CN114486825B

CN114486825B - 一种基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法

Info

Publication number: CN114486825B
Application number: CN202111674636.0A
Authority: CN
Inventors: 欧阳琴; 张明明; 王丽; 陈全胜; 李欢欢; 郭志明
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-01-17
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114486825A

Abstract

本发明公开了一种基于上转换‑分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法，步骤为：合成以甲基丙烯酰胺为功能单体、以多菌灵为模板分子的分子印记聚合物作为识别元件，将聚合物涂层嫁接到已制备好的上转换荧光纳米材料上合成上转换‑分子印迹荧光传感器；在多菌灵存在的情况下，它将特异性地与分子印迹聚合物空腔结合以诱导电子转移，导致上转换‑分子印迹荧光传感器的荧光淬灭；通过测定待测样品淬灭前后荧光强度的变化，实现多菌灵含量的检测；检测范围为0.01‑10μg/mL，检测限为0.0036μg/mL。本发明构建的上转换‑分子印迹荧光传感器具有高灵敏度和高选择性，在实际检测中有很低的检测限，应用前景良好。

Description

一种基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法

技术领域

本发明属于农药残留检测技术领域，具体涉及一种基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法。

背景技术

检测食品中的多菌灵残留量非常有必要。传统的多菌灵残留量的检测方法包括高性能液相色谱、毛细管电泳、气相色谱串联质谱仪和液相色谱串联质谱。这些方法在检测多菌灵残留上具有较高的灵敏度和精确度，但同时它们的检测步骤繁琐，需要高昂的检测设备，检测时间过长，这些缺点意味着传统检测方法不能很好的应用到实际的快速检测场景中。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过构建特异性多菌灵检测体系，从而实现食品中多菌灵农药的高灵敏度、特异性检测。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法，包括以下步骤：

利用热分解法合成上转换纳米颗粒，并对其进行表面包硅改性，得到水溶性上转换纳米颗粒作为信号载体；

利用模板分子多菌灵和功能分子甲基丙烯酰胺的氢键反应，得到分子印迹聚合物作为特异性识别分子；

将所述特异性识别分子嫁接到信号载体表面上得到上转换-分子印迹荧光传感器；

配制不同浓度的多菌灵标准溶液，加入上转换-分子印迹荧光传感器后得到不同浓度的检测液；通过测定检测液的荧光强度，与多菌灵浓度进行线性拟合，建立多菌灵含量检测的标准曲线；

将上转换-分子印迹荧光传感器加入待测溶液中，通过测定荧光强度代入标准曲线实现待测溶液中多菌灵浓度的检测。

优选的是，所述基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法，具体包括以下步骤：

步骤1：制备油溶性上转换纳米颗粒：

首先，称取六水合物氯化钇、六水合物氯化镱和六水合物氯化铒，倒入甲醇A中超声溶解；然后与油酸和1-十八烯溶液的混合溶液进行混合；在通氩气条件下磁力搅拌进行第一次加热反应，反应后得到透明溶液，经自然冷却至室温，记为混合溶液A；

随后，将氢氧化钠、氟化铵和甲醇B形成的混合溶液，滴加到上述混合溶液A中，在封闭条件下，进行第二次加热反应；去除封闭条件，进行第三次加热反应以挥发甲醇B；然后，继续升温进行第四次反应，反应后冷却至室温，经离心得到白色固体沉淀，即为油溶性上转换纳米颗粒；

优选的，步骤1中所述六水合物氯化钇、六水合物氯化镱、六水合物氯化铒、甲醇A、油酸和1-十八烯的用量比为236.6mg：77.6mg：7.6mg：10mL：4～6mL：8～12mL；所述超声溶解的时间为10-15min；所述第一次加热反应的温度为160℃，时间为30min。

优选的，步骤1中所述氢氧化钠、氟化铵、甲醇B与混合溶液A中甲醇A的用量比为100mg：148.2mg：10mL：10mL；所述第二次加热反应的温度为50℃，反应时间为30min；第三次加热反应的温度为70℃，反应时间为30-40min；所述第四次反应的温度为290-310℃，反应时间为1h，升温速率为10-20℃/min。

步骤2：水溶性上转换纳米颗粒的制备：首先，将步骤(1)得到的油溶性上转换纳米颗粒超声分散在环己烷中，加入IGEPAL CO-520，进行第一次超声处理形成反转的微乳液；随后，在微乳液中加入氨水和正硅酸四乙酯，搅拌反应后，通过离心得到的产物为二氧化硅涂层的上转换纳米颗粒，用乙醇清洗；清洗后分散在乙醇中进行第二次超声处理，然后加入乙酸和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷对，经加热回流后的溶液通过离心得到的产物即为水溶性上转换纳米颗粒；

优选的，步骤2中所述油溶性上转换纳米颗粒、环己烷、IGEPAL CO-520的用量关系为50mg：10mL：4mL。

优选的，步骤2中所述油溶性上转换纳米颗粒、氨水和正硅酸四乙酯用量比为50mg：300-500μL：50-60μL；所述搅拌反应的时间为4-6h。

优选的，步骤2中所述二氧化硅涂层的上转换纳米颗粒、乙醇、乙酸和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷对的用量关系为70mg：50-100mL：50-70μL：1-3mL。

优选的，步骤2中所述第一次超声处理的时间为10-20min；第二次超声处理的时间为30-50min；所述加热回流的温度为70℃，时间为5h。

步骤3：上转换-分子印迹荧光传感器的制备：将多菌灵和功能单体甲基丙烯酰胺分散在的N,N-二甲基甲酰胺中进行预聚合得到多菌灵-单体聚合物；再与步骤(2)得到的水溶性上转换纳米材料混合，之后加入引发剂偶氮二异丁腈、交联剂二甲基丙烯酸酯乙二醇酯混匀，在一定温度条件下进行聚合反应，反应后的反应液加入甲醇和乙酸进行清洗，离心收集制备的分子印迹聚合物修饰的上转换纳米材料，即为上转换-分子印迹荧光传感器；

优选的，步骤3中所述多菌灵、甲基丙烯酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、水溶性上转换纳米材料、偶氮二异丁腈、二甲基丙烯酸酯乙二醇酯的用量关系为0.1mmol：0.4mmol：20mL：70mg：10mg：1mmol；其中所述多菌灵、甲基丙烯酰胺、二甲基丙烯酸酯乙二醇酯的摩尔比为1：4：10；所述预聚合的时间为30-60min。

优选的，步骤3中所述一定温度条件为60℃，聚合时间为12-18h。

优选的，步骤3中所述清洗时，反应液中水溶性上转换纳米材料与甲醇和乙酸的用量比为70mg：180～360mL：20～40mL；所述甲醇和乙酸体积比为9：1。

步骤4：标准曲线的建立：首先配制不同浓度的多菌灵标准溶液，然后将步骤3得到的上转换-分子印迹荧光传感器加入不同浓度的多菌灵标准溶液(一个上转换-分子印迹荧光传感器对应一种浓度)，在室温下进行振荡，使多菌灵充分吸附在上转换-分子印迹荧光传感器的表面，得到不同浓度的检测液；随后，测定检测液的荧光强度，以多菌灵浓度和荧光强度进行线性拟合，建立多菌灵含量检测的标准曲线；

优选的，步骤4中所述多菌灵标准溶液的浓度为0.01～1.0μg/mL；所述上转换-分子印迹荧光传感器与多菌灵标准溶液的用量为1mg：1mL；所述室温下进行振荡的时间为50min。

步骤5：实际样品的检测：将实际样本经预处理，提取得到含有多菌灵的待测溶液；将待测溶液与上转换-分子印迹荧光传感器混合，在室温下进行振荡后测定其荧光强度，带入步骤4所得的标准曲线，计算出实际样本的多菌灵的含量。

优选的，步骤5中所述实际样品包括绿茶、红茶和抹茶粉；所述室温下进行振荡的时间为50min；所述上转换-分子印迹荧光传感器与待测溶液的用量比为1mg：1mL。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明公开的是一种基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法，采用上转换纳米颗粒作为发光材料，结合表面分子印迹技术，通过多菌灵与上转换纳米材料的光诱导电子转移猝灭上转换材料荧光，当材料表面多菌灵被洗脱后，材料的荧光强度恢复，成功构建了高效特异性多菌灵检测体系。

(2)本发明构建的特异性检测体系，使用的荧光材料是上转换纳米材料，对比常见的下转换荧光材料，上转换纳米材料具有较低的自发荧光，同时有效的避免复杂食品基体中背景荧光的干扰，制备的分子印迹聚合物对多菌灵的检测具有特异性，克服了传统方法的不足，能够实现对多菌灵的高灵敏度检测。

(3)本发明建立的多菌灵浓度与荧光强度信号特征值的线性浓度范围为0.01-10μg/mL，具有较宽的线性检测范围，检测限LOD为0.0036ng/mL，与传统的高效液相色谱方法进行比较，没有产生任何明显的差异，可以满足食品中多菌灵的快速、高灵敏检测，具有很好的通用性；同时这些数据也表明本发明具有良好的实用前景。

附图说明

图1为基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测原理图。

图2为实施例1中分子印迹聚合物修饰的上转换纳米材料扫描电镜图。

图3为多菌灵、甲基丙烯酰胺和乙烯二甲基丙烯酸酯的添加物比例优化(A)与聚合反应时间优化(B)图。

图4为不同浓度多菌灵检测的上转换荧光光谱(A)和标准曲线(B)。

图5为检测体系的特异性分析。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1：

1、油溶性上转换纳米材料的制备

上转换荧光纳米颗粒采用高温热分解法制备，具体合成过程如下：首先，称取六水合物氯化钇236.6mg(0.78mmol)，77.6mg六水合物氯化镱(0.2mmol)和7.6mg六水合物氯化铒(0.02mmol)，倒入装有10mL甲醇的烧杯中超声溶解10min。将其转移至装有4mL油酸和8mL1-十八烯的250mL三口圆底烧瓶中；在通氩气条件下磁力搅拌加热至160℃并保持30min，得到透明溶液，自然冷却至室温；随后，将溶解有100mg氢氧化钠(2.5mmol)和148.2mg氟化铵(4mmol)的10mL甲醇混合液逐滴滴加到上述烧瓶中，形成白色悬浊液，然后在封闭条件下，加热至50℃并保持30min；然后，打开装置去除封闭条件，加热至70℃持续搅拌30min以挥发混合液中的甲醇。接着，继续升温(10℃/min)至290℃，反应1h后，关闭加热，冷却至室温，离心得到白色固体沉淀即为油溶性上转换纳米颗粒；

2、水溶性上转换纳米材料的制备

首先，将50mg油溶性上转换纳米颗粒超声分散在10mL环己烷中，加入4mL IGEPALCO-520，超声处理10min，形成反转的微乳液。随后，在上述溶液中加入300μL氨水和50μL正硅酸四乙酯，然后搅拌4h。之后，通过离心得到二氧化硅涂层的上转换纳米颗粒，用乙醇离心清洗后，取70mg清洗后的二氧化硅涂层的上转换纳米颗粒分散在50mL乙醇中超声处理30min，然后加入50μL乙酸和1mL 3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷对，在70℃下回流5h；最后，通过离心得到水溶性上转换纳米颗粒的制备；

3、上转换-分子印迹荧光传感器的制备；

首先，将0.1mmol模板分子多菌灵和0.4mmol功能性单体甲基丙烯酰胺分散在20mL的N,N-二甲基甲酰胺中，并大力搅拌上述溶液得到预聚合物溶液。随后，将水溶性上转换纳米材料加入到预聚合物溶液中，并加入10mg引发剂偶氮二异丁腈和1mmol交联剂二甲基丙烯酸酯乙二醇酯，在油浴60℃中反应12h进行聚合反应，得到反应液再加入180mL甲醇和20mL乙酸的混合液进行清洗，通过离心收集制备的分子印迹聚合物修饰的上转换纳米材料，即为上转换-分子印迹荧光传感器，如图2所示。

实施例2：

1、油溶性上转换纳米材料的制备；

上转换荧光纳米颗粒采用高温热分解法制备，具体合成过程如下：首先，称取六水合物氯化钇236.6mg(0.78mmol)，77.6mg六水合物氯化镱(0.2mmol)和7.6mg六水合物氯化铒(0.02mmol)，倒入装有10mL甲醇的烧杯中超声溶解10min。将其转移至装有5mL油酸和10mL 1-十八烯的250mL三口圆底烧瓶中。在通氩气条件下磁力搅拌加热至160℃并保持30min，得到透明溶液，自然冷却至室温。随后，将溶解有100mg氢氧化钠(2.5mmol)和148.2mg氟化铵(4mmol)的10mL甲醇混合液逐滴滴加到上述烧瓶中，形成白色悬浊液，然后在封闭条件下，加热至50℃并保持30min。然后，打开装置，加热至70℃持续搅拌35min以挥发混合液中的甲醇。接着，继续升温(15℃/min)至300℃，反应1h后，关闭加热。冷却至室温，离心得到白色固体沉淀即为油溶性上转换纳米颗粒；

2、水溶性上转换纳米材料的制备；

首先，将50mg油溶性上转换纳米颗粒超声分散在10mL环己烷中，加入4mL IGEPALCO-520，超声处理15min，形成反转的微乳液。随后，在上述溶液中加入400μL氨水和55μL正硅酸四乙酯，然后搅拌5h。之后，通过离心得到二氧化硅涂层的上转换纳米颗粒，用乙醇离心清洗后，取70mg清洗后的二氧化硅涂层的上转换纳米颗粒分散在75mL乙醇中超声处理40min，然后加入60μL乙酸和2mL 3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷对，在70℃下回流5h。最后，通过离心得到水溶性上转换纳米颗粒的制备；

3、上转换-分子印迹荧光传感器的制备；

首先，将0.1mmol模板分子多菌灵和0.4mmol功能性单体甲基丙烯酰胺分散在20mL的N,N-二甲基甲酰胺中，并大力搅拌上述溶液得到预聚合物溶液。随后，将水溶性上转换纳米材料加入到预聚合物溶液中，并加入10mg引发剂偶氮二异丁腈和1mmol交联剂二甲基丙烯酸酯乙二醇酯，在油浴60℃中反应16h进行聚合反应，得到反应液再加入270mL甲醇和30mL乙酸的混合液进行清洗，通过离心收集制备的分子印迹聚合物修饰的上转换纳米材料，即为上转换-分子印迹荧光传感器。

实施例3：

1、油溶性上转换纳米材料的制备；

上转换荧光纳米颗粒采用高温热分解法制备，具体合成过程如下：首先，称取六水合物氯化钇236.6mg(0.78mmol)，77.6mg六水合物氯化镱(0.2mmol)和7.6mg六水合物氯化铒(0.02mmol)，倒入装有10mL甲醇的烧杯中超声溶解10min；将其转移至装有6mL油酸和12mL 1-十八烯的250mL三口圆底烧瓶中。在通氩气条件下磁力搅拌加热至160℃并保持30min，得到透明溶液，自然冷却至室温。随后，将溶解有100mg氢氧化钠(2.5mmol)和148.2mg氟化铵(4mmol)的10mL甲醇混合液逐滴滴加到上述烧瓶中，形成白色悬浊液，然后在封闭条件下，加热至50℃并保持半小时；然后，打开装置，加热至70℃持续搅拌40min以挥发混合液中的甲醇，接着，继续升温(20℃/min)至310℃，反应1h后，关闭加热。冷却至室温，离心得到白色固体沉淀即为油溶性上转换纳米颗粒；

2、水溶性上转换纳米材料的制备

首先，将50mg油溶性上转换纳米颗粒超声分散在10mL环己烷中，加入4mL IGEPALCO-520，超声处理20min形成反转的微乳液；随后，在上述溶液中加入500μL氨水和60μL正硅酸四乙酯，然后搅拌6h。之后，通过离心得到二氧化硅涂层的上转换纳米颗粒，用乙醇离心清洗后，取70mg清洗后的二氧化硅涂层的上转换纳米颗粒分散在100mL乙醇中超声处理50min，然后加入70μL乙酸和3mL 3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷对，在70℃下回流5h。最后，通过离心得到水溶性上转换纳米颗粒的制备；

3、上转换-分子印迹荧光传感器的制备；

首先，将0.1mmol模板分子多菌灵和0.4mmol功能性单体甲基丙烯酰胺分散在20mL的N,N-二甲基甲酰胺中，并大力搅拌上述溶液得到预聚合物溶液；随后，将水溶性上转换纳米材料加入到预聚合物溶液中，并加入10mg引发剂偶氮二异丁腈和1mmol交联剂二甲基丙烯酸酯乙二醇酯，在油浴60℃中反应18h进行聚合反应，得到反应液再加入360mL甲醇和40mL乙酸的混合液进行清洗，通过离心收集制备的分子印迹聚合物修饰的上转换纳米材料，即为上转换-分子印迹荧光传感器。

检测条件优化；

为了所构建的方法获得最佳的检测性能，研究对聚合反应的添加物比例以及分子印迹聚合物与上转换荧光纳米材料的聚合时间进行了优化。

首先，研究了聚合反应的添加物的比例，具体为多菌灵、甲基丙烯酰胺与二甲基丙烯酸酯乙二醇酯的摩尔比。如图3中(A)所示，交联剂二甲基丙烯酸酯乙二醇酯的添加量过少会导致无法形成网络聚合物，从而降低吸附能力和特异性。但当二甲基丙烯酸酯乙二醇酯的添加量较多时，会使上转换纳米材料表面的印迹层变厚，不仅会阻挡上转换纳米材料的荧光强度，还会影响聚合物对目标的吸附能力和传质效果。因此，在随后的实验中，摩尔比为1:4:10的添加比例被认为是最佳的。

最后，对分子印迹聚合物与上转换荧光纳米材料的聚合时间进行了优化。如图3中(B)所示，混合物中的荧光强度在16h内逐渐达到最大值，因此，16h被选为最佳聚合时间。

多菌灵检测标准曲线的建立；

将不同浓度的多菌灵(0.01、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0μg/mL)与实施例2得到的1mg上转换-分子印迹荧光传感器均匀地混合。随后，将上述混合物在室温下振荡50min，使多菌灵充分吸附在上转换-分子印迹荧光传感器的表面。最后，用荧光光谱检测系统测量多菌灵吸附前后的荧光光谱。

结果如图4中(A)图所示，为添加不同浓度多菌灵后体系的荧光光谱变化情况，可以看出随着多菌灵的浓度的增加，荧光强度差值不断扩大。图4中(B)图为654nm处荧光强度与多菌灵浓度值之间的关系，可以看出，在0.01-10μg/mL范围内，荧光值与多菌灵浓度值之间存在良好线性的关系，其线性回归方程为Y＝0.4115X+1.0735(其中F₀和F分别是多菌灵不存在和存在时上转换-分子印迹荧光传感器在654nm处的荧光强度，X是多菌灵浓度)，R²＝0.9938，检测限为0.0036ng/mL。

不同食品中多菌灵的检测；

为了评估所构建的方法对鲜肉样品中多菌灵检测中的可行性，研究以绿茶、红茶、抹茶粉为例，采用标准加入法进行加标回收实验，具体操作过程如下：

(1)首先，绿茶、红茶和抹茶粉作为实际样品；

预处理：绿茶和红茶首先用高速研磨机进行研磨，然后将1mL浓度为1、2、5μg/mL的多菌灵标准溶液分别加入2.0g绿茶、红茶和抹茶粉中，得到9个加标样品。接着，将9个加标样品分别与50mL乙腈混合，高速匀浆5min，然后以6000rpm离心10min；然后，将提取液在80℃的旋转蒸发器中加热，以蒸发乙腈。最后，将干燥的残余物溶解在1mL甲醇中，得到待测溶液，进行定量检测；

(2)将待测溶液与上转换-分子印迹荧光传感器混合，在室温下进行振荡50min后测定其荧光强度，带入上述所得的标准曲线中，计算出实际样本的多菌灵的含量。

为了进一步验证所开发的上转换-分子印迹荧光传感器的准确性，同时采用高效液相色谱法测定加标样品中的多菌灵。两种方法检测在检测值和回收率方面基本接近，即两种方法的检测结果不存在显著差异。这些结果说明试验所构建的检测方法准确、稳定，对实际样品中多菌灵的检测具有应用价值。

表1对实际样品中的多菌灵的加标回收结果

^a SD:标准偏差，n＝3.

^b RSD:相对标准偏差.

^c P:P>0.05表明无显著性差异.

检测方法的特异性；

为了评估所构建的检测体系对于多菌灵检测的特异性和抗干扰性，本发明选择了多菌灵的类似物，包括甲基硫菌灵、噻菌灵、苯菌灵和氰菌灵，作为干扰性农药，进一步研究上转换-分子印迹荧光传感器的荧光特性；

如图5所示，制备的上转换-分子印迹荧光传感器对多菌灵农药的荧光响应效率明显高于其他类似物，结果表明，所构建的上转换-分子印迹荧光传感器具有较好的特异性和抗干扰性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1：制备油溶性上转换纳米颗粒；

首先，称取六水合物氯化钇、六水合物氯化镱和六水合物氯化铒，倒入甲醇中超声溶解；然后与油酸和1-十八烯溶液的混合溶液进行混合；在通氩气条件下磁力搅拌进行第一次加热反应，反应后得到透明溶液，经自然冷却至室温，记为混合溶液A；

随后，将氢氧化钠、氟化铵和甲醇形成的混合溶液，滴加到上述混合溶液A中，在封闭条件下，进行第二次加热反应；去除封闭条件，进行第三次加热反应以挥发甲醇；然后，继续升温进行第四次反应，反应后冷却至室温，经离心得到白色固体沉淀，即为油溶性上转换纳米颗粒；

步骤2：水溶性上转换纳米颗粒的制备；

首先，将步骤（1）得到的油溶性上转换纳米颗粒超声分散在环己烷中，加入IGEPAL CO-520，进行第一次超声处理形成反转的微乳液；随后，在微乳液中加入氨水和正硅酸四乙酯，搅拌反应后，通过离心得到的产物为二氧化硅涂层的上转换纳米颗粒，用乙醇清洗；清洗后分散在乙醇中进行第二次超声处理，然后加入乙酸和3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷对，经加热回流后的溶液通过离心得到的产物即为水溶性上转换纳米颗粒；

步骤3：上转换-分子印迹荧光传感器的制备；

将多菌灵和功能单体甲基丙烯酰胺分散在的N,N-二甲基甲酰胺中进行预聚合得到多菌灵-单体聚合物；再与步骤（2）得到的水溶性上转换纳米材料混合，之后加入引发剂偶氮二异丁腈、交联剂二甲基丙烯酸酯乙二醇酯混匀，在一定温度条件下进行聚合反应，反应后用甲醇和乙酸进行清洗，离心收集制备的分子印迹聚合物修饰的上转换纳米材料，即为上转换-分子印迹荧光传感器；

步骤4：标准曲线的建立；

首先配制不同浓度的多菌灵标准溶液，然后将步骤3得到的上转换-分子印迹荧光传感器加入不同浓度的多菌灵标准溶液，一个上转换-分子印迹荧光传感器对应一种浓度；在室温下进行振荡，使多菌灵充分吸附在上转换-分子印迹荧光传感器的表面，得到不同浓度的检测液；随后，测定检测液的荧光强度，以多菌灵浓度和荧光强度进行线性拟合，建立多菌灵含量检测的标准曲线；

2. 根据权利要求1所述的基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法，其特征在于，步骤1中所述六水合物氯化钇、六水合物氯化镱、六水合物氯化铒、甲醇、油酸和1-十八烯的用量比为236.6 mg：77.6 mg：7.6 mg：10 mL：4~6 mL：8 ~12 mL；所述超声溶解的时间为10-15 min；所述第一次加热反应的温度为160 ℃，时间为30 min。

3. 根据权利要求1所述的基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法，其特征在于，步骤1中所述氢氧化钠、氟化铵、甲醇与混合溶液中甲醇的用量比为100 mg：148.2 mg：10 mL：10 mL；所述第二次加热反应的温度为50 ℃，反应时间为30 min；第三次加热反应的温度为70 ℃，反应时间为30-40 min；所述第四次反应的温度为290-310 ℃，反应时间为1 h，升温速率为10-20 ℃/min。

4. 根据权利要求1所述的基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法，其特征在于，步骤2中所述油溶性上转换纳米颗粒、环己烷、IGEPAL CO-520的用量关系为50mg：10 mL：4 mL；所述油溶性上转换纳米颗粒、氨水和正硅酸四乙酯用量比为50 mg ：300-500 µL：50-60 µL；所述搅拌反应的时间为4-6 h；所述二氧化硅涂层的上转换纳米颗粒、乙醇、乙酸和3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷对的用量关系为70 mg：50-100 mL：50-70 µL：1-3 mL。

5. 根据权利要求1所述的基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法，其特征在于，步骤2中所述第一次超声处理的时间为10-20 min；第二次超声处理的时间为30-50 min；所述加热回流的温度为70 ℃，时间为5 h。

6. 根据权利要求1所述的基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法，其特征在于，步骤3中所述多菌灵、甲基丙烯酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、水溶性上转换纳米材料、偶氮二异丁腈、二甲基丙烯酸酯乙二醇酯的用量关系为0.1 mmol：0.4 mmol：20 mL：70mg：10 mg：0.6-1.1 mmol；其中所述多菌灵、甲基丙烯酰胺、二甲基丙烯酸酯乙二醇酯的摩尔比为1：4：10；所述预聚合的时间为30-60 min。

7. 根据权利要求1所述的基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法，其特征在于，步骤3中所述一定温度条件为60 ℃，聚合时间为12-18 h；所述清洗时，反应液中水溶性上转换纳米材料与甲醇和乙酸的用量比为70 mg：180~360mL：20~40mL；所述甲醇和乙酸体积比为9：1。

8. 根据权利要求1所述的基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法，其特征在于，步骤4中所述多菌灵标准溶液的浓度为0.01~1.0 μg/mL；所述上转换-分子印迹荧光传感器与多菌灵标准溶液的用量为1 mg：1 mL；所述室温下进行振荡的时间为50min。

9. 根据权利要求1所述的基于上转换-分子印迹荧光传感器的多菌灵快速检测方法，其特征在于，步骤5中所述实际样品包括绿茶、红茶和抹茶粉；所述室温下进行振荡的时间为50 min。