CN114504683B - 一种可注射生物活性复合导电水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于组织工程学技术领域，具体涉及一种可注射生物活性复合导电水凝胶及其制备方法与应用，本发明通过去细胞基质水凝胶和PEDOT:PSS各自的物理交联制备得到一种复合导电水凝胶。本发明的复合导电水凝胶具有极高的电子传输效率和机械强度，可以较好还原细胞生长的微环境，具有优秀的生物相容性，能促进组织再生，且具有很好的流动性和可注射性，使用时不受形状和尺寸限制，凝胶化后与组织能够很好粘附，不需要额外的手术缝合；还可以通过调节PEDOT:PSS的加入量来调节水凝胶的电导率，并通过外加微弱电流来实现为细胞提供电刺激，可以有效促进细胞增殖、迁移及功能化，有望制备成生物医用导电材料进行应用。

Description

一种可注射生物活性复合导电水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于组织工程学技术领域，具体涉及一种可注射生物活性复合导电水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
随着组织工程学的发展，越来越多生物材料被用于组织再生过程。在所有应用的生物材料中，天然生物材料是一类来源广泛、在自然条件下生成的生物材料，包括天然纤维、生物体组织、结构蛋白、多糖等。天然生物材料具有优良的生物相容性和生物活性，并且具有与组织相似的力学性能，能够为细胞生长提供结构支撑和粘附位点。
水凝胶是一类富含水的三维网络结构，由于存在交联网络，水凝胶可以在水中溶胀而不至破裂，且其吸水量与水凝胶的交联度密切相关，交联度越高，吸水量越小，这一特性与软组织相似。近年来，由于水凝胶具有柔软的力学特点以及与细胞外基质的相似性，被广泛应用于医用生物材料领域。其中，基于去细胞基质(dECM,decellularizedextracellular matrix)的水凝胶来源于组织/器官，由组织经脱细胞操作去除免疫源性物质而获得，具有较高的生物相容性，且保留了原组织所含有的蛋白质(胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等)、多糖(甘聚糖、蛋白多糖、糖蛋白等)和一些生长因子等活性物质，表现出组织特异性的特有生物活性。当前，对去细胞基质的研究已涉及到多个组织，如角膜、小肠粘膜下层、心肌等。相比于传统单一组分的生物水凝胶，dECM水凝胶可以更好地模拟原生组织微环境的组成、微观结构和生物力学特性，为细胞提供更多附着位点和营养成分，促进细胞的粘附和生长，进而促进组织的生长和再生。
在人体内，存在着大量的生物电，尤其是在神经组织、心脏组织等电活性组织中，细胞之间通常以电信号来快速传递信息。其中，电刺激通过外围电子设备产生的电信号作用于目标神经组织或细胞上。大量的研究表明，电刺激对神经细胞的活化、迁移、生长和轴突延伸起到重要的作用。相较于化学刺激、物理刺激，电刺激具有更多的优越性(如方向、频率、电压大小的可控性)，并且不会在刺激环境中遗留化学产物。
目前，常用于生物导电的导电材料主要有无机与有机两大类。其中，无机导电材料主要包括碳纳米材料(如碳纳米管、碳纳米球、碳纳米线)和金属及其合金(如金、铂等和它们的合金)；有机导电材料则主要集中在共轭聚合物一类，如聚苯胺(PAni)、聚吡咯(PPy)和聚乙撑二氧噻吩-聚苯乙烯磺酸盐(PEDOT:PSS)等。但将碳纳米材料应用于制备导电水凝胶，通常会由于相分布不均匀而导致力学性能和电学性能不连续；金属及其合金颗粒掺杂的导电水凝胶则会由于金属溶蚀而产生pH改变、释放气体或热量、形成自由基等问题，从而容易导致电极表面与生物组织界面产生炎症反应。而导电聚合物(CP)近年来因其与细胞和组织的机械相容性而逐渐成为一种理想的生物医用导电材料，这些材料具有与金属相当的电性能，同时还具有其他优点(如加工和修饰的灵活性)，是一种同时具有仿生机械性能和化学性能的电活性材料。
导电水凝胶是一种结合了导电材料的高电导率和水凝胶的柔软与可塑性的理想生物相容性材料，这类导电聚合物对于神经组织再生、辅助神经电信号的传输以及电刺激神经细胞促进再生均具有促进作用，因而被广泛应用于心肌、神经等组织工程材料领域。这类导电聚合物与各种生物大分子(如透明质酸、壳聚糖、纤维蛋白原、胶原蛋白等)共混可以提高生物相容性，并有利于水凝胶成型。其中，PEDOT:PSS作为近年来备受关注的导电高分子之一，具有电导率高、生物相容性好的优点。目前已有研究将PEDOT:PSS与甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)混合制备成可光固化3D打印水凝胶用于促进背根神经节神经元(DRG,dorsal root ganglion)的轴突延伸，并且在增加电刺激的条件下可以增强神经分化，但GelMA的生物性能较为单一且光交联后细胞黏附能力下降。中国发明专利2021105548830则公开了一种PEDOT:PSS导电水凝胶的构建方法，该方法在PEDOT:PSS溶液中添加水溶性的山梨醇溶液和水性聚氨酯WPU溶液，再加入壳聚糖季铵盐后通过pH调节制成水凝胶溶液，最后蒸发制得水凝胶，并将水凝胶导入电极模具，得到水凝胶电极。但该水凝胶材料是一种不具备生物活性的导电水凝胶，生物相容性较差。总体而言，现有的导电水凝胶材料尽管具有较高模量，但生物活性低，对细胞生长促进作用不明显，且由于本身共轭结构存在一定脆性，导致形成的材料力学性能不佳；同时，所采用的天然或合成的生物材料并不具备组织特异性的生物活性，无法较好的模拟原有活体组织内的细胞生长微环境，导致生物性能不足。因此，有必要开发一种有利于细胞的黏附、增殖且机械性能、生物相容性好的导电水凝胶。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种可注射生物活性复合导电水凝胶，该水凝胶同时包括去细胞基质水凝胶和PEDOT:PSS，该水凝胶更有利于细胞的黏附、增殖以及包埋在水凝胶中进行三维培养和细胞移植，在生物相容性、生物活性以及可导电性方面都有突出的优势，有望制备成生物医用导电材料。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案来为：
本发明还提供了一种可注射生物活性复合导电水凝胶，所述复合导电水凝胶包括去细胞基质水凝胶和PEDOT:PSS，且所述复合导电水凝胶通过去细胞基质水凝胶和PEDOT:PSS各自物理交联得到。
在本发明中，去细胞基质水凝胶去除了免疫源性物质，保留了原有组织所特有的蛋白质、多糖、生长因子等活性物质，针对性强，能够更好地模拟细胞生长微环境，有利于细胞粘附、生长及繁殖，促进细胞外基质的分泌和积累，具有极佳的细胞相容性和组织相容性。PEDOT:PSS是一种导电聚合物，PEDOT分子具有许多共轭双键结构，分子链间形成的π-π堆积提高了电子传输效率，PSS长链可以增强PEDOT在水溶液当中的溶解性，并且PSS上的负电荷起到离子导电作用。PBS具有pH缓冲、盐平衡的作用。
本发明还提供了上述可注射生物活性复合导电水凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：
S1、将来源于器官或组织的脱细胞基质粉末溶解在胃蛋白酶溶液中制成均相消化液，调节pH至碱性终止消化后再将pH调至中性，然后加入PBS溶液制备成去细胞基质溶胶；
S2、往步骤S1的去细胞基质溶胶中加入PEDOT:PSS溶液，用PBS溶液稀释后于37℃下经静置制备得到复合导电水凝胶。
优选地，所述器官或组织包括但不限于神经系统、心肌组织、肌肉组织、软骨组织、皮肤组织、角膜组织、口腔组织。
具体地，所述脱细胞基质粉末来源于组织，所述组织为猪下肢的坐骨神经组织。
本发明提供了一种基于来源于不同器官或组织的去细胞基质水凝胶掺杂PEDOT:PSS的导电水凝胶的制备方法。在去细胞基质水凝胶网络的基础上引入PEDOT:PSS构建第二个物理交联网络，PEDOT分子链上的共轭双键结构为电子传输提供路径，具有极高的电子传输效率；PSS长链则带负电荷，具有离子导电特性；去细胞基质则赋予水凝胶更好的生物活性，可以还原细胞真实的生长微环境，并且提高水凝胶的机械强度。该水凝胶基于水凝胶溶胶凝胶转变的特点，在凝胶化前具有良好的流动性，凝胶化后具有多孔结构，本发明中的双网络导电水凝胶不仅可以包载细胞，在成胶固定后能为细胞提供营养物质和生长孔道，减少对细胞的伤害；还有望与各种生长因子、药物等均匀混合，进一步增强水凝胶的促修复效果，有望制备成生物医用导电材料。
优选地，所述脱细胞基质粉末的制备方法为：先分别用3％Triton X-100和4％脱氧胆酸钠对器官或组织进行脱细胞处理，洗涤、干燥和碎化处理后再用乙醇和二氯甲烷混合溶液进行浸泡处理，最后经洗涤、干燥和粉碎后制得。
进一步地，乙醇和二氯甲烷混合溶液中，乙醇与二氯甲烷的体积比为1:2。
进一步地，3％Triton X-100脱细胞的时间不少于12h，4％脱氧胆酸钠脱细胞的时间不少于24h。
进一步地，乙醇和二氯甲烷混合溶液浸泡的时间不少于24h。
优选地，复合导电水凝胶中，脱细胞基质的浓度为5～10mg/mL。具体地，脱细胞基质的浓度为5mg/mL。
优选地，复合导电水凝胶中，PEDOT:PSS的浓度为0～1mg/mL，且PEDOT:PSS的浓度不为0。具体地，PEDOT:PSS的浓度为0.1mg/mL。
人体内存在密集的生物电，尤其是神经类细胞具有明显的电活性，大量研究表明，电刺激(ES)对神经细胞的增殖、导向、分化以及轴突再生具有重要影响，并且由于电刺激的特殊性，对刺激环境不会产生遗留化学物质，已经成为生化、物理刺激的有效替代。通过搭建导电装置，为搭载神经细胞的导电水凝胶培养提供微弱电流刺激，可刺激该神经细胞的功能性分化与生长。
本发明的复合导电水凝胶可以通过调节PEDOT:PSS的加入量来调节水凝胶的电导率，进而可以通过外加微弱电流来实现为细胞提供电刺激，并可以有效促进细胞增殖、迁移及功能化。
优选地，复合导电水凝胶中，PBS溶液的浓度为250-495μL/mL。具体地，PBS溶液的浓度为490μL/mL。
本发明还提供了上述可注射生物活性复合导电水凝胶在制备生物医用导电材料中的应用。
本发明的可注射生物活性复合导电水凝胶具有极高的电子传输效率，在凝胶化前具有很好的流动性，在使用时不受特定的形状或尺寸限制，凝胶化后与组织能够很好粘附，不需要额外的手术缝合；水凝胶凝胶化前具有可注射性，凝胶过程及凝胶后对细胞不具有毒害作用，生物相容性好；且水凝胶能够与生长因子、药物、细胞等均匀混合，可作为营养因子、药物和细胞的释放载体，有望制备成生物医用导电材料。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种可注射生物活性复合导电水凝胶，该复合导电水凝胶由去细胞基质水凝胶和PEDOT:PSS组成，通过两种成分各自物理交联得到。本发明的制备方法简单、快速、易实现，使用时不需要复杂的工具或手术器具；本发明使用的去细胞基质材料来源广，可以极大满足使用需求；本发明中的去细胞基质水凝胶可以在体温37℃左右形成凝胶，为医疗应用提供可能；本发明中的去细胞基质水凝胶可以较好还原细胞生长的微环境，具有优秀的生物相容性，能促进组织再生，可以改善细胞粘附性和生物活性等；本发明中的去细胞基质水凝胶在凝胶化前具有很好的流动性和可注射性，使用时不受形状和尺寸限制，凝胶化后与组织能够很好粘附，不需要额外的手术缝合；本发明中的去细胞基质水凝胶+PEDOT:PSS复合导电水凝胶可以通过调节PEDOT:PSS的加入量来调节水凝胶的电导率；本发明中的去细胞基质水凝胶+PEDOT:PSS复合导电水凝胶可以通过外加微弱电流来实现为细胞提供电刺激，并可以有效促进细胞增殖、迁移及功能化。可见，本发明的复合导电水凝胶有望制备成生物医用导电材料。
附图说明
图1为去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶的实物图；
图2为去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶在4-37℃之间的扫描流变曲线(G’为储存模量，G”为损耗模量)；
图3为去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶在4-37℃之间的快速升温流变曲线(G’为储存模量)；
图4为去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶可注射性能展示图；
图5为去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶的粘度特性曲线；
图6为去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶电导率测试结果；
图7为去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶的LED亮灯实验结果；
图8为去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶的阻抗图；
图9为去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶通过循环伏安法(CV)测试电化学性能的曲线；
图10为0.5％pDNM水凝胶培养PC12细胞的光镜图；
图11为去细胞基质水凝胶和去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶二维培养大鼠背根神经节细胞3天的活死染色结果；
图12为去细胞基质水凝胶和去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶培养大鼠背根神经节细胞1、3天的存活率统计图；
图13为去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶三维培养大鼠背根神经节细胞7天的免疫荧光染色结果(绿色：NF200；红色：S100；蓝色：DAPI)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
下述实施例和对比例的物质组分重量配比如下表所示：
Figure BDA0003515840020000061
实施例1去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶(pDNM/PEDOT:PSS复合导电水凝胶)的制备
(1)制备冻干外周神经脱细胞粉末：取小型猪下肢的新鲜坐骨神经组织分别用3％Triton X-100脱细胞12h和4％脱氧胆酸钠脱细胞24h，然后用去离子水冲洗3次，此过程重复两遍以完成去细胞化，随后冻干并剪碎，然后将其浸泡在无水乙醇和二氯甲烷混合溶液(V乙醇∶V二氯甲烷＝1∶2)中，搅拌24h，重复两遍，最后放入真空干燥箱中抽除溶剂，并用去离子水冲洗3次，再次冻干并粉碎，得到外周神经脱细胞粉末；
(2)先用稀盐酸溶解胃蛋白酶，得到胃蛋白酶溶液(1mg/mL)，然后将5mg外周神经脱细胞粉末溶解在1mL胃蛋白酶溶液中，室温搅拌消化得到均相消化液(无可见粉末残留)。
(3)消化完毕后，高速离心(20000rpm，10min)，去除未消化颗粒及杂质；
(4)用NaOH溶液调节消化液pH至8使胃蛋白酶失活，从而终止消化，再用HCl溶液调节消化液pH至中性；
(5)加入PBS溶液得到1％(质量体积比)去细胞基质(pDNM)溶胶；
(6)用NaOH溶液调节PEDOT:PSS溶液(购自贺利氏，货号为Clevios PH1000(Heraeus)，浓度为10mg/mL，溶剂是水)至中性；
(7)往去细胞基质溶胶中加入5μL中性PEDOT:PSS溶液(PEDOT:PSS的终浓度为0.05mg/mL)，再加入495μL中性PBS稀释；
(8)在37℃下形成pDNM/PEDOT:PSS复合导电水凝胶(0.5％pDNM+0.005％PEDOT:PSS)，其外观如图1所示。
实施例2pDNM/PEDOT:PSS复合导电水凝胶(0.5％pDNM+0.01％PEDOT:PSS)的制备
制备方法同对比例1，不同之处在于：步骤(7)中的中性PEDOT:PSS溶液为5μL，PBS的加入量为495μL，其外观如图1所示。
实施例3pDNM/PEDOT:PSS复合导电水凝胶(0.5％pDNM+0.025％PEDOT:PSS)的制备
制备方法同对比例1，不同之处在于：步骤(7)中的中性PEDOT:PSS溶液为25μL，PBS的加入量为475μL。
实施例4pDNM/PEDOT:PSS复合导电水凝胶(0.5％pDNM+0.1％PEDOT:PSS)的制备
制备方法同对比例1，不同之处在于：步骤(7)中的中性PEDOT:PSS溶液为100μL，PBS的加入量为400μL。
实施例5pDNM/PEDOT:PSS复合导电水凝胶(0.5％pDNM+0.25％PEDOT:PSS)的制备
制备方法同对比例1，不同之处在于：步骤(7)中的中性PEDOT:PSS溶液为250μL，PBS的加入量为250μL。
对比例1去细胞基质水凝胶(1％pDNM)的制备
(1)制备冻干外周神经脱细胞粉末：取小型猪下肢的新鲜坐骨神经组织分别用3％Triton X-100脱细胞12h和4％脱氧胆酸钠脱细胞24h，然后用去离子水冲洗3次，此过程重复两遍以完成去细胞化，随后冻干并剪碎，然后将其浸泡在无水乙醇和二氯甲烷混合溶液(V乙醇∶V二氯甲烷＝1∶2)中，搅拌24h，重复两遍，最后放入真空干燥箱中抽除溶剂，并用去离子水冲洗3次，再次冻干并粉碎，得到外周神经脱细胞粉末；
(2)先用稀盐酸溶解胃蛋白酶，得到胃蛋白酶溶液(1mg/mL)，然后将10mg外周神经脱细胞粉末溶解在1mL胃蛋白酶溶液中，室温搅拌消化得到均相消化液(无可见粉末残留)。
(3)消化完毕后，高速离心(20000rpm，10min)，去除未消化颗粒及杂质。
(4)用NaOH溶液调节消化液的pH至8使胃蛋白酶失活，从而终止消化，再用HCl溶液调节消化液pH至中性。
(5)加入PBS溶液得到1％(质量体积比)去细胞基质(pDNM)溶胶。
(6)在37℃下自发形成去细胞基质(pDNM)水凝胶，其外观如图1所示。
由图1可以看出，外周神经去细胞基质可以形成透明度较高的水凝胶，加入PEDOT:PSS溶液后亦能形成凝胶状态。
对比例2去细胞基质水凝胶(0.5％pDNM)的制备
制备方法同对比例1，不同之处在于：步骤(5)中加入1％pDNM溶胶体积的1/9体积的PBS溶液后，涡旋均匀，再加入跟1％pDNM溶胶等体积的PBS溶液稀释至0.5％pDNM。
实验例1性能测试
(1)流变性能测试
1)流变曲线测试
取各实施例和对比例中的去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶200μL，滴在旋转流变仪(Kinexus Pro+，Malvern Instruments Ltd)的平行板上，用20mm平板进行测量扫描流变曲线，两个平行板夹具之间的距离为0.5mm，设置温度为4℃，升温速率为3℃/min，从4℃升温至37℃。
由图2可以看出，去细胞基质水凝胶从4℃升温至37℃过程中发生溶胶-凝胶转变，并且1％pDNM具有最高的储存模量G’。
2)快速升温流变曲线测试
取实施例1、2和对比例1、2中的去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶200μL，滴在旋转流变仪(HAAKE MARS III，Thermo Scientific)的平行板上，用20mm平板进行测量快速升温流变曲线，两个平行板夹具之间的距离为0.5mm，设置温度为4℃，升温速率为200℃/min，从4℃升温至37℃。
由图3可以看出，去细胞基质水凝胶在37℃下具有较好的力学性能，就1％pDNM而言，储存模量G’可达700～800Pa。这种去细胞基质水凝胶的力学性能(如强度等)，会因不同物种、不同组织/器官来源而不同。
(2)可注射性能测试
由图4可以看出，本发明的水凝胶具有良好的可注射性能。即将各实施例中的去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶加入注射器，通过7号针头可以顺利挤出，并且在接收板上37℃下可以成胶，在PBS溶液中室温也可成胶。
(3)粘度特性测试
取实施例1、2和对比例1、2中的去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶200μL，滴在旋转流变仪(HAAKE MARS III，Thermo Scientific)的平行板上，用20mm平板进行测量粘度，两个平行板夹具之间的距离为0.5mm，设置温度为4℃，剪切速率范围为1-100s-1。
图5的粘度曲线说明本发明的水凝胶的黏度η*随剪切速率增加而显著减小，具有明显的剪切变稀特性，进一步证明了其可注射性能。
(4)电导率测试
将实施例1、2中的去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶制备成直径15mm，厚度2mm的圆片，然后将圆片置于四探针测试仪(4Probes Tech)下测试其电导率。
由图6可以看出，0.5％pDNM+0.01％PEDOT:PSS相比0.5％pDNM+0.005％PEDOT:PSS具有更高的电导率，达到0.58S/m。
(5)LED亮灯实验
将实施例1、2中的去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶制备成直径15mm，厚度2mm的圆片，用导线将水凝胶圆片与LED小灯泡、电源箱一同接入电路，然后观察水凝胶的LED亮灯情况。
由图7可以看出，本发明的水凝胶接入电路中均能点亮LED灯泡，在相同电压下，通过0.5％pDNM+0.01％PEDOT:PSS水凝胶的电流最大，LED灯泡最亮。
(6)阻抗测试
将实施例1、2，对比例2中的去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶制备成直径15mm，厚度2mm的圆片，并将其置于两铜片之间形成三明治结构，在电化学工作站(CHI660E，上海辰华)下以5mV为交变电压，扫描频率为1Hz-105 Hz进行测试，得到交流阻抗谱图。
由图8可以看出，在较高频率下，电容性电流占主导地位，所有pDNM、pDNM/PEDOT:PSS水凝胶都表现出低阻抗；在较低频率下，电阻性电流占主导地位，pDNM/PEDOT:PSS水凝胶比pDNM水凝胶阻抗低，说明PEDOT:PSS的加入增强了pDNM水凝胶的导电性。
(7)电化学性能
将实施例1、2，对比例2中去细胞基质PEDOT:PSS复合导电水凝胶制备成直径15mm，厚度2mm的圆片，并将其置于两铜片之间形成三明治结构，在电化学工作站(CHI660E，上海辰华)下进行电化学测试，选择的扫描速率为0.05Vs-1，扫描范围为-0.3-0.6V，所有样品的电化学测试均在常温下进行。
图9的结果显示了不同水凝胶的电荷传递能力(CDC)，导电水凝胶的CDC随着PEDOT:PSS浓度的增加而显著增加，在一个CV循环中，通过0.5％pDNM+0.01％PEDOT:PSS水凝胶的电荷量最多(所围成的面积最大)，说明其具有最好的电荷传输能力。
(8)细胞相容性测试
1)0.5％pDNM水凝胶培养PC12细胞
将PC12细胞接种在对比例2的0.5％pDNM水凝胶上，37℃下培养7天后通过倒置荧光显微镜(Ts2FL，Nikon)拍摄。
由图10可以看出，PC12细胞在0.5％pDNM水凝胶上生长良好，充分粘附，说明本发明中的外周神经去细胞基质水凝胶具有优良的细胞相容性，这归因于pDNM具有许多组织特有的多糖、蛋白和生长因子等，有利于神经细胞的粘附与铺展。
2)pDNM/PEDOT:PSS复合导电水凝胶培养大鼠背根神经节细胞(DRG细胞，来自中山大学实验动物中心)3天的活死染色实验
将各实施例的pDNM/PEDOT:PSS复合导电水凝胶在溶胶状态下加入48孔板，随后放入37℃培养箱成胶，用移液枪吸取DRG细胞悬液滴在水凝胶表面。将水凝胶吸出，用PBS溶液冲洗2遍，加入CalceinAM(钙黄绿素-AM，1∶2000)和PI(碘化丙啶，1∶2000)的混合溶液，直至没过水凝胶，在37℃培养箱中培养20min完成染色，然后通过倒置荧光显微镜(Ts2FL，Nikon)观察，并根据活死染色结果，使用ImageJ软件分析大鼠背根神经节细胞1、3天的存活率。
图11的结果说明pDNM/PEDOT:PSS复合导电水凝胶具有良好的生物相容性，在较高浓度下DRG细胞仍可以在其表面充分粘附、铺展，并伴随一定程度的轴突延伸。
图12的结果说明pDNM/PEDOT:PSS复合导电水凝胶具有良好的生物相容性，DRG细胞在pDNM/PEDOT:PSS复合导电水凝胶上培养3天后存活率仍在90％以上。
3)DNM/PEDOT:PSS复合导电水凝胶培养大鼠背根神经节细胞(DRG细胞，来自中山大学实验动物中心)7天的免疫荧光染色实验
将DRG细胞接种在实施例1、2中的DNM/PEDOT:PSS复合导电水凝胶上，37℃下培养7天后使用4％多聚甲醛固定大鼠背根神经节细胞20min，然后用PBS缓冲液配制0.2％TritonX-100和5％BSA的混合溶液，对细胞进行透化、封闭20min，然后加入一抗NF200(1∶160)、S100(1∶1000)在4℃下放置过夜，第二天用PBS缓冲溶液冲洗三遍后加入二抗Fluro 488(1∶1500)和Fluro 594(1∶1500)，室温孵育1h，再加入DAPI(1∶2500)孵育20min，最后用PBS缓冲溶液冲洗三遍去除多余DAPI，并通过激光共聚焦显微镜(LSM 710NLO，ZESS)进行拍摄。
图13的结果说明pDNM水凝胶混合PEDOT:PSS导电水凝胶可以促进DRG轴突延伸，并一定程度上促进DRG细胞的增殖与迁移。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种可注射生物活性复合导电水凝胶，其特征在于，所述复合导电水凝胶包括去细胞基质水凝胶和PEDOT:PSS，且所述复合导电水凝胶通过去细胞基质水凝胶和PEDOT:PSS各自物理交联得到；所述可注射生物活性复合导电水凝胶的制备方法包括以下步骤：
S1、将来源于猪下肢坐骨神经组织的脱细胞基质粉末溶解在胃蛋白酶溶液中制成均相消化液，调节pH至碱性终止消化后再将pH调至中性，然后加入PBS溶液制备成去细胞基质溶胶；
S2、往步骤S1的去细胞基质溶胶中加入PEDOT:PSS溶液，用PBS溶液稀释后于37℃下经静置制备得到复合导电水凝胶，所述复合导电水凝胶中，脱细胞基质的浓度为5 ~ 10 mg/mL，PEDOT:PSS的浓度为0 ~ 1 mg/mL，且PEDOT:PSS的浓度不为0，PBS溶液的浓度为250 ~495μL/mL。
2.根据权利要求1所述的一种可注射生物活性复合导电水凝胶，其特征在于，所述脱细胞基质粉末的制备方法为：先分别用3% Triton X-100和4%脱氧胆酸钠对器官或组织进行脱细胞处理，洗涤、干燥和碎化处理后再用乙醇和二氯甲烷混合溶液进行浸泡处理，最后经洗涤、干燥和粉碎后制得。
3.根据权利要求2所述的一种可注射生物活性复合导电水凝胶，其特征在于，乙醇和二氯甲烷混合溶液中，乙醇与二氯甲烷的体积比为1:2。
4.权利要求1-3任一项所述的可注射生物活性复合导电水凝胶在制备生物医用导电材料中的应用。
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