CN1145033A - Bpi蛋白产物的人类治疗性应用 - Google Patents

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Abstract

本文公开了对循环系统中有细菌内毒素的人施用杀菌/增强通透性(BPI)的蛋白产物以进行治疗的方法，通过这种治疗，可观察到由内毒素介导的循环细胞因子，纤维蛋白溶解和凝集因子的增长，以及淋巴细胞计数的变化都得以缓解，而这种缓解可用血清学或血液学方法验证。另外还观察到由内毒素介导的系统性血管抗性指数(SVRI)的降低，以及伴发的心脏指数(CI)的增长也得以缓解。

Description

BPI蛋白产物的人类治疗性应用
(与相关申请相互参照)
本申请是1994年8月16日递交的美国专利申请系列号08/291,112的部分继续申请，而08/291,112号申请又是1994年1月24日递交的美国专利申请系列号08/188,221的部分继续申请。
                    本发明的背景
本发明一般涉及治疗方法，更具体地涉及对那些因诸如革兰氏阴性细菌感染，偶然注射了受内毒素污染的液体，内毒素从肠道转移出来，内毒素因抗生素介导的细菌细胞溶解或其他类似情况而被释放入循环系统所造成的血液循环中带有细菌内毒素的人进行治疗的方法。
革兰氏阴性细菌内毒素在革兰氏阴性脓毒症和脓毒性休克的发病机理中起着重要作用，这两种疾病是危重病人发病和死亡的最主要原因。内毒素与炎症细胞相互作用，释放内源性介质如细胞因子，水解酶，肽，前列腺素以及其他引起导致毒性休克的病理生理学的化合物。一方面内毒素进入循环的主要原因是革兰氏阴性细菌血症以及细菌和细菌产物从肠道内转移至循环系统，另一方面也可因偶然注射了被污染的液体或因抗生素治疗而导致的内裂解的细菌，释放出内毒素，从而使内毒素进入循环。不久前，已有对治疗脓毒症和脓毒性休克的治疗方法的提议，它们重在尝试结合循环中的内毒素以及直接和间接抑制因内毒素的存在而导致的前炎症物质释放入循环。例如，抗内毒素抗体有望能抑制内毒素在人体中的作用。
在开发治疗人内毒素血症的治疗方法和物质方面总是遇到一个困难，就是将体外，甚至非人类的体内试验结果作为人类治疗的可能方法的一种指示通常是不可信的。由于内毒素在循环中的作用复杂，而且涉及体内多种细胞类型的直接和间接反应，尝试在体外干涉内毒素对特殊细胞类型的作用所得的试验结果为体内作用的评价提供了不完善的根据。由于细菌内毒素对不同种的动物，和同一种动物的不同模型的作用不同，而使动物研究很复杂。人类对内毒素非常敏感，而其他动物的反应明显地各不相同。例如，以重量为基础相比小鼠和大鼠对内毒素，远比兔和狗有抗性；对兔有生命威胁的剂量对小鼠只产生最小的作用。而且，所观察到的作用类型均很不相同。狗在使用了亚致死但产生休克之剂量的内毒素后表现出肠道出血，而其他实验室常用的动物就不会这样。在注射内毒素后让小鼠处在一般室温中，其体温会下降，若处在30℃中，则会发烧。例见Pagexx in the Introduction in Cellular Biology of Endotoxin，L.Berryed，Volume3 in the Series Handbook of Endotoxin(R.Proctor，Series ed)Elsevier，Amsterdam，1985.
本发明的背景中，令人感兴趣的是很多有关在健康志愿者身上施用内毒素的体内作用的报道。Martich etal，Immurobiol，187：403-416(1993)提供了最近的较详细的综述文献，论述了在其他健康人中由实验性内毒素血症所带来的对循环系统组分的影响。发现人体中由内毒素引发的反应与急性炎症反应没什么两样，而后者是宿主对组织损伤或感染之反应的一部分，作者坚持认为施用内毒素可作为评价炎症反应以及内毒素特异性反应的一种独特方法，作者还注意到，尽管给健康人施用内毒素并不是脓毒性休克中全面宿主反应的一个精确模型，但它的确可以研究宿主对细菌内毒素的最初炎症反应。
Martich等人注意到静脉内注射内毒素同样伴随有发热反应和各种能被异丁苯丙酸减轻却不能被磷酸二酯酶抑制物，己酮可可碱减轻的体质上的变化(肌痛等等)。在人的实验性内毒素血症中观察到了与临床脓毒症中所观察到的性质相似的心血管反应。在循环的细胞因子，如肿瘤坏死因子α(TNF)，白细胞介素6(IL-6)，白细胞介素1β(IL-1β)，白细胞介素8(IL-8)，和粒细胞集落刺激因子(GCSF)中均发现有特征性增大。当循环的TNF水平增长后，还发现TNF的抑制性可溶受体也以一特征性模式增长。在Martich等人报道的研究结果中还提供了有关成果，即异丁苯丙酸在实验性内毒素血症中能提高TNF和IL-6的循环水平，而已酮可可碱能降低TNF的循环水平，但不能降低IL-6的循环水平。
已注意到人的实验性内毒素血症与在脓毒症中所观察到的类似，能增强体液炎症反应。纤维蛋白溶解系统被激活，组织纤维蛋白酶原激活剂(tPA)在循环中的水平上升，还伴随有α2-纤维蛋白酶抑制因子——纤维蛋白酶复合物(PAP)的增加，这证实了tPA对纤维蛋白酶原的激活。已发现给人施用内毒素可促进暂时性的白细胞减少症，随后可促进快速白细胞增多症。中性粒细胞发生脱颗粒时，伴随有弹性蛋白酶(以弹性蛋白酶/α1-抗胰蛋白酶(EAA)复合物进行测量)和乳铁蛋白被释放入循环。
Martich等人总结出：给人施用内毒素代表了一种急性炎症的重要模型，它能重现许多发生在脓毒症和脓毒性休克期间的炎症事件，并提供研究宿主对某一重要细菌产物的反应的一种独特方法。
在Martich等人发表了这篇综述文献后，相同的研究小组又报道了对实验性内毒素血症的一项研究，其中试图查明将内毒素施用进循环是否能使肺里通过支气管肺泡灌洗法(BAL)测量的已增高的细胞因子水平再提高。Boujoukos et al，J Appl.Physiol，74(6)：3027-3033(1933)。即使同时施用异丁苯丙酸来促进人体中由内毒素介导的TNF和IL-6的循环水平，也没有在BAL灌洗液中观察到TNF，IL-6或IL-8水平的增高。这说明循环中细胞因子对内毒素的反应是分隔在不同区域的，而且并不直接涉及肺内皮组织。
对脓毒性休克中的心血管障碍的研究明确了，通常体克的特征在于高的心脏指数(CI)和低的系统性血管抗性指数(SVRI)。[Parker et al，Crit.Care.Mead.，15：923-929(1987)；Rackow et al.，Circ.Shock，22：11-22(1987)；and Parker et al，Ann.Intern，Med.，100：483-490(1984)]对本发明的背景，另外的兴趣在于那些证实了心肌收缩减弱和舒张期机能异常的人体实验性内毒素血症的研究。[Suffredini et al，N.Eng.J.Med.，321：280-287(1989)]。
杀菌/增强通透性蛋白(BPI)是一种从哺乳类动物多形核白细胞(PMN)的颗粒中分离出的蛋白质，PMN是抵御微生物入侵的防御屏障中的基本血细胞。用酸抽提法，结合离子交换层析[Elsbach，J.Biol.Chem.，254：11000(1979)]或大肠杆菌亲和层析[Weiss，e-tal.，Blood，69：652(1987)]而从PMN中分离出的人BPI蛋白具有最佳杀菌活性，对革兰氏阴性细菌有一个较宽的抗菌谱。人BPI的分子量约为55,000道尔顿(55KD)。完整人BPI蛋白的氨基酸序列，以及编码此蛋白的DNA序列，都已在引入本文参考文献的Grayet al.J.Biol，Chem.，264：9505(1989)的图1中被清楚说明。
最近出版的科技文献中已说明BPI的杀菌作用对敏感的革兰氏阴性菌类有高度特异性，而对其他微生物和真核细胞往往缺乏毒性。BPI杀死细菌的确切机制至今尚未完全阐明，但已知BPI必须先结合到易感的革兰氏阴性细菌的表面。 BPI对细菌的初次结合涉及碱性BPI蛋白和内毒素的带负电荷位点之间的静电和巯水相互作用。BPI与类脂A结合，类脂A是最具毒性和生物学活性的内毒素成分。
据认为在易感细菌中，BPI的结合可破坏脂多糖(LPS)结构，从而可导致降解磷脂和肽聚糖的细菌酶类的激活，改变细胞外膜的通透性，并启动最终导致细胞死亡的事件。[Elsbach and Weiss，Infor-mation：Basic Principles and Clinical Correlates，eds.Gallin et al.，Chapter30，Reven Bess，Ltd.(1992)]。据认为BPI可在两个阶段起作用。首先是亚致死阶段，其特征在于即时生长抑制，外膜通透和水解磷脂及肽聚糖的细菌酶类被选择性激活。可通过在添加血清白蛋白的培养基中培养此阶段的细菌而救活之。第二阶段可限定为不能由血清白蛋白逆转的生长抑制，它是在延长细菌暴露于BPI中的时间之后发生的，其特征在于广泛的生理和结构变化，包括胞质膜的穿透。
细菌细胞外膜对例如放线菌素D这样的巯水性探针的穿透是很快的，而且取决于BPI最初与内毒素的结合，它可导致组织改变，这种改变很可能是由于结合了内毒素的KDO区域的阴离子基因而引起的，而后者一般能通过结合Mg++和Ca++而稳定外膜。BPI的结合及随后的细菌杀死过程至少部分取决于内毒素多糖链的长度，带有长O链的生物体比带短链的“粗糙”的生物体对BPI的杀菌作用更具抗性，[Weiss et al.，J.Clin.Invest.，65：619-628(1980)]。BPI作用的第一阶段可通过将BPI从它的结合位点上脱离下来而逆转。这一过程需要合成新的LPS，并需有二价阳离子的存在。[Weiss etal.，J.Immunol.，132：3109-3115(1984)]。然而细菌生活力的丧失并不能通过恢复外膜完整性的过程而使之逆转，这说明杀菌作用是通过在靶生物体中被诱导的另外的损伤而介导的，此损伤可能位于胞质膜上[Mannion et al.，J.Clin.Invest.，86：631-641(1990)]。对这种可能性的特殊研究表明，在克分子基础上，BPI对胞质膜泡囊功能的抑制作用至少与多粘菌素B一样[Int Veld etal.，Infection and Immunity，56：1203-1208(1988)]，但确切机制至今尚未查明。
相当于人BPI全蛋白质N末端部分的蛋白酶解片段基本上具有来自自然的55KD人全蛋白质的所有杀菌效力[Ooi etal.，J.Bio.Chem.，262：14891-14894(1987)]。与N末端部分相反，分离的人BPI蛋白的C末端区域仅显示出勉强可检测到的抗细菌活性。[Ooiet al.，J.Exp.Med.，174：649(1991)]。由重组方法已生产出大约含有人BPI全蛋白质的最初199个氨基酸残基，并被称为“rBPI23”的BPIN末端片段，其为23KD蛋白质。[Gazzano-Santoro et al.，In-fect.Immun.，60：4754-4761(1992)]。
本申请另外的兴趣在于涉及得自兔PMN颗粒的15KD蛋白质(命名为P15)对BPI杀菌活性之增强的文献。Ooi等人在J.Biol.Chem.，265：15956(1990)中，公开了得自兔PMN颗粒的两种相关的15KD蛋白质，它们能增强BPI在第一个亚致死阶段的抗菌活性，但对BPI在第二个致死阶段的抗菌活性有抑制作用。Levy等人在J.Biol.Chem.，268：6058-6063(1993)中公开了编码这两种兔蛋白质的cDNA序列，并报道了有较强增强作用的蛋白质将早期制菌作用所需的BPI剂量减少了约20倍。
本发明背景的特别兴趣在于有关在各种体外试验和非人类体内试验系统中细菌内毒素与BPI蛋白产物之间的相互作用的报道。例如Leach等人在Keystene Symposia“Recognition of Endotoxin inBiologic Systems”，Lake Tahoe，CA，March1-7，1992(Abstract)中报道了rBPI23(如Gazzano-santoro et al.，文献同上的描述)能在被E.coli 011：B4 LPS攻击的内放线菌素D致敏的CD-1小鼠中防止致死性内毒素血症的发生。另一项研究中，Kohn等人在J.InfectionsDiseases，168：1307-1310(1993)中阐明rBPI23不仅能以依赖于剂量的方式保护被放线菌素D致敏的小鼠免受LPS攻击的致死效应，而且还减小了血清中经LPS诱导的TNF和IL-1的增高幅度。Am-mons等人[Circulatory Shock，41：176-184(1993)]阐明在大鼠内毒素血症模型中，rBPI23产生了与内毒素血症相关的依赖于剂量的对血液动力学变化的抑制作用。Kelly等人在Surgey，114：140-146(1993)中说明在经气管内接种了致死剂量大肠杆菌的小鼠中，rBPI23比抗内毒素单克隆抗体(E5)能提供明显要强得多的保护免受死之作用。 Kung等人在International Conference on Endotoxin Am-sterdamIV，August 17-20(1993)(Abstract)中公开了在包括活细菌攻击和内毒素血症模型的几种动物模型中rBPI23的功效。
M.N.Marra and R.W.Scott及其同事已在美国专利许可Nos.5,089,274 and 5,171,739，已公开的PCT申请W092/03535以及Marra et al.，J.Immunol.，144：662-665(1990)和Marra et al.，J.Immunol.，148：532-537(1992)中论述了内毒素与BPI蛋白产物之间的相互作用。这些文献中报道的体外及非人类体内实验程序包括当内毒素预先与BPI产物共同孵育时对含有BPI的粒细胞浸出物，高度纯化的粒细胞BPI和重组BPI抑制内毒素刺激人的粘附单核细胞培养物产生肿瘤坏死因子α(TNF)的能力的阳性评估。内毒素与BPI蛋白产物的预孵育也表现出可在体外减少内毒素刺激(上调)中性粒细胞表面表达补体系统成分C3b和C3bi的受体的能力。然而，目前这些补体系统成分中没有一种已被阐明可作为内毒素在人类循环中出现的结果，而在循环中以增加的量存在。这些文献中报道的实验研究包括对受试小鼠和大鼠内内毒素与BPI蛋白产物相互作用的体内评估。在某一系列实验中，发现在经鼻内施用内毒素而被攻击的小鼠体内，BPI能抑制刺激肺细胞产生TNF的作用(以支气管肺泡灌洗液中纤维肉瘤细胞的细胞毒性为依据测量)。在另一系列实验中，发现施用BPI能保护小鼠和大鼠不受各种细菌性内毒素制剂和活的假单胞菌的致死性攻击，还发现BPI对内毒素的结果，在兔体内能减少致热反应。然而，就如上文所发现的，Boujoukas等人在J.Appl.Physiol.，74(6)：3027-3033(1993)中已证实：虽然给人循环施用内毒素会导致循环的TNF，IL-6和IL-8水平增高，但在人受试者的支气管肺泡灌洗液中未检测到这些物质的增高。
自从1994年1月24日递交了原始美国专利申请系列号08/188,221后，又公开了其他的有关BPI体外和体内作用的研究。Fisher等人在Critical Care Med.，22(4)：553-558(1994)中提到在小鼠、大鼠和兔中所做的研究，并得出结论说“这种杀菌增强通透性的蛋白可作为特殊的治疗剂，用来增强人体内调节内毒素的天然负反馈机制，这种令人兴奋的可能性值得进行研究。”Marra等人在Critical Care Med.，22(4)：559-565(1994)中提到在小鼠中进行的研究并总结说“杀菌增强通透性蛋白的潜在的组合并中和内毒素的性质暗示了它可用于治疗与内毒素相关的人类疾病。”
因此，尽管在多种体外和非人类的体内模型系统中已明确BPI蛋白产物很可能具有与内毒素的有益的相互作用，但有关这些蛋白产物在那些因例如革兰氏阴性细菌感染，抗生素治疗，意外注射了被内毒素污染的液体，内毒素从肠内转移等情况而使人体循环中确实出现了细菌内毒素的人体内的功效仍是未知的。
                    本发明概要
本发明提供了治疗那些循环中出现有细菌内毒素的病人的新方法，此方法包括施用BPI蛋白产物以提供对内毒素作用的血清学、血液学、血液动力学上可验证的缓解作用。因而本发明也提到BPI蛋白产物在生产药物组合物中的用途，该组合物可用于治疗循环中存在有细菌内毒素的病人。
根据本发明的一个方面，以足以提供对内毒素介导之效应的血清学、血液学和血液动力学上可检验出的缓解作用的量给人施用如rBPI23的BPI蛋白产物。这些效应包括但不限于：循环的肿瘤坏死因子(TNF)，可溶性TNF受体P55和P75[sTNFr(P55)and sTNFr(P75)]，白细胞介素6(IL-6)，白细胞介素8(IL-8)，白细胞介素10(IL-10)的增加，以循环的乳铁蛋白和/或弹性蛋白酶/α1抗胰蛋白酶复合物(EAA)的增长为特征的增强的嗜中性粒细胞脱颗粒作用；循环的组织纤维蛋白溶酶原激活物抗原(tPA Ag)，组织纤维蛋白溶酶原激活物活性(tPA act)，和α2-纤维蛋白溶酶抑制物——纤维蛋白溶酶(PAP)复合物，纤维蛋白溶酶原激活物抑制物抗原(PAIAg)及尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活物(uPA)的增加；淋巴细胞的减少；凝血酶/抗凝血酶III(TAT)复合物的增加；系统性血管抗性指数(SVRI)的下降和心脏指数(CI)的增加。
根据本发明的另一方面，给接受抗生素治疗的病人联合施用BPI蛋白产物，从而以一种血清学、血液学和血液动力学上可检验出的方式改善往往伴随抗生素介导的细菌细胞溶解或崩解而释放入循环的内毒素的影响。
在目前较优选的形式中，可根据本发明以约0.1至10mg/kg体重的剂量经如静脉内的非肠道途径，以单一和多样的剂量形式或经连续灌注施用BPI蛋白产物，口服和喷雾化施用形式也包括在本发明的范围之内。
本发明提供BPI蛋白产物对于生产用于治疗循环中出现细菌内毒素的病人的药物的用途。本发明的这个方面打算在生产这种药物时以有效量应用BPI蛋白产物，此有效量应能减轻由内毒素介导的循环肿瘤坏死因子和白细胞介素6的增长；能减轻由内毒素介导的循环白细胞介素8和以循环的乳铁蛋白和/或弹性蛋白酶/α1抗胰蛋白酶复合物增长为特征的中性粒细胞脱颗粒作用的增长；能减小由内毒素介导的循环淋巴细胞数量的变化；能减小由内毒素介导的循环组织纤维蛋白溶酶原激活物和组织纤维蛋白溶酶原激活物活性的增长；并能减小由内毒素介导的系统性血管抗性指数的降低。本发明的这个方面进一步打算在生产该药物时将BPI蛋白产物与细菌抗生素联合使用。
此人类治疗方法的发明的其他方面和优点，对仔细考虑了以下本发明较优选的实施方案的详细描述，并参考了附图的本领域技术人员来说是显而易见的，所述附图中提供了暴露于细菌内毒素的病人、及依据本发明使用安慰治疗(空心圆)或用BPI蛋白产物治疗(实心圆)的病人的数据。在图2-19中，为便于观察比较，安慰疗法病人的数据点(空心圆)均在时间轴上稍向对应的经BPI治疗的病人的数据点(实心环)的右边偏。
图1是细菌内毒素的血清学分析结果的图示；
图2是TNF的血清学分析结果的图示；
图3是可溶性TNF P55受体的血清学分析结果的图示；
图4是可溶性TNF P75受体的血清学分析结果的图示；
图5是IL-6的血清学分析结果的图示；
图6是IL-8的血清学分析结果的图示；
图7是IL-10的血清学分析结果的图示；
图8是乳铁蛋白的血清学分析结果的图示；
图9是弹性蛋白酶/α1抗胰蛋白酶复合物的血清学分析结果的图示；
图10是中性粒细胞的血液学分析结果的图示；
图11是淋巴细胞血液学分析结果的图示；
图12是组织纤维蛋白溶酶原激活物抗原的血清学分析结果的图示；
图13是组织纤维蛋白溶酶原激活物活性的血清学分析结果的图示；
图14是纤维蛋白溶酶原激活物抑制物抗原的血清学分析结果的图示；
图15是α2-纤维蛋白溶酶抑制物——纤维蛋白溶酶复合物的血清学分析结果的图示；
图16是尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活物的血清学分析结果的图示；
图17是凝血酶/抗凝血酶III(TAT)复合物的血清学分析结果的图示；
图18是对系统性血管抗性指数(SVRI)的分析结果的图示；
图19是对心脏指数(CI)的分析结果的图示。
                 本发明的详细描述
本文所用的“BPI蛋白产物”包括天然和重组产生的BPI蛋白；天然的，合成的，和重组的BPI蛋白的生物活性多肽片段；包括杂合融合蛋白和二聚体的BPI蛋白的生物活性多肽变异体或其片段，包括被半胱氨酸取代之类似物的BPI蛋白的生物活性多肽类似物或其片段或其变异体，根据本发明施用的BPI蛋白产物可以以本领域所知的任何方法产生和/或分离。美国专利号5,198,541(其所公开的内容在此编入参考文献)公开了编码包括重组BPI全蛋白之BPI蛋白的重组基因以及表达所述蛋白质的方法，所述蛋白质被称为rBPI50，和BPI的重组片段。共有的都是悬而未决的美国专利申请系列号07/885,501以及1993年5月19日递交的其部分持续申请，美国专利申请系列号08/072,063，(在此编入参考文献)中公开了纯化由经培养的基因转化的哺乳动物宿主细胞中表达并分泌出的重组BPI蛋白产物的新方法，并公开了如何能产生大量重组BPI产物以适于掺入稳定的，均质的药物制品。
BPI的生物活性片段(BPI片段)包括具有与天然人类BPI全蛋白相同之氨基酸序列的生物活性分子，缺失人BPI全蛋白之氨基末端氨基酸，内部氨基酸，和/或羧基末端氨基酸的片段分子除外。这种片段的非限制性例子包括如Ooi等人在J.Exp.Med.，174：649(1991)所描述的约为25KD的天然人BPI的N末端片段，以及如Gazzano-Santoro等人在Infect.Immun.60：4754-4761(1992)中所描述的编码天然人BPIN末端1至约193或199位氨基酸之DNA的重组表达产物，该产物被称为rBPI23。在那篇文献中，使用了表达载体作为编码重组表达产物(rBPI23)之DNA的来源，如Gray等人，文献同上的图1所示该产物具有31个残基的信号序列和成熟的人BPIN末端的最初199个氨基酸，只是第151位的缬氨酸由GTG而不是GTC来指定，第185位残基是谷氨酸(由GAG指定)而不是赖氨酸(由AAG指定)。也生产了重组全蛋白(rBPI)，除了所注意到的rBPI23的例外，以及第417位残基是丙氨酸(由GCT指定)而不是缬氨酸(由GTT指定)外，它具有如Gray等人，文献同上的图1所示的序列(SEQ.ID NOS.1和2)，其他例子包括BPI片段的二聚体形式，此形式描述于1994年3月11日递交的共有且都为悬而未决的美国专利申请系列号08/212,132(在此也编入参考文献)。
BPI的生物学活性变异体(BPI变异体)包括但不限于重组杂合融合蛋白和BPI变异体的二聚体形式。所述杂合融合蛋白含有BPI全蛋白或其生物活性片段以及至少一个其他的多肽的至少一个部分。这种杂合融合蛋白和二聚体形式的例子在Theofan等人在共有，都是悬而未决的美国专利申请系列号07/885,911及其部分继续申请，1993年5月19日递交的美国专利申请系列号08/064,693(在此编入参考文献)中有完整描述，该例子包括的杂合融合蛋白在氨基末端含有BPI蛋白或其生物活性片段，在羧基末端含有免疫球蛋白重链的至少一个恒定区或其等位基因变异体。
BPI的生物活性类似物(BPI类似物)包括，但不限于其中一个或多个氨基酸残基已被不同的氨基酸取代的BPI蛋白产物。例如，共有的同是悬而未决的美国专利申请系列号08/013,801(Theofan等人，“稳定的杀菌/增强通透性蛋白产物和含有同样产物的药物组合物”，1993年2月2日递交，其所公开的内容在此被编入参考文献，它公开了BPI和BPI片段的多肽类似物，其中半胱氨酸残基已被不同氨基酸所取代。本申请所描述的较优选的BPI蛋白产物是编码BPI全蛋白N末端的第1氨基酸到约193或199氨基酸之DNA的表达产物，但其中132号残基的半胱氨酸被丙氨酸取代，并被命名为rBPI21Δcys或rBPI21。
对根据本发明的方法，有用的其他BPI蛋白产物为衍生于或基于由重组或合成方法产生之BPI的多肽(衍生于BPI的多肽)，比如描述于1994年3月11日递交的共有和共为悬而未决的美国专利申请系列号08/209,762中的那些所述申请是1994年1月14日递交的美国专利申请系列号08/183,222的部分继续申请，后者又是1993年7月15日递交的美国专利申请系列号08/093,202的部分持续申请，后者又是1993年3月12日递交的美国专利申请系列号08/030,644的部分持续申请，其中所有公开的内容在此都被编入参考文献。其他有用的BPI蛋白产物包括基于或衍生于下列专利申请所描述之BPI的多肽。这些专利申请是Horwitz等人于1994年7月11日递交的共有和共为悬而未决的美国专利申请系列号08/274,299和Little等人于1994年7月11日递交的美国专利申请系列号08/273,540。
目前较优选的BPI蛋白产物包括重组产生的BPIN末端片段，特别是那些分子量约为21至25KD的诸如rBPI23或rBPI21的片段，和这些N末端片段的二聚体形式。此外，较优选的BPI蛋白产物包括rBPI50和衍生于BPI的肽类。
本文还期望与其他能增强BPI蛋白产物活性的产物一起施用BPI蛋白产物。如，血清补体增强了BPI蛋白产物对革兰氏阴性细菌的杀菌活性；将BPI蛋白产物和血清补体联合能提供协同的杀菌/生长抑制效应。例见Ooi et al.J.Biol.Chem.，265：15956(1990)和Levy et al.，J.Biol.Chem.，268：6038-6083(1993)，这两篇文献提到可增强BPI的抗菌活性的天然产生的15KD蛋白。也见于1993年7月14日递交的共有的，共为悬而未决的美国专利申请系列号08/093,201以及于1994年7月11递交的其部分继续的美国专利申请系列号08/274,373中描述了通过施用脂多糖结合蛋白(LBP)和LBP蛋白产物来增强BPI蛋白产物对革兰氏阴性菌的杀菌活性的方法。以上这些申请的公开内容在此被编入参考文献。缺少CD14免疫刺激特性的LBP蛋白衍生物和衍生杂合体均描述在下列专利申请中，这些专利申请是1994年6月17日递交的共有，共为悬而未决的美国专利申请系列号08/261,660，它是1993年6月17日递交的美国专利申请系列号08/079,510的部分继续申请，它们在此都被列入参考方献。亦见于1995年1月24日递交的共有和共为悬而未决的美国专利申请系列号(Attorney Dochet No.27129/32407)所公开的定量LBP的免疫试验，该专利申请是1994年1月24日递交的美国专利申请系列号08/186,811的部分继续申请。它们在此都被列入参考文献。
在下列实施例中将举例说明本发明方法的实际操作，其中：实施例1中描述了BPI蛋白产物对受到细菌内毒素攻击的志愿人员之影响的可控制的双肓交换型研究；实施例2提到了对细胞因子和细胞因子相关物质的血清学分析；实施例3提到乳糖和葡萄糖的血清学分析；实施例4提到总的和有区别的白细胞分析和白细胞激活作用分析；实施例5提到了各种凝集和纤维蛋白溶解作用参数的血清学分析；实施例6提到血液动力学参数，特别是左心室功能的分析。
                    实施例1
在此设计了可控制的双肓交换型研究，以研究BPI蛋白产物(这里以被称为rBPI23的重组产生的氨基末端片段为代表)对经静脉灌注细菌内毒素致使患上内毒素血症的人体的影响。
8位健康男性志愿者参加了这项研究。每位均无明显医疗史，并经正常体检，在常规实验室测试中亦有基本正常结果。所有志愿者的EKG，胸部x-线和超声心动图结果均在正常范围。在研究之前一个月内患任何感染性疾病的志愿者不能参加此项研究，如果志愿者在研究前一周内报告有任何急性病，或在研究前两周内接受过任何治疗也不能参加此项研究。所有参加人员均有书面形式的保证，研究也经一个道德检查委员会批准。该研究设计了个交换型，其中受试者在两种状况下接受内毒素攻击。为期6周的淘汰期将他们区别开，两种状况中的任何一种均是将安慰剂或rBPI23与内毒素一同使用，以使每位志愿者可以以自身为对照。按两种顺序之比率为1∶1随机决定治疗顺序先rBPI23，后安慰剂，先安慰剂后rBPI23。故在第一轮和第二轮内毒素攻击中都有4位志愿者接受rBPI23治疗。
按Gazzano-Sardoro等人，文献同上的方法制备所研究的药物rBPI23所提供的药物是澄清，无色、无菌、不含致热原的溶液，分装于10ml一次性使用的玻璃小瓶中，它在缓冲液中的浓度为1mg/ml，所述缓冲液是不含防腐剂的20mmol/l柠檬酸钠，0.15M氯化钠，0.1％poloxamer188，0.002％多乙氧基醚，PH5.0，所提供的安慰剂溶液是澄清、无色、无菌、不含致热原的溶液，分装于10ml一次性使用玻璃小瓶内。该溶液在不含防腐剂的缓冲液中含0.2mg/ml人白蛋白。所述缓冲液为20mmol/l柠檬酸钠，0.15mol/l氯化钠，PH5.0。按随机程序表将每位受试人的治疗试剂盒编号。
所用的内毒素制品是由Dr.D.Hochstein(Burean of Biologics，U.S.Food and Drug Administration，Bethesda，MD)赠送的FDA lotEC-5(大肠杆菌)。在注射前，该内毒素制品又按FDA的指导进行重建，保温至37℃，剧烈振荡30分钟，用不含内毒素的盐水稀释到合适的浓度。以精确的5分钟，在前臂静脉内施用rBPI23或安慰剂。在试验药物灌注的第3分钟内在另一支胳膊的前臂静脉内注射内毒素1分钟，剂量为40EU/kg。使用dinamap装置(Critikon，TampaFlorida)每间隔15分钟监测血压和心率。
在下列时间点：-30，3，5，7，12，20，30，35分钟，1，1.5，2，3，4，6，8，10和12小时通过静脉内内置导管获得血液。在含柠檬酸葡萄糖的Vacutainer管(Becton Dickinson，Rutherford，NJ)中收集血液以用于BPI测定，在不含致热原的含肝素(ThromboliquineROrganon，Oss，Netherlands，终浓度30u/ml)的无致热原塑料试管(Falcon2063，Oxnard，CA)中收集血液以用于内毒素试验，在含K3-EDTA的试管中收集血液以用于白细胞计数，在加有大豆胰蛋白酶抑制剂的硅化Vacutainer管(Becton Dickinson)中收集血液以用于检测弹性蛋白酶/α1-抗胰蛋白酶复合物，乳铁蛋白和C3a-desarg分析。将凝成块状的血液在200Xg离心20分钟可制备能用于所有其他试验的血清。
对所作的每个实验评估中，分析数据以确定平均值，中位值和相关的标准误差。结果被绘成相关时间阶段的函数图。用Wilcoxon标记的等级试验[Lehmann，基于等级的无参数统计方法，(Holden-Day，Inc.，San Francisco，CA1975)]测每位志愿者的BPI蛋白产物治疗曲线下(AUC)的斜方格面积相对于他的安慰治疗AUC的变化百分率来评价中位数值治疗差别的统计学显著性。rBPI23治疗相对于安慰疗法的AUC中变化百分率被限定为100X(AUCBPI-AUC安慰方法)/(AUC安慰疗法)。负的变化百分率暗示rBPI23治疗比安慰法治疗的AUC有所下降。分别评估了试验的每个起作用的小组的统计学显著性以使每个组的参数的1型误差率保持在α＝0.05。使用Hochberg方法[Hochberg，Biometrika，75：800-802(1988)]，和可用于多重显著性测试的改良Bonfenoni方法[Miller，Simultaneousstatistical Inference(Springer-Verlag，New York，New York，seconded.，1981)]来测定每个参数组的统计显著性。根据Koch Biomet-rics，28：577-584(1972)描述的无参数方法进行了遗留和阶段效应测试。在用此方法发现了阶段效应之外，又如Koch，文献同上中所述，通过进行治疗效应的测试进一步探查了治疗的区别。
将rBPI23与内毒素一起灌注给8个志愿者，其中有6位导致了短暂的(平均15分钟)发烧，但未引起其他体征。灌注内毒素后，口腔温度的上升与灌注安慰剂和BPI后是相似的：注射内毒素和安慰剂后，口腔温度从36.0±0.2℃升至37.8±0.1℃；注射rBPI23后，从35.6±0.2℃升至37.5±0.3℃。平均动脉血压在两个研究阶段均有降低，且不受BPI灌注的影响。没有在任何一个志愿者身上发现与安全性相关的EKG变化。在两种治疗方案中，志愿者均承受了象头痛、肌痛、寒战和恶心这样的临床症状。所有志愿者在开始灌注的24小时后均完全恢复，也正是在这一时间点，肾、肝和血液学参数均在正常范围。
评估了包括收缩期血压(SBP)，舒张期血压(DBP)，平均动脉血压(MAP)，脉搏，呼吸频率和体温的生命体征参数。下表1给出了生命体征的统计分析结果，揭示了经rBPI23治疗的病人相对于接受安慰疗法病人得出的值没有统计学的显著性差异。
                       表1
                     生命体征
参数 AUC小时   AUC变化百分率的中位数 P-值a 统计学意义b
 舒张期血压  0-10    -1％     .95  不显著
 平均动脉压  0-10    +1％     .74  不显著
  呼吸频率  0-10    -6％     .64  不显著
 收缩期血压  0-10    +3％     .55  不显著
    体温  0-10    -4％    .1094  不显著
    脉搏  0-10    -21％    .0391  不显著
a.比较每个受试者中rBPI23对安慰剂AUC的P-值(Wilcoxon标记的等级试验)。
b.按Hochberg方法确定的统计学意义(S指显著，NS指不显著)。
如Van Deventer等人在Blood，76(12)：2520-2526(1990)中的描述进行内毒素试验。结果示于图1，其中安慰疗法病人的平均值的平均值±标准误以空心圆表示，经BPI治疗的病人的值以实心圆表示。0到20分钟的这段时期内，用安慰剂治疗与用rBPI23治疗相比内毒素水平显著升高(AUC的中位变化百分率为98％，P值为0.0156)。
                    实施例2
         细胞因子和细胞因子相关蛋白
用放射免疫法试验测定TNF的血清水平(RMA Medgenix，Fleurus，Belgium)。简而言之，用识别不同的TNF表位的重组TNF与单克隆抗体的联合物包被聚丙烯试管。加待测样品与经125I标记的抗TNF抗体将试管保温过夜。倾去上清后，在伽玛计数器上计数，结合部分与重组TNF的标准结合曲线相对比就可以Pg/ml表示TNF的水平。
按厂家教导用商购的ELISA试剂盒(Medgemx，Fleurus，Bel-gium)测定IL-1β，IL-8和IL-10的血清浓度。按厂家教导也用EUSA测定IL-6的血清浓度。[Central Laboratory of the Nether-lands Red Cross Blood Transtasion Service(CLB)Amsterdam，Nether-lands]。
如Van der Poll等人在J.Infect.Dis.，168：955-960(1993)中的描述用特异性酶联免疫试验测定可溶性TNF受体P55和P75的浓度。简单说，用结合TNF但非抑制性的抗TNFR-P55(克隆htr-20)或TNFR-P75(克隆utr-4)单克隆抗体于室温下包被微量滴定板Ma-tisorp，Nunc，Denmark)过夜。所述单抗由Dr.H.Gallati，HoffmannLaroche Ltd.Basel，Switzerland赠送，然后，洗涤包被好的孔，孔中所保留的蛋白结合能力可用于200mM Tris/HCl，PH7.5，0.02％Kathon(Hoffmann Laroche Ltd.，Basel，Switzerland)中的1％BSA饱和。弃去贮存缓冲液后，在含10％胎牛血清，0.1％苯酚，0.1％吐温20，0.02％Kathon的0.1M吐温20，PH7.25的溶液中以1∶5稀释的样品被加至孔中。用重组的sTNFR-p55或sTNFR-p75构成标准曲线。加入与过氧化物酶偶联的重组人TNF，混合物于4℃培养2天。洗涤后，加入邻苯二胺二盐酸盐底物培育15-20分钟。用1.5M H2SO4终止反应，用分光光度计测490nm的吸光率。
TNF，p55和p75可溶性TNF受体的试验结果分别示于图2，图3和图4中。正如图中所指示出的，灌注内毒素/安慰剂一个和一个半小时之后，TNF水平从灌注前的0.50±0.38pg/ml(平均值±平均SEM标准误差)迅速上升至峰值261.88±60.73pg/ml，10小时后又回到3.50±0.91pg/ml。然而当内毒素灌注伴有rBPI23时，TNF峰较低(41.13±14.36pg/ml)而且延迟到灌注3小时后才出现。受内毒素/安慰剂攻击后两种类型的TNF受体的血清浓度均升高(TNFR-p55：从0时间的1.21±0.07ng/ml到3小时的3.79±0.29ng/ml；TNFR-p75：从0时的3.28±0.24ng/ml到3小时时的12.72±1.43ng/ml)，而在灌注了内毒素加rBPI23后，升高的程度要小一些(TNFR-p55：从0时的1.12±0.07ng/ml到4小时时的2.45±0.16ng/ml；TNFR-p75：从0时的3.27±0.29到6小时后的7.45±0.71ng/ml)，而且峰值水平也暂时性改变了。
在完整实验的两个治疗阶段IL-1的治疗后水平均低于试验检测最低限。
如图5所示，用内毒素/安慰剂治疗的志愿者的IL-6水平从灌注前的0.23±0.23pg/ml(mean±SEM)上升至3小时后的188.78±79.99pg/ml，10小时后又回到正常值。rBPI23治疗后，IL-6从注射前的0.06±0.04pg/ml在4小时后达到峰值水平45.13±23.28pg/ml，随后在10小时后又回复正常。
如图6所示，经内毒素/安慰剂治疗的病人，其IL-8从灌注前的不可测水平上升至2小时后的69.83±16.72pg/ml，10小时后又降至4.18±2.38pg/ml。而在灌注rBPI23后，IL-8峰值的出现时间推迟了(4小时后达14.20±10.63pg/ml)，而且8位志愿人员中有三位在整个10小时的评估阶段其IL-8水平一直测不到。10小时时，没有任何一个接受rBPI23治疗的志愿者的IL-8可以测得到。
在用安慰剂和rBPI23治疗后，受内毒素攻击的志愿者其血清IL-10水平也有上升。如图7所示，峰值水平出现在灌注后的1或1.5小时到3小时期间。在安慰疗法小组，IL-10从灌注前的10.35±4.19pg/ml(mean±SEM)上升至38.94±10.66pg/ml(在3小时后)，然后又降至10.35±4.37pg/ml(在10小时后)。在rBPI23治疗组，IL-10上升程序较小；即从初始水平的8.86±3.35pg/ml上升至3小时后的21.76±6.89pg/ml。
下表2给出了对细胞因子和细胞因子相关蛋白从0到10小时的测试结果的统计分析结果。
                         表2
              细胞因子和细胞因子相关蛋白
参数 AUC小时   AUC的变化百分率中位值 P-值a 统计学意义b
    IL-1   0-10     0％    .25  不显著
    IL-10   0-10   -38％   .0156   显著
    IL-6   0-10   -79％   .0078   显著
    IL-8   0-10   -97％   .0078   显著
    TNF   0-10   -86％   .0078   显著
 TNF r(p55)   0-10   -40％   .0078   显著
 TNF r(p75)   0-10   -48％   .0078   显著
a.比较每个受试者中rBPI23对安慰剂AUC的P-值(Wilcoxon标记的等级试验)。
b.按Hochberg方法确定的统计学意义(S指显著，NS指不显著)。
上述结果确立了这样一个事实：用BPI蛋白产物治疗实验性内毒素血症病人可以导致在细胞因子对循环中存在的内毒素的反应中血清学可检验的而且有统计学上显著的修饰作用。由内毒素介导的TNF产生的严密性和暂时分配发生了戏剧性的改变，并伴随有循环的可溶性TNF受体水平的下降和循环受体峰值的一个暂时性改变。同样，IL-6作为内毒素出现在循环中的随后结果也出现在循环中，而且明显是被修饰了的。虽有某项以前的研究暗示实验性内毒素血症病人体内的循环TNF水平可通过加入己酮可可碱而减少[Zabelet al.，Lancet，2：1474-1477(1989)]，而观察到异丁苯丙酸可以在施用内毒素后增加TNF和IL-6水平，但以前的这类研究没有一个能鉴别出能有效减少TNF和IL-6对人体内内毒素的反应的试剂。
用施用rBPI23的方式降低TNF对内毒素的反应，不仅减少了循环的TNF受体，同时还减少了循环的IL-10，后者被鉴定为抗炎症的细胞因子。在IL-8峰值水平中伴随的减少和改变是以下实施例4所要讨论的主题。
                    实施例3
               乳酸和葡萄糖分析
用标准的实验室程序进行乳酸和葡萄糖的分析。简单说，两个治疗组的血清葡萄糖经一段时间后均相似地上升，而每组的乳糖水平都只比基线稍有一点上升。
                    实施例4
    总白细胞和特异白细胞及白细胞活性分析
使用流式细胞计数器测定白细胞总数和特异计数(TechniconHi System，Technicon Instruments，Tarrytowiv NY)。白细胞计数在安慰疗法阶段从0时的5.7±0.7×109/L降至1.5小时后的4.0±0.6×109/L，随后又在6小时后升至10.6±0.9×109/L。rBPI23在早期白细胞减少(1.5小时时白细胞计数为：5.9±0.6×109/L，AUC中位变化值在最初两小时内为+30％，P值为0.078)和随后的白细胞上升(6小时时8.1±0.8×109/L)时均表现较平缓，以致在最初12小时内白细胞AUC的中位值减小19％(P＝0.039)。在灌注内毒素2小时以内显著的单核细胞减少症和淋巴细胞减少症病情有发展，而单核细胞和淋巴细胞计数分别在6小时和12小时时又回落到基线水平。在安慰疗法阶段，单核细胞和淋巴细胞计数在内毒素攻击后24小时时开始下降(淋巴细胞、1.3±0.2×109/L；单核细胞：0.4±0.1×109/L)。嗜酸性粒细胞计数在灌注内毒素并给以安慰剂治疗后从0时的0.23±0.07×109/L降至8小时后的0.04±0.008×109/L。嗜中性粒细胞计数在安慰剂治疗中从0时的3.5±0.6×109/L上升至6小时后的峰值9.5±0.8×109/L，然后在24小时时又降至2.4±0.3×109/L，正如下文表3所示，灌注rBPI23显著地减缓了淋巴细胞的下降(AUC的变化率中位值为+34％；P＝0.0078)，也减缓了单核细胞，嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的下降，在AUC的单核细胞的变化率中位值为+42％(P＝0.023)，嗜酸性粒细胞的为+37％(P＝0.039)嗜中性粒细胞的为-26％(P＝0.016)。然而在经rBPI23治疗后24小时后，单核细胞，淋巴细胞和嗜酸性粒细胞计数后保持在基线水平(淋巴细胞：1.5±0.2×108/L；单核细胞：0.5±0.1×109/L；嗜酸性粒细胞：0.15±0.04×109/L嗜中性粒细胞：3.2±0.7×109/L)。
嗜中性粒细胞和淋巴细胞的测定结果(平均值±SEM)分别示于图10和图11中。下表3中，给出了从0到12小时的总白细胞和特异白细胞的统计分析结果。
                          表3
                       白细胞差异
参数 AUC小时   AUC变化百分率的中位值 P-值a 统计学意义b
 嗜碱性粒细胞  0-12    +2％    .95  不显著
 嗜酸性粒细胞  0-12   +37％   .0391  不显著
    白细胞  0-12   -19％   .0391  不显著
   单核细胞  0-12   +42％   .0234  不显著
 嗜中性粒细胞  0-12   -26％   .0156  不显著
   淋巴细胞  0-12   +34％   .0078   显著
a.比较每个受试者中rBPI23对安慰剂AUC的P-值(Wilcoxon标记的等级试验)。
b.按Hochberg方法确定的统计学意义(S指显著，NS指不显著)。
按Nuijens等人在J.Lab.Clin.Med.，119：159-168(1992)中所描述的方法经放射性免疫分析测定弹性蛋白酶/α1抗胰蛋白酶复合物(EAA)和乳铁蛋白的血浆浓度，所测值用ng/ml表示。按Hack等人在J.Immunol.Meth.，107：77-84(1988)中所描述的放谢性免疫分析法测出C3a-desarg的血浆浓度来评估补体激活作用，所测值用nmol/l的方式表示。
乳铁蛋白和EAA的分析结果都在以下表4中给出，平均值±标准误差的结果分别示于图8和图9中。安慰疗法后，弹性蛋白酶/α1抗胰蛋白酶复合物(EAA)从0时的62.5±8.5ng/ml上升至灌注内毒素4小时后的141±20.9ng/ml，表示升高到基准的2.26倍。在rBPI23治疗中，只观察到弹性蛋白酶/α1抗胰蛋白酶复合物构成有很小增大(从0时的57.5±7.4ng/ml上升至灌注后6小时的96.0±8.7ng/ml，升高到基准的1.67倍)。乳铁蛋白浓度在灌注内毒素后高于基准2.59倍(从0时的163±22.6ng/ml到4小时后的422±58.0ng/ml)。经rBPI23治疗后，乳铁蛋白浓度只升至基准的1.64倍(从0时的169±27.6ng/ml升至3小时后的276.6±60.5ng/ml)。rBPI23疗法相对于安慰疗法的乳铁蛋白AUC减少了47％是有显著意义的，(P＝0.0078)(表4)。EAA的AUC降低36％，没有显著意义(P＝0.15)；然而，因为阶段效应的测试对此参数有显著意义，故进一步用Koch，supra介绍的方法探查了治疗效果。此项分析提示了在较低的EAAAUC中rBPI23的显著性治疗效应。(P＝0.0304)(表4)
                        表4
                  白细胞活化作用
参数   AUC小时   AUC变化百分率的中位值 P-值a  统计学意义b
   EAA   0-10   -36％   .0304c   显著
 乳铁蛋白   0-10   -47％   .0078   显著
a.比较每个受试者中rBPI23对安慰剂AUC的P-值(Wilcoxon标记的等级试验)。
b.按Hochberg方法确定的统计学意义(S指显著，NS指不显著)。
c.阶段效应的计算。
在两种治疗策略中，关于C3a-desarg未见有显著性差别，而在经BPI治疗的受试人体内EAA复合物结构和乳铁蛋白分析结果明显地低于经安慰剂治疗的志愿者。EAA和乳铁蛋白试验中观察的结果与前面所注意到的受BPI治疗者的IL-8水平下降是一致的。IL-8与影响中性粒细胞脱颗粒作用及由此所致的循环乳铁蛋白和EAA的升高有关。因此，本研究反映出已知的第一例因人体内实验性内毒素血症的干扰而导致内毒素介导的IL-8循环水平的下降，以及相伴的由分析循环乳铁蛋白和EAA而评估出的中性粒细胞脱颗粒作用的减弱。
                    实施例5
          纤维蛋白溶解和凝集参数分析
为评估下列物质的循环水平，对它们进行了血清学分析。所述物质是：D-二聚体，凝血酶原片段F1＋2(Frag F1＋2)，纤维蛋白溶酶原激活剂抑制物抗原(PAI Ag)，纤维蛋白溶酶原激活剂抑制物活性(PAI Act)，α2-纤维蛋白溶酶抑制物-纤维蛋白溶酶复合物(PAP)，蛋白活性(Prot.C Act)，凝血酶——抗凝血酶III(TAT)复合物，α2-抗纤维蛋白溶酶(AAP)，纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白激活物抗原(tPA Ag)，组织纤维蛋白溶酶原激活剂活性(tPA Act)和尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)。从肘前静脉处经不同点静脉穿刺收集血液，时间分别是开始灌注内毒素之后的1，1.5，2，3，4，6和10小时及之前，到12小时可收集血小板。用于测量AAP，纤维蛋白溶酶原，tPA Ag，uPA，PAI Ag，PAI Act，D-二聚体，Prot.CAct，Frag F1＋2和TAT复合物的血液(9倍体积)被收集在含3.8％柠檬酸钠(1倍体积)的vacutainer管中(Becton Dickinson，Ruther-ford，NJ)。用于测量t-PA Act的血液被收集在含有能通过封闭PAI对t-PA的抑制作用而稳定t-PA活性的低PH值柠檬酸抗凝剂的Biopool StabilyteTM管中(Bioppol，Umea，Sweden)。为了测量PAP复合物，可在硅化的vacutainer管中收集血液(Becton Dickin-son，Plymouth，England)，流管中加入了EDTA(终浓度为10mM)和大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma T-9003；终浓度为0.1mg/ml)以防止体外复合物的形成。使用含有K3-EDTA的试管收集血液作血小板计数。为了除血小板计数之外的所有测量，在15℃下经2000xg离心30分钟制备血浆，然后在-70℃下冷冻直至进行成批地评价。
使用流式细胞计数器(Technicon HI System，Technicon Instru-ment，Tarrytown，USA)测定血小板数目。用ELISA(BehringwerkeAG，Marburg，Germany)检测TAT复合物和Frag F1＋2的血浆水平[Teitel et al.，Blood，59：1086-1096(1982)]。结果分别表示为ng/ml和nmol/l。如Sturk等人在Clin.chim.Acta，165：263-270(1987)中的描述，用酰胺裂解试验检测C蛋白的活性。用酰胺裂解试验检测tPA Act[Verheijen et al.，Thromb.Haemostasis，48：266-269(1982)]。简单地说，将25ml血浆与0.1M TrisHCI，PH7.5，0.1％(v/v)吐温80，0.3mM S-2251(Kabi Haematology，MoIndal，Sweden)，0.13M纤维蛋白溶酶原和0.12mg/ml纤维蛋白原的溴化氰片段(Kabi Haematology，MoIndal，Sweden)混合至终体积为250ml。结果表示成IU/ml(世界卫生组织的第一国际标准)。
用酰胺裂解试验检测PAI Act[Chmielewska，et al.，Thromb.Res.，31：427-436(1983)]，试验中将样品与过量的组织型纤维蛋白溶酶原激活剂一起于室温保温10分钟。部分t-PA被样品中存在的PAI抑制，并形成无活性复合物。经随后与0.13μM纤维蛋白溶酶原(Kabi Haematology)，0.12mg/ml溴化氰消化的纤维蛋白原片段(t-PA刺激物，Kabi Haemotology)以及0.1mMS-2251(KabiHaematology)一起保温可检测残余的tPA活性。经产色性底物的转换所测得的，保温混合物中产生的纤维蛋白溶酶的量，正好与样品中PAI Act或反比。所测得样品的结果与在血浆中排除了PAI Act(Kabi Haematology)但加入了固定量的t-PA的样品结果相关。结果均表示成国际单位(IU)。此外1IU是能抑制1IUt-PA的PAIAct的量。
用ELISA’s[Holvoet et al.，Thromb.Haemostasis，54：684(1985)]分析t-PA Ag和PAI Ag。(Asserachrom t-PA，Diag-mostica Stago，Asnieres-sur-Seine，France and PAI-ELISA Kit，monozyme，Charlottenlund，Denmark，respertively)。结果表示为ng/ml。用夹心ELISA测UPA[Binbema et al.，Thromb.Res.，43：569(1986)]。该试验测定血浆中存在的尿激酶抗原，不考虑它的分子形式，即前尿激酶，活性尿激酶和与抑制物或复合物的尿激酶；结果表示成ng/ml。用自动酰胺裂解技术检测纤维蛋白溶酶原活性和AAP，该技术根据的是Peeters等人在Thromb.Res.，28：773(1982)中所述的方法。结果表示为正常值的百分率。用ELISA测D-二聚体(Asserachrom D-Di，Diagnostica Stago，Asnieres-sur Serne，France)[Elms et al.，Thromb.Hacmostasis，50：591(1983)]，结果表示为mg/ml。用Levi等人在J.Clin.Invest.88：1155-1160(1991)中所述的RIA(放射免疫分析——译者注)来检测PAP复合物。简而言之，抗灭活的和复合的α2-抗纤维蛋白溶酶的特异性的单克隆抗体，被结合在Sepharose珠上，再与血浆样品一起保温。用磷酸盐缓冲盐水洗Sepharose后，将所结合的复合物再与经125I标记的抗纤维蛋白溶酶的单克隆抗体一起保温。再次洗涤后，测Sepharose结合的放射性。作为标准，将系列稀释的血浆，[其中有经与双链的尿激酶(choay，Paris，France)一起保温后产生了最大量的PAP复合物]在温育前用甲胺灭活α2-巨球蛋白后投入使用，结果以nmol/L表示。
对这些分析结果的统计分析(如实施例1所述)反应在表5和表6。组织纤维蛋白溶酶原激活物抗原(t-PA Ag)，组织纤维蛋白溶酶原激活物活性(t-PA Act)，组织纤维蛋白溶酶原激活物抑制物抗原(PAI Ag)，α2-纤维蛋白溶酶抑制物——纤维蛋白溶酶(PAP)复合物，尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活物(uPA)和凝血酶/抗凝血酶III(TAT)复合物，它们的平均值±SEM结果分别图示在图12，13，14，15，16，17中。
                                表5
                            纤维蛋白溶解
参数 AUC小时   AUC变化百分率的中位数 P-值a 统计学意义b
  α2-antipl   0-10    -3％    .95  不显著
   d-二聚体   0-10   -45％    .31  不显著
 组织纤维蛋白溶酶原   0-10   -10％    .20  不显著
   PAI活性   2-10   -51％   .0304c  不显著
  PAP复合体   0-10   -51％   .0078   显著
     uPA   0-10   -50％   .0078   显著
    PAI Ag   2-10   -52％   .0078   显著
    tPA Ag   1-10   -79％   .0078   显著
   tPA活性    1-6   -57％   .0078   显著
a.比较每个受试者中rBPI23对安慰剂AUC的P-值(Wilcoxon标记的等级试验)。
b.按Hochberg方法确定的统计学意义(S指显著，NS指不显著)。
c.阶段效应的计算。
                         表6
                         凝集
参数 AUC小时   AUC变化百分率的中位数 P-值a 统计学意义b
 C蛋白活性   0-10   -21％    .64  不显著
   F1＋2   1-10   -31％  .0391  不显著
 TAT复合物   1-10   -36％  .0078   显著
注：a.比较每个受试者中rBPI23对安慰剂AUC的P-值(Wilcoxon标记的等级试验)。
b.按Hochberg方法确定的统计学意义(S指显著，NS指不显著)。
本研究中，内毒素诱发了凝集系统的活化，这与Van Deventer etal.，Supra，and Levi et al.，J.Clin.Invest.，93：114(1994)是一致的。具体地说，灌注内毒素导致TAT复合物和凝血酶原片段F1+2的血浆水平分别增长7.3倍和7.4倍。TAT复合物的平均水平从5.5±1.4ng/ml升至40.0±5.3ng/ml，在灌注内毒素3小时后达到峰值，随后又逐渐下降(图17)。F1＋2血浆水平在灌注内毒素4小时后达到其峰值(从0.78±0.10nmol/L升至5.77±1.27nmol/L)。C蛋白活性的血浆水平未见有显著变化。
灌注rBPI23导致内毒素诱导的凝血酶产生显著减少。具体是，F1＋2水平在联合灌注内毒素和rBPI23后相对于单独灌注内毒素，最高水平为3.30±0.39nmol/L；最高的在联合使用内毒素和rBPI23治疗后TAT复合物水平为30.8±6.9ng/ml(图17)。用rBPI23治疗对C蛋白活性的血浆水平没有影响(表6)。TAT复合物的AUC在经rBPI23治疗后明显降低(中位值降低率36％，P＝0.0078)(表6)。F1＋2的AUC在经rBPI23治疗后也降低；但依据Hochberg，Supra的方法，这种影响并没有意义(中位值降低率为31％，P＝0.0391)。
在两种治疗小组中血小板计数均减少，安慰疗法中从206.5±15.0×1012的基线水平降至4小时后的181.6±13.2×1012，用rBPI23治疗后从190.4±16.9×1012降至6小时后174.8±10.7×1012(导致AUC的减小率为7％，P＝0.19)。
此外，本研究中，内毒素诱导纤维蛋白溶解系统先活化然后开始抑制，这与Suffredini等人在N.Engl，J.Ned，320：1165(1989)中的描述一致。纤维蛋白溶酶原激活活性从0.22±0.03IU/ml升至2.14±0.13IU/ml，在单独使用内毒素2小时后达到峰值。纤维蛋白溶酶原激活物活性的增长(图13)与t-PA抗原(图12)和u-PA抗原(图16)的增长相平行。t-PA抗原和u-PA抗原分别于3小时和2小时达到其峰值45.6±6.6ng/ml和6.0±0.5ng/ml。纤维蛋白溶酶原活性增高后产生了纤维蛋白溶酶，PAP-复合物水平(图15)和D-二聚体水平也相应增高，分别从4.61±0.38nmol/L增至2小时后的12.4±2.1nmol/L，和从217±117ng/ml增至10小时后的707±120ng/ml。在施用内毒素2小时后PAI活性和抗原的血浆水平(图14)仍保持不变。然后均在灌注4小时后出现一个迅速的增高，分别达到峰值34.5±2.6IU/ml和225.8±1.3ng/ml。PAI增高后t-PA活性于瞬间降低，而后产生纤维蛋白溶酶，PAP复合物水平也下降。由于在t-PA和u-PA抗原的分析中也测量了复合物中的纤维蛋白溶酶原激活物及其抑制物(即PAI)，故这些参数的值仅仅是逐步地降低。
同时施用rBPI23和内毒素导致内毒素诱导的纤维蛋白溶解活性实质上的减弱并推迟。纤维蛋白溶酶原激活物活性(0.61±0.2IU/ml)和t-PA抗原(16.4±6.7ng/ml)分别于3和4小时达到其峰值水平。联合施用内毒素与rBPI23时，未见u-PA抗原有任何增高。内毒素诱导的PAP复合物和D-二聚体的血浆水平增高也因rBPI23的灌注而大大减弱。PAP复合物和D-二聚体分别在3和10小时达其峰值水平：7.7±1.3nmol/l，531±119.5ng/ml。经内毒素诱导的PAI活性和抗原的增高也因同时施用rBPI23而被推迟，并有部分被抑制。PAI活性和抗原在灌注内毒素和rBPI23后6小时达到峰值水平。联合施用内毒素和rBPI23使PAI活性水平最高达22.6±2.9IU/ml，PAI抗原水平最高达122.9±22.0ng/ml。在经rBPI23治疗后t-PA活性，t-PA抗原，u-PA抗原，PAP复合物和PAI抗原的AUC显著下降(每种物质的P值均为0.0078，AUC下降率中位值从50％到79％变化不一，见表5)。经rBPI23治疗后，PAI活性的D-二聚体的AUC下降，但并不显著(中位值下降率51％，P＝0.0304；45％，P＝0.31，表5)。纤维蛋白溶酶原和α2抗纤维蛋白溶解的AUC在经rBPI23治疗后并无改变(表5)。
图12到图17中的安慰剂/内毒素治疗结果证实了对内毒素治疗存在协调的血清学反应，即在tPA水平上升后不久，因循环的纤维蛋白溶酶原激活物抑制物水平上升而使陡然降下来的tPA活性又猛增，此结果证明在这些相关的现象之间通过BPI蛋白产物的作用发生了协调性干涉作用。tPA的峰值降低并暂时性改变，而且可见tPA活性和循环的纤维蛋白溶酶原激活物抑制物水平相应地下降。如同循环的α2--纤维蛋白溶酶抑制物——纤维蛋白溶酶复合物(PAP)水平所暗示的那样，tPA对纤维蛋白溶酶原的活化作用也减弱。因而，本研究首次提出了对实验性内毒素血症病人体内由内毒素介导的循环tPA及其活性增高的干扰作用的实例。
                     实施例6
        防止内毒素诱发的肌活动过多性循环状态
对循环状态的评价按下述进行：用带有2.25MHz相控阵探针的ultramark9超声心动图仪(Advanced Technology Laboratories CBoth-ell，WA)进行超声心动图检测，该探针的特点是易操纵，脉冲多普勒型。所有受试者在安静状态下(基础状态)接受基础超声心电图研究，包括M-型测量，自胸骨旁，自顶，自肋骨下视角的二维成像，彩色编码的多普勒成像和脉冲式多普勒测量。得到最佳的胸骨旁的和顶部的窗并标记在受试者皮肤上。观察到每位受试者所有获得的背景，样本容积大小和深度及多普勒输出背景，而且在每次测量中均被仔细地重复。第一次基础研究是在第一天灌注内毒素的几周前进行的。在每个灌注日，均在清晨灌注前1小时进行基础研究。第4次基础研究是在最后一次灌注后的4--6周后获得的。这4次超声心电图的平均值就组成了基底值。在做研究的那些天，在开始注射后的1.5，2.5，4，5，5，8，12小时时做如下测量：M-方式：左心室舒张期末直径(LVEDD)，左心室收缩基末直径(LVESD)。心室间间隔厚度(IVS)，左心室后壁厚度(LVPW)主动脉根(AO)的和左心房的(LA)尺寸大小，二尖瓣和主动脉的瓣膜运动的示踪。二维：标准的胸骨旁长轴和短轴视像，顶部和肋骨下视像均做了，从而可估计直径，壁的运动及二尖瓣、主动脉和三尖瓣瓣膜器官的外观。当主动脉瓣膜打开后，在早期收缩期静止结构的胸骨旁长轴视像中，仔细测量了比主动脉瓣膜约低1厘米处的左心室流出囊最窄处的直径。每个时间点至少做了6次测试。彩色多普勒：如果有二尖瓣瓣膜流量和三尖瓣瓣膜流量及回流量则均做了评估。脉冲式多普勒测定：在基础研究和研究日开始注射后的0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，6，8，10，12小时的时间点上从顶部窗口得到左心室流出囊中心位置的收缩期流量的脉冲式多普勒测量值。10次连续的多普勒流量示踪均记录在录相带上。心率、体温和血压也同时做了记录。
脱机研究完成后，从录相带上追踪出由Vi·ξt总数给出的以米计量的速率时间积分(VTI)或光谱区。从VTI追踪中还发现了最大速率Vmax。从10次搜索中得到平均埴。
分析结果所用的等式如下：
(1)左心室舒张期末容积
LVEDV＝(7.0/(2.4＋LVEDD))×LVEDD3)/100；
(2)左心室收缩期末容积
LVESV＝(7.0/(2.4＋LVESD))×LVESD3)/100；
(3)收缩比例
FS＝(LVEDD－LVESD)/LVEDD)×100；
(4)射血分数
EF＝(LVEDV－LVESV)/LVEDV)×100；
(5)交叉截面积
CSA＝π(D1va)2/4；
(6)心搏动容积
SV＝CSAxVTI×100；
(7)心输出量
CO＝SV×HR/1000
其中HR为心率(每分钟心跳次数)
(8)心脏指数
CI＝CO/BSA
其中BSA为体表面积；和
(9)体表面积
BSA＝(身高)0.725×(体重)0.425×(0.007184)
(10)系统性血管抗性指数(达因*秒/cm5per平方米)：
SVRI＝80*(平均动脉血压－6)/心脏指数
下表7中给出了主要的左心室功能参数，SVRI和CI的统计分析(如实施例1所述)的结果。SVRI和CI的数据分别示于图18和图19中。
                表7
          主要左心室功能
参数   AUC变化百分率的中位数a P-值b  统计学意义c
   SVRI   +28％  .0304d   显著
    CI   -13％  .0156   显著
a.从0至6小时计算所得的AUC
b.对每位受试者将rBPI23和安慰剂治疗相比较的P-值的效果(Wilcoxon标记的等级试验)
c.按提供给主要的分析参数的Hochberg法确定的统计学意义(S为显著，NS为不显著)
d.阶段效应的计算。
下表8给出了有关中位数的P值的变化率的数据，以对其他左心室功能参数进行次级(第二级)评估。
              表8
        相关的左心室功能
参数   AUC变化百分率的中位值a P-值b
    AO    -4％     .55
    CO    -11％     .0156
    EF    -10％     .64
    FS    -13％     .74
    HR    -27％     .0078
    IVS    +3％     .55
    LA    -15％     .38
   LVEDD    -4％     .95
   LVEDV    -4％     .84
   LVESD    +13％     .31c
   LVESV    +14％     .31c
   LVPW    +4％     .84
    SV    +9％     .15
    VTI    +1％     .55
a.从0至6小时计算所得的AUC
b.对每位受试者将rBPI23和安慰剂治疗相比较的P-值的效果(Wilcoxon标记的等级试验)
c.按提供给主要的分析参数的Hochberg法确定的统计学意义(S为显著，NS为不显著)
两种研究阶段心率均有增加，但rBPI23治疗阶段增加较少。在rBPI23治疗阶段，心率从0时的56±2次/分钟达到4.5小时后最高值77±5，6小时后又降至73±3，而在安慰剂治疗阶段，心率更快地从0时的61±5达到3.5小时后的最高值87±4，6小时后跌至75±3(从0到6小时AUC下降率为27％，P＝0.0078)。安慰剂期和rBPI23期初始心率的差别主要是因为同一受试者心率的不同，此人在灌注第一天(安慰剂)，很可能因为兴奋，分别在0时和0：30时就开始有87和74的心率，而第二天的0时又只有55的心率。
rBPI23治疗期的速率时间积分(VTI)显示在0：30小时和1小时时有增高，很可能与8位实验者中的6位出现发烧有关。rBPI23治疗期，VTI在0时为0.210±0.009m，0：30小时时为0.223±0.008m，在0：30小时时为0.222±0.006m。安慰剂治疗期，VTI在0时为0.203±0.008m，在0：30小时为0.207±0.006m，在1小时为0.201±0.007m。从5小时起，rBPI23期就一直保持较低的心率和较高的VTI。
在两种灌注期Vmax均显示有增大，但rBPI23治疗期增大得较少。Wilcoxon标记的等级试验测出AUC中位值，rBPI23的是1.15，安慰剂的是2.29，P＝0.061，由于在第1期和第2期之间存在残余影响，故只在第1期统计检验Vmax。rBPI23治疗期Vmax从0时的1.05±0.076m/s升到3：30小时的1.23±0.08m/s，安慰剂治疗期Vmax从0时的1.05±0.05m/s升至3：30小时的1.29±0.05m/s。左心室流出囊的流量图变化显示速率较高而排出时间较短，由此导致不变的VTI。
在每个时间点测了6次交叉截面积(CSA)，CSA的平均值并不随心率变化，每个受试者在一个灌注期所有测量到的CSA平均值被用作等式中的一个常数，此8人组的平均CSA是4.37±0.4cm2。
在两种研究期心脏指数均升高但灌注rBPI23可明显减少内毒素诱发的心脏指数升高(表7：AUC减少率13％，P＝0.0156)。对rBPI23治疗期而言，CI在0时为2.51±0.16(L/min/m2)，而且逐渐上升，到3：30小时为3.27±0.30。对安慰剂治疗组而言：CI在0时为2.64±0.18，3：30小时为3.98±0.27。4：30小时的时候，两种研究中心脏指数相对于基底值均升高了，并在12小时又逐渐回到基底值水平。
在两个研究期收缩期血压(SBP)，舒张期血压(OBP)和平均动脉血压(MAP)均下降，而且不受rBPI23灌注的影响。
在两个时期系统性血管抗性指数(SVRI)都显示出下降，但在rBPI23灌注期的下降显著减少(表7：AUC减少率28％，P＝0.304)。在安慰剂治疗期SVRI在基线时为2714.4±204.0，3小时后降至1633.8±88.5，而在rBPi23治疗期基线为2908.2±205.2，3小时后2056.0±145.2(图18)。
在两种治疗期的任何时间点经M-型超声心动图测出的舒张期末容积和收缩期末容积没有不同。平均舒张期末容积显示出逐步下降趋势，从基线的201±13ml到4小时后的在安慰剂期185±13ml，rBPI23期到188±11ml。收缩期末容积从基线的85±6ml到4小时后安慰剂期的74±9ml和rBPI23期的75±7ml。
M-型射血分数显示有轻微增长，从基线的56±0.9％，在rBPI23期4小时后到60±2.8％，12小时后到59±1％，而在安慰剂期4小时后到62±2.6％，12小时后到60±2.8％。缩小比例也显示有增长，从基线的33.1±0.7％，在rBPI23治疗期的4小时达36±2.3％，12小时达35±0.9％，而在安慰剂治疗期的4小时达38±2.7％，12小时达37±2.2％。
上述结果证明，用BPI蛋白产物治疗人体实验性内毒素血症，将导致在对循环中的内毒素反应中，左心室功能中的过度活动变化受到修饰，此修饰有统计学意义。BPI蛋白产物缓解了系统性血管抗性指数的降低和同时相伴而来的心脏指数升高，它们均是随着内毒素出现的。
在仔细考虑了上述例举的实施例及其目前较优选的实践后，本发明的其他很多方面的优点对于本领域的技术人员而言就显而易见了。例如，很明显，患革兰氏阴性细菌血症，意外注射经内毒素污染的液体或因从肠道转移而系统性释放内毒素的病人均能从服用BPI蛋白产物的实践中获得好处(通过，如连续静脉注射的方法)，以提供对内毒素介导的增高的血清学和血液学上可检验的减少，如循环的细胞因子和组织纤维蛋白溶酶原水平的增高，淋巴细胞数目的变化。同样很明显的是，BPI蛋白产物的使用将为接受抗生素治疗，并因抗生素导致细菌裂解而面临内毒素完全进入循环的状况的病人提供一种有利的辅助疗法。所以只有所附权利要求书中出现的这些规定应该包括在本发明中。
                 序列表(1)一般资料
(i)申请人：XOMA CORPORATTON
(ii)发明的题目：BPI蛋白产物的人类治疗性应用
(iii)序列数：2
(iv)通讯地址
(A)地址：Marshall，O’Toole，Gerstein，Murray&Borun
    (B)街：6300Sears Tower，233South Wacker Drive
    (C)城市：Chicago
    (D)州：IIIinois
    (E)国家：United States of America
    (F)邮编：60606-6402
(v)计算机可读形式
    (A)介质类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC compatible
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：Patentln Release#1.0，Version#1.25
(vi)现有申请数据：
    (A)申请号：
    (B)申请日：
    (C)分类：
(viii)代理人资料：
    (A)姓名：Michael F.Borun
    (B)注册号：25，447
    (C)参考/备案号：27129/32451
(ix)电讯资料：
    (A)电话：312/474-6300
    (B)电传：312/474-0448
    (C)电报：25-3856(2)SEQ ID NO：1的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：1813个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：CDNA
(ix)特征：
    (A)名称/关键词：CDS
    (B)位置：31..1491
(ix)特点：
    (A)名称/关键词：mat_肽
    (B)位置：124..1491
(ix)特征：
    (A)名称/关键词：misc_特征
    (B)其他资料：“rBPI”
(xi)SEQ ID NO：1序列描述CAGGCCTTGA GGTTTTGGCA GCTCTGGAGG ATG AGA GAG AAC ATG GCC AGG GGC        54
                             Met Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly
                             -31 -30                 -25CCT TGC AAC GCG CCG AGA TGG GTG TCC CTG ATG GTG CTC GTC GCC ATA        102Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp Val Ser Leu Met Val Leu Val Ala Ile
        -20                 -15                 -10GGC ACC GCC GTG ACA GCG GCC GTC AAC CCT GGC GTC GTG GTC AGG ATC        150Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val Asn Pro Gly Val Val Val Arg Ile
     -5                   1               5TCC CAG AAG GGC CTG GAC TAC GCC AGC CAG CAG GGG ACG GCC GCT CTG        198Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu10                  15                  20                  25CAG AAG GAG CTG AAG AGG ATC AAG ATT CCT GAC TAC TCA GAC AGC TTT        246Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile Lys Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe
             30                  35                  40AAG ATC AAG CAT CTT GGG AAG GGG CAT TAT AGC TTC TAC AGC ATG GAC        294Lys Ile Lys His Leu Gly Lys Gly His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp
         45                  50                  55ATC CGT GAA TTC CAG CTT CCC AGT TCC CAG ATA AGC ATG GTG CCC AAT        342Ile Arg Glu Phe Gln Leu Pro Ser Ser Gln Ile Ser Met Val Pro Asn
     60                  65                  70GTG GGC CTT AAG TTC TCC ATC AGC AAC GCC AAT ATC AAG ATC AGC GGG        390Val Gly Leu Lys Phe Ser Ile Ser Asn Ala Asn Ile Lys Ile Ser Gly
 75                  80                  85AAA TGG AAG GCA CAA AAG AGA TTC TTA AAA ATG AGC GGC AAT TTT GAC        438Lys Trp Lys Ala Gln Lys Arg Phe Leu Lys Met Ser Gly Asn Phe Asp90                  95                 100                 105CTG AGC ATA GAA GGC ATG TCC ATT TCG GCT GAT CTG AAG CTG GGC AGT        486Leu Ser Ile Glu Gly Met Ser Ile Ser Ala Asp Leu Lys Leu Gly Ser
            110                 115                 120AAC CCC ACG TCA GGC AAG CCC ACC ATC ACC TGC TCC AGC TGC AGC AGC        534Asn Pro Thr Ser Gly Lys Pro Thr Ile Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser
        125                 130                 135CAC ATC AAC AGT GTC CAC GTG CAC ATC TCA AAG AGC AAA GTC GGG TGG        582His Ile Asn Ser Val His Val His Ile Ser Lys Ser Lys Val Gly Trp
    140                 145                 150CTG ATC CAA CTC TTC CAC AAA AAA ATT GAG TCT GCG CTT CGA AAC AAG        630Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys Ile Glu Ser Ala Leu Arg Asn Lys
155                 160                 165ATG AAC AGC CAG GTC TGC GAG AAA GTG ACC AAT TCT GTA TCC TCC AAG        678Met Asn Ser Gln Val Cys Glu Lys Val Thr Asn Ser Val Ser Ser Lys170                 175                 180                 185CTG CAA CCT TAT TTC CAG ACT CTG CCA GTA ATG ACC AAA ATA GAT TCT        726Leu Gln Pro Tyr Phe Gln Thr Leu Pro Val Met Thr Lys Ile Asp Ser
            190                 195                 200GTG GCT GGA ATC AAC TAT GGT CTG GTG GCA CCT CCA GCA ACC ACG GCT         774Val Ala Gly Ile Asn Tyr Gly Leu Val Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala
        205                 210                 215GAG ACC CTG GAT GTA CAG ATG AAG GGG GAG TTT TAC AGT GAG AAC CAC         822Glu Thr Leu Asp Val Gln Met Lys Gly Glu Phe Tyr Ser Glu Asn His
    220                 225                 230CAC AAT CCA CCT CCC TTT GCT CCA CCA GTG ATG GAG TTT CCC GCT GCC         870His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro Pro Val Met Glu Phe Pro Ala Ala
235                 240                 245CAT GAC CGC ATG GTA TAC CTG GGC CTC TCA GAC TAC TTC TTC AAC ACA         918His Asp Arg Met Val Tyr Leu Gly Leu Ser Asp Tyr Phe Phe Asn Thr250                 255                 260                 265GCC GGG CTT GTA TAC CAA GAG GCT GGG GTC TTG AAG ATG ACC CTT AGA         966Ala Gly Leu Val Tyr Gln Glu Ala Gly Val Leu Lys Met Thr Leu Arg
            270                 275                 280GAT GAC ATG ATT CCA AAG GAG TCC AAA TTT CGA CTG ACA ACC AAG TTC        1014Asp Asp Met Ile Pro Lys Glu Ser Lys Phe Arg Leu Thr Thr Lys Phe
        285                 290                 295TTT GGA ACC TTC CTA CCT GAG GTG GCC AAG AAG TTT CCC AAC ATG AAG        1062Phe Gly Thr Phe Leu Pro Glu Val Ala Lys Lys Phe Pro Asn Met Lys
    300                 305                 310ATA CAG ATC CAT GTC TCA GCC TCC ACC CCG CCA CAC CTG TCT GTG CAG        1110Ile Gln Ile His Val Ser Ala Ser Thr Pro Pro His Leu Ser Val Gln
315                 320                 325CCC ACC GGC CTT ACC TTC TAC CCT GCC GTG GAT GTC CAG GCC TTT GCC        1158Pro Thr Gly Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Val Asp Val Gln Ala Phe Ala330                 335                 340                 345GTC CTC CCC AAC TCC TCC CTG GCT TCC CTC TTC CTG ATT GGC ATG CAC        1206Val Leu Pro Asn Ser Ser Leu Ala Ser Leu Phe Leu Ile Gly Met His
            350                 355                 360ACA ACT GGT TCC ATG GAG GTC AGC GCC GAG TCC AAC AGG CTT GTT GGA        1254Thr Thr Gly Ser Met Glu Val Ser Ala Glu Ser Asn Arg Leu Val Gly
        365                 370                 375GAG CTC AAG CTG GAT AGG CTG CTC CTG GAA CTG AAG CAC TCA AAT ATT        1302Glu Leu Lys Leu Asp Arg Leu Leu Leu Glu Leu Lys His Ser Asn Ile
    380                 385                 390GGC CCC TTC CCG GTT GAA TTG CTG CAG GAT ATC ATG AAC TAC ATT GTA        1350Gly Pro Phe Pro Val Glu Leu Leu Gln Asp Ile Met Asn Tyr Ile Val
395                 400                 405CCC ATT CTT GTG CTG CCC AGG GTT AAC GAG AAA CTA CAG AAA GGC TTC        1398Pro Ile Leu Val Leu Pro Arg Val Asn Glu Lys Leu Gln Lys Gly Phe410                 415                 420                 425CCT CTC CCG ACG CCG GCC AGA GTC CAG CTC TAC AAC GTA GTG CTT CAG        1446Pro Leu Pro Thr Pro Ala Arg Val Gln Leu Tyr Asn Val Val Leu Gln
            430                 435                 440CCT CAC CAG AAC TTC CTG CTG TTC GGT GCA GAC GTT GTC TAT AAA            1491Pro His Gln Asn Phe Leu Leu Phe Gly Ala Asp Val Val Tyr Lys
        445                 450                 455TGAAGGCACC AGGGGTGCCG GGGGCTGTCA GCCGCACCTG TTCCTGATGG GCTGTGGGGC      1551ACCGGCTGCC TTTCCCCAGG GAATCCTCTC CAGATCTTAA CCAAGAGCCC CTTGCAAACT      1611TCTTCGACTC AGATTCAGAA ATGATCTAAA CACGAGGAAA CATTATTCAT TGGAAAAGTG      1671CATGGTGTGT ATTTTAGGGA TTATGAGCTT CTTTCAAGGG CTAAGGCTGC AGAGATATTT      1731CCTCCAGGAA TCGTGTTTCA ATTGTAACCA AGAAATTTCC ATTTGTGCTT CATGAAAAAA      1791AACTTCTGGT TTTTTTCATG TG                                               1813(2)SEQ ID NO：2的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：487氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)SEQ ID NO：2的序列描述Met Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp Val-31 -30                 -25                 -20Ser Leu Met Val Leu Val Ala Ile Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val-15                 -10                  -5                   1Asn Pro Gly Val Val Val Arg Ile Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala
          5                  10                  15Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile Lys
     20                  25                  30Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe Lys Ile Lys His Leu Gly Lys Gly
 35                  40                  45His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp Ile Arg Glu Phe Gln Leu Pro Ser50                  55                  60                  65Ser Gln Ile Ser Met Val Pro Asn Val Gly Leu Lys Phe Ser Ile Ser
             70                  75                  80Asn Ala Asn Ile Lys Ile Ser Gly Lys Trp Lys Ala Gln Lys Arg Phe
         85                  90                  95Leu Lys Met Ser Gly Asn Phe Asp Leu Ser Ile Glu Gly Met Ser Ile
    100                 105                 110Ser Ala Asp Leu Lys Leu Gly Ser Asn Pro Thr Ser Gly Lys Pro Thr
115                 120                 125Ile Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser His Ile Asn Ser Val His Val His130                 135                 140                 145Ile Ser Lys Ser Lys Val Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys
            150                 155                 160Ile Glu Ser Ala Leu Arg Asn Lys Met Asn Ser Gln Val Cys Glu Lys
        165                 170                 175Val Thr Asn Ser Val Ser Ser Lys Leu Gln Pro Tyr Phe Gln Thr Leu
    180                 185                 190Pro Val Met Thr Lys Ile Asp Ser Val Ala Gly Ile Asn Tyr Gly Leu
195                 200                 205Val Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala Glu Thr Leu Asp Val Gln Met Lys210                 215                 220                 225Gly Glu Phe Tyr Ser Glu Asn His His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro
            230                 235                 240Pro Val Met Glu Phe Pro Ala Ala His Asp Arg Met Val Tyr Leu Gly
        245                 250                 255Leu Ser Asp Tyr Phe Phe Asn Thr Ala Gly Leu Val Tyr Gln Glu Ala
    260                 265                 270Gly Val Leu Lys Met Thr Leu Arg Asp Asp Met Ile Pro Lys Glu Ser
275                 280                 285Lys Phe Arg Leu Thr Thr Lys Phe Phe Gly Thr Phe Leu Pro Glu Val290                 295                 300                 305Ala Lys Lys Phe Pro Asn Met Lys Ile Gln Ile His Val Ser Ala Ser
            310                 315                 320Thr Pro Pro His Leu Ser Val Gln Pro Thr Gly Leu Thr Phe Tyr Pro
        325                 330                 335Ala Val Asp Val Gln Ala Phe Ala Val Leu Pro Asn Ser Ser Leu Ala
    340                 345                 350Ser Leu Phe Leu Ile Gly Met His Thr Thr Gly Ser Met Glu Val Ser
355                 360                 365Ala Glu Ser Asn Arg Leu Val Gly Glu Leu Lys Leu Asp Arg Leu Leu370                 375                 380                 385Leu Glu Leu Lys His Ser Asn Ile Gly Pro Phe Pro Val Glu Leu Leu
            390                 395                 400Gln Asp Ile Met Asn Tyr Ile Val Pro Ile Leu Val Leu Pro Arg Val
        405                 410                 415Asn Glu Lys Leu Gln Lys Gly Phe Pro Leu Pro Thr Pro Ala Arg Val
    420                 425                 430Gln Leu Tyr Asn Val Val Leu Gln Pro His Gln Asn Phe Leu Leu Phe
435                 440                 445Gly Ala Asp Val Val Tyr Lys450                 455

Claims (20)

1.一种治疗循环中出现细菌内毒素的病人的方法，包括施用有效量的BPI蛋白产物以缓解内毒素介导的循环肿瘤坏死因子和白细胞介素6的增加。
2.一种治疗循环中出现细菌内毒素的病人的方法，包括施用有效量的BPI蛋白产物以缓解内毒素介导的循环白细胞介素8的增高，和以循环乳铁蛋白和/或弹性蛋白酶α1抗胰蛋白复合物的增高为特征的中性粒细胞脱颗粒作用的加强。
3.一种治疗循环中出现细菌内毒素的病人的方法，包括施用有效量的BPI蛋白产物以缓解内毒素介导的循环淋巴细胞数的改变。
4.一种治疗循环中出现细菌内毒素的病人的方法，包括施用有效量的BPI蛋白产物以缓解内毒素介导的循环组织纤维蛋白溶酶原激活物和组织纤维蛋白溶酶原激活物活性的增加。
5.一种治疗循环中出现细菌内毒素的病人的方法，包括施用有效量的BPI蛋白产物以缓解内毒素介导的系统性血管抗性指数下降。
6.在涉及施用细菌抗生素的人类治疗方法中，改进包括施用有效量的BPI蛋白产物以缓解内毒素介导的循环肿瘤坏死因子和白细胞介素6的增加。
7.在涉及施用细菌抗生素的人类治疗方法中，改进包括施用有效量的BPI蛋白产物以缓解内毒素介导的循环白细胞介素8的增高，和以循环乳铁蛋白和/或弹性蛋白酶/α1抗胰蛋白酶复合物增高为特征的中性粒细胞脱颗粒作用的下降。
8.在涉及施用细菌抗生素的人类治疗方法中，改进包括施用有效量的BPI蛋白产物以缓解内毒素介导的循环淋巴细胞数目的变化。
9.在涉及施用细菌抗生素的人类治疗方法中，改进包括施用有效量的BPI蛋白产物以缓解内毒素介导的循环的组织纤维蛋白溶酶原激活物和组织纤维蛋白溶酶原激活物活性的增加。
10.在涉及施用细菌抗生素的人类治疗方法中，改进包括施用有效量的BPI蛋白产物以缓解内毒素介导的系统性血管抗性指数下降。
11.在制药中应用BPI蛋白产物以缓解体内循环中有细菌内毒素的病人由内毒素介导的循环肿瘤坏死因子和白细胞介素6的上升。
12.在制药中应用BPI蛋白产物以缓解体内循环中有细菌内毒素的病人由内毒素介导的循环白细胞介素8的增加和以循环乳铁蛋白和/或弹性蛋白酶/α1抗胰蛋白酶复合物增加为特征的中性粒细胞脱颗粒作用的增强。
13.在制药中应用BPI蛋白产物以缓解体内循环中有细菌内毒素的病人由内毒素介导的循环淋巴细胞数目的改变。
14.在制药中应用BPI蛋白产物以缓解体内循环中有细菌内毒素的病人由内毒素介导的循环组织纤维蛋白溶酶原激活物和组织纤维蛋白溶酶原激活物活性的升高。
15.在制药中应用BPI蛋白产物以缓解体内循环中有细菌内毒素的病人由内毒素介导的系统性血管抗性指数下降。
16.在制药中联合应用BPI蛋白产物和细菌抗生素以缓解体内循环中有细菌内毒素的病人由内毒素介导的循环肿瘤坏死因子和白细胞介素6的增加。
17.在制药中联合应用BPI蛋白产物和细菌抗生素，以缓解循环中有细菌内毒素的病人由内毒素介导的循环白细胞介素8增高，和以循环乳铁蛋白和/或弹性蛋白酶/α1抗胰蛋白酶复合物增加为特征的中性粒细胞脱颗粒作用增强。
18.在制药中联合应用BPI蛋白产物和细菌抗生素，以缓解循环中有细菌内毒素的病人由内毒素介导的淋巴细胞数的改变。
19.在制药中联合应用BPI蛋白产物和细菌抗生素，以缓解循环中出现细菌内毒素的病人由内毒素介导的循环组织纤维蛋白溶酶原激活物和组织纤维蛋白溶酶原激活物活性的增高。
20.在制药中联合应用BPI蛋白产物和细菌抗生素，以缓解循环中出现细菌内毒素的病人因细菌内毒素所致的系统性血管抗性指数的下降。
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