CN114796603B - 一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶及其制备方法，属于天然生物高分子材料技术领域。采用酸性物质GDL溶解CS，在制备过程中使CS的‑NH2质子化，与体系中XG、PEDOT‑HA的‑COOH结合，完成交联后可形成结构稳定的导电水凝胶，之后利用冷冻干燥技术制备干态支架。本发明中GDL为绿色酸性物质具有分步骤电离，缓慢改变pH的特点，制备过程无需添加其他化学交联剂，使得制备流程简单。本发明制备的导电水凝胶支架具有良好吸水性、高孔隙率、适宜电导率与力学性能；通过体外模拟神经细胞生活的微电环境，完成神经组织修复；支架上细胞的SEM照片显示，支架内含有大量细胞，细胞间呈交错网状结构，由此可见制备的导电水凝胶支架具有应用于神经组织工程的潜力。

Description

一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于复合材料技术领域，涉及一种三维多孔PEDOT-HA/CS/XG可导电水凝胶支架材料及其制备方法，尤其涉及一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶及其制备方法。
背景技术
随着人口老龄化的加剧，神经退行性疾病等神经系统发病人数逐年增加，病因尚不明确，表现为神经细胞不断萎缩变性及死亡，引发神经功能障碍而自身难以有效补充，造成愈加的社会负担。组织工程是通过构建三维复合支架，将种子细胞接种于支架上，经过适当条件培养，体外细胞增殖与分化，最终实现组织修复的治疗方法。在神经组织工程领域，神经元细胞经常需要电活动来进行收缩和信号传递，其细胞功能很大程度上依赖环境的电传导能力，导电支架作为组织工程的新型材料，被认为可模拟神经细胞生长的微电环境，有利于细胞的增殖生长和神经组织修复。但导电聚合物通常会引发细胞毒性和疏水基团引起细胞粘附问题，所以开发良好生物相容性的导电支架具有重要价值。
导电聚合物是类似金属和无机半导体的导电材料，因其具有柔软的机械兼容性、细胞和器官的协调性等特点被广泛应用于可植入电极、生物传感器、组织工程支架材料。其中聚3,4-乙撑二氧噻吩(Poly 3,4-ethylene dioxythiophene，PEDOT)是聚噻吩衍生的一种导电聚合物，具有优秀的导电性和生物应用能力。Abidian等通电化学法制备螺旋状内腔的PEDOT/琼脂糖神经导管，修复大鼠10mm的神经间隙，术后12周结果显示，导电神经导管支持神经轴突以及神经再生。Sirivisoot等将PEDOT和聚苯胺两种导电聚合物引入胶原蛋白溶液，获得导电凝胶在电导率上提升400％以上，接入PC12细胞的实验显示，材料可支持细胞的粘附生长。但引入导电聚合物通常会引发细胞毒性与细胞粘附问题，有研究通过掺杂生物分子如纤维蛋白原、透明质酸(HA)等改善PEDOT的生物相容性。在制备时使用氧化剂将EDOT单体转化为阳离子，利用生物分子作为稳定剂和掺杂剂实现PEDOT的氧化聚合。其中利用HA掺杂PEDOT制备导电聚合物，HA可作为中间的桥梁实现PEDOT与水凝胶骨架的结合。据报道利用HA掺杂PEDOT的导电支架，可达到层粘连蛋白所具有的支持效果，有利于神经突的形成与存活。因此在制备导电支架时，生物分子HA可作为掺杂剂改善PEDOT的生物相容性，赋予支架导电能力，从而模拟神经细胞生长的微电环境。
壳聚糖(Chitosan，CS)这种天然阳离子多糖具有许多独特生理特性，例如生物降解性、无免疫原性、无毒性和良好的生物相容性，但其溶解性限制了它的应用。CS的溶解性与自身的脱乙酰度、分子量、溶液的pH有关，溶解CS时酸性物质选择非常关键，绿色的酸性物质可以免除洗涤，简化制备流程，可增强CS材料在生物领域的应用潜力。另外单独使用CS机械性能不足也是重要的考察问题，其主链上携带有-OH，-NH2和-COOH等活性基团，可与其他材料结合改善机械性能，也可引入功能分子提供支架新的性质。
黄原胶(Xanthangum，XG)是一种来源广泛的微生物多糖，因其可降解性、高吸水性和良好的生物相容性被广泛应用于生物医学领域。有研究发现将XG引入体系，提升了材料的亲水性和保水性，同时增强了培养基中血清蛋白的吸附率，这有利于细胞的粘附生长。XG自身的高分子量和丰富的侧链增加水凝胶网络的缠绕程度和分子内交叉，通过改变XG含量可使水凝胶的机械强度成为可控因素。据报道在神经组织工程领域，XG复合材料可支撑神经细胞增殖生长表现良好细胞相容性，作为神经导管也有助于神经突延长，从而完成神经修复。虽然XG具有弱凝胶特性，但自身无法形成足够机械强度的水凝胶，有研究表明XG与CS结合可同时实现两种材料的功能优势，制备具有力学性能适宜、吸水性强、有利于细胞粘附的水凝胶，因此研究CS与XG的分子结构特点，考察两者的结合方式具有重要意义。
考虑CS与XG结合时，需要选择酸性物质溶解CS，葡萄糖酸内酯(Gluconolactone，GDL)是绿色的酸性物质，经常用作食品添加剂，可被肝脏完全代谢。GDL可以缓慢调节溶液pH，首先经水解反应生成葡萄糖酸(GA)，这一过程缓慢，之后GA电离出H+，降低溶液pH。在以往的工作中，为满足CS溶解的弱酸环境，使用乙酸作为酸性物质，得到支架还需要使用戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、2-吗啉乙烷磺酸(MES)和碳二亚胺(EDC)等完成CS基水凝胶材料的化学交联，残留的酸性物质与化学交联剂需要弱碱性物质和双蒸水洗涤。然而利用GDL作为酸性物质，缓慢改变溶液的pH不仅可以满足CS的溶解条件，而且无需添加其他化学交联剂，避免了化学交联剂残余，这可优化水凝胶的制备流程，也能提升生物相容性。目前对于CS与XG体系，利用GDL构建水凝胶骨架并加入PEDOT-HA，制备三维多孔导电水凝胶尚未见报道，通过这种新颖方式制备导电水凝胶用于神经组织修复与再生是一个亟待深入的研究课题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种新型导电水凝胶支架的制备方法。本发明提供的导电水凝胶支架及其制备方法，制备方法简单，具有较好的重复性，无需洗涤酸性物质和化学交联剂，具有良好的生物相容性，可以作为体外承载种子细胞的移植材料和介电材料应用于神经组织工程。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶的制备方法，所述的PEDOT-HA为HA掺杂PEDOT制备得到的具有较高导电性能且生物相容性良好的导电纳米颗粒。所述PEDOT-HA/CS/XG为导电纳米颗粒(PEDOT-HA)与黄原胶(XG)、壳聚糖(CS)的聚合物，PEDOT-HA/CS/XG为其简称。所述三维多孔PEDOT-HA/CS/XG可导电水凝胶支架的制备方法包括以下步骤：
第一步，制备导电纳米颗粒PEDOT-HA
S1、称取透明质酸(HA)粉末溶于双蒸水中，配制0.1％-0.2％质量分数的水溶液。
S2、室温下，加入聚3,4乙烯二氧噻吩(EDOT)单体，机械搅拌使其混合均匀得到混合液，混合液中EDOT浓度为0.1M-0.2M。
S3、通氮除氧，逐滴APS水溶液，室温搅拌使其发生氧化聚合反应12h-24h。其中，所述的每40mL步骤S2中的混合液，对应加入10mL浓度为0.015M的APS水溶液。
S4、将反应物倒入丙酮中，高速离心机离心收集沉淀物，并分别用乙醇、双蒸水多次离心洗涤沉淀物。真空干燥处理得到的沉淀物，得到蓝黑色粉末状颗粒即为PEDOT-HA导电纳米颗粒。
第二步，制备三维多孔PEDOT-HA/CS/XG可导电水凝胶支架
S1、室温下，将XG溶于双蒸水中配制质量分数为1％-2％的XG溶液，再使用磁力搅拌器使XG充分溶解。
S2、室温下，再加入CS，配制混合溶液，其中，CS和XG的质量比为1:1或1:2，使用磁力搅拌器使CS分布均匀。
S3、室温下，向步骤S2混合溶液中加入PEDOT-HA导电纳米颗粒，使用磁力搅拌器充分搅拌并超声处理使其混合均匀，得到混合溶液A。其中，所述PEDOT-HA导电纳米颗粒与溶液A中多糖的质量比不大于10％。
S4、室温下，向步骤S3混合溶液中A加入GDL，搅拌均匀，交联反应2-4h后制备得到水凝胶；其中，每1mL的A溶液中加入0.005g-0.03g的GDL，交联反应过程中，GDL逐步电离调节pH，使CS的氨基质子化后与溶液中XG的羧基阴离子结合，使CS/XG形成水凝胶骨架，并且能够有效地将导电纳米颗粒PEDOT-HA与CS/XG骨架结合，赋予水凝胶导电性。
S5、水凝胶在-20℃的条件下预冷冻12h-24h。
S6、将预冻好的水凝胶转移至冷冻干燥机，经过冷冻干燥后得到PEDOT-HA/CS/XG导电水凝胶支架。
进一步的，所述的第一步步骤S4中，真空干燥的温度为50℃，时间为24h。
进一步的，所述的第二步步骤S6中，冷冻干燥的温度为-50℃，时间为24h-36h。
一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶的制备方法，采用上述制备方法制得。
本发明的创新性为：利用新型绿色酸性物质GDL缓慢改变体系pH(满足CS的溶解条件)，溶解CS，实现CS/XG水凝胶骨架形成，引入PEDOT-HA导电纳米颗粒，成功制备一种新型的三维多孔PEDOT-HA/CS/XG可导电水凝胶支架。在制备过程中使CS的-NH2质子化，与体系中XG、PEDOT-HA的-COOH结合，完成交联后可形成结构稳定的导电水凝胶，之后利用冷冻干燥技术制备干态支架。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明方法简单，具有良好的重复性。
(2)本发明利用绿色的酸性物质GDL逐步电离调节pH，使CS/XG形成水凝胶骨架，并且有效地将导电纳米颗粒PEDOT-HA与CS/XG骨架结合，赋予水凝胶导电性。
(3)本发明中GDL为绿色酸性物质(被肝脏代谢)具有分步骤电离，缓慢改变pH的特点，制备过程无需添加其他化学交联剂即可制备水凝胶，简化制备流程，改变GDL含量可缩短成胶时间，针对CS/XG基水凝胶制备具有应用前景。
(4)本发明制备得到的导电水凝胶支架，通过体外模拟神经细胞生活的微电环境，促进细胞的增殖生长，有望补充神经退行性疾病的神经细胞缺失，完成神经组织修复。
附图说明
图1为不同含量GDL溶液与1％乙酸(体积分数)溶液pH随时间变化曲线。
图2为不同含量GDL对CS/XG水凝胶成胶时间的影响结果。
图3为本发明所有实施例制备的三维多孔PEDOT-HA/CS/XG可导电水凝胶支架图，其中图3(a)为湿态，图3(b)为干态。
图4为本发明所有实施例制备的三维多孔PEDOT-HA/CS/XG可导电水凝胶支架的粘弹性检测，其中图4(a)为未加入GDL体系的储能模量；图4(b)为未加入GDL的损耗模量；图4(c)为加入GDL导电水凝胶的储能模量；图4(d)为加入GDL导电水凝胶的损耗模量。
图5为本发明实施例1、2制备的三维多孔EDOT-HA/CS/XG可导电水凝胶支架的扫描电子显微镜下形态学表面微观观察(SEM)，其中图5(a)为0％PEDOT-HA/CS/XG导电水凝胶支架放大100倍的局部放大图；图5(b)为0％PEDOT-HA/CS/XG导电水凝胶支架放大200倍的局部放大图；图5(c)为0％PEDOT-HA/CS/XG导电水凝胶支架放大400倍的局部放大图；图5(d)为0％PEDOT-HA/CS/XG导电水凝胶支架放大800倍的局部放大图；图5(e)为2％PEDOT-HA/CS/XG导电水凝胶支架放大100倍的局部放大图；图5(f)为2％PEDOT-HA/CS/XG导电水凝胶支架放大200倍的局部放大图；图5(g)为2％PEDOT-HA/CS/XG导电水凝胶支架放大400倍的局部放大图；图5(h)为2％PEDOT-HA/CS/XG导电水凝胶支架放大800倍的局部放大图。
图6为本发明所有实施例制备的三维多孔PEDOT-HA/CS/XG可导电水凝胶支架的红外光谱图。
图7为本发明将PC12细胞接入所有实施例制备的三维多孔PEDOT-HA/CS/XG可导电水凝胶支架，培养1、3、5天后利用CCK-8进行细胞活力检测的结果。
图8为本发明将PC12细胞接入所有实施例制备的三维多孔PEDOT-HA/CS/XG可导电水凝胶支架，培养5天后的SEM照片。图8(a)为放大800倍0％PEDOT-HA/CS/XG上的细胞形态图；图8(b)为放大800倍2％PEDOT-HA/CS/XG上的细胞形态图；图8(c)为放大800倍5％PEDOT-HA/CS/XG上的细胞形态图；图8(d)为放大800倍8％PEDOT-HA/CS/XG上的细胞形态图；图8(e)为放大800倍10％PEDOT-HA/CS/XG上的细胞形态图；图8(f)为放大1600倍0％PEDOT-HA/CS/XG上的细胞形态图；图8(g)为放大1600倍2％PEDOT-HA/CS/XG上的细胞形态图；图8(h)为放大1600倍5％PEDOT-HA/CS/XG上的细胞形态图；图8(i)为放大1600倍8％PEDOT-HA/CS/XG上的细胞形态图；图8(j)为放大1600倍10％PEDOT-HA/CS/XG上的细胞形态图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明，但并不因此而限制于本发明。
实施例1
一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶的制备(标记为0％PEDOT-HA/CS/XG)：
S1、称取HA粉末溶于双蒸水中，配制0.125％质量分数的水溶液。
S2、室温下，加入EDOT单体，机械搅拌使其混合均匀得到混合液，混合液中EDOT浓度为0.1M。
S3、通氮除氧，逐滴APS水溶液，室温搅拌使其发生氧化聚合反应12h。其中，所述的每40mL步骤S2中的混合液，对应加入10mL浓度为0.015M的APS水溶液。
S4、将反应物倒入等体积丙酮中，高速离心机离心收集沉淀物，并分别用乙醇、双蒸水多次离心洗涤沉淀物。50℃真空干燥24h得到的沉淀物，得到蓝黑色粉末状颗粒即为PEDOT-HA导电纳米颗粒。
S5、用10mL双蒸水溶解0.133gXG，再使用磁力搅拌器室温条件下搅拌4h；
S6、称取0.067gCS加入到S5得到溶液中，使用磁力搅拌器室温条件下搅拌4h，超声分散1h；
S7、用移液枪将S6所得溶液吸取2000μL注入24孔板中。每个空中加入0.04gGDL，室温条件下搅拌均匀，反应2h；
S8、在-20℃下预冷冻12h；
S9、在-50℃冷冻干燥24h得到三维多孔0％PEDOT-HA/CS/XG水凝胶导电支架，避光保存。
实施例2
一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶的制备(标记为2％PEDOT-HA/CS/XG)：
S1、称取HA粉末溶于双蒸水中，配制0.1％质量分数的水溶液。
S2、室温下，加入EDOT单体，机械搅拌使其混合均匀得到混合液，混合液中EDOT浓度为0.15M。
S3、通氮除氧，逐滴APS水溶液，室温搅拌使其发生氧化聚合反应24h。其中，所述的每40mL步骤S2中的混合液，对应加入10mL浓度为0.015M的APS水溶液。
S4、将反应物倒入等体积丙酮中，高速离心机离心收集沉淀物，并分别用乙醇、双蒸水多次离心洗涤沉淀物。50℃真空干燥24h得到的沉淀物，得到蓝黑色粉末状颗粒即为PEDOT-HA导电纳米颗粒。
S5、用10mL双蒸水溶解0.1gXG，再使用磁力搅拌器室温条件下搅拌3h；
S6、称取0.1gCS加入到S5得到溶液中，使用磁力搅拌器室温条件下搅拌2h；
S7、称取PEDOT-HA：0.004g加入S6得到的溶液中。使用磁力搅拌器室温条件下搅拌1h，超声分散2h；
S8、用移液枪将S7所得溶液吸取2000μL注入24孔板中。每个空中加入0.01gGDL，室温条件下搅拌均匀，反应4h；
S9、在-20℃下预冷冻24h；
S10、在-50℃冷冻干燥36h得到三维多孔2％PEDOT-HA/CS/XG水凝胶导电支架，避光保存。
实施例3
一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶的制备(标记为5％PEDOT-HA/CS/XG)：
S1、称取HA粉末溶于双蒸水中，配制0.2％质量分数的水溶液。
S2、室温下，加入EDOT单体，机械搅拌使其混合均匀得到混合液，混合液中EDOT浓度为0.2M。
S3、通氮除氧，逐滴APS水溶液，室温搅拌使其发生氧化聚合反应18h。其中，所述的每40mL步骤S2中的混合液，对应加入10mL浓度为0.015M的APS水溶液。
S4、将反应物倒入等体积丙酮中，高速离心机离心收集沉淀物，并分别用乙醇、双蒸水多次离心洗涤沉淀物。50℃真空干燥24h得到的沉淀物，得到蓝黑色粉末状颗粒即为PEDOT-HA导电纳米颗粒。
S5、用10mL双蒸水溶解0.2gXG，再使用磁力搅拌器室温条件下搅拌5h；
S6、称取0.1gCS加入到S5得到溶液中，使用磁力搅拌器室温条件下搅拌3h；
S7、称取PEDOT-HA：0.015g加入S6得到的溶液中。使用磁力搅拌器室温条件下搅拌1.5h，超声分散1.5h；
S8、用移液枪将S7所得溶液吸取2000μL注入24孔板中。每个空中加入0.06gGDL，室温条件下搅拌均匀，反应2h；
S9、在-20℃下预冷冻18h；
S10、在-50℃冷冻干燥30h得到三维多孔5％PEDOT-HA/CS/XG水凝胶导电支架，避光保存。
实施例4
一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶的制备(标记为8％PEDOT-HA/CS/XG)：
S1、称取HA粉末溶于双蒸水中，配制0.15％质量分数的水溶液。
S2、室温下，加入EDOT单体，机械搅拌使其混合均匀得到混合液，混合液中EDOT浓度为0.12M。
S3、通氮除氧，逐滴APS水溶液，室温搅拌使其发生氧化聚合反应15h。其中，所述的每40mL步骤S2中的混合液，对应加入10mL浓度为0.015M的APS水溶液。
S4、将反应物倒入等体积丙酮中，高速离心机离心收集沉淀物，并分别用乙醇、双蒸水多次离心洗涤沉淀物。50℃真空干燥24h得到的沉淀物，得到蓝黑色粉末状颗粒即为PEDOT-HA导电纳米颗粒。
S5、用10mL双蒸水溶解0.15gXG，再使用磁力搅拌器室温条件下搅拌5h；
S6、称取0.15gCS加入到S5得到溶液中，使用磁力搅拌器室温条件下搅拌3h；
S7、称取PEDOT-HA：0.024g加入S6得到的溶液中。使用磁力搅拌器室温条件下搅拌2h，超声分散1h；
S8、用移液枪将S7所得溶液吸取2000μL注入24孔板中。每个空中加入0.02gGDL，室温条件下搅拌均匀，反应3h；
S9、在-20℃下预冷冻24h；
S10、在-50℃冷冻干燥32h得到三维多孔8％PEDOT-HA/CS/XG水凝胶导电支架，避光保存。
实施例5
一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶的制备(标记为10％PEDOT-HA/CS/XG)：
S1、称取透明质酸HA粉末溶于双蒸水中，配制0.18％质量分数的水溶液。
S2、室温下，加入EDOT单体，机械搅拌使其混合均匀得到混合液，混合液中EDOT浓度为0.15M。
S3、通氮除氧，逐滴APS水溶液，室温搅拌使其发生氧化聚合反应18h。其中，所述的每40mL步骤S2中的混合液，对应加入10mL浓度为0.015M的APS水溶液。
S4、将反应物倒入等体积丙酮中，高速离心机离心收集沉淀物，并分别用乙醇、双蒸水多次离心洗涤沉淀物。50℃真空干燥24h得到的沉淀物，得到蓝黑色粉末状颗粒即为PEDOT-HA导电纳米颗粒。
S5、用10mL双蒸水溶解0.18gXG，再使用磁力搅拌器室温条件下搅拌4h；
S6、称取0.09gCS加入到S5得到溶液中，使用磁力搅拌器室温条件下搅拌4h；
S7、称取PEDOT-HA：0.02g加入S6得到的溶液中。使用磁力搅拌器室温条件下搅拌2h，使用超声分散3h；
S8、用移液枪将S7所得溶液吸取2000μL注入24孔板中。每个空中加入0.04gGDL，室温条件下搅拌均匀，反应2h；
S9、在-20℃下预冷冻20h；
S10、在-50℃冷冻干燥34h得到三维多孔10％PEDOT-HA/CS/XG水凝胶导电支架，避光保存。
测试与表征
(1)不同含量GDL溶液pH随时间变化曲线：配置1％(体积分数)乙酸溶液和0.5％、1％、2％、3％(质量分数)GDL溶液，利用pH计测定240min内溶液的pH变化。
结果如图1所示，乙酸和GDL溶液的pH随着时间都会降低，都会满足CS的溶解条件，并且随着GDL浓度增加，pH降低的速度更快。乙酸在短时间内会达到电离平衡，溶液中存在大量的H+，这会导致CS与XG之间出现过高的交联密度从而快速发生反应。相比于乙酸，GDL溶液的pH降低的速度更慢，在120min左右达到电离平衡，显然GDL释放H+更温和，溶液中的H+分布更均匀，得到的水凝胶具有更均匀的交联密度，有利于形成结构稳定的CS/XG水凝胶，由此可见GDL具有替代乙酸溶解CS的潜力。
(2)GDL含量对CS/XG成胶时间的影响：配置2％浓度的XG水溶液，加入CS使CS与XG的质量比为1:2，加入GDL，其质量分数为0.05％、1％、2％、3％，之后每2min将小瓶倾斜一次，每3min倒置一次，直到材料不改变其相对位置，将该时间记录为成胶时间。
实验发现GDL含量会影响水凝胶的成胶时间，结果如图2所示，当GDL含量由0.5％增加到2％，成胶时间由252min降低到83min，成胶时间显著降低。而进一步增加GDL含量时，成胶时间则没有明显变化，因此确定GDL在体系中的最优含量为2％。
(3)导电水凝胶流变性能检测：将所有实施例制备导电水凝胶时，加入GDL之前的聚合物溶液和加入GDL成胶后的导电水凝胶分别置于旋转流变仪载物台正中心，启动悬臂使其下降并压紧待测物，选择角频率范围为0.1-100，温度设为37℃，应变为1％，并选择G’-G”-frequency”模型开始采点，之后拟合为角频率-G’和G”曲线。
粘弹性检测结果如图4所示，图4(a)、(b)表示未加入GDL，不同PEDOT-HA聚合物溶液0.1rad/s到100rad/s频率内的G’和G”，此时体系没有形成水凝胶，但可看出聚合物溶液始终出现G’>G”，证明此时水凝胶具有较强弹性，这是因为XG与体系内存在分子链和分子间氢键，增大了分子链的缠结程度，使得该网络不会被外加振动破坏，XG体系这种粘弹性现象类似弱凝胶。随着PEDOT-HA含量的增加，聚合物溶液的G’和G”均增加，表明PEDOT-HA引入可提升材料弹性。图4(c)、(d)分别是导电水凝胶的G’和G”，对比聚合物的粘弹性可看出，导电水凝胶的G’和G”大幅增加，这是由于在GDL作用下，PEDOT-HA和XG的-COOH与CS的-NH2形成酰胺键，内部形成稳定的网络结构，增大了材料的机械性能。导电水凝胶的G’>G”是典型的凝胶网络结构证明，随着PEDOT-HA含量增加，G’和G”明显提升，这是因为PEDOT-HA引入了更多的交联位点，提升了材料的结构稳定性。由此可见，在成胶过程中GDL提供了酸性环境可满足CS溶解条件，促使CS与XG建立共价键，整个体系形成稳定的网络结构，证明GDL作为酸性物质溶解CS，可制备结构稳定的水凝胶材料。
(4)支架的孔隙率测试方法采用液体置换法：本测试所使用的替换液体为无水乙醇。首先测量所有实施例制备成品支架的质量(干质量，md)；将支架样品浸泡在装满无水乙醇的比重瓶中，然后置于减压抽滤装置中反复抽真空知道没有气泡产生，这样是乙醇浸满水凝胶支架空中，装满无水乙醇的比重瓶称重，记为m1；将上述吸饱无水乙醇的水凝胶支架浸入装满无水乙醇的比重瓶中，擦净瓶外表面排除的无水乙醇后称重，记为m2；小心取出比重瓶中的水凝胶支架，称量比重瓶与瓶中剩余无水乙醇的质量，记为m3。则各组水凝胶支架的孔隙率按以下公式计算得到。每个实验重复三次，结果取平均值。
Figure BDA0003667961190000091
表1所示实施例制备得到的水凝胶支架孔隙率。5组支架材料的孔隙率为87.92％～92.32％，总体的孔隙率较高，随着PEDOT-HA含量增加，导电水凝胶支架孔隙率升高。其中10％PEDOT-HA/CS/XG支架孔隙率最高，达到92.32％，可为细胞生长提供三维生长环境。
表1为本发明所有实施例制备的三维多孔PEDOT-HA/CS/XG可导电水凝胶支架的孔隙率、吸水率、电导率、压缩模量。
表1
Figure BDA0003667961190000092
Figure BDA0003667961190000101
(5)支架的吸水性能检测：检测所有实施例水凝胶支架，利用分析天平称量干燥样品质量记为m1，将样品置于37℃的双蒸水中浸泡30min、60min、90min、150min、210min、340min、1440min后称取湿态质量记为m2。支架的吸水率Wa由以下公式计算：
Figure BDA0003667961190000102
表1中，水凝胶支架的吸水率范围在2575％～4068％，随着PEDOT-HA含量的增加，降低了支架的亲水能力，导致吸水性减弱，这是由于PEDOT-HA导电纳米颗粒引入的大量疏水基团造成，导电支架的高吸水能力可以模拟人体细胞外基质的环境，有利于细胞之间的物质传递，可为细胞的生长提供充足的营养物质。
(6)导电水凝胶支架电导率检测：用双蒸水浸泡所有实施例制备的导电水凝胶支架达到吸水平衡状态，采用四探针测试仪在恒定电流0.5mA，温室条件下测试湿态支架电导率。
表1中，0％PEDOT-HA/CS/XG的电导率为3.37×10-4S·cm-1，这是因为湿态下CS为弱阳离子聚合电解质，水合过程中氨基质子化而带有导电性。随着PEDOT-HA含量增加，导电水凝胶支架的电导率增大，最高10％PEDOT-HA/CS/XG的电导率为4.10×10-4S·cm-1，是0％PEDOT-HA/CS/XG的121.66％。据报道神经组织生长的电导率范围在1.0×10-4S·cm-1到5.7×10-3S·cm-1之间，可以看出制备的导电支架符合神经组织的导电性要求。尽管通过提高PEDOT-HA含量未大幅提升电导率，但考虑生物相容性，拥有适宜电导率的支架可以通过模拟神经细胞的微电环境，促进支架上细胞的生长、迁移等细胞活动，从而应用于神经组织工程。
(7)导电水凝胶支架压缩模量检测：利用微机控制电子万能试验机对所有实施例制备的湿态导电支架的机械强度进行检测，电脑记录应力应变曲线，压缩速度为1mm/min，根据样品应力应变曲线10％～15％的切线斜率计算支架的压缩模量。
表1中，与对照组相比，2％、5％、8％、10％PEDOT-HA/CS/XG导电支架的压缩模量增大，可见导电颗粒引入提高了材料机械强度。湿态水凝胶的压缩模量在10.2KPa到32.2KPa之间，具有合适的机械强度，可作为支架材料用于神经组织工程。
(8)支架的表面微观结构检测：将样品实施例1和实施例2制得的支架成品通过导电胶固定在载物台上，用氮气吹扫除去表面杂屑，在经过真空喷金处理后置于扫描室中，用扫描电子显微镜(Scanning elecrton microscopy，SEM)观察样品，选择不同的倍数扫描拍照。
从图5中看出实施例1和2制备得到的水凝胶支架均为均匀孔径的三维多孔材料。对比图5(e)，图5(a)中看出当PEDOT-HA导电纳米颗粒均匀分散在基质材料中时，这会使支架孔径减小，掺杂PEDOT-HA的导电水凝胶支架孔径分布更加均匀，材料结构更加有序，这利于细胞间信息的传递和营养物质的传输。同时对比图5(d)和图5(h)的椭圆区域，PEDOT-HA的加入会使支架的孔壁变得更加粗糙，这为细胞粘附提供锚定点，有利于细胞的粘附生长。
(9)支架的结构表征分析，采用Bruker EQUINOX55傅里叶红外光谱仪对所有实施例的水凝胶支架进行测试：将所有实施例水凝胶支架分别放入4mL EP管中，置于液氮环境下5min后取出，立即用玻璃棒捣碎成粉末，真空干燥的粉末样品。将粉末样品与KBr混合后压片，用傅里叶红外光谱仪对制备的水凝胶进行分析，测试波长为400-4000cm-1。
如图6所示，1520cm-1、2900cm-1、3400cm-1等处出现了PEDOT-HA和-CO-NH-的特征吸收峰。这是因为在交联剂GDL的作用下，CS、XG及PEDOT-HA分子中的-COOH与-NH2发生反应生成酰胺键，从而将PEDOT-HA与CS和XG分子结合在一起。2％、5％、8％、10％PEDOT-HA/CS/XG与0％PEDOT-HA/CS/XG相比，在1520cm-1出现吸收峰，此处对应PEDOT-HA上噻吩环的C＝C的伸缩峰，证明利用HA作为掺杂剂成功将PEDOT-HA引入导电水凝胶支架内。
(10)PC12细胞在支架上的细胞活力测定：使用CCK-8试剂盒检测PC12细胞数量，利用酶标仪对其进行OD值检测：将所有实施例水凝胶支架样品浸入75％(体积比)乙醇灭菌24h，用无菌PBS冲洗三次。然后将样品置于无菌玻璃皿中干燥，并进一步进行紫外(UV)灭菌。然后将样品放入48孔板当中，并将PC12细胞悬浮液(5×10-5cell/mL，20μL)接种在样品中。孵育3h。向含有PC12细胞的支架样品的48孔板中补加700μL的DMEM培养基。置于37℃培养箱中连续培养5天，每1天用新鲜培养基(700μL)更换就培养基。在培养1、3、5天后将DMEM培养基吸出，加入含有CCK-8的DMEM培养基200mL，再将装有样品的48孔板转移到培养箱中培养4h，使用酶标仪检测450nm波长下的OD值。使用以下公式计算细胞活力：
OD＝ODS-ODi
其中，含有PC12细胞的支架的吸光度记为ODS；各自未接种细胞的空白支架样品的吸光度为ODi。
检测结果如图7所示，第1d时，5组支架之间的细胞活力无明显差异。在第3d时，对照组支架上的细胞活力较高，其他导电支架上的细胞活力无明显差异，这可能是因为不含PEDOT-HA的支架具有更高的吸水性，有助于吸附培养液中更多的营养物质，让细胞更快的适应周围环境，并开始扩增。在第5d时，导电支架上的细胞增长速度更快，且细胞活力高于对照组，8％PEDOT-HA/CS/XG上PC12细胞的细胞活力是对照组支架的114.58％，10％PEDOT-HA/CS/XG是对照组支架的120.42％，展现制备导电水凝胶支架具有良好的生物相容性。
(11)PC12细胞在支架上的微观观察：如上述操作在所有实施例制备的导电支架内，接入相同数量的PC12细胞，在培养箱中培养5天，取出细胞与支架复合物，用25g/L的戊二醛固定细胞6h，用浓度为60％、70％、80％、90％、100％(体积分数)的酒精进行梯度脱水处理，每次30min，待干燥后置于扫描电镜下观察细胞。
结果如图8所示，导电支架的孔道内有大量PC12细胞生长，有部分细胞呈团聚状态，细胞与细胞之间形成交错的网状结构，证明细胞可在支架内部粘附增殖，体现导电支架的体外培养细胞的应用能力。
本发明验证导电水凝胶支架作为组织工程承载种子细胞的移植材料和介电材料能力，对材料的理化性质和生物相容性进行表征，结果表明其具有良好吸水性、高孔隙率、适宜电导率与力学性能，将PC12细胞接种材料内检测细胞活力并观察细胞状态，在第5天导电支架上PC12细胞的细胞活力高于对照组，10％PEDOT-HA/CS/XG支架上的细胞活力最高可达到对照组的120.42％，支架上细胞的SEM照片显示，支架内含有大量细胞，细胞间呈交错网状结构，由此可见制备的导电水凝胶支架具有应用于神经组织工程的潜力。
本发明采用GDL溶解CS，实现CS与XG的结合，无需添加其他交联剂，简化了制备流程，并通过优化GDL含量缩短水凝胶成胶时间，同时将PEDOT-HA导电颗粒引入，制备导电水凝胶支架。在GDL作用下CS、XG、PEDOT-HA之间形成酰胺键，体系的储能模量与损耗模量增加，形成富有弹性的水凝胶，与0％PEDOT-HA相比，PEDOT-HA含量增加会降低支架的吸水率，提高压缩模量、电导率、孔隙率，并且体外培养PC12细胞5天，8％PEDOT-HA/CS/XG上细胞活力是对照组支架的114.58％，10％PEDOT-HA/CS/XG是对照组支架的120.42％，展现导电水凝胶支架良好的生物相容性，具有应用于组织工程的潜力。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，制备导电纳米颗粒PEDOT-HA
S1、称取透明质酸HA粉末溶于双蒸水中；
S2、室温下，加入聚3,4乙烯二氧噻吩EDOT单体，机械搅拌使其混合均匀得到混合液；
S3、通氮除氧，逐滴APS水溶液，室温搅拌使其发生氧化聚合反应12h-24h；其中，每40mL步骤S2中的混合液，对应加入10mL浓度为0.015M的APS水溶液；
S4、将反应物倒入丙酮中，高速离心机离心收集沉淀物，并分别用乙醇、双蒸水离心洗涤沉淀物；真空干燥得到的沉淀物为蓝黑色粉末状颗粒，即为PEDOT-HA导电纳米颗粒；
第二步，制备三维多孔PEDOT-HA/CS/XG可导电水凝胶支架
S1、室温下，将XG溶于双蒸水中，磁力搅拌器使XG充分溶解；
S2、室温下，再加入CS，配制混合溶液，其中，CS和XG的质量比为1:1或1:2，采用磁力搅拌器使CS分布均匀；
S3、室温下，向步骤S2混合溶液中加入PEDOT-HA导电纳米颗粒，使用磁力搅拌器充分搅拌并超声处理使其混合均匀，得到混合溶液A；其中，所述PEDOT-HA导电纳米颗粒与溶液A中多糖的质量比不大于10%；
S4、室温下，向步骤S3混合溶液中A加入GDL，搅拌均匀，交联反应2-4h后制备得到水凝胶；其中，每1mL的A溶液中加入0.005g-0.03g的GDL，交联反应过程中，GDL逐步电离调节pH，使CS的氨基质子化后与溶液中XG的羧基阴离子结合，使CS/XG形成水凝胶骨架，并且能够有效地将导电纳米颗粒PEDOT-HA与CS/XG骨架结合，赋予水凝胶导电性；
S5、水凝胶在-20℃的条件下预冷冻12h-24h；
S6、将预冻好的水凝胶转移至冷冻干燥机，经过冷冻干燥后得到基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的第一步步骤S1水溶液中，透明质酸HA的质量分数为0.1%-0.2%。
3.根据权利要求1所述的一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的第一步步骤S2混合液中，EDOT浓度为0.1M-0.2M。
4.根据权利要求1所述的一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的第一步步骤S4中，真空干燥的温度为50℃，时间为24h。
5.根据权利要求1所述的一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的第二步步骤S1溶液中，XG的质量分数为1%-2%。
6.根据权利要求1所述的一种基于壳聚糖/黄原胶互穿网络导电水凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述的第二步步骤S6中，冷冻干燥的温度为-50℃，时间为24h-36h。
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