CN114480627A - 用于重性抑郁障碍诊断的circRNA标志物及其应用 - Google Patents
用于重性抑郁障碍诊断的circRNA标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于重性抑郁障碍诊断的circRNA标志物及其应用,所述circRNA标志物为circUBE2K,所述circUBE2K的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明首次揭示了检测MDD的标志物circUBE2K,且circUBE2K具有高度稳定性、特异性和敏感性;同时研究发现circUBE2K表达越高,症状越重;且本发明中所表达的circUBE2K在MDD患者全血及CUMS小鼠的大脑试样中共同进行高表达,因此,circUBE2K可以作为MDD发生的新的基因靶点。基于此,MDD的诊断可以通过circUBE2K的表达水平这一客观指标进行检查、确诊。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种用于重性抑郁障碍诊断的circRNA标志物及其应用。
背景技术
抑郁障碍(Depressive disorder)以心境低落为主要特征的一组疾病,全球大约有2.64亿名抑郁障碍患者。根据DSM-5,抑郁障碍包括重性抑郁障碍(major depressivedisorder,MDD),持续性抑郁障碍(persistent depressive disorder,PDD),经前期烦躁障碍(premenstrual dysphoric disorder),破坏性心境失调(disruptive mooddysregulation disorder),其他躯体疾病所致的抑郁障碍(depressive disorder due toanother medical condition),物质/药物所致的抑郁障碍(substance/medicationinduced depressive disorder)等。其中MDD是最常见的抑郁障碍,临床上常表现为情绪低落,兴趣丧失,快感缺失,意志活动减退等症状,具有反复发作的倾向,严重者可出现自杀念头和行为。
目前MDD的诊断主要依据患者对症状的主观叙述以及医生对患者的精神状态检测,这受患者表达症状的能力和医生解读与评估能力的影响,因而缺乏客观性,准确性不足。因此,深入研究MDD的发病机制,可以为发现MDD可靠的生物学标志及新的治疗方法提供坚实的理论基础。
circRNAs是一类共价闭合的非编码RNA,无多聚腺苷酸尾或5’端帽子结,具有高稳定性,广泛表达和组织/发育阶段特异性表达的特点,且在血液和大脑中表达丰富。circRNAs的闭合环结构使其比线性RNA更稳定且半衰期更长,并能抵抗RNA核酸外切酶R(Rnase R)降解;与其他非编码RNA分子(如miRNAs和lncRNAs)相比,circRNAs具有更多理想的疾病诊断生物标志物的特性。已有研究表明circRNAs与MDD相关,因此深入探索circRNAs在MDD的作用将对MDD的诊断和治疗具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于一种用于重性抑郁障碍诊断的circRNA标志物及其应用。
本发明通过下述技术方案实现:
本发明的第一个目的在于提供一种用于重性抑郁障碍诊断的circRNA标志物,所述circRNA标志物为circUBE2K,所述circUBE2K的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
可选地,所述circRNA标志物为患者全血标志物。
本发明的第二个目的在于提供一种上述的circRNA标志物的筛选方法,包括如下步骤:
(1)通过对MDD患者和正常对照全血进行全转录组测序,筛选出差异表达的circRNA;
(2)扩大样本量进行qRT-PCR验证差异circRNA;
(3)用ROC曲线和相关性分析判断相关circRNA的对MDD的诊断价值;
(4)在动物和细胞模型上相关circRNA对疾病的作用和影响研究。
本发明的第三个目的在于提供一种上述的circRNA标志物的引物组合,所述引物组合包括上游引物与下游引物;
所述上游引物为:TTCCGTCACAGGGGCTATTT;
所述下游引物为:TTTTGCTCGTCATTGATCTTTCA。
本发明的第四个目的在于提供一种上述的circRNA标志物及上述引物组合在制备重性抑郁障碍诊断试剂盒中的应用。
可选地,所述试剂盒检测全血中circRNA标志物的含量。
本发明的第五个目的在于提供一种诊断试剂盒,所述试剂盒内包括上述的引物组合。
可选地,所述试剂盒还包括逆转录、PCR反应用的酶和试剂,以及内参。
本发明的第六个目的在于提供一种诊断试剂盒的制备方法,包括:全血总RNA提取、定量RNA逆转录、实时荧光定量PCR、用内参基因β-actin将circRNAs的表达水平进行标准化。
可选地,所述定量RNA逆转录的过程为:将提取的总RNA、5X gDNA去除缓冲液、gDNA去除剂、RNase Free H2O混合,得混合液;将得到的混合液置于PCR仪中进行gDNA去除;进行反转录;
所述实时荧光定量PCR的过程为:将cDNA、预混液、RNase Free H2O、上游引物、下游引物、ROX参比染料混合,将得到的混合液置于实时荧光定量PCR仪中进行荧光定量。
本发明具有如下的优点和有益效果:
1、本发明首次揭示了检测MDD的标志物circUBE2K,且circUBE2K具有高度稳定性、特异性和敏感性;同时发明人研究发现circUBE2K表达越高,汉密顿抑郁量表得分越高,从而可以通过检测circUBE2K表达情况来辅助判断抑郁的严重程度;且本发明中所表达的circUBE2K在MDD患者全血及CUMS小鼠的大脑试样中高表达,因此,circUBE2K可以作为MDD发生的新的基因靶点。基于此,MDD的诊断不用再依赖主观经验判断,而是可以通过circUBE2K标志物的表达水平这一客观指标进行检查、确诊,提高诊断准确率。同时根据各实施例的研究,表明circUBE2K可能通过激活小胶质细胞参与神经炎症发生进而导致抑郁,circUBE2K可以作为MDD发生的新的基因靶点。
2、本发明首次提出了一种试剂盒,可用于通过检测患者全血中circUBE2K的表达水平,检测、确诊MDD,以及判断症状等级。
附图说明
为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中:
图1为实施例1中MDD患者全血的circRNAs表达谱聚类分析图。
图2a为实施例2中实时荧光定量PCR检测分析MDD病人与健康对照人群的差异性表达circUBE2K图,图中的**表示p<0.01;
图2b为实施例2中标志物circUBE2K的ROC曲线图;
图2c为实施例2中circUBE2K的表达水平和MDD患者的HAMD得分曲线图。
图3a为实施例3中CON组、CUMS组小鼠的糖水偏好指数统计图,图中的***表示p<0.001;
图3b为实施例3中circUBE2K在CON组和CUMS组小鼠的皮层和海马组织中的表达水平示意图,图中的*表示p<0.05;
图3c为实施例3中CON组、CUMS组的脑组织进行荧光原位杂交得到样品的荧光原位杂交图。
图4a为实施例4中CON组、CUMS组的脑组织进行FISH原位杂交与IF共染后得到样品的免疫荧光共染图;
图4b为实施例4中的过表达circUBE2K后小胶质细胞形态图。
图5为实施例5中的过表达circUBE2K后小鼠脑组织炎症因子变化谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,下面结合实施例,对本发明作进一步的详细说明,本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明,并不作为对本发明的限定。
在以下描述中,为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而,对于本领域普通技术人员显而易见的是:不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实施例中,为了避免混淆本发明,未具体描述公知的材料或方法。
本发明提供了一种用于重性抑郁障碍诊断的circRNA标志物circUBE2K,是由UBE2K第四号染色体(NM_005339,chr4:39739039-39757359)的2,3,4外显子反向拼接构成,其序列如SEQ ID NO:1所示。circRNA标志物存在于患者全血中,可用于制备重性抑郁障碍诊断试剂盒。
SEQ ID NO:1为:
ACGAGCAAAAATCAAATTAAAGTAGATCTTGTAGATGAGAATTTTACAGAATTAAGAGGAGAAATAGCAGGACCTCCAGACACACCATATGAAGGAGGAAGATACCAACTAGAGATAAAAATACCAGAAACATACCCATTTAATCCCCCTAAGGTCCGGTTTATCACTAAAATATGGCATCCTAATATTAGTTCCGTCACAGGGGCTATTTGTTTGGATATCCTGAAAGATCAATG。
本发明还提供了circRNA标志物的筛选方法,包括如下步骤:
(1)通过对MDD患者和正常对照全血进行全转录组测序,筛选出差异表达的circRNA;
(2)扩大样本量进行qRT-PCR验证差异circRNA;
(3)用ROC曲线和相关性分析判断相关circRNA的对MDD的诊断价值;
(4)在动物和细胞模型上相关circRNA对疾病的作用和影响研究。
本发明还提供了circRNA标志物的引物组合,包括上游引物:
TTCCGTCACAGGGGCTATTT,其序列如SEQ ID NO:2所示;下游引物为:
TTTTGCTCGTCATTGATCTTTCA,其序列如SEQ ID NO:3所示。可用于制备重性抑郁障碍诊断试剂盒。
本发明还提供了一种诊断试剂盒,该试剂盒包含以上引物组合。该试剂盒中还包括逆转录、PCR反应用的酶和试剂,以及内参。
以下通过具体实施例对本发明技术方案进行进一步地阐述。
实施例1:MDD病人与健康全血对照人群全血的circRNAs表达分析
一、研究对象和研究方法
1、研究对象
病例组(MDD)为2020年7月到2020年9月,在广东医科大学附属医院的患者,共入组29名。
纳入标准为:(1)满足精神障碍手册(Manual of Mental Disorders,第五版)(DSM-V)的MDD诊断标准;(2)HAMD-24>=8,SDS抑郁自评量表标准分>=53;(3)14~59岁,首次发病在55岁以下;(4)汉族;(5)首发未用药者或至少三个月未服用任何精神类药物;(6)无传染病史,无其他科重大疾病;(7)无吸烟酗酒史;(8)无脑部外伤史。
排除标准:(1)有其他精神病史,如物质滥用、精神分裂症、强迫症等;(2)孕期及哺乳期妇女;(3)长期服用药物或保健品者。
健康对照人群为附近社区居民,共入组19名。健康对照人群纳入标准为:(1)HAMD-24<8,SDS抑郁自评量表标准分<53;(2)18~59岁;(3)汉族;(4)近三月未服用任何药物;(5)本人及家族无重大精神疾病史,身体健康,无重大疾病史;(6)无吸烟酗酒史。排除标准:(1)孕期及哺乳期妇女;(2)长期服用药物或保健品者。在男女比例及年龄配比上与病例组相似。
最终选取了4例MDD与4例健康对照组的全血进行全转录组测序。
所有纳入研究的对象均签署知情同意书。
2、研究方法
(1)样本采集:入组后,用EDTA抗凝管管中收集参与者肘静脉血,将得到的样品分装于无酶离心管,经液氮速冻后保存在-80℃直至分析。
(2)对样品进行circRNAs表达谱分析:文库建设和测序的整个步骤委托上海生命基因科技有限公司完成(Lifegenes,Shanghai),此过程涉及的方法、仪器以及试剂等均为已知技术。P<0.05,且|log2(foldchange)|>1为显著差异表达阈值。
3、结果
MDD患者全血的circRNAs表达谱聚类分析见图1。由图1可知,最终得到445个差异表达的circRNAs,包括有circUBE2K在内的67个上调circRNAs和378个下调circRNAs。
实施例2:实时荧光定量PCR检测MDD患者全血中circRNAs的表达
一、研究对象和研究方法
1.研究对象
病例组(MDD)为2020年7月到2020年9月,在广东医科大学附属医院的患者,共入组29名。
健康对照人群为附近社区居民,共入组19名。纳入以及排出标准与实施例1相同。
2.研究方法
(1)样本采集:与实施例1相同。
(2)全血总RNA提取:根据产品说明书,用Trizol试剂(美赛默飞世尔Invitrogen,美国)提取总RNA。将提取的RNA溶解在RNase Free H2O(艾科瑞生物Accurate Biology,中国)中,并使用酶标仪(美国BioTek Epoch)定量。
(3)实时荧光定量PCR:根据产品说明书,使用Evo M-MLV RT Kit with gDNAClean for qPCR II试剂盒(艾科瑞生物Accurate Biology,中国)进行定量RNA的逆转录。
定量RNA的逆转录具体为:将1000ng RNA,2ul 5X gDNA去除缓冲液,1ul gDNA去除剂和RNase Free H2O混合至终体积10ul。
然后将混合液置于PCR仪中进行gDNA去除,反应条件为42℃2min;4℃暂存。再加入4ul 5X RTase Reaction Buffer Mix I,1ul Evo M-MLV RTase Enzyme Mix,4ul RNaseFree H2O和1ul RT Primer Mix,至上述四种试剂的终体积为20ul,然后将混合液置于PCR仪中进行反转录,反应条件如下:反转录反应:37℃下15min;加热使反转录酶失活:85℃下5s;4℃暂存。
上述试剂包括RNase Free H2O、RTase Reaction Buffer Mix I、Evo M-MLVRTase Enzyme Mix、RT Primer Mix均来自Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCRII试剂盒(艾科瑞生物Accurate Biology,中国)。
将1ul cDNA,5ul 2XGreen Pro Taq HS预混液(艾科瑞生物AccurateBiology,中国),3.4ul RNase Free H2O,0.2ul上游引物(10uM),0.2ul下游引物(10uM)和0.2ul ROX参比染料(4uM)混合,然后将混合液置于实时荧光定量PCR仪ABI 7500(美国Applied Biosystems)中进行荧光定量,反应条件为:预变性:95℃30秒;PCR反应:95℃5秒,60℃30秒,循环数为40次;4℃暂存。
用内参基因β-actin将circRNAs的表达水平进行标准化。circRNAs的相对表达水平使用2-ΔΔCt方法定量来表示。
本实施例中所使用的上游引物和下游引物分别为下表1中所示的circUBE2K标志物、内参human-β-actin的引物,且每个引物组合重复实验3次,取均值。
表1:可作为分子标志物的circRNAs所用的引物
3、结果
(1)标志物circUBE2K的差异表达
根据|log2(fold change)|>1且并且p<0.05,选择排名前10位的人鼠同源的circRNAs,通过荧光定量PCR验证这些circRNAs在29名MDD患者和19名健康对照人群中的差异表达,结果如图2a中所示,作为潜在生物标志物的circUBE2K在MDD患者中的表达明显比健康对照人群高,且具有统计学意义(p<0.05)。
(2)标志物circUBE2K对MDD的预测能力
用受试者工作特征曲线ROC分析标志物circUBE2K对MDD的预测能力,结果如图2b所示,由图2b可知,敏感度(sensitivity)达到93.1%,截断值(cut-off value)为1.181,特异性(specificity)为75%,曲线下面积(AUC=0.8642,p<0.0001)提示全血circUBE2K对MDD有较好的诊断价值。
(3)标志物circUBE2K的表达水平与抑郁程度的关系
分析circUBE2K的表达水平和MDD患者汉密顿抑郁量表得分(HamiltonDepression Scale,HAMD)曲线,结果如图2c,可知HAMD-17与circUBE2K的表达水平的皮尔逊相关(r)=0.3990,p=0.0320;HAMD-24与circUBE2K的表达水平的皮尔逊相关(r)=0.4662,p=0.0108。说明circUBE2K的表达水平与MDD患者的HAMD得分呈正相关,即circUBE2K的表达水平越高,抑郁程度越重。
实施例3:小鼠脑组织中标志物circUBE2K的PCR检测和探针荧光原位杂交
一、研究对象与研究方法
1、研究对象
CUMS抑郁模型。本实验是受广东医科大学伦理委员会许可后实施的。包括将C57小鼠利用慢性温和不可预测性应激(CUMS)方式制作抑郁小鼠。小鼠均置于无特定病原体动物(SPF:specific pathogen free)的环境中饲养和护理。
2、研究方法
(1)CUMS抑郁模型
取4周大小C57小鼠38只,分两组,CON组19只、CUMS16只。CUMS组小鼠随机给予如表2中所示的刺激,每日进行1-2种刺激,3天内不出现同种刺激,造模时长为12周。CON组小鼠约4只一笼进行饲养,CUMS组小鼠独笼饲养。
表2:CUMS组小鼠给予的刺激类型
1 | 缺水 |
2 | 缺食 |
3 | 缺锯末 |
4 | 湿锯末 |
5 | 缺锯末+薄水 |
6 | 同笼 |
7 | 束缚 |
8 | 无刺激 |
9 | 昼夜颠倒 |
10 | 24h光照 |
11 | 24h黑暗 |
12 | 倾斜 |
13 | 红光频闪 |
14 | 夹尾 |
15 | 空水瓶 |
(2)糖水偏好:分别对于CON组、CUMS组的小鼠进行糖水偏好测试,具体测试如下:
适应期:第一个24小时,每笼放置两瓶1%蔗糖水;第二个24小时,每笼放置一瓶蔗糖水、一瓶饮用水。第三个24h,交换两种水瓶位置。
测试期:第一个24小时:同时给予每只小鼠事先称量好的两瓶水:一瓶1%蔗糖水,一瓶饮用水,24h后取走两瓶并称重。第二个24小时:交换两种水瓶位置,并在24h后取走两瓶并称重。第三个24h:交换两种水瓶位置并24h后取走两瓶并称重。计算小鼠的糖水偏爱指数(糖水偏爱=糖水消耗/总液体消耗×100%)。结果如图3a所示。
(3)PCR检测
样本采集:CON小鼠和CUMS小鼠分别经颈部脱臼处死,断头取脑,脑组织沿矢状面一分为二,经液氮速冻后保存于-80℃中。
组织总RNA提取:取小鼠半脑组织,加入适量Trizol试剂(Invitrogen,美国)研磨,根据产品说明书,提取总RNA。将提取的RNA溶解在RNase Free H2O中,并使用酶标仪(美国BioTek Epoch)定量。
实时荧光定量PCR检测:首先进行定量RNA的逆转录,具体过程与实施例2中的定量RNA的逆转录过程相同,不同点在于本实施例中所使用的上游引物和下游引物分别为下表3中所示的circUBE2K标志物、鼠GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的引物。
然后用GAPDH将circRNAs的表达水平进行标准化。circRNAs的相对表达水平使用2-ΔΔCt方法定量来表示。结果如图3b所示。
同时本实施例每个引物组合重复实验3次,取均值。
表3:可作为分子标志物的circRNAs所用的引物
引物名称 | 上游引物 | 下游引物 |
circUBE2K | TTCCGTCACAGGGGCTATTT | TTTTGCTCGTCATTGATCTTTCA |
Mouse GAPDH | AGGTCGGTGTGAACGGATTTG | TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA |
(4)荧光原位杂交
脑组织的准备:小鼠用5%水合氯醛腹腔注射麻醉后,经左心室生理盐水灌注至流出的液体澄清;再用4%多聚甲醛灌注固定,取脑。脑组织取出后立即放入4%多聚甲醛(4℃)固定约16h,再分别于10%、20%、30%蔗糖水中脱水(4℃)后OCT包埋,-80℃保存。
荧光原位杂交:
第一天:分别取CON组、CUMS组的小鼠脑组织,在冰冻切片机中制备厚度为10um的脑组织冰冻切片。脑组织切片于4%多聚甲醛固定5min,1XPBS洗3次,每次5min。免疫荧光强力通透液(碧云天生物试剂-P0097),室温孵育5min,1XPBS洗3次,每次5min。
采用探针杂交液稀释circUBE2K探针(稀释比例为1:200),此circUBE2K探针委托广州市杏海生物科技有限公司制备。探针变性:将探针杂交液置于PCR仪上,88℃变性5min,4℃平衡3min。将变性好的探针杂交液覆盖脑组织切片样品,避光,37℃孵育过夜(20-22h)。
第二天:吸去探针杂交液,42℃2XSSC洗2次,每次5min;42℃0.2XSSC洗2次,每次5min。4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育3min。1XPBS洗3次,每次5min。加抗荧光猝灭剂,封片切片于奥林巴斯共聚焦(FV3000)下观察并采集图像,结果如3c所示。
3、结果
由图3a可知,CUMS组小鼠糖水偏好明显下降,提示其存在抑郁样行为,即小鼠抑郁模型造模成功。
如图3b所示,可知circUBE2K在CON组和CUMS组小鼠的大脑组织中均有表达,但在CUMS组表达水平高于在CON组的表达水平。
由图3c可知,circUBE2K在CON组和CUMS组小鼠大脑中均有表达,其中海马CA3区和皮层区表达较多。
以上结果表明circUBE2K存在于小鼠脑组织中,并且在CUMS小鼠大脑中表达高于CON组小鼠,荧光原位杂交实验也证实了这一点,荧光原位杂交实验也提示了circUBE2K在CA3区和皮层区(CORTEX)表达较多,提示其可能通过调控海马CA3区和(或)皮层区功能来影响抑郁的发病。
由实施例1-3的研究结果表明:circUBE2K在MDD患者全血和抑郁小鼠模型皮层和海马的表达升高,且circUBE2K表达水平与抑郁程度相关,ROC分析证实了circUBE2K对MDD有较好的诊断价值,这些结果提示了circUBE2K可作为MDD的生物标志物,用于诊断MDD并评估病情严重程度。基于此提供了一种含有circUBE2K的上、下游引物的MDD诊断试剂盒,其能够测定血液中的circUBE2K的含量。
实施例4:circUBE2K可改变小鼠大脑小胶质细胞表型
1、研究对象
CON小鼠和CUMS小鼠。
2、研究方法
(1)荧光原位杂交试验和IF共染:
第一天:分别取实施例3中得到的CON组、CUMS组的脑组织切片,4%多聚甲醛,固定5min,1XPBS洗3次,每次5min。免疫荧光强力通透液(碧云天生物试剂-P0097),室温孵育5min,1XPBS洗3次,每次5min。10%山羊血清封闭40min,不洗。一抗IBA1(WAKO#019-19741,稀释比例1:250)、GFAP(ABCAM-ab7260,稀释比例1:200)、MAP2(1:200ABCAM-ab4074,稀释比例1:200),避光,4℃孵育过夜(19-20h)。
用探针杂交液稀释circUBE2K探针(稀释比例1:200),探针委托广州市杏海生物科技有限公司制备,探针的具体制备过程采用已知方法。探针变性:将探针杂交液置于PCR仪上,88℃变性5min,4℃平衡3min。将变性好的探针杂交液覆盖脑组织切片样品,避光,37℃孵育过夜(20-22h)。
第三天:吸去杂交探针液,42℃2*SSC洗2次,每次5min;42℃0.2*SSC洗2次,每次5min。DAPI孵育3min。1XPBS洗3次,每次5min。加抗荧光猝灭剂,封片切片于奥林巴斯共聚焦(FV3000)下观察并采集图像。结果如图4a所示。
(2)过表达circUBE2K后小胶质细胞形态的改变
1、研究对象
C57小鼠。小鼠均置于SPF(specific pathogen free)环境中饲养和护理。
2、研究方法
(1)小鼠circUBE2K过表达模型
取23只C57小鼠,分为circCON组(15只)和circUBE2K组(8只),circCON组经脑立体定位技术于两侧海马部位注射各1.5ul慢病毒-HBLV-ZsGreen(汉恒生物)过表达对照病毒;
circUBE2K组经脑立体定位技术于两侧海马部位注射各1ulHBLV-mmu-circ-0012726-Null-ZsG病毒(病毒由汉恒生物科技有限公司制备,具体制备过程采用现有技术)。两个月后再将circCON组分为circCON-NC组和circCON-CUMS组和circUBE2K(即circUBE2K-CUMS)组进行CUMS造模12周。
(2)脑组织的准备:与实施例3中的脑组织准备过程相同。
(3)免疫荧光
分别取(2)中得到的对应于circUBE2K-CUMS组、circCON-CUMS组、circCON-NC组的脑组织进行如下操作:
第一天:分别取(2)中得到的对应于circUBE2K-CUMS组、circCON-CUMS组、circCON-NC组的脑组织,4%多聚甲醛,固定5min,1XPBS洗3次,每次5min。免疫荧光强力通透液(碧云天-P0097),室温孵育5min,1XPBS洗3次,每次5min。10%山羊血清封闭40min,不洗。一抗IBA1(1:250WAKO#019-19741)。
第二天:回收一抗,1XPBS洗3次,每次5min。二抗(abcam-Alexa594,浓度:1:200,羊抗兔),避光,室温孵育1h。回收二抗,1XPBS洗3次,每次5min。DAPI孵育3min。1XPBS洗3次,每次5min。加抗荧光猝灭剂,封片,切片于奥林巴斯共聚焦(FV3000)下观察并采集图像。结果如图4b所示。
3、结果
由图4a可知,circUBE2K与GFAP、IBA1、MAP2均有共定位,其中与IBA1共定位最明显,提示circUBE2K可能与小胶质细胞存在关联。
如图4b所示,circUBE2K-CUMS组小胶质细胞标志物IBA1的亮度高于circCON-CUMS组,而circCON-CUMS组又高于circCON-NC组。说明CUMS小鼠小胶质细胞活化,而且过表达circUBE2K能加强小胶质细胞的活化,小胶质细胞与神经炎症相关,circUBE2K能促进神经炎症发生。
实施例5:过表达circUBE2K后小鼠脑组织炎症因子变化谱
1、研究对象
随机挑选实施4中得到的3只circCON-CUMS组和3只circUBE2K-CUMS组的C57小鼠。
2、研究方法
(1)小鼠circUBE2K过表达模型:
同实施例4。
(2)脑组织的准备:
取(1)中的两组小鼠,经颈部脱臼处死,断头取脑,脑组织沿矢状面一分为二,液氮速冻后保存于-80℃中。
(3)小鼠炎症细胞因子(Inflammation)抗体芯片(QAM-INF)检测:
整个检测过程委托广州瑞博奥生物科技有限公司完成。采用QAM-INF-1的数据分析软件来进行数据分析,具体检测和分析过程均采用已知技术进行,结果如图5所示。
3、结果
如图5所示,在circUBE2K-CUMS组中炎症因子KC、MCP-5、MCSF、RANTES、LIX、TNFα、MIG、Leptin升高,提示circUBE2K-CUMS小鼠有神经炎症发生。CircUBE2K可能通过炎症机制发挥作用。
在实施例4、5中,通过干预circUBE2K小鼠大脑中的表达,发现小胶质细胞表型发生了改变。过表达circUBE2K后小鼠大脑中小胶质细胞得到激活,并且炎症因子升高,提示小鼠大脑有神经炎症发生。表明CircUBE2K可能通过激活小胶质细胞参与神经炎症发生进而导致抑郁。说明CircUBE2K可作为MDD的生物标志物,并且可能是MDD发生的新的基因靶点。
实施例6:试剂盒
如实施例2中所述,本发明实施例提供的试剂盒中包含circRNA标志物的引物组合,该引物组合包括上游引物与下游引物;其中,上游引物为:TTCCGTCACAGGGGCTATTT;下游引物为:TTTTGCTCGTCATTGATCTTTCA。
该试剂盒还包括逆转录、PCR反应用的酶和试剂,以及内参。优选地,本发明实施例中,试剂盒包括5X gDNA去除缓冲液、gDNA去除剂、RNase Free H2O、5X RTase ReactionBuffer Mix I、Evo M-MLV RTase Enzyme Mix、1ul RT Primer Mix、2XGreen ProTaq HS预混液、ROX参比染料和上、下游引物,选用β-actin作为内参。
该试剂盒的具体制备过程见实施例2中的(2)全血总RNA提取、(3)实时荧光定量PCR中所述。
本发明提供的MDD生物标记物circRNA标记物,经临床验证之后,有较高的诊断参考价值。抑郁症的诊断将不依靠主观经验判断,而是可以通过circRNA表达水平这种客观指标检查,辅助临床诊断MDD并评估病情严重程度;有望通过改变特定circRNA表达水平能够使异常的基因调控网络和信号通路正常化,进而治疗MDD。
本发明各实施例中未提及的方法、检测过程等均是采用已知技术进行,且未提及的仪器、设备、试剂等均是可以通过外购或其他的方式得到,均是现有技术,在此不进行赘述。
以上所述的具体实施方式,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施方式而已,并不用于限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东医科大学附属医院
<120> 用于重性抑郁障碍诊断的circRNA标志物及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 236
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgagcaaaa atcaaattaa agtagatctt gtagatgaga attttacaga attaagagga 60
gaaatagcag gacctccaga cacaccatat gaaggaggaa gataccaact agagataaaa 120
ataccagaaa catacccatt taatccccct aaggtccggt ttatcactaa aatatggcat 180
cctaatatta gttccgtcac aggggctatt tgtttggata tcctgaaaga tcaatg 236
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttccgtcaca ggggctattt 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttttgctcgt cattgatctt tca 23
Claims (10)
1.一种用于重性抑郁障碍诊断的circRNA标志物,其特征在于,所述circRNA标志物为circUBE2K,所述circUBE2K的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的circRNA标志物,其特征在于,所述circRNA标志物为患者全血标志物。
3.一种如权利要求1所述的circRNA标志物的筛选方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)通过对MDD患者和正常对照全血进行全转录组测序,筛选出差异表达的circRNA;
(2)扩大样本量进行qRT-PCR验证差异circRNA;
(3)用ROC曲线和相关性分析判断相关circRNA的对MDD的诊断价值;
(4)在动物和细胞模型上相关circRNA对疾病的作用和影响研究。
4.如权利要求1所述的circRNA标志物的引物组合,其特征在于,所述引物组合包括上游引物与下游引物;
所述上游引物为:TTCCGTCACAGGGGCTATTT;
所述下游引物为:TTTTGCTCGTCATTGATCTTTCA。
5.如权利要求1所述的circRNA标志物或权利要求3所述的引物组合在制备重性抑郁障碍诊断试剂盒中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述试剂盒检测全血中circRNA标志物的含量。
7.一种诊断试剂盒,其特征在于,包括如权利要求3所述的引物组合。
8.如权利要求7所述的一种诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒内还包括逆转录、PCR反应用的酶和试剂,以及内参。
9.如权利要求7或8所述的一种诊断试剂盒的制备方法,其特征在于,包括:全血总RNA提取、定量RNA逆转录、实时荧光定量PCR、用内参基因β-actin将circRNAs的表达水平进行标准化。
10.如权利要求9所述的诊断试剂盒的制备方法,其特征在于,
所述定量RNA逆转录的过程包括:将提取的总RNA、5X gDNA去除缓冲液、gDNA去除剂、RNase Free H2O混合,得混合液;将得到的混合液置于PCR仪中进行gDNA去除;进行反转录;
所述实时荧光定量PCR的过程包括:将cDNA、预混液、RNase Free H2O、上游引物、下游引物、ROX参比染料混合,将得到的混合液置于实时荧光定量PCR仪中进行荧光定量。
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Title |
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