CN114516897A - 雷公藤红素衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种结构新型的雷公藤红素衍生物，其采用拟茎点霉对雷公藤红素进行生物转化，所述拟茎点霉的保藏登记号为CGMCC NO.16088。与雷公藤红素相比，这种雷公藤红素衍生物的抗肿瘤活性无显著差异，但细胞毒性大幅度降低。本发明所述雷公藤红素衍生物具有制备成新型抗肿瘤药物的潜力，为大规模利用生物技术制备雷公藤红素衍生物提供了广阔的应用前景。

Description

雷公藤红素衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及雷公藤红素衍生物的制备及活性检测，具体涉及采用生物转化法制备雷公藤红素衍生物及其抗肿瘤活性。

背景技术

雷公藤具有抑菌、抗炎、抑制肿瘤细胞等功效，雷公藤中的活性成分为雷公藤红素(Celastrol，CSL)。本领域普通技术人员对雷公藤红素药理活性的了解，可参阅专利CN111848722A、CN103642887B以及相关技术文献。本专利对此不再作详细阐述。雷公藤红素虽有显著的药理活性，但其水溶性低、心肌毒性大以及对正常细胞的较强的杀伤作用，严重影响了其在临床上的应用。因此，提高或保留雷公藤红素的药理活性，同时降低其对正常细胞的毒性，提升其治疗指数，是拓展雷公藤红素临床应用急需要解决的技术难题。

天然活性先导化合物生物转化是利用生物体系(如酶、微生物、植物细胞等)将加入到生物反应系统中的天然活性先导化合物进行特异性的分子结构修饰以获得高效、低毒新化合物的方法。该方法的本质是生物体系中的酶对外源性底物的催化反应。在天然先导化合物的结构优化方面，微生物转化具有反应条件温和、立体选择性强、催化效率高、反应种类多以及环境污染小等特点，尤其在复杂结构天然产物的结构修饰中表现出显著的优势。

专利CN111848722A公开了多种雷公藤红素衍生物，其在雷公藤红素的29位羧酸上通过酰胺键的形成与二肽进行偶联，可以降低雷公藤红素的细胞毒性，并增强对肿瘤细胞的选择性。与专利CN111848722A采用合成或半合成方法对雷公藤红素进行结构修饰不同，专利CN103642887B以雷公藤红素为微生物代谢药物，得到多种基于雷公藤红素的羟基、还原或羧基化等取代修饰的雷公藤红素衍生物。在通过生物转化技术制备雷公藤红素衍生物方面，本专利发明人团队开了系统性研究，并申请了专利CN109957515B。具体地，专利CN109957515B给出了一株拟茎点霉菌株，并利用该菌株对雷公藤红素进行生物转化，制备了抑菌活性新化合物16-OH-Celastrol。拟茎点霉菌株LGT-5是一株重要的植物内生真菌，为进一步拓展该菌株在生物医药领域的应用，本发明探究了拟茎点霉菌株LGT-5对雷公藤红素的生物转化，并检测了所的新化合物的药理活性。

发明内容

本发明的意图之一在于利用拟茎点霉菌株LGT-5对雷公藤红素进行生物转化，制备出具有抗肿瘤活性的雷公藤红素衍生物。

雷公藤红素CSL的化学结构如下所示，具有A-E的环状结构。本发明利用拟茎点霉菌株LGT-5对雷公藤红素进行生物转化，制备出新的雷公藤红素衍生物式(Ⅰ)。相较于雷公藤红素，式(Ⅰ)雷公藤红素衍生物的结构修饰发生在雷公藤红素A环上。

本发明提供一种雷公藤红素衍生物，其具有式(Ⅰ)所示的化学结构，

本发明给出了式(Ⅰ)所示雷公藤红素衍生物的制备方法，其采用拟茎点霉对雷公藤红素进行生物转化，所述拟茎点霉的保藏登记号为CGMCC NO.16088。

需要说明的是，本发明所用拟茎点霉与专利CN109957515B公开的拟茎点霉菌株LGT-5相同，有关拟茎点霉相关阐述具体参见专利CN109957515B。

本发明的意图之二在于拓展所述拟茎点霉在制备雷公藤红素衍生物中的应用。经本专利发明人探究得出，本发明所述拟茎点霉可以用于制备式(Ⅰ)所示雷公藤红素衍生物。

本发明的意图之三在于提供雷公藤红素衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。这里的雷公藤红素衍生物利用拟茎点霉菌株LGT-5对雷公藤红素进行生物转化获得。具体地，式(Ⅰ)所示雷公藤红素衍生物可用于制备抗肿瘤药物。经试验验证，式(Ⅰ)所示雷公藤红素衍生物以及所述抗肿瘤药物对肿瘤细胞U251、A549、KG-1和B16具有增殖抑制作用。所述抗肿瘤药物包含式(Ⅰ)所示雷公藤红素衍生物。

本发明的意图之四在于提供抗肿瘤药物。作为一种优选的实施方式，本发明给出一种抗肿瘤药物，其抗肿瘤活性成分为式(Ⅰ)所示雷公藤红素衍生物。作为一种优选的实施方式，本发明给出一种抗肿瘤药物，其抗肿瘤活性成分包括式(Ⅰ)所示雷公藤红素衍生物。

本领域普通技术人员易于知晓，本发明所述抗肿瘤药物除含有抗肿瘤活性成分外，还包括药学上可接受的辅料或载体。优选的，所述药学上可接受的辅料或载体为溶剂、润湿剂、乳化剂、增稠剂、赋形剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、润滑剂或稀释剂中的至少一种。根据抗肿瘤药物活性成分的特性，以及具体的使用方式和作用靶标，本发明所述抗肿瘤药物可以制备成药学上可接受的多种药物剂型。

与现有技术相比，本发明所述雷公藤红素衍生物及其制备方法与应用，至少具有下述的优点或有益效果：

本发明进一步拓展了拟茎点霉菌株LGT-5在医药领域中的应用，经对雷公藤红素进行生物转化，可以制备出具有抗肿瘤活性的雷公藤红素衍生物。

本发明提供了结构新型的雷公藤红素衍生物，式(Ⅰ)所示雷公藤红素衍生物(16-S-OH celastrol，化合物1)是雷公藤红素A环发生芳香化。与雷公藤红素相比，所述雷公藤红素衍生物的抗肿瘤活性无显著差异，但细胞毒性大幅度降低。

本发明所述雷公藤红素衍生物具有制备成新型抗肿瘤药物的潜力，为大规模利用生物技术制备雷公藤红素衍生物提供了广阔的应用前景。

附图说明

图1为化合物1的¹H NMR图谱。

图2为化合物1的¹³C NMR图谱。

图3为化合物1的DEPT图谱。

图4为化合物1的¹H-¹H COSY图谱。

图5为化合物1的HMQC图谱。

图6为化合物1的HMBC图谱。

图7为化合物1的NOESY图谱。

图8为化合物1的(-)-ESIMS图谱。

图9为化合物1对肿瘤细胞U251的作用，^**P<0.01(与雷公藤红素相比)。

图10为化合物1对肿瘤细胞A549的作用，^**P<0.01(与雷公藤红素相比)。

图11为化合物1对肿瘤细胞KG-1的作用，^**P<0.01(与雷公藤红素相比)。

图12为化合物1对肿瘤细胞B16的作用，^**P<0.01(与雷公藤红素相比)。

图13为化合物1对正常细胞BV-2的作用，^**P<0.01(与雷公藤红素相比)。

图14为化合物1对正常细胞H9c2的作用，^**P<0.01(与雷公藤红素相比)。

图15为化合物1对正常细胞PC12的作用，^**P<0.01(与雷公藤红素相比)。

具体实施方式

在以下实施例中进一步描述本发明，而不以任何形式旨在限制如权利要求所表明的本发明的保护范围。

实施例1

本实施例给出应用拟茎点霉LGT-5进行雷公藤红素转化，经分离鉴定得到式(Ⅰ)所示雷公藤红素衍生物(化合物1)。

1)生物制备

将拟茎点霉LGT-5接种至装有150mL改良马丁液体培养基的三角瓶中，28℃、180rpm振荡培养至对数生长期(通常培养时间为1天)，此时拟茎点霉LGT-5的浓度约为5g干重/L培养体系。本实施例采用的干重计量方法为：取样培养体系，离心收集菌体，用无菌水充分洗涤，然后烘干至干重。本实施例所述改良马丁液体培养基(pH6.2-6.6)的配方为：蛋白胨5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，酵母浸出粉2g，葡萄糖20g，蒸馏水1L。

在拟茎点霉LGT-5培养体系中加入2mL雷公藤红素溶液(含50mg雷公藤红素，溶剂为DMSO；雷公藤红素购自上海笛柏化学品技术有限公司，CAS号为34157-83-0)，28℃、180rpm振荡培养5天。即，拟茎点霉LGT-5与雷公藤红素的配比为0.75g干重的拟茎点霉LGT-5:50mg雷公藤红素。

取上述培养体系，通过离心或过滤的方式除去菌丝体，收集清液。

2)产物预制备

取1体积份1)得到的清液，加入1体积份乙酸乙酯，进行萃取(23℃静置半小时)，收集乙酸乙酯相；剩余的水相再加入1体积份乙酸乙酯，进行萃取(23℃静置半小时)，收集乙酸乙酯相；剩余的水相再加入1体积份乙酸乙酯，进行萃取(23℃静置半小时)，收集乙酸乙酯相；将3次乙酸乙酯相合并。

减压蒸馏(0.07MPa、60℃)合并后的乙酸乙酯相，除去溶剂，得到红棕色膏状产物。每152mL培养体系约得到45mg产物。

3)分离和鉴定

采用硅胶柱色谱对2)的产物初步进行分离纯化。干法装硅胶柱，样品拌样，对所得石油醚-丙酮(100:5)洗脱部分进行继续分离纯化。

对石油醚-二氯甲烷(100:5)洗脱部分进行液相色谱制备。选用反向高效液相(HPLC)制备色谱仪(型号NP7005C，江苏汉邦科技有限公司)，色谱柱为5C18-MS-Ⅱ10ID×250mm。

目标化合物1的纯化过程：将石油醚-丙酮(100:5)洗脱部分(红棕色膏状)，溶于甲醇后上样，每次进样0.2mL，流动相由甲醇和水组成(93％甲醇/水)，流速为5mL/min，目标物的峰对应的保留时间为18min左右。继续对该部分进行反向高效液相分离，流动相为甲醇/水85:15，目标物的峰对应的保留时间为35min左右，减压浓缩后，进行凝胶(Sephadex LH-20)柱色谱分离，石油醚/氯仿/甲醇(5:5:1)洗脱，得到化合物1(14.6mg)。收集目标峰对应的过柱后溶液，进行减压蒸馏(0.07MPa、50℃)以除去溶剂，得到产物，产物为红色粉末。目标化合物1的结构鉴定谱图见图1-图8。

目标化合物1的核磁数据见表1，(-)-ESIMS m/z 467.3026[M-H]^-。结果表明，目标化合物1为式(Ⅰ)所示化合物，即在雷公藤红素结构的基础上A环发生芳香化，16位有羟基取代(16-S-OH celastrol)。

表1，化合物1的核磁数据

实施例2

本实施例开展细胞毒性试验，对化合物1抗肿瘤活性进行测定，测定结果见图9-图15。

供试药剂：Celastrol(雷公藤红素)，通过实施例1制备的化合物1。

供试细胞：U251细胞，A549细胞，KG-1细胞，B16细胞；BV-2细胞，PC12细胞，H9c2细胞。

供试药剂溶液的配制：用DMSO溶解供试药剂，得到浓度为50mmol/mL的溶液，然后用完全培养基稀释，得到浓度为8μmol/L、5μmol/L、2μmol/L或1μmol/L的待测供试药剂溶液。所述完全培养基由9体积份DMEM培养基和1体积份胎牛血清组成。

培养条件：37℃，5％CO2。

试验步骤：

1)取96孔板，每孔加入100μL供试细胞的细胞悬液(含5×10³个供试细胞)，培养24小时，弃除上清。

2)完成步骤1)后，取所述96孔板，加入100μL样品液，培养48小时，弃除上清。每种供试药剂溶液(样品液)设置3个复孔。样品液为待测供试药剂或阴性对照溶液。每种待测供试药剂溶液都具有对应的阴性对照溶液，阴性对照溶液为含DMSO的完全培养基(DMSO含量同相应的待测供试药剂溶液)。空白孔为仅加入完全培养基的孔。

3)完成步骤2后，取所述96孔板，用PBS缓冲液清洗，进行CCK-8染色(2小时)，然后采用酶标仪测定490nm处的吸光度。

细胞增殖抑制率(％)＝(OD值给药孔一OD值阴性对照孔)/OD值空白孔×l00％。

采用SPSS内的ProbitAnalysis法计算半数抑制浓度(IC50)，单位为μmol/L。试验结果见表2。

表2，化合物1的抗肿瘤活性测定结果

由表2可知，化合物1对U251细胞、A549细胞、KG-1细胞、B16细胞均有不同程度的抑制活性，整体而言，化合物1对上述肿瘤细胞的抑制活性与雷公藤红素相当。但化合物1对BV-2的细胞毒性显著低于雷公藤红素，化合物1对KG-1细胞的抑制活性明显优于雷公藤红素。通过本实施例还可以说明，化合物1具有制备成抗肿瘤药物的潜力。

上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (6)

1.一种雷公藤红素衍生物，其具有式(Ⅰ)所示的化学结构，

2.权利要求1所述雷公藤红素衍生物的制备方法，其采用拟茎点霉对雷公藤红素进行生物转化，所述拟茎点霉的保藏登记号为CGMCC NO.16088。

3.权利要求2所述拟茎点霉在制备权利要求1所述雷公藤红素衍生物中的应用。

4.权利要求1所述的雷公藤红素衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物对肿瘤细胞U251、A549、KG-1和B16具有增殖抑制作用。

6.一种抗肿瘤药物，其抗肿瘤活性成分包括权利要求1所述雷公藤红素衍生物。

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