固成型后,切割为边长为2-5mm的立方体,得到微生物组合物;颗粒太小不利于沉降,太大则导致骨架内部利用率低,2-5mm比表面积较大,利用率高且利于截流,为最适颗粒大小。
微生物组合物的使用方式为:将其直接浸入水中。
微生物菌液通过以下方法制备:将微生物接种到无菌的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L)中,30℃,200rpm培养48h,4-10℃下,4000-6000rpm下离心5-10min,沉淀用适量无菌水重悬,并取样在105℃烘干测定细胞浓度,将微生物菌重悬液稀释到100mg干细胞/mL。
微生物组合物中,微生物的附着量为≥50mg微生物/g主体;微生物为铜绿假单胞菌和代尔夫特菌中的至少一种。
凝固温度20-30℃是大部分微生物生长的最适温度,所得的微生物组合物的微生物性最好;固定化时间在30-60min内基本完成催化交联反应,低于30min可能未完成反应,导致骨架结构不稳定;时间过长会导致成型效率下降。
目前常用的海藻酸钠固定化微生物方法,制备过程复杂,成本较高,且形成的藻酸盐凝胶容易被微生物分解,不能长期使用;此外,常规的方法还包括共价法、交联法等,例如聚乙烯醇和海藻酸钠混合交联的固定化方法,但聚乙烯醇在快速交联的过程中使用的硼酸交联剂对微生物具有极强的杀伤力,导致其固定化活性较低,效率下降。
微生物组合物尤其适用于低C/N比废水处理,也就是说,低C/N比的废水通常为能源不足,微生物长期饥饿,但骨架为惰性介质,微生物可在骨架内部稳定存活。
实施例1:
制备微生物菌液:将铜绿假单胞菌PAO1(ATCC 15692)和代尔夫特菌JL5(CCTCCM2021139)分别接种到300mL无菌的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L)中,30℃,200rpm培养48h,4-10℃下,6000rpm下离心10min,沉淀用适量无菌水重悬,并取样在105℃烘干测定细胞浓度;将PAO1和JL5重悬液稀释到100mg干细胞/mL。
一种微生物组合物的制备方法,包括:
混合步骤:将PAO1和JL5的菌液分别与硅藻土(200目)混合,菌液与硅藻土的质量比为100:5,在温度为30℃的条件下200rpm培养2h,然后加入浓度为12.5wt%的聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量400),得到混合液,聚乙二醇二丙烯酸酯在混合液中的比例为20wt%;
交联步骤:在混合液中加入N,N,N',N'-四甲基乙二胺和过硫酸钾,得到待凝固溶液,N,N,N',N'-四甲基乙二胺在待凝固溶液中的比例为0.4wt%,过硫酸钾在待凝固溶液中的比例为0.2wt%,将待凝固溶液在温度为25℃,时间55min的条件下凝固成型;
切割步骤:将待凝固溶液凝固成型后,切割为边长为3-5mm的立方体,如图1所示,其固定有PAO1的微生物组合物的SEM图,如图2所示,PAO1在主体内部形态完好,且可观察到明显的细菌增殖分裂。
实施例2:
微生物菌液的制备同实施例1;
一种微生物组合物的制备方法,包括:
混合步骤:将PAO1和JL5的菌液分别与粉煤灰(200目)混合,菌液与粉煤灰的质量比为100:10,在温度为30℃的条件下200rpm培养2h,然后加入浓度为6.25wt%的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(平均分子量400)和6.25wt%聚乙二醇二甲基丙烯酸酯,得到混合液,聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯总量在混合液中的比例为18wt%;
交联步骤:在混合液中加入N,N,N',N'-四甲基乙二胺和过硫酸钾,得到待凝固溶液,N,N,N',N'-四甲基乙二胺在待凝固溶液中的比例为0.4wt%,过硫酸钾在待凝固溶液中的比例为0.2wt%,将待凝固溶液在温度为25℃,时间55min的条件下凝固成型;
切割步骤:将待凝固溶液凝固成型后,切割为边长为3-5mm的立方体,如图3所示,其固定有PAO1的微生物组合物的SEM图,如图4所示,PAO1在主体内部形态完好,且可观察到明显的细菌增殖分裂。
实施例3:
微生物菌液的制备同实施例1;
一种微生物组合物的制备方法,包括:
混合步骤:将PAO1和JL5的菌液与活性炭(200目)混合,菌液与活性炭的质量比为100:8,在温度为30℃的条件下200rpm培养2h,然后加入浓度为12.5wt%的聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(平均分子量400),得到混合液,聚乙二醇二甲基丙烯酸酯在混合液中的比例为15wt%;
交联步骤:在混合液中加入N,N,N',N'-四甲基乙二胺和过硫酸钾,得到待凝固溶液,N,N,N',N'-四甲基乙二胺在待凝固溶液中的比例为0.4wt%,过硫酸钾在待凝固溶液中的比例为0.2wt%,将待凝固溶液在温度为25℃,时间55min的条件下凝固成型;
切割步骤:将待凝固溶液凝固成型后,切割为边长为3-5mm的立方体,如图5所示,其固定有PAO1的微生物组合物的SEM图,如图6所示,PAO1在主体内部形态完好,且可观察到明显的细菌增殖分裂。
固定有PAO1的微生物组合物的活性检验:
(1)取实施例1-3固定有PAO1的微生物组合物各5g,添加到200mL反硝化培养基中(表格1所示),30℃,200rpm下连续培养;
表格1反硝化基础培养基
物质 | 浓度(g/L) |
KNO3 | 1.44 |
葡萄糖 | 2 |
K2HPO4 | 3 |
NaH2PO4 | 6 |
NaCl | 5 |
MgSO4 | 0.2 |
(2)分别在0,6,12,18,24h取样10mL,样品在8000×g下离心5mi n,样品保存于4℃;
(3)采用国标法所有样品NO3 --N(HJ/T 346-2007)、NO2 --N(GB 7493-87)和NH4 +-N(HJ 536-2009)浓度;
(4)绘制氮代谢曲线并分析脱氮性能,如图7所示,曲线①为无微生物的主体(不加入微生物菌液,其余与实施例1相同),②实施例1,③实施例2,④实施例3;实施例1-3的NO3--N还原动力学特性差异较小,均能在16h内将200mg/LNO3--N完全消耗。
固定有JL5的微生物组合物的活性检验:
(1)取实施例1-3固定有JL5的微生物组合物各5g,添加到100mL 50mmol/L的Tris-Cl缓冲液(含200nmol/LN-庚酰基高丝氨酸内酯(C8-HSL)中,30℃,200rpm下连续培养;
(2)分别在1,30,60,90min取样1mL,样品在8000×g下离心5min,取上清于95℃加热;C8-HSL的剩余量采用根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaci ens A136(ATCC 51350)的X-Gal生物显色法,用含有4.5μg/mL四环素、50μg/mL大观霉素和200μg/mL X-Gal及报告菌株A136的LB琼脂平板检测上清液中剩余的C8-HSL含量;
(3)30℃恒温培养24h后观察指示平板显色圈的大小、颜色深浅,根据已知浓度的C8-HSL的显色圈大小评估固定化JL5的降解能力,如图8所示,①为无微生物的主体(不加入微生物菌液,其余与实施例1相同),②实施例1,③实施例2,④实施例3,从图中所得,实施例2的C8-HSL降解性能最好,能在90min内将200nmol/L C8-HSL完全降解,而实施例1和实施例3在90min内仍有部分剩余,但都显示出了较强的C8-HSL降解活性。
对于本领域的技术人员来说,可根据以上描述的技术方案以及构思,做出其它各种相应的改变以及变形,而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种微生物组合物,包括主体和微生物;所述微生物附着于主体上;所述主体包括骨架和助剂;其特征在于,所述骨架包括聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和聚乙二醇二丙烯酸酯中的至少一种;所述助剂包括硅藻土、粉煤灰、改性活性炭和二氧化硅中的至少一种;所述微生物为铜绿假单胞菌PAO1(ATCC 15692)和代尔夫特菌JL5(CCTCC M2021139);
所述微生物组合物通过以下方法制备得到:
混合步骤:将微生物菌液与助剂混合,微生物菌液与助剂的质量比为100:(2.5-15),微生物菌液的浓度为100mg干细胞/mL,在温度为28-35℃的条件下200rpm培养1-2h,然后加入骨架试剂,得到混合液,骨架试剂在混合液中的比例为8-25wt%;
交联步骤:在混合液中加入N,N,N',N'-四甲基乙二胺和过硫酸钾,得到待凝固溶液,N,N,N',N'-四甲基乙二胺在待凝固溶液中的比例为0.1-0.5wt%,过硫酸钾在待凝固溶液中的比例为0.1-0.3wt%,将待凝固溶液在温度为20-30℃,时间30-60min的条件下凝固成型;
切割步骤:将待凝固溶液凝固成型后,切割为边长为2-5mm的立方体。
2.如权利要求1所述的微生物组合物,其特征在于,所述微生物的附着量为≥50mg微生物/g主体。
3.如权利要求1所述的微生物组合物,其特征在于,所述微生物菌液通过以下方法制备:将微生物接种到无菌的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L)中,30℃,200rpm培养48h,4-10℃下,4000-6000rpm下离心5-10min,沉淀用适量无菌水重悬,并取样在105℃烘干测定细胞浓度,将微生物菌重悬液稀释到100mg干细胞/mL。
4.一种微生物组合物的制备方法,其特征在于,包括:
混合步骤:将微生物菌液与助剂混合,微生物菌液与助剂的质量比为100:(2.5-15),微生物菌液的浓度为100mg干细胞/mL,在温度为28-35℃的条件下200rpm培养1-2h,然后加入骨架试剂,得到混合液,骨架试剂在混合液中的比例为8-25wt%;所述骨架试剂包括聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和聚乙二醇二丙烯酸酯中的至少一种;所述助剂包括硅藻土、粉煤灰、改性活性炭和二氧化硅中的至少一种;所述微生物为铜绿假单胞菌PAO1(AT CC 15692)和代尔夫特菌JL5(CCTCC M2021139);
交联步骤:在混合液中加入N,N,N',N'-四甲基乙二胺和过硫酸钾,得到待凝固溶液,N,N,N',N'-四甲基乙二胺在待凝固溶液中的比例为0.1-0.5wt%,过硫酸钾在待凝固溶液中的比例为0.1-0.3wt%,将待凝固溶液在温度为20-30℃,时间30-60min的条件下凝固成型;
切割步骤:将待凝固溶液凝固成型后,切割为边长为2-5mm的立方体,得到微生物组合物。
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