CN114496090A - 一种基于核酸杂交的dna分子逻辑门 - Google Patents

一种基于核酸杂交的dna分子逻辑门 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于核酸杂交的DNA分子逻辑门。本发明具体提供一种基于核酸杂交的DNA分子逻辑门，包括：输入信号、信号转化单元和输出信号，所述输入信号包括：至少两种DNA输入链；所述信号转化单元包括：底物链；所述输出信号包括：核酸扩增结果。本发明基于DNA自组装，为DNA计算机基本原理的构建提供了一种简单可行的方案。

Description

一种基于核酸杂交的DNA分子逻辑门
技术领域
本发明属于分子计算技术领域，具体涉及一种基于核酸杂交的DNA分子逻辑门。
背景技术
基于分子生物的计算机创建引起了人们的广泛关注，尤其在合成生物学领域。
计算设备主要包括算法逻辑单元、控制单元、存储器、输入和输出设备。布尔逻辑和逻辑门是其中运行的核心，生物计算机若想成为现实，那么生物分子逻辑门的构建就是必须的。
目前随着复杂的生物学工具被开发出来，基于核酸和蛋白质的逻辑系统也已经产生出来了，而基于DNA和RNA的催化剂和逻辑门也已被提出作为合成化学电路的通用组件，并应用于医疗治疗、纳米技术和化学反应嵌入式控制等方面。这一方向的进展将取决于三个领域的进展：1、开发DNA电路与生物相关分子、DNA纳米机器和常规化学之间的输入/输出接口；2、发展DNA电路构建技术，扩大规模，以便系统地创建大型电路；3、将DNA编程方法扩展到分子和宏观尺度的空间结构之外。
算法逻辑单元是执行逻辑运算的复杂设备，它包括三个部分详细功能：感应输入，处理输入信息以进行决策以及执行输出。
为此，基于生物学的算法逻辑单元具有内置传感器，可以接收各种环境因素产生的输入信号。具体而言，质膜及其整合的受体可以感应压力，渗透压，细胞内接触，温度和化学物质。同时，活性氧、pH、营养素、信号转导因子和其他内部状态指标由内部受体记录。在任何给定时间将单个环境输入或它们中的许多组合的变化程度呈现给单元，从而产生了大量输入信息集。细胞连续处理大量输入信号，以决定其适当的反应，从而导致基因表达、酶活性和信号网络重新连接变化。该决策过程以迁移，增长或分裂以及程序化细胞死亡作为输出信息的形式表现出来。除了上述这些元素外，DNA也可以构成逻辑单元。
DNA是一种性能稳定的生物分子，可用于构建分子计算系统。特别是DNA逻辑电路在可扩展性和计算正确性方面表现出了良好的性能。然而，以前的DNA逻辑电路架构有两个局限性。首先，计算速度很慢，通常需要数小时才能计算出一个简单的函数。第二，电路对于DNA链的数量是高度复杂的。例如，最早提出DNA加法的是Guarnieri，他利用引物延伸反应完成了2位二进制加法。其后陆续出现了其他的DNA加法算法运算方案，如Wasiewicz的加法和统一标识法方案、Barua的递归方案等。这些算法都有一个缺陷：它们的实验步骤是线性叠加的。这意味着实验步骤会随加法位数的增加而增加，到最后会导致无法在实验室中进行下去。当然也有一些实验步骤不变的方案，但是其在实验上较为复杂，只能在理论上实现。后来Hug等人提出了在DNA芯片上操作的DNA计算法，可以并行实行，但是该实验会耗费相当长的时间，并且不一定能在芯片表面完成进位加法。最近，有研究设计的一些方案来加快DNA逻辑电路的速度，包括使用局部DNA电路和无泄漏链置换。然而，这两种方法都需要对DNA折纸或门进行非常多的额外工作，这增加了设计、操作和链的复杂性。所以，设计一种即不会增加实验步骤又能运算多位二进制的DNA加法很重要。
发明内容
为此，本发明的目的是提供一种基于核酸杂交的DNA分子逻辑门。
本发明第一方面提供一种基于核酸杂交的DNA分子逻辑门，包括：输入信号、信号转化单元和输出信号，
所述输入信号包括：至少两种DNA输入链；
所述信号转化单元包括：底物链，包含加数链A0链、Ai链、Ae链和被加数链Bi链，其中i＝1,2,3…n，n为大于1的正整数，通过核酸(底物链和输入链)的杂交和扩增对输入信号进行逻辑运算，输出逻辑运算结果；
所述输出信号包括：核酸扩增结果，
其中，
Ai的3’端a2i个序列与Bi的3’端a2i个序列互补，Bi的5’端a2i+1个序列与Ai+1的5’端a2i+1个序列互补，Bi-1的5’端a2i-1个序列与Ai的5’端a2i-1个序列互补，Bn的5’端c个序列与Ae的5’端c个序列互补，使得加数链Ai链、Ae链和被加数链Bi链能交错互补以i＝1,2,3…n的顺序形成带有缺口的双链，
A0的5’端和Ae的3’端分别与引物互补，
数值c和各a分别各自独立为大于或等于5的正整数，并且a2i-1+a2i≤Ai的全长碱基数，且a2i+a2i+1≤Bi的全长碱基数。
在一个或多个实施方案中，a2i+a2i+1比Bi的全长碱基数少0、少1、少2、少3、少4或少5。
在一个或多个实施方案中，a2i-1+a2i比Ai的全长碱基数少0、少1、少2、少3、少4或少5。
在一个或多个实施方案中，A0链与可检测标记偶联，优选与生物素偶联。
在一个或多个实施方案中，c、各a分别各自独立为5-40的正整数，优选为10-20的正整数，更优选为20。
在一个或多个实施方案中，上述DNA分子逻辑门中，所述DNA分子逻辑门为AND门，所述AND门中：
A0的3’端的a0个序列与第一输入链的3’端a0个序列互补，第一输入链的5’端b个序列和第二输入链的3’端b个序列互补，第二输入链的5’端a1个序列互补与A1的5’端a1个序列互补，通过底物链和输入链的杂交和扩增对输入信号进行逻辑运算，输出逻辑运算结果。
在一个或多个实施方案中，a0、a1、b各自独立为5-40的正整数，优选为10-20的正整数。
在一个或多个实施方案中，上述DNA分子逻辑门中，所述DNA分子逻辑门为OR门，所述OR门中：
所述底物链还包括连接链L0和L1，并且A0分为A0I和A0II，
A0I的3’端的a0个序列与第一输入链的3’端a0个序列互补，第一输入链的5’端b个序列与L0的3’端b个序列互补，L0的5’端a1个序列互补与A1的5’端a1个序列互补，
A0II的3’端的a0’个序列与第二输入链的3’端a0’个序列互补，第二输入链的5’端b’个序列与L1的3’端b’个序列互补，L1的5’端a1’个序列互补与A1的5’端a1’个序列互补，
第一输入链与L1不互补，第二输入链与L0不互补，
通过底物链和输入链的杂交和扩增对输入信号进行逻辑运算，输出逻辑运算结果。
在一个或多个实施方案中，a0、a0’、a1、a1’、b各自独立为5-40的正整数，优选为10-20的正整数。
在一个或多个实施方案中，上述DNA分子逻辑门中，所述DNA分子逻辑门为NAND门，所述NAND门中：
所述底物链还包括被加数链B0I和B0II，并且A1分为A1I和A1II，
B0I的3’端的a0个序列与A0的3’端的a0个序列互补，B0II的3’端的a0’个序列与A0的3’端的a0’个序列互补，B0I的3’端的a0个序列和B0II的3’端的a0’个序列具有至少90％相同性(优选99％或完全相同)，
B0I的5’端的a1个序列与A1I的5’端的a1个序列互补，B0II的5’端的a1’个序列与A1II的5’端的a1’个序列互补，并且A1I的5’端a1个序列和A1II的5’端a1’个序列具有至少90％相同性(优选99％或完全相同)，
A1I的3’端的a2i个序列与B1的3’端的a2i个序列互补，
A1II的3’端的a2i’个序列与B1的3’端的a2i’个序列互补，
B0I优先与第一输入链而非与A0和A1I杂交，并且B0I与第二输入链不杂交；优选地，B0I与第一输入链至少70％(优选80％、90％，更优选98％)互补，
B0II优先与第一输入链而非与A0和A1II杂交，并且B0II与第一输入链不杂交；优选地，B0II与第二输入链至少70％(优选80％、90％，更优选98％)互补，
通过底物链和输入链的杂交和扩增对输入信号进行逻辑运算，输出逻辑运算结果。。
在一个或多个实施方案中，a0、a0’、a1、a1’、a2i、a2i’各自独立为5-40的正整数，优选为10-20的正整数。
在一个或多个实施方案中，a0与a0’相等或不等。
在一个或多个实施方案中，a1与a1’相等或不等。
在一个或多个实施方案中，a2i与a2i’相等或不等。
在一个或多个实施方案中，所述信号转化单元还包括选自以下试剂的一种或多种：磷酸化酶、连接酶、聚合酶、dNTP和缓冲液。
所述连接酶能将各加数链相连和/或将各被加数链相连。
本发明第二方面还提供一种含有本文任一实施方案所述的DNA分子逻辑门的DNA电路。
本发明第三方面还提供本文任一实施方案所述的DNA分子逻辑门或DNA电路在生物检测、分子计算或制备电路纳米器件中的应用。
本发明第四方面还提供一种本文任一实施方案所述的DNA分子逻辑门的构建方法，包括如下步骤：
任选的1)将底物链磷酸化，任选将所述输入链和/或连接链磷酸化，
2)将输入链和底物链等比例混合，并退火，组装为带缺口的DNA双链，
3)将DNA双链的缺口补齐，获得完整的DNA双链，
4)使用引物进行扩增，输出信号为扩增的DNA双链。
在一个或多个实施方案中，所述输入链、底物链如本发明第一方面任一实施方案所述。
本发明有益效果为：
本发明基于DNA自组装，实验步骤简单易操作，为DNA计算机基本原理的构建提供了一种简单可行的方案。
附图说明
图1为AND门构建示意图。其中Endgroup指示Ae链。
图2为OR门构建示意图。其中Endgroup指示Ae链。
图3为NAND门构建示意图。其中Endgroup指示Ae链。
具体实施方式
为了减轻上面详细描述的限制，生物计算机的架构需要某些特性。首先，逻辑门应该有非常低的容错率(意外反应)，这样信号扩增的步骤是最小的；其次，应该避免带有多种DNA复合物的逻辑门，因为这种DNA复合物增加了链的复杂性，与简单的DNA结构(如单链)相比，更容易因序列设计和纯化的不完善而出错。
本发明首先提供一种基于核酸杂交的DNA分子逻辑门，包括：输入信号、信号转化单元和输出信号，
所述输入信号包括：至少两种DNA输入链ss1和ss2；
所述信号转化单元包括：底物链，包含加数链A0链、Ai链、Ae链和被加数链Bi链，其中i＝1,2,3…n，n为大于1的正整数，通过核酸的杂交和扩增(例如底物链和输入链的杂交和扩增)对输入信号进行逻辑运算，输出逻辑运算结果；
所述输出信号包括：核酸扩增结果，
其中，
Ai的3’端a2i个序列与Bi的3’端a2i个序列互补，Bi的5’端a2i+1个序列与Ai+1的5’端a2i+1个序列互补，Bn的5’端c个序列与Ae的5’端c个序列互补，使得加数链Ai链、Ae链和被加数链Bi链能交错互补以i＝1,2,3…n的顺序形成带有缺口的双链，
A0的5’端和Ae的3’端分别与引物互补。
上述各a的数值、c的数值各自独立为大于或等于5的正整数，例如5-40的正整数，优选为10-20的正整数，更优选为20。
通常，a2i-1+a2i≤Ai的全长碱基数，且a2i+a2i+1≤Bi的全长碱基数。
在逻辑运行中，由于序列之间的互补关系，加数链和被加数链在混合后会杂交形成交错配对的带有缺口的双链形式。该双链的一条链为加数链A1、A2…An和Ae按顺序依次排列，各加数链之间具有缺口；另一条链为被加数链B0(若有)、B1、B2…Bn按顺序依次排列，各加数链之间具有缺口。Ai分别于Bi-1(若有)和Bi互补杂交，形成交错杂交的结构。如图1-3中的结果链所示。所述“缺口”是单链中的未连接部分，可以是相邻但是未连接的核酸分子之间的断开，也可以是缺失1-5个(优选1-3个，更优选1个)核苷酸，即，a2i+a2i+1比Bi的全长碱基数少0、少1、少2、少3、少4或少5，并且a2i-1+a2i比Ai的全长碱基数少0、少1、少2、少3、少4或少5。
此时，通过体系中的连接酶，双链中各单链的缺口通过形成核苷酸之间的连接键(例如3’,5’磷酸二酯键)而补齐。连接之前，各链(至少包括加数链)任选经过磷酸化处理，例如通过磷酸化酶。在某些实施方案中，至少将加数链磷酸化。当然，其他链也可以经磷酸化处理。
在缺口为缺失核苷酸的实施方案中，体系中还包含DNA聚合酶和dNTP，从而通过在缺口中依据DNA碱基配对原则补齐缺口。
因此，所述信号转化单元还包括选自以下试剂的一种或多种：磷酸化酶、连接酶、聚合酶、dNTP和缓冲液。适用于本文的各种酶和缓冲液是生物化学领域常用于DNA磷酸化、杂交、连接或PCR的酶和缓冲液，它们均市售可得，其浓度或比例可由本领域技术人员根据实验材料的情况(例如DNA链的含量)调节。优选地，磷酸化酶为核酸激酶(例如T4核酸激酶)、连接酶是DNA连接酶(例如T4 DNA连接酶)、聚合酶是DNA聚合酶。
通过如下所述的与门、或门或与非门，带有与引物配对序列的A0与上述双链结构连接或不连接，从而通过A0和Ae的引物配对序列进行DNA扩增(例如PCR)实现结果输出。
结果以是否存在扩增的结果链为依据。检测扩增的结果链的方法本领域熟知，例如琼脂糖凝胶电泳、测序。
与门(AND门)
如图1所示，输入单元(输入链)为ss1和ss2，转换单元包含底物链。A0的3’端的a0个序列与第一输入链ss1的3’端a0个序列互补，第一输入链ss1的5’端b个序列和第二输入链ss2的3’端b个序列互补，第二输入链ss2的5’端a1个序列互补与A1的5’端a1个序列互补。通过底物链和输入链的杂交和扩增对输入信号进行逻辑运算，输出逻辑运算结果。与上述各a的数值和c的数值类似，a0、a1、b各自独立为大于或等于5的正整数，例如5-40的正整数，优选为10-20的正整数，更优选为20。
当仅输入ss1(0,1)时，不能发生加法运算，没有信号输出；当仅输入ss2(1,0)时，不能发生加法运算，没有信号输出；当同时输入ss1和ss2时(1,1)，构成了加法运算的条件，生成了结果链，构成了信号输出，并能通过PCR扩增来放大信号。当仅输入ss1(0,1)时，不能发生加法运算，没有信号输出；当仅输入ss2(1,0)时，不能发生加法运算，真值表如下所示：
Figure BDA0003437368470000071
在一些实施方案中，两条输入链ss1和ss2各包含有底物链(加数链A0和A1)结合部分(H或CS)及连接互补(P)两个部分；ss1(0,1)＝H 0-P1，ss2(1,0)＝P 1-C1S0。
在n＝3的实施方案中，底物链包括：A0链(A0＝PrimerL-H0)，加数链A1＝C 1 S 0-H1、A2＝C 2 S 1-H2、A3＝C 3 S 2-H3，ENDGROUP(即Ae)＝C 4 S 3-PrimerR，被加数链B1＝H 1-C2S1、B2＝H 2-C3S2、B3＝H 3-C4S3。
在优选实施方案中，底物链包括：A0链(A0＝PrimerL-H0[0])，加数链A1＝C 1 S 0[00]-H1[0]、A2＝C 2 S 1[00]-H2[0]、A3＝C 3 S 2[00]-H3[1]，ENDGROUP(即Ae)＝C 4 S 3[10]-PrimerR，被加数链B1＝H 1[0]-C2S1[00]、B2＝H 2[0]-C3S2[00]、B3＝H 3[1]-C4S3[10]。示例性具体序列如表1所示。
本文中，H和CS后的中括号“[]”中的赋值是示例性的，仅用于区别不同序列，并不构成对各链及其序列的限制。
利用引物进行PCR扩增后，检测结果链的存在与否(例如通过琼脂糖凝胶电泳检测条带位置)，实现与门的输出。
或门(OR门)
如图2所示，输入单元(输入链)为ss3和ss4，转换单元包含底物链，与AND门不同的是，其中增加了两种连接链L0和L1以确保运算能够运行，并且A0分为两种链A0I和A0II。
A0I的3’端的a0个序列与第一输入链ss3的3’端a0个序列互补，第一输入链ss3的5’端b个序列与L0的3’端b个序列互补，L0的5’端a1个序列互补与A1的5’端a1个序列互补。A0II的3’端的a0’个序列与第二输入链ss4的3’端a0’个序列互补，第二输入链ss4的5’端b’个序列与L1的3’端b’个序列互补，L1的5’端a1’个序列互补与A1的5’端a1’个序列互补。第一输入链ss3与L1不互补，第二输入链与L0不互补。通过底物链(包括连接链)和输入链的杂交和扩增对输入信号进行逻辑运算，输出逻辑运算结果。与上述各a的数值和c的数值类似，a0、a0’、a1、a1’、b各自独立为大于或等于5的正整数，例如5-40的正整数，优选为10-20的正整数，更优选为20。
当仅输入ss3(0,1)时，能发生加法运算，产生信号输出；当仅输入ss2(1,0)时，能发生加法运算，产生信号输出；当同时输入ss1和ss2时(1,1)，也能发生加法运算，产生信号输出。真值表如下所示：
Figure BDA0003437368470000081
在一些实施方案中，两条输入链(ss3和ss4)各包含有底物链(A0I和A0II)结合部分(H或CS)及与连接链(L0和L1)的连接互补区(P)两个部分，ss3(0,1)＝H 0[0]-P1，ss4(1,0)＝H 0[1]-P0。
在n＝3的实施方案中，底物链包括：2种A0链(A0I＝PrimerL-H0[0]和A0II＝PrimerL-H0[1])，加数链A1＝C 1 S 0-H1、A2＝C 2 S 1-H2、A3＝C 3 S 2-H3，ENDGROUP(即Ae＝C 4 S 3-PrimerR)，被加数链B1＝H 1-C2S1、B2＝H 2[0]-C3S2、B3＝H 3-C4S3，连接链：L0＝P1-C1S0、L1＝P 0-C1S0。
在优选实施方案中，底物链包括：2种A0链(A0I＝PrimerL-H0[0]和A0II＝PrimerL-H0[1])，加数链A1＝C 1 S 0[00]-H1[0]、A2＝C 2 S 1[00]-H2[0]、A3＝C 3 S 2[00]-H3[1]，ENDGROUP(即Ae＝C 4 S 3[10]-PrimerR)，被加数链B1＝H 1[0]-C2S1[00]、B2＝H 2[0]-C3S2[00]、B3＝H 3[1]-C4S3[10]，连接链L0＝P1-C1S0[00]、L1＝P 0-C1S0[00]。示例性具体序列如表2所示。
因为底物中含有两种A0链(A0I和A0II)，所以当分别加入输入链ss3和ss4或者都加入时，都会产生DNA双链(结构链)。利用引物进行PCR扩增后，检测结果链的存在与否(例如通过琼脂糖凝胶电泳检测条带位置)，实现或门的输出。
与非门(NAND门)
如图3所示，输入单元(输入链)为ss5和ss6，转换单元包含进行运算的底物链，增加了两种B0链(B0I和B0II)以确保加法运算能够运行，并且A1分为两种链A1I和A1II。
B0I的3’端的a0个序列与A0的3’端的a0个序列互补，B0II的3’端的a0’个序列与A0的3’端的a0’个序列互补，B0I的3’端的a0个序列和B0II的3’端的a0’个序列具有至少90％相同性(优选99％或完全相同)。B0I的5’端的a1个序列与A1I的5’端的a1个序列互补，B0II的5’端的a1’个序列与A1II的5’端的a1’个序列互补，并且A1I的5’端a1个序列和A1II的5’端a1’个序列具有至少90％相同性(优选99％或完全相同)。A1I的3’端的a2i个序列与B1的3’端的a2i个序列互补。A1II的3’端的a2i’个序列与B1的3’端的a2i’个序列互补。通过底物链和输入链的杂交和扩增对输入信号进行逻辑运算，输出逻辑运算结果。
B0I优先与第一输入链而非与A0和A1I杂交，并且B0I与第二输入链不杂交；优选地，B0I与第一输入链至少70％(优选80％、90％，更优选98％)互补。同样地，B0II优先与第一输入链而非与A0和A1II杂交，并且B0II与第一输入链不杂交；优选地，B0II与第二输入链至少70％(优选80％、90％，更优选98％)互补。
与上述各a的数值和c的数值类似，a0、a0’、a1、a1’、a2i、a2i’各自独立为大于或等于5的正整数，例如5-40的正整数，优选为10-20的正整数，更优选为20。a0与a0’、a1与a1’、a2i与a2i’分别可以相等或不等。
当仅输入ss5(0,1)时，ss5与B0I(B0＝0)结合，但B0II(B0＝1)链可以运行加法运算，产生信号输出；当仅输入ss6(1,0)时，ss6与B0II(B0＝1)结合，但B0I(B0＝0)链可以运行运算，产生信号输出；当同时输入ss5和ss6时(1,1)，ss5和ss6分别与两种B0链结合，无法发生运算，无信号输出；当输入信号为(0,0)，即不加入ss5和ss6时，底物中的运算能够运行，能产生信号输出。真值表如下：
Figure BDA0003437368470000101
在一些实施方案中，ss5与B0I完全互补，即ss5(0,1)＝H0-C 1 S 0[00]；ss6与B0II完全互补，即ss6(1,0)＝H0-C 1 S 0[01]。
在n＝3的实施方案中，底物链包括：A0＝PrimerL-H0，加数链A1(A1I＝C 1 S 0[00]-H1和A1II＝C 1 S 0[01]-H1)、A2＝C 2S1-H2、A3＝C 3 S 2-H3，ENDGROUP(即Ae＝C 4 S 3-PrimerR)，被加数链B0(B0I＝H 0-C1S0[00]和B0II＝H 0-C1S0[01])、B1＝H 1-C2S1、B2＝H 2-C3S2、B3＝H 3-C4S3。
在优选实施方案中，底物链包括：A0＝PrimerL-H0[0]，加数链A1(A1I＝C 1 S 0[00]-H1[0]和A1II＝C 1 S 0[01]-H1[0])、A2＝C 2 S 1[00]-H2[0]、A3＝C 3 S 2[00]-H3[1]，ENDGROUP(即Ae＝C 4 S 3[10]-PrimerR)，被加数链B0(B0I＝H 0[0]-C1S0[00]和B0II＝H 0[0]-C1S0[01])、B1＝H 1[0]-C2S1[00]、B2＝H 2[0]-C3S2[00]、B3＝H 3[1]-C4S3[10]。示例性具体序列如表3所示。
当ss5和ss6同时加入时，因为ss5和ss6分别与两种B0链完全互补，所以会优先结合，而无法与其他的底物链结合，无法进行加法运算，故无法形成结果链。所以只有当ss5和ss6都不加入或仅加入1条时才会出现结果。利用引物进行PCR扩增后，检测结果链的存在与否(例如通过琼脂糖凝胶电泳检测条带位置)，实现与非门的输出。
在用上述逻辑门进行加法运算的过程中，各A0(包括A0I和A0II)或B0(包括B0I和B0II)可包括两条链A0和A0’中至少一条，A0和A0’分别对应于二进制的0和1；各加数链包括两条链Ai和Ai’中至少一条，Ai和Ai’分别对应于二进制的0和1；各被加数链包括两条链Bi和Bi’中至少一条，Bi和Bi’分别对应于二进制的0和1。
为了便于检测，任一条或多条加数链(例如A0链和/或Ae链)可以与可检测标记偶联，所述可检测标记可以是可视化标记例如荧光分子，或者偶联用标记例如生物素。核酸通过生物素可以与固相载体(例如磁珠)连接。所述磁珠优选为市售磁珠。
各核酸链的浓度通常小于或等于1mM，例如小于或等于10uM。本发明对输入链、底物链、连接链和生物素链等的具体序列没有特殊限定，能够满足本发明上述要求即可。
本发明第还提供DNA分子逻辑门的构建方法，包括如下步骤：任选的1)将底物链磷酸化，2)将输入链和底物链等比例混合，并退火，组装为带缺口的DNA双链，3)将DNA双链的缺口补齐，获得完整的DNA双链，和4)使用引物进行扩增，输出信号为扩增的DNA双链。所述输入链、底物链如本文具体实施方式中任一实施方案所述。步骤1)还可包括将所述输入链和/或连接链磷酸化。
将若干输入链、底物链、核酸激酶、DNA连接酶、缓冲液混合、退火、纯化获得所述逻辑门。缓冲液优选为DNA连接缓冲液。所述电路制备过程中还包括用水定容到固定体积。在本发明中，所述输入链的体积优选为10μL；所述底物链的体积优选为10μL；所述连接溶液的体积优选为20μL；核酸激酶的体积优选为1-10μL、DNA连接酶的体积优选为1-10μL。在本发明中，所述退火的温度优选为10～60℃；所述退火的时间优选为10min-2h，更优选为30min。在本发明中，所述纯化优选的采用DNA纯化试剂盒。在本发明具体实施过程中，优选的首先将所述若干输入链、底物链、核酸激酶、缓冲液混合进行磷酸化获得混合链；然后将所述混合链与DNA连接酶混合进行退火、连接形成DNA逻辑门基底。在本发明中，优选的对所述DNA逻辑门基底进行提纯，本发明对所述提纯的方法没有特殊限定，采用常规的DNA纯化方法即可。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
基于线性DNA自组装构建了三种逻辑门——AND门、OR门、NAND门，无需荧光检测。输入单元为两条40bp DNA单链，作为信号输入链1和2；转换单元为基于DNA自组装的加法运算，其中含有提供加法运算的DNA单链作为底物链；将加法运算得到200bp长链作为输出单元的输出信号，并用T1磁珠分离出带有生物素的200bp DNA双链，通过PCR扩增起到放大信号的作用。
实验材料
DNA链由上海迪赢生物科技有限公司制备，
T4 Polynucleotide Kinase试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，
T4 DNA Ligase试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，
Taq Mix试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，
实验方法
1、磷酸化
1)稀释：各单链DNA按照说明(上海迪赢生物科技有限公司)对应稀释至一定体积，终浓度为10uM。A0链连接有生物素从而可以与磁珠偶联。
2)将10uM的输入链和底物链对应的所有单链DNA分为两组(Group1和Group2)，分别进行磷酸化反应，37℃30min。
2、杂交
将两组磷酸化的产物按照各实施例所示的杂交反应体系杂交，94℃30s后置于室温30min，得到Group3。
3、连接
将杂交后的溶液按照各实施例所示的连接反应体系进行连接反应，4℃过夜(约16h)。得到Group4。
4、磁珠吸附
1)磁珠清洗：
a)取T1磁珠，将磁珠瓶置于漩涡振荡器上20s，振荡重悬磁珠，置于室温30min；
b)取50ul T1磁珠到新离心管中，加入200ul洗液1，震荡混匀，置于磁力架上，1min后移除上清液；
c)重复步骤b，共洗涤磁珠3次；
d)最后一次移除上清液后，加入200ul洗液1，重悬磁珠；
2)磁珠吸附
a)向含有200ul洗液1的T1磁珠中加入200ul的Group4，充分振荡重悬磁珠，将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合30min；
b)取下离心管，置于磁力架上2-3min，弃上清，用200ul洗液1清洗磁珠3次；
3)磁珠洗脱：向清洗后的磁珠中加入20ul ddH2O，重悬磁珠，置于磁力架上，取上清。
5、PCR
取5ul洗脱后的连接产物，按照如下所示的反应体系进行PCR(25ul体系)。
Figure BDA0003437368470000131
PCR参数设置：
Figure BDA0003437368470000132
6.琼脂糖凝胶电泳检测
对PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行检测，上样量为10ul，marker使用D2000；目的条带大小为200bp。
实施例1
1、AND门介绍：
如图1所示，输入单元为ss1和ss2，转换单元包含进行加法运算的底物链。当仅输入ss1(0,1)时，不能发生加法运算，没有信号输出；当仅输入ss2(1,0)时，不能发生加法运算，没有信号输出；当同时输入ss1和ss2时(1,1)，构成了加法运算的条件，生成了结果链，构成了信号输出，并能通过PCR扩增来放大信号。
1)真值表
Figure BDA0003437368470000133
2)输入链ssDNA设计：根据底物链的设计方法，两条输入链各包含有底物链结合部分(H或CS)及连接互补(P)两个部分，每个部分为20bp；ss1(0,1)＝H 0[0]-P1，ss2(1,0)＝P 1-C1S0[00]。
3)底物链：带有生物素的A0链(A0＝PrimerL-H0[0])，加数链A1＝C 1 S 0[00]-H1[0]、A2＝C 2 S 1[00]-H2[0]、A3＝C 3 S 2[00]-H3[1]，ENDGROUP＝C 4 S 3[10]-PrimerR，被加数链B1＝H 1[0]-C2S1[00]、B2＝H 2[0]-C3S2[00]、B3＝H 3[1]-C4S3[10]。
4)序列
表1
Figure BDA0003437368470000141
2、实验步骤
1)磷酸化
a)加入两条输入链
Figure BDA0003437368470000142
Figure BDA0003437368470000151
Figure BDA0003437368470000152
b)仅加入输入链SS1时，Group1不变
Figure BDA0003437368470000153
c)仅加入输入链SS2时，Group1不变
Figure BDA0003437368470000154
d)不加入输入链时，Group1不变
Figure BDA0003437368470000155
Figure BDA0003437368470000161
2)杂交
Figure BDA0003437368470000162
3)连接
Figure BDA0003437368470000163
将结果链PCR扩增后，用琼脂糖凝胶电泳检测条带位置。同时可送测序进一步检测。
实施例2
OR门介绍
如图2所示，输入单元为ss3和ss4，转换单元包含进行加法运算的底物链，与AND门不同的是，其中增加了两种连接链以确保加法运算能够运行。当仅输入ss3(0,1)时，能发生加法运算，产生信号输出；当仅输入ss2(1,0)时，能发生加法运算，产生信号输出；当同时输入ss1和ss2时(1,1)，也能发生加法运算，产生信号输出。
1)真值表
Figure BDA0003437368470000164
Figure BDA0003437368470000171
2)输入链ssDNA设计：根据底物链的设计方法，两条输入链各包含有底物链结合部分(H或CS)及连接互补(P)两个部分，ss3(0,1)＝H 0[0]-P1，ss4(1,0)＝H 0[1]-P0。
3)底物链：带有生物素的赋值不同的2种A0链(分别是A0＝0，A0＝1)，加数链A1、A2、A3，ENDGROUP，被加数链B1、B2、B3。
4)连接链：L0＝P1-C1S0[00]、L1＝P 0-C1S0[00]
5)序列：
表2
Figure BDA0003437368470000172
实验步骤：
1)磷酸化
a)加入两条输入链
Figure BDA0003437368470000173
Figure BDA0003437368470000181
Figure BDA0003437368470000182
b)仅加入输入链SS3时，Group1不变
Figure BDA0003437368470000183
c)仅加入输入链SS4时，Group1不变
Figure BDA0003437368470000184
Figure BDA0003437368470000191
d)不加入输入链时，Group1不变
Figure BDA0003437368470000192
2)杂交
a)加入两条输入链
Figure BDA0003437368470000193
b)仅加入SS3，同a)
c)仅加入SS4，同a)
d)不加入输入链
Figure BDA0003437368470000194
Figure BDA0003437368470000201
3)连接
a)加入两条输入链
Figure BDA0003437368470000202
b)仅加入SS3链同a)
c)仅加入SS4链同a)
d)不加入输入链
Figure BDA0003437368470000203
因为底物中含有两种A0链，所以当分别加入输入链ss3和ss4或者都加入时，都会产生200bp的DNA双链，可由琼脂糖凝胶电泳检测到，证明OR门构建成功。
实施例3
NAND门介绍
如图3所示，输入单元为ss5和ss6，转换单元包含进行加法运算的底物链，增加了两种B0链(B0＝0，B0＝1)以确保加法运算能够运行。当仅输入ss5(0,1)时，ss5与B0＝0结合，但B0＝1链可以运行加法运算，产生信号输出；当仅输入ss6(1,0)时，ss6与B0＝1结合，但B0＝0链可以运行加法运算，产生信号输出；当同时输入ss5和ss6时(1,1)，ss5和ss6分别与两种B0链结合，无法发生加法运算，无信号输出；当输入信号为(0,0)，即不加入ss5和ss6时，底物中的加法运算能够运行，能产生信号输出。
1)真值表：
Figure BDA0003437368470000204
Figure BDA0003437368470000211
2)输入链ssDNA设计：根据底物链的设计方法，ss5与B0＝0完全互补，即ss5(0,1)＝H0[0]-C 1 S 0[00]；ss6与B0＝1完全互补，即ss6(1,0)＝H0[0]-C 1 S 0[01]。
3)底物链：带有生物素的A0链(A0＝PrimerL-H0[0])，加数链A1、A2、A3，ENDGROUP，被加数链B0、B1、B2、B3。
4)序列
表3
Figure BDA0003437368470000212
实验步骤
1)磷酸化
a)加入两条输入链
Figure BDA0003437368470000221
Figure BDA0003437368470000222
b)仅加入输入链SS5时，Group1不变
Figure BDA0003437368470000223
c)仅加入输入链SS6时，Group1不变
Figure BDA0003437368470000224
Figure BDA0003437368470000231
d)不加入输入链时，Group1不变
Figure BDA0003437368470000232
2)杂交
a)加入两条输入链
Figure BDA0003437368470000233
b)仅加入输入链SS5，同a)
c)仅加入输入链SS6，同a)
d)不加入输入链
Figure BDA0003437368470000234
3)连接
a)加入两条输入链
Figure BDA0003437368470000241
b)仅加入输入链SS5，同a)
c)仅加入输入链SS6，同a)
d)不加入输入链
Figure BDA0003437368470000242
当ss5和ss6同时加入时，因为ss5和ss6分别与两种B0链完全互补链，所以会优先结合，而无法与其他的底物链结合，无法进行加法运算，故无法形成结果链。所以只有当ss5和ss6都不加入或仅加入1条时才会出现结果链，琼脂糖凝胶电泳检测到正确位置条带，证明NAND门构建成功。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海产业技术研究院
上海交通大学
<120> 一种基于核酸杂交的DNA分子逻辑门
<130> 219930 1CNCN
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
<400> 1
aagtgttagc cgataggagg ccgaaggtca gcgattcgcg 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
<400> 2
atacagcctc gatgaggtct agaaaggcaa tcttcgcagc 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
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gttaatatcg ccaaccgcct tctgctggat tcctggccgc 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
<400> 4
tcacggttat gcaaagcgag ctgattctag gtcgtccgcg 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
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aggcggttgg cgatattaac gctgcgaaga ttgcctttct 40
<210> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
<400> 6
ctcgctttgc ataaccgtga gcggccagga atccagcaga 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
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tatagcaata ctcggatctg cgcggacgac ctagaatcag 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
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cagatccgag tattgctata actttcacca gcgtttctct 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 输入链
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tgcattccaa gctagtacat cgcgaatcgc tgaccttcgg 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 输入链
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agacctcatc gaggctgtat atgtactagc ttggaatgca 40
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 底物链
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aagtgttagc cgataggagg gcttacgaca agaaaaatac 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 底物链
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gttaatatcg ccaaccgcct tctgctggat tcctggccgc 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
<400> 16
aggcggttgg cgatattaac gctgcgaaga ttgcctttct 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
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ctcgctttgc ataaccgtga gcggccagga atccagcaga 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
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tatagcaata ctcggatctg cgcggacgac ctagaatcag 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
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cagatccgag tattgctata actttcacca gcgtttctct 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 输入链
<400> 20
tgcattccaa gctagtacat cgcgaatcgc tgaccttcgg 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 输入链
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ctggaccgtt cgtagccctt gtatttttct tgtcgtaagc 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 连接链
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 连接链
<400> 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 底物链
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aagtgttagc cgataggagg ccgaaggtca gcgattcgcg 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
<400> 25
atacagcctc gatgaggtct agaaaggcaa tcttcgcagc 40
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 底物链
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gttaatatcg ccaaccgcct tctgctggat tcctggccgc 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 底物链
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tcacggttat gcaaagcgag ctgattctag gtcgtccgcg 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 底物链
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agacctcatc gaggctgtat cgcgaatcgc tgaccttcgg 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
<400> 30
tcgcgtacaa ggcgagaagc cgcgaatcgc tgaccttcgg 40
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
<400> 31
aggcggttgg cgatattaac gctgcgaaga ttgcctttct 40
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
<400> 32
ctcgctttgc ataaccgtga gcggccagga atccagcaga 40
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
<400> 33
tatagcaata ctcggatctg cgcggacgac ctagaatcag 40
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 底物链
<400> 34
cagatccgag tattgctata actttcacca gcgtttctct 40
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 输入链
<400> 35
ccgaaggtca gcgattcgcg atacagcctc gatgaggtct 40
<210> 36
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 输入链
<400> 36
ccgaaggtca gcgattcgcg gcttctcgcc ttgtacgcga 40

Claims (10)

1.一种基于核酸杂交的DNA分子逻辑门，包括：输入信号、信号转化单元和输出信号，
所述输入信号包括：至少两种DNA输入链；
所述信号转化单元包括：底物链，包含加数链A0链、Ai链、Ae链和被加数链Bi链，其中i＝1,2,3…n，n为大于1的正整数，通过核酸的杂交和扩增对输入信号进行逻辑运算，输出逻辑运算结果；
所述输出信号包括：核酸扩增结果，
其中，
Ai的3’端a2i个序列与Bi的3’端a2i个序列互补，Bi的5’端a2i+1个序列与Ai+1的5’端a2i+1个序列互补，Bi-1的5’端a2i-1个序列与Ai的5’端a2i-1个序列互补，Bn的5’端c个序列与Ae的5’端c个序列互补，使得加数链Ai链、Ae链和被加数链Bi链能交错互补以i＝1,2,3…n的顺序形成带有缺口的双链，
优选地，
A0的5’端和Ae的3’端分别与引物互补，和/或
数值c和各a各自独立为大于或等于5的正整数，并且a2i-1+a2i≤Ai的全长碱基数，且a2i+a2i+1≤Bi的全长碱基数。
2.如权利要求1所述的DNA分子逻辑门，其特征在于，
a2i+a2i+1比Bi的全长碱基数少0、少1、少2、少3、少4或少5，和/或
a2i-1+a2i比Ai的全长碱基数少0、少1、少2、少3、少4或少5，和/或
A0链或Ae链与可检测标记偶联，优选与生物素偶联，和/或
数值c和各a分别各自独立为5-40的正整数，更优选为10-20的正整数，更优选为20。
3.如权利要求1或2所述的DNA分子逻辑门，其特征在于，所述信号转化单元还包括选自以下的一种或多种：磷酸化酶、连接酶、聚合酶、dNTP和缓冲液。
4.如权利要求1或2所述的DNA分子逻辑门，其特征在于，所述DNA分子逻辑门为AND门，所述AND门中：
A0的3’端的a0个序列与第一输入链的3’端a0个序列互补，第一输入链的5’端b个序列和第二输入链的3’端b个序列互补，第二输入链的5’端a1个序列互补与A1的5’端a1个序列互补，通过底物链和输入链的杂交和扩增对输入信号进行逻辑运算，输出逻辑运算结果，
优选地，a0、a1、b各自独立为大于或等于5的正整数，更优选各自独立为5-40的正整数。
5.如权利要求1或2所述的DNA分子逻辑门，其特征在于，所述DNA分子逻辑门为OR门，所述OR门中：
所述底物链还包括连接链L0和L1，并且A0分为A0I和A0II，
A0I的3’端的a0个序列与第一输入链的3’端a0个序列互补，第一输入链的5’端b个序列与L0的3’端b个序列互补，L0的5’端a1个序列互补与A1的5’端a1个序列互补，
A0II的3’端的a0’个序列与第二输入链的3’端a0’个序列互补，第二输入链的5’端b’个序列与L1的3’端b’个序列互补，L1的5’端a1’个序列互补与A1的5’端a1’个序列互补，
第一输入链与L1不互补，第二输入链与L0不互补，
通过底物链和输入链的杂交和扩增对输入信号进行逻辑运算，输出逻辑运算结果，
优选地，a0、a0’、a1、a1’、b各自独立为大于或等于5的正整数，更优选各自独立为5-40的正整数。
6.如权利要求1或2所述的DNA分子逻辑门，其特征在于，所述DNA分子逻辑门为NAND门，所述NAND门中：
所述底物链还包括被加数链B0I和B0II，并且A1分为A1I和A1II，
B0I的3’端的a0个序列与A0的3’端的a0个序列互补，B0II的3’端的a0’个序列与A0的3’端的a0’个序列互补，B0I的3’端的a0个序列和B0II的3’端的a0’个序列具有至少90％相同性，
B0I的5’端的a1个序列与A1I的5’端的a1个序列互补，B0II的5’端的a1’个序列与A1II的5’端的a1’个序列互补，并且A1I的5’端a1个序列和A1II的5’端a1’个序列具有至少90％相同性，
A1I的3’端的a2i个序列与B1的3’端的a2i个序列互补，
A1II的3’端的a2i’个序列与B1的3’端的a2i’个序列互补，
B0I优先与第一输入链而非与A0和A1I杂交，并且B0I与第二输入链不杂交；优选地，B0I与第一输入链至少70％互补，
B0II优先与第一输入链而非与A0和A1II杂交，并且B0II与第一输入链不杂交；优选地，B0II与第二输入链至少70％互补，
通过底物链和输入链的杂交和扩增对输入信号进行逻辑运算，输出逻辑运算结果，
优选地，a0、a0’、a1、a1’、a2i、a2i’各自独立为大于或等于5的正整数，更优选各自独立为5-40的正整数。
7.如权利要求6所述的DNA分子逻辑门，其特征在于，
a0与a0’相等，和/或
a1与a1’相等，和/或
a2i与a2i’相等。
8.一种含有权利要求1-7中任一项所述的DNA分子逻辑门的DNA电路。
9.权利要求1-7中任一项所述的DNA分子逻辑门在生物检测、分子计算或制备电路纳米器件中的应用。
10.一种构建如权利要求1-7中任一项所述的DNA分子逻辑门的方法，包括如下步骤：
任选的1)将所述底物链磷酸化，任选将所述输入链磷酸化，
2)将输入链和底物链等比例混合，并退火，组装为带缺口的DNA双链，
3)将DNA双链的缺口补齐，获得完整的DNA双链，和
4)使用引物进行扩增，输出信号为扩增的DNA双链。
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