CN114504558A - 一种治疗关节炎的缓释制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于治疗关节炎的缓释制剂及其制备方法，该缓释制剂包括人参皂苷Rg3 0.1‑30wt％，载体55‑85wt％、乳化剂0~5wt％，助乳化剂0~10wt％。本发明制备出7天以上缓释效果的人参皂苷Rg3缓释制剂，并同时确定了该种缓释制剂的最佳原料及其用量；所述制备方法工艺简单，操作便捷，药物分散更均匀。有效提升了人参皂苷Rg3的生物利用度；减少口服给药次数，提高病人的顺应性；使药物平稳持久释放，提高用药安全性，具有较好的应用前景。

Description

一种治疗关节炎的缓释制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于制药领域，特别是涉及一种治疗关节炎的缓释制剂及其制备方法。
背景技术
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种发病基质尚不完全明确的全身性自身免疫病，主要表现为滑膜炎和渐进性、不可逆的软骨和骨破坏，RA具有致残性，主要原因是关节骨质破坏以及由此产生的功能障碍。
RA常见治疗方法主要有药物治疗、干细胞移植、手术治疗等，治疗原则主要是延缓疾病进展以及降低风湿活动性，以此来预防关节损伤、疾病进展和长期残疾。目前治疗类风湿性关节炎的药物有非甾体类抗炎药物、糖皮质激素、慢性抗风湿药、早期生物制剂和植物药制剂。
药物治疗虽然能够减轻患者的急性炎症和疼痛，但都不能阻止类风湿关节炎的病程并且都有严重的不良反应，由于类风湿关节炎的发病特点，需要长期服药，患者容易产生耐受、增大不良反应的发生率。生物制剂与DMARDs相比，临床疗效更显著且对肝肾损害较小，但是生物制剂多采用皮下注射，患者使用不方便，此外生物制剂增加了严重感染的风险，结核、肿瘤等疾病限制了其使用。
目前还没有能够完全治愈RA的方法，且治疗RA中需长期用药，故需保证在用药期间的药物释放浓度恒定，可保证在RA治疗中持续进行治疗、保障治疗效果。因此研制一种可用于长期治疗类风湿性关节炎的药物是很有必要的，将治疗RA的药物改成缓释制剂将会在RA治疗中起到重要的作用，有助于RA疾病的进一步治疗及控制。
人参皂苷Rg3(GRg3)是由日本著名天然药物化学家北川勋1980年首先制备，并确定其分子式，随后日本、中国、韩国、德国、美国等国家学者也不同程度地开展了研究。人参皂苷Rg3具有多种药理活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗病毒与神经保护等作用，研究发现人参皂苷Rg3具有较好的抗炎和免疫抑制作用。但是由于人参皂苷Rg3水溶性差，影响了临床疗效，研究发现大鼠灌胃给药，GRg3的生物利用度仅为2.63％，这使得人参皂苷Rg3能够发挥出来的药效大大降低，抗RA作用减弱，可通过提高人参皂苷Rg3的生物利用度及控制药物释放速率达到RA治疗要求，故有必要制备人参皂苷Rg3缓释制剂。
相对于目前临床上使用的药物，人参皂苷Rg3暂无明显的毒副作用，适合作为治疗RA的长期用药。为了减少给药次数，提高患者的依从性，将人参皂苷Rg3的剂型设计成为缓释制剂，使得药物平稳释放，让药效更长久，作为一种用于治疗类风湿性关节炎的全新制剂，具有很大的应用前景。且可保证患者在用药期间用药剂量平稳释放，在用药期间均能保证药物用于患者的剂量，保障需要长期用药疾病的治疗效果。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种治疗关节炎的缓释制剂及其制备方法，本发明最终所制得的治疗关节炎的缓释制剂能够预防和治疗关节炎，能够持续平稳释放，并且大大提高了人参皂苷Rg3的生物利用度，具有很好的市场推广及应用价值。
本发明的技术方案具体如下：
一种用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 0.1-30wt％，载体55-85wt％、乳化剂0～5wt％，助乳化剂0～10wt％；
其中，所述载体选自高级脂肪酸类、高级脂肪醇类中的一种或多种；
所述乳化剂选自吐温类、司盘类、聚乙二醇硬脂酸酯类、聚氧乙烯辛基苯基醚、蓖麻油聚氧乙烯类、氢化蓖麻油中的一种或多种；
所述助乳化剂选自多元醇类、PEG类、乙醇、正丁醇、二乙二醇单乙基醚的一种或多种。
进一步地，所述高级脂肪醇类为十四醇、十八醇、十六醇；所述高级脂肪酸类为硬脂酸、软脂酸、油酸；
进一步地，所述乳化剂为吐温80、吐温60、吐温20、司盘80、司盘60、司盘20。
进一步地，所述助乳化剂为PEG类、乙醇、正丁醇。
本发明还涉及的一种用于治疗关节炎的缓释制剂，所述缓释制剂由下述重量百分比的原料制备而成：
人参皂苷Rg3 14wt％，十八醇53wt％，硬脂酸31wt％，吐温80 1wt％，PEG200001wt％。
本发明还涉及的上述的缓释制剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)、将人参皂苷Rg3研磨成细粉，备用；
步骤(2)、将载体于85℃-95℃水浴加热搅拌熔融至呈液态，加入人参皂苷Rg3原料药以及助乳化剂、乳化剂，均质10-60分钟，转速4000-7000r/min，得均质溶液；
步骤(3)、称取200％-400％倍量的水，恒温至55-70℃，持续搅拌5-30分钟，转速500-900r/min，将步骤(2)制得均质溶液倾倒入水中，继续搅拌5-30分钟后，停止搅拌，得固液混合物；
步骤(4)、将步骤(3)中装有固液混合物的器皿快速移入5-20℃水中静置5-10分钟；再放入-15-5℃二级冷却液中冷却10-60分钟，取出，抽滤、冷冻干燥得人参皂苷Rg3缓释微球。
进一步地，步骤(1)中，人参皂苷Rg3细粉细度为100-300目。
进一步地，步骤(4)中，冷冻干燥中，冷凝温度为-50℃，真空度为10Pa，冻干面积为0.12㎡。
进一步地，步骤(4)中，二级冷却液是指丙二醇、乙二醇、乙醇、甲醇、甘油、蜂蜜与水比在15：85-30：70所制得的混合溶液。
由于人参皂苷Rg3为难溶性药物，步骤(1)和(2)可使人参皂苷Rg3快速、稳定、均匀地分散在载体中，减少药物损失，提高载药量。步骤(3)和(4)操作简单，用时短，可使微球快速成型，能耗小，无溶剂残留，整个过程不会引入其他杂质，易于实现连续化大生产。整体工艺能大幅提高人参皂苷Rg3的溶出度，促进药物吸收，提高药物生物利用度。
上述方案中：
1.单因素实验
采用单因素实验法对载体、乳化剂、助溶剂、基质配比、药物与基质比例、熔融温度、分散温度、分散时间、转速等进行筛选，以载药量、包封率、微球成型度为评价指标，初选工艺，是后面制备工艺优化的前提。
2.星点设计效用面法优选制备工艺
根据单因素实验结果，以药物基质比(X1)、基质比(X2)、分散温度(X3)、转速(X4)为自变量，以载药量(Y1)、包封率(Y2)为评价指标，用星点设计效用面法优选人参皂苷Rg3微球制备工艺。实验采用四因素、五水平的星点设计-效应面优化法优选人参皂苷Rg3微球制备工艺。因素及水平表见1，实验设计及各响应值结果见表2。对药物基质比(X1)、基质比(X2)、分散温度(X3)、转速(X4)进行二次多项式拟合，以拟合优度R2和置信度P作为模型判断标准。结果显示：
Y1＝+14.19+2.42*X1-0.52*X2+4.36*X3+0.19*X4+0.78*X1X2+0.46*X2X3+2.48*X2X4-0.57*X2^2+0.37*X3^2(<0.0001，R2＝0.9824)；
Y2＝+96.57-6.95X1+2.87X2+1.57X3+5.48X4+3.92X1X2-0.15X1X3+2.52X2X3+3.569X2X4-2.5X1^2^2-2.73X2^2^2-0.1X3^2^2-1.93X4^2(P<0.0001，R2＝0.9789)
Y1、Y2二次多项式拟合的显著性水平(P)均小于0.05，结果都具有统计学意义，方差分析见表3、表4。
分析可知，药物基质比(X1)、基质比(X2)、分散温度(X3)、转速(X4)相互之间均具有较为明显的交互作用，根据设计的评价指标应选择区域中间值为目标值，此效应面有较优区域，其中对载药量(Y1)、包封率(Y2)影响最大的为药物与基质比，其次为基质比。
根据Design-Expert 8.06软件推荐的处方并结合微丸制备的实际情况，确定微球制备工艺为：药物与基质比为3：20，基质比为2:5,分散温度为65℃、时间为5min，转速为600，均质时间为20min、温度为92℃及以上，一级冷却温度5摄氏度及以下，冷却时间5min，二级冷却温度为-15摄氏度，时间为20min。
表1人参皂苷Rg3微球星点设计的因素及水平
Figure BDA0003515623700000031
表2人参皂苷Rg3微球星点设计及各响应值结果
实验号 X<sub>1</sub> X<sub>2</sub> X<sub>3</sub> X<sub>4</sub> Y<sub>1</sub> Y<sub>2</sub>
1 +1 +1 +1 -1 14.65 82.24
2 +1 +1 -1 -1 13.32 74.88
3 +1 -1 +1 +1 13.67 73.63
4 +1 -1 -1 +1 14.87 78.18
5 -1 +1 +1 -1 11.94 89.01
6 -1 +1 -1 -1 11.13 82.85
7 -1 -1 +1 +1 12.73 97.89
8 -1 -1 -1 +1 12.93 99.99
9 +2 0 0 0 16.38 73.95
10 -2 0 0 0 10.81 99.16
11 0 +2 0 0 14.62 91.31
12 0 -2 0 0 15.34 79.96
13 0 0 +2 0 14.27 97.12
14 0 0 -2 0 14.26 88.03
15 0 0 0 +2 13.36 99.87
16 0 0 0 -2 14.25 77.82
17 0 0 0 0 13.78 94.87
18 0 0 0 0 14.31 97.34
19 0 0 0 0 14.17 97.82
20 0 0 0 0 13.78 93.41
21 0 0 0 0 14.31 99.39
表3载药量(Y1)响应值的方差分析
Figure BDA0003515623700000032
Figure BDA0003515623700000041
表4包封率(Y2)响应值的方差分析
方差来源 平方和 自由度 F值 P值
模型 1832.791 12 31.05647 <0.0001
X<sub>1</sub> 773.282 1 157.2383 <0.0001
X<sub>2</sub> 98.56797 1 20.0427 0.0021
X<sub>3</sub> 39.20947 1 7.972808 0.0224
X<sub>4</sub> 360.8708 1 73.37906 <0.0001
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub> 122.6952 1 24.9487 0.0011
X<sub>1</sub>X<sub>3</sub> 0.191473 1 0.038934 0.8485
X<sub>2</sub>X<sub>3</sub> 50.90384 1 10.35073 0.0123
X<sub>2</sub>X<sub>4</sub> 50.94985 1 10.36008 0.0123
X<sub>1</sub>^2 143.2045 1 29.11903 0.0006
X<sub>2</sub>^2 170.7323 1 34.71652 0.0004
X<sub>3</sub>^2 22.74893 1 4.62574 0.0637
X<sub>4</sub>^2 85.19163 1 17.32277 0.0032
残差 39.3432 8
失拟项 16.37964 4 0.71 0.6243
纯误差 22.96356 4
总离度 1872.134 20
3.最优微球制备工艺预测及验证
根据拟合方程和3D响应面综合分析以及制备的具体情况所得到以上的最佳制备工艺，并以该工艺制备三批人参皂苷Rg3微球进行验证。并测定其载药量和包封率，处方验证结果见下表5，结果说明预测值与实际值没有差异。
表5 Rg3缓释微球制备工艺验证结果表
Figure BDA0003515623700000042
Figure BDA0003515623700000051
通过上述技术方案，本发明与现有技术相比至少具有以下优势：
本发明经发明人大量的实验和研究制得在人工胃液、人工肠液、PH＝7.8磷酸缓冲盐中均可达7天缓释效果的人参皂苷Rg3缓释制剂，并同时确定了该种缓释制剂的最佳原料及其用量；其中，缓释制剂以本发明所述重量百分比的人参皂苷Rg3、硬脂酸、十八醇和助乳化剂——共PEG类、乙醇、正丁醇中的至少一种为原料效果较好，助乳化剂优选PFG20000，并在分散温度为60-70℃条件下，其缓释效果最佳。
研究发现以蜡质材料为载体时，包括蜂蜡、巴西棕榈蜡、鲸蜡等，单独与人参皂苷Rg3以多种配比相配比时，凝结成块，无法成球；与其他乳化剂、助乳化剂以多种配比相配比时，形成乳液，无法成球。
若单独使用高级脂肪醇与人参皂苷Rg3相配比时，形成条状物质，无法成球；高级脂肪醇与其他乳化剂、助乳化剂以多种配比相配比时，有空心球，且球状大小不一，有拖尾；高级脂肪酸和高级脂肪醇相配比或者与乳化剂、助乳化剂的一种或多种相配比，可成球，辅料配比见表6，实验结果见表5。
表6辅料处方
Figure BDA0003515623700000052
表7实验结果
Figure BDA0003515623700000053
Figure BDA0003515623700000061
本发明与液中干燥法制得的人参皂苷Rg3缓释制剂相比，释药较为持久，本发明制得人参皂苷Rg3缓释制剂体外释药符合Higuchi模型，液中干燥法制得人参皂苷Rg3缓释制剂体外释药符合一级模型。与常规制备方法液中干燥法相比，本发明所制得的缓释制剂载药量和成型度高，见表8。
表8两种制备方法制备缓释微球方法比较
Figure BDA0003515623700000062
微球常见的制备方法为液中干燥法、乳化交联法和喷雾干燥法及相分离法等。然而，液中干燥法作为最经典的微球制备方法之一，但由于操作环境相对开放，不仅极易受到多种外界因素影响，微球灌装和无菌控制等工艺等技术难点尚未攻克。喷雾干燥法制备属于物理过程，需要特定的设备，就目前的设备来说，喷出液滴的粒径难于控制，不利于微球产品的质量控制，往往需要通过过筛来保证粒径的均一性，造成了原料的损失。相分离法该对参数敏感，细小的变化就可以引起巨大的结果差异，不利于批间重现；同时也存在相分离过程中不同微球之间互相粘连聚集的现象。此外，缓释微球的材料以及方法的选择，多以药物性质为基准来把控。通过大量实验和研究表明，本发明制备方法适用于人参皂苷Rg3缓释制剂的制备。
本发明所涉及的方法多用于微丸的制备，但经过本发明人大量实验和研究表明所制得微粒大小符合微球大小要求，且用时短，操作步骤简单，无溶剂残留。所制得缓释制剂外观为白色固体，可作为口服制剂，无需注射给药，提高患者顺应性，实现高效、持续治疗关节炎，具有较好的应用前景。
附图说明
图1是实施例的人参皂苷Rg3缓释微球电镜下的外观现状；图1A为加助乳化剂的扫描电镜图，1B为不加助乳化剂的扫描电镜图；
图2是实施例的三种溶液的HPLC色谱图；图2A为对照品溶液；图2B为供试品溶液；图2C为阴性样品溶液；1-人参皂苷Rg3；
图3A是实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂体外释放曲线；3B是人参皂苷Rg3缓释制剂体外释放浓度图；
图4是实施例的大鼠关节肿胀拍照图；A-空白组；B-AA组；C-阳性对照组；D-原料药组；E-F依次为低剂量组、中剂量组、高剂量组；上右足，下为左足；
图5是实施例的大鼠关节肿胀拍照图；其中，A-空白组；B-AA组；C-阳性对照组；D-原料药组；E-F依次为给药时间1-1、4-1量组、7-1组；上右足，下为左足。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 15wt％、软脂酸35wt％、十六醇50wt％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按以下进行：
精密称取人参皂苷Rg3原料药细粉、十六醇、软脂酸，备用；将十八醇和软脂酸混合均匀于85℃水浴加热搅拌熔融至呈液态，加入人参皂苷Rg3原料药，均质10分钟，转速4000r/min、水浴温度85℃，得均质溶液。称取200％倍量的水，恒温至55℃，持续搅拌5分钟，转速500r/min，将制得均质溶液倾倒入水中，继续搅拌5min后，转速500r/min，停止搅拌，得固液混合物。将装有固液混合物的器皿快速移入20℃水中静置10分钟；再放入5℃乙二醇-水混合物(30：70)中冷却60分钟，取出，抽滤、冷冻干燥，冷凝温度-50℃，真空度10Pa，冻干面积0.12㎡，得人参皂苷Rg3缓释微球。
实施例2
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 14wt％、硬脂酸31wt％、十八醇53wt％、吐温80 1wt％、PEG200001wt％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按以下进行：
精密称取人参皂苷Rg3原料药细粉、十八醇、硬脂酸，备用；将十八醇和硬脂酸混合均匀于92℃水浴加热搅拌熔融至呈液态，加入人参皂苷Rg3原料药、吐温80、PEG20000，均质20分钟，转速5500r/min、水浴温度92℃，得均质溶液。称取300％倍量的水，恒温至63℃，持续搅拌，转速700r/min，将制得均质溶液倾倒入水中，继续搅拌7min后，转速700r/min，停止搅拌，得固液混合物。将装有固液混合物的器皿快速移入5℃水中静置10分钟；再放入-5℃丙二醇-水混合物(15：85)中冷却30分钟，取出，抽滤、冷冻干燥，冷凝温度-50℃，真空度10Pa，冻干面积0.12㎡，得人参皂苷Rg3缓释微球。
实施例3
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 30wt％、油酸20wt％、十四醇35wt％、吐温80 5wt％、PEG2000010wt％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按以下进行：
精密称取人参皂苷Rg3原料药细粉、十四醇、油酸、吐温80、PEG20000，备用；将十四醇、油酸、吐温80、PEG20000混合均匀于95℃水浴加热搅拌熔融至呈液态，加入人参皂苷Rg3原料药，均质60分钟，转速7000r/min、水浴温度95℃，得均质溶液。称取400％倍量的水，恒温至70℃，持续搅拌，转速900r/min，将制得均质溶液倾倒入水中，继续搅拌30min后，转速900r/min，停止搅拌，得固液混合物。将装有固液混合物的器皿快速移入15℃水中静置5分钟；再放入-15℃丙二醇-水混合物(15：85)中冷却10分钟，取出，抽滤、冷冻干燥，冷凝温度-50℃，真空度10Pa，冻干面积0.12㎡，得人参皂苷Rg3缓释微球。
实施例4
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 0.1wt％、硬脂酸30wt％、十四醇55wt％、司盘80 5wt％、正丁醇9.9wt％。
精密称取人参皂苷Rg3原料药细粉、十八醇、硬脂酸，备用；将十八醇和硬脂酸混合均匀于92℃水浴加热搅拌熔融至呈液态，加入人参皂苷Rg3原料药、司盘80、正丁醇均质30分钟，转速6500r/min、水浴温度92℃，得均质溶液。称取400％倍量的水，恒温至65℃，持续搅拌，转速600r/min，将制得均质溶液倾倒入水中，继续搅拌5min后，转速600r/min，停止搅拌，得固液混合物。将装有固液混合物的器皿快速移入5℃水中静置10分钟；再放入-5℃乙醇-水混合物(15：85)中冷却30分钟，取出，抽滤、冷冻干燥，冷凝温度-50℃真空度10Pa冻干面积0.12㎡，得人参皂苷Rg3缓释微球。
实施例5
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 18.75wt％、硬脂酸31.25wt％、十八醇50wt％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
实施例6
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 15wt％、硬脂酸30wt％、十八醇50wt％、PEG20000 5％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
实施例7
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 15wt％、硬脂酸32wt％、十八醇52wt％、正丁醇1％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
实施例8
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 15wt％、硬脂酸32wt％、十八醇52wt％、乙醇溶液(80％)1wt％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
实施例9
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 15wt％、硬脂酸32wt％、十八醇52wt％、乙醇溶液(80％)0.5wt％、PEG20000 0.5％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
实施例10
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 15wt％、硬脂酸20wt％、十八醇50wt％、吐温80 5wt％、二乙二醇单乙基醚10％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
实施例11
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，：包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 15wt％、油酸30wt％、十六醇50wt％、丙三醇5％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
实施例12
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 15wt％、油酸20wt％、十六醇50wt％、吐温80 5wt％、PEG2000010％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
实施例13
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 15wt％、软脂酸30wt％、十六醇50wt％、吐温2 5％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
实施例14
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 15wt％、硬脂酸30wt％、十四醇50wt％、乙醇5％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
实施例15
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 15wt％、硬脂酸20wt％、十四醇50wt％、吐温20 5wt％、PEG200010％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
实施例16
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 15wt％、硬脂酸30wt％、十八醇50wt％吐温60 5wt％
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
实施例17
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 15wt％、硬脂酸30wt％、十八醇50wt％、司盘60 5wt％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
实施例18
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 15wt％、硬脂酸30wt％、十八醇50wt％、司盘20 5wt％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
实施例19
本实施例的用于治疗关节炎的缓释制剂，包括下列重量百分比：
人参皂苷Rg3 15wt％、硬脂酸30wt％、十八醇50wt％、司盘80 5wt％。
本实施例的人参皂苷Rg3缓释制剂制备按实例4进行。
对实施案例2进行验证
1.外观观察(扫描电镜)
用扫描电镜观察微球的外观形状，可观察到微球成型度较好，为圆球形微球，且大小均一，结果见图1。
2.微球粉体学的考察
粉体学性质是评价微球质量的重要指标之一。主要包括粒径及粒度分布、圆整度、流动性和堆密度。
2.1粒径及粒度分布
采用筛分法测定微球的粒径。微丸粒径主要分布在0.355mm～0.5mm，少部分在0.125mm～0.355mm。
2.2圆整度
通过测定微球的平面临界角来衡量微球的圆整度。微球的平面临界角取定量微球置光滑玻璃平板上，将平板一侧缓慢抬起，测量在微球开始滚动前倾斜平面与水平面的夹角，甲角越小表明微球的圆整度越好。平行测3次，测得夹角都是15°，夹角较小，说明其圆整度较好。
2.3流动性
采用固定圆锥槽法测定微球的休止角。休止角不仅可放映微球的流动性,同时又可间接反映微球的圆整度。休止角越小，微球的流动性和圆整度越好。固定圆锥槽法将三个串联漏斗固定在圆形表面皿的中心上方，使微球从最上方的漏斗,经三个漏斗流出，直至微球在表面皿上堆积到最高的锥体为止，测出锥体高度、表面皿直径，计算休止角，结果见表9。根据公式(tanθ＝H/R)，平行测3次所求的的休止角均≤30°表示流动性好。
表9休止角数据结果表
Figure BDA0003515623700000101
2.4堆密度
称取适量定量微球使其缓缓通过一玻璃漏斗，倾倒至量筒内，在桌面上轻敲至体积不再减小为止，测定微球的堆容积，按式一计算微球的堆密度，结果见表10。根据公式(堆密度＝重量/堆容积)求得平行测6次所求的堆密度RSD％＝0.88，符合相关要求。
表10堆密度数据结果表
Figure BDA0003515623700000102
3.水分含量
根据中国药典水分测定第二法(烘干法)取微球2～5g，如、平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5mm，疏松供试品不超过10mm，精密称定，开启瓶盖在100～105℃干燥5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，放冷30分钟，精密称定，再在上述温度干燥1小时，放冷，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量(％)，结果如表11所示。
表11水分测定结果表
Figure BDA0003515623700000103
Figure BDA0003515623700000111
4.含量测定
4.1色谱条件
色谱条件：Neptune c18色谱柱(250mmx4.6mm,5μm)；以乙腈-10％异丙醇(40：60)为流动相；检测波长203nm,进样量为10ul；流速为1.0ml/min；柱温30℃。
4.2对照品溶液制备
同“4.1”项下的方法制备。
4.3供试品溶液制备
同“4.2”项下的方法制备。
4.4阴性对照品
同“4.3”项下的方法制备。
4.5专属性实验
分别精密吸取人参皂苷Rg3对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10uL，注入高效液相色谱仪，按照“2.1.1”项下的色谱条件检测。结果显示人参皂苷Rg3缓释微球的色谱峰与相邻色谱峰的分离度良好，对称因子在0.95～1.05，理论塔板数大于6000，对照品溶液与供试品溶液在相同的保留时间均出峰，阴性对照对人参皂苷Rg3检测无干扰，结果见图2。说明该方法专属性强。
4.6标准曲线的制备
精密称取对照品人参皂苷Rg3适量，甲醇稀释,摇匀,制成1ml含0.06，0.1007，0.1202，0.1505，0.2，0.5034mg的对照品溶液,精密吸取对照品溶液10ul依次进样。按“5.1”项下的色谱条件进样分析，记录色谱图。以人参皂苷Rg3对照品质量浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得到回归方程为y＝3283.2x，R2＝0.9991，结果表明人参皂苷Rg3 0.06mg/mL～0.5034mg/mL线性关系良好。
4.7精密度实验
取浓度为0.1047mg/mlmg/ml人参皂苷Rg3对照品溶液，按照“5.1”项下的色谱条件检测，重复进样6次，每次进样10ul，测定色谱峰面积，计算RSD值。结果显示RSD＝0.18％(n＝6)，结果见表说明仪器精密度良好。
4.8重复性实验
取同一批人参皂苷Rg3微丸按照“5.3”项下制备方法平行制成6份，按照“5.1”项下的色谱条件测定。RSD＝0.84％，结果表明该方法重现良好。
4.9稳定性实验
取同一批对照品溶液和供试品溶液，室温下分别在0、2、4、6、8、10、12、24h按照“5.1”项下的色谱条件检测。对照品峰面积的RSD％为0.23，供试品峰面积RSD％值为0.50，结果表明对照品溶液和供试品溶液在24小时内稳定性良好。
4.10回收率实验
精密称定已知含量的供试品9份，分别加入一定量的人参皂苷Rg3对照品，配置成浓度分别为80％、100％、120％供试品溶液，每个浓度平行制备3份，按照“5.1”项下的色谱条件测定，计算回收率。三个浓度的平均回收率分别为95.04％、95.65％、99.90％，RSD值分别为1.12％、0.53％、1.06％，此方法准确可行。
对实施案例1进行体外释放实验
6.体外释放实验
精密称取人参皂苷Rg3缓释微球2g，以纯化水、pH＝6.8磷酸缓冲液、人工肠液、人工胃液为溶出介质，用量100mL，装入250mL样品瓶中，密封后放置在恒温震荡培养箱中震荡(温度(37±0.5)℃，转速100r·min-1)，于1h、4h、8h、12h、16h、1d、2d、4d、7d、14d、24d各吸取10mL，离心取上清液，将下层微球倒回样品瓶中同时立即补加等温同量溶出介质，浓缩蒸干后加入2ml甲醇溶解，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，精密吸取10μL进行HPLC含量测定。
如图3A所示，以时间为横坐标，累积释放率为纵坐标绘制释放曲线，结果见表12。结果表明人参皂苷Rg3缓释微球体外释放在pH＝6.8磷酸缓冲液、人工肠液、人工胃液7天内的释放度分别为87.73％、102.60％、93.98％。测定24小时人参皂苷Rg3原料药在不同介质中的溶解度分别为4.54％、8.37％、10.79％，所制得的人参皂苷Rg3缓释微球释放度较高，能够提高人参皂苷Rg3的生物利用度。
表12人参皂苷Rg3释放结果表
T C<sub>磷酸</sub> C<sub>胃</sub> C<sub>肠</sub>
1 6.82 4.94 4.49
4 10.45 10.02 12.76
8 13.96 22.98 17.50
12 23.47 27.76 22.48
24 34.90 33.65 27.66
36 39.92 41.51 37.11
96 50.44 56.36 50.55
168 59.86 69.96 63.82
336 59.86 69.56 63.82
7.释药机制研究
对人参皂苷Rg3缓释微球在不同释放介质的释药进行拟合，解释其释药规律。本实验将释药曲线分别用零级、一级、Higuchi、Weibull方程对释放曲线直线部分进行拟合，结果见表13。结果表明Rg3缓释微球体外释药模型拟合接近程度依次为Higuchi模型＞一级模型＞零级模型，结果发现Weibull方程拟合相关性极低。因此认为人参皂苷Rg3缓释微球体外释药符合Higuchi模型，属于缓释。
表13人参皂苷Rg3缓释微球的释药规律
Figure BDA0003515623700000121
Figure BDA0003515623700000131
实施案例1进行药效学实验
8.不同给药剂量对类风湿性关节炎的影响
8.1动物模型的建立及给药
适应性喂养1周后，称量大鼠体重，测足趾直径、足趾容积以及周长。随机分为4组：正常对照组、AA对照组、人参皂苷Rg3原料药AA组、人参皂苷Rg3缓释微球高、中、低剂量AA组。
正常对照组：一次性右后足跖皮内注射生理盐水0.1mL，7天后，灌胃给药生理盐水(2ml·kg-1·d-1)
AA组：一次性右后足跖皮内注射CFA 0.1mL，7天后，灌胃给药生理盐水(1ml·kg-1·d-1)。
GRg3原料药AA组：大鼠一次性右后足跖皮内注射CFA 0.1mL，7天后，给予Rg3原料药(10mg·kg-1·d-1)灌胃给药。
GRg3缓释微球AA高、中、低剂量AA组组：大鼠一次性右后足跖皮内注射CFA 0.1mL，7天后，给予不同剂量人参皂苷Rg3缓释微球(0.1g/0.3g/0.5g·kg-1·d-1)灌胃给药。
阳性对照组：以秋水仙碱作为阴性对照，给药剂量为25mg·kg-1·d-1。为了保证免疫条件的齐同性，各组均在同一时间免疫，即以免疫时间为基准点。
8.2取材
戊巴比妥钠麻醉下，采用腹主动脉取血，2500rpm离心20min后取血浆，分装后，-80℃冰冻备用。取双侧膝、踝关节，在福尔马林固定备用。
8.3指标的测定
一般状态观察主要包括体重、被毛状况、活动状况及排便状况等。
关节炎指数(Arthritis index，AI)评分方法参照5级评分法评价，将2只后踝关节的病变程度累计积分，计算出关节炎指数，每个动物最大为8分。0分：无关节炎；1分：小趾关节轻度肿胀；2分：小趾关节和足跖肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内全部关节肿胀。
关节肿胀度的测量方法致炎前在大鼠后肢踝关节上方0.5cm处做出标记，鼠免疫前和免疫后第4、7、14、21天分别测小鼠的左右后足垫体(足跖测量仪测定)膨胀率按以下公式计算：
肿胀度(Edemarate,ER)＝(Vt-V0)/V0×100％。其中V0表示造模前的容积，Vt表示造模后的容积。
关节切片及光镜下关节破坏半定量分析方法关节在福尔马林固定1周后，5％HNO3脱钙1周，酒精逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包理，切片，常规HE染色。光镜下观察滑膜、软骨、骨的病理改变，并进行关节病理损伤半定量分析。0分：关节结构正常，关节间隙均匀，软骨、骨无损伤，滑膜组织无炎症、增生等；1分：关节结构基本正常，有滑膜增生，血管数量增加，可见少量炎细胞浸润，软骨表层轻度破坏；2分：关节软骨有明显的侵蚀破坏，血管翳形成，炎细胞浸润明显，无骨破坏，关节间隙基本正常；3分：有大量的血管翳形成，可见广泛的软骨的侵蚀破坏，可见骨破坏，关节结构遭破坏。
血浆抗Ⅱ型胶原抗体、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-ɑ、TNF-β含量的测定采用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)，具体步骤按照试剂盒说明书进行。
8.4结果
一般状态观察结果
正常对照组：大鼠精神状态良好，双目有神，反应、活动灵活敏捷，被毛光泽，饮食正常，体重日渐增加。
AA组:大鼠精神萎靡，眯眼，被毛枯疏无光泽，弓背蜷缩，踝关节红肿，倦怠、懒动，喜聚堆，饮食减少，体重下降，稀便。
给药组：不同给药剂量组的大鼠精神状态均良好，被毛光泽，饮食正常，反应较灵活。
阳性对照组：少数大鼠出现腹泻情况
通过对大鼠足跖进行拍照观察发现给药组大鼠足跖肿胀程度远小于AA组，给药组中低剂量给药组的足跖无明显肿胀，其次是中剂量和阳性对照组。且实验中发现AA组继发性病程明显，除左足足跖肿胀明显之外，尾巴以及耳后出现不同大小的结节，而给药物组无继发性病程，说明人参皂苷Rg3缓释微球具有抗RA以及延缓继发性病程的作用。如图4所示。
关节炎指数
与模型组相比，不同给药剂量组大鼠关节指数评分减小，并且无继发病症的发生。与阳性对照组相比，低剂量组的关节炎指数较低，说明人参皂苷Rg3缓释微球在低剂量的抗RA作用较强，结果见表14、15。
表14给药前关节指数
Figure BDA0003515623700000141
表15给药后关节指数
Figure BDA0003515623700000142
关节肿胀度
由实验结果可以看出不同给药剂量组与模型组相比，大鼠足跖肿胀度减小明显甚至有消退的现象，说明这种制剂对类风湿性关节炎有治疗作用。AA组大鼠有严重的继发性病程，尾部以及前足都有不同程度的肿胀。结果见表16。
表16不同组类风湿性关节炎大鼠关节肿胀度的变化
Figure BDA0003515623700000151
ELISA实验结果
由实验结果可以发现人参皂苷Rg3缓释微球使得IL-6、TNF-ɑ因子水平上升、同时使得IL-10、IFN-γ、TNF-β因子水平降低。结果见表17。
表17不同组类风湿性关节炎大鼠关节炎症因子水平
Figure BDA0003515623700000152
综上所述，利用人参皂苷Rg3缓释微球治疗类风湿性关节炎，通过调节大鼠体内的炎症因子，可以显著降低关节炎的严重程度以及延缓继发性病程。
9.不同给药时间间隔人参皂苷Rg3缓释微球对类风湿性关节炎动物的影响
9.1动物模型的建立及给药
适应性喂养1周后，称量大鼠体重，测足趾厚度，足趾容积。随机分为6组：正常对照组、AA对照组、GRg3载药缓释微球AA1组、GRg3载药缓释微球AA2组、GRg3载药缓释微球AA3组。
正常对照组：一次性右后足跖皮内注射生理盐水0.1mL，7天后，灌胃给药生理盐水(1ml·kg-1·d-1)
AA组：一次性右后足跖皮内注射CFA 0.1mL，7天后，灌胃给药生理盐水(1ml·kg-1·d-1)。
GRg3缓释微球AA1组：大鼠一次性右后足跖皮内注射CFA 0.1mL，7天后，给予人参皂苷Rg3缓释微球(0.5g·kg-1·d-1)灌胃给药。
GRg3缓释微球AA2组：大鼠一次性右后足跖皮内注射CFA 0.1mL，7天后，给予人参皂苷Rg3缓释微球(0.5g·kg-1·d-3)灌胃给药。
GRg3缓释微球AA组：大鼠一次性右后足跖皮内注射CFA 0.1mL，7天后，给予人参皂苷Rg3缓释微球(0.5g·kg-1·w-1)灌胃给药。
阳性对照组：以秋水仙碱作为阴性对照，给药剂量为25mg·kg-1·d-1。
9.2取材：同“8.2”取材。
9.3指标的测定：同“8.3”指标测定。
9.4结果
一般状态观察结果
正常对照组：大鼠精神状态良好，双目有神，反应、活动灵活敏捷，被毛光泽，饮食正常，体重日渐增加。
AA组:大鼠精神萎靡，眯眼，被毛枯疏无光泽，弓背蜷缩，踝关节红肿，倦怠、懒动，喜聚堆，饮食减少，体重下降，稀便。
给药组：不同给药剂量组的大鼠精神状态均良好，被毛光泽，饮食正常，反应较灵活。
阳性对照组：少数大鼠出现腹泻情况
通过对大鼠足跖进行拍照观察发现给药组大鼠足跖肿胀程度远小于AA组，给药组给药7天给药组的足跖无明显肿胀，其次是中剂量和阳性对照组。且实验中发现AA组继发性病程明显，除左足足跖肿胀明显之外，尾巴以及耳后出现不同大小的结节，而给药物组无继发性病程，说明人参皂苷Rg3缓释微球足有抗RA以及延缓继发性病程的作用。如图5所示。
关节炎指数
与模型组相比，不同给药时间组大鼠关节指数评分减小，并且无继发病症的发生，给药7天效果最明显。结果见表18、19。
表18给药前关节指数关节肿胀度
Figure BDA0003515623700000161
Figure BDA0003515623700000171
表19给药后关节指数
Figure BDA0003515623700000172
由实验结果可以看出不同给药时间组与模型组相比，大鼠足跖肿胀度减小明显甚至有消退的现象，说明这种制剂对类风湿性关节炎有治疗作用，且给药时间3天和7天效果最明显，说明该制剂对关节炎具有治疗作用。AA组大鼠有严重的继发性病程，尾部以及前足都有不同程度的肿胀，结果见表20。
表20不同给药时间类风湿性关节炎大鼠关节肿胀度的变化
Figure BDA0003515623700000173
ELISA实验结果
由实验结果可以发现给药组使得IL-6、TNF-ɑ因子水平上升、同时使得IL-10、IFN-γ、TNF-β因子水平降低，结果见表21。
表21不同给药时间类风湿性关节炎大鼠关节炎症因子水平
Figure BDA0003515623700000174
Figure BDA0003515623700000181
综上所述，人参皂苷Rg3缓释微球给药时间间隔对治疗类风湿性关节炎有一定的影响，研究发现，大鼠给药时间间隔为3天和7天比给药时间间隔为1天的治疗效果好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于治疗关节炎的缓释制剂，其特征在于：包括下列重量百分比：人参皂苷Rg30.1-30wt％，载体 55-85wt％、乳化剂0~5wt％，助乳化剂0~10wt％；
其中，所述载体选自高级脂肪酸类、高级脂肪醇类中的一种或多种；
所述乳化剂选自吐温类、司盘类、聚乙二醇硬脂酸酯类、聚氧乙烯辛基苯基醚、蓖麻油聚氧乙烯类、氢化蓖麻油中的一种或多种；
所述助乳化剂选自多元醇类、PEG类、乙醇、正丁醇、二乙二醇单乙基醚的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的缓释制剂，其特征在于：所述高级脂肪醇类为十四醇、十八醇、十六醇；所述高级脂肪酸类为硬脂酸、软脂酸、油酸；所述乳化剂为吐温80、吐温60、吐温20、司盘80、司盘60、司盘20。
3.根据权利要求1所述的缓释制剂，其特征在于，所述助乳化剂为PEG类、乙醇、正丁醇。
4.一种用于治疗关节炎的缓释制剂，其特征在于，所述缓释制剂由下述重量百分比的原料制备而成：
人参皂苷Rg3 14wt％，十八醇 53wt％，硬脂酸 31wt％，吐温80 1 wt％，PEG20000 1wt％。
5.权利要求1-4中任一项所述的缓释制剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤（1）、将人参皂苷Rg3研磨成细粉，备用；
步骤（2）、将载体于85℃-95℃水浴加热搅拌熔融至呈液态，加入人参皂苷Rg3原料药以及助乳化剂、乳化剂，均质10-60分钟，转速4000-7000r/min，得均质溶液；
步骤（3）、称取200%-400%倍量的水，恒温至55-70℃，持续搅拌5-30分钟，转速500-900r/min，将步骤（2）制得均质溶液倾倒入水中，继续搅拌5-30分钟后，停止搅拌，得固液混合物；
步骤（4）、将步骤（3）中装有固液混合物的器皿快速移入5-20℃水中静置5-10分钟；再放入-15-5℃二级冷却液中冷却10-60分钟，取出，抽滤、冷冻干燥得人参皂苷Rg3缓释微球。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，人参皂苷Rg3细粉细度为100-300目。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，冷冻干燥中，冷凝温度为-50℃，真空度为10Pa，冻干面积为0.12㎡。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，二级冷却液是指丙二醇、乙二醇、乙醇、甲醇、甘油、蜂蜜与水比在15：85-30：70所制得的混合溶液。
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