CN114480313A - 一种荧光素酶冻干粉制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种荧光素酶冻干粉制备工艺，包括以下步骤：S1、对虫荧光素酶溶液使用亲和层析方法进行纯化；S2、加入相对于虫荧光素酶溶液体积为5‑50％虫荧光素酶冻干保存液；S3、进行冻干程序：首先使得步骤S2中混合溶液在5℃条件下进行预冻2‑3h，预冻后在真空状态在进行冻干，所述冻干的温度曲线为：在‑30～‑25℃保持4‑5h，在‑18～‑10℃保持1‑3h，在0～10℃保持6～8h；结束后冻干完成。本发明提供的重组虫荧光素酶K的冻干工艺操作简单、成本低廉，制备得到的虫荧光素酶干粉热稳定性以及保存稳定性优异。
Description
技术领域
本发明涉及酶的冻干技术领域，具体涉及一种荧光素酶冻干粉制备工艺。
背景技术
大部分萤火虫荧光素酶由单一的多肽链构成，而且不同的萤火虫提取出来的萤火虫荧光素酶的相对分子量和结构各有些差异，从北美萤火虫中提取出来的荧光素酶的相对分子质量约为62kD，是由551个氨基酸残基构成的含有大量的疏水氨基酸残基的单一多肽链。虫荧光素酶能有效的催化由三膦酸腺苷(ATP)，荧光素，氧气和Mg2+组成的反应，同时将生物能转化成光能发出荧光。影响荧光素酶催化发光的因素很多，包括ATP，荧光素，氧气，镁离子的浓度，pH以及反应温度等。目前应用最广泛的是北美萤火虫荧光素酶，其最适反应温度为37℃，最适反应pH为7.8。虽然荧光素酶催化生物发光技术在食品，医学，农业，生命科学等领域有广阔的应用前景，但荧光素酶对温度及冻融等因素极为敏感，使用前需分装保存在-20℃冰箱中，否则极易失活。由于荧光素酶的不稳定性，因此很大程度的制约了其产品的开发和应用。
虫荧光素酶的特点是热稳定性差，受热极易失去活性，这将极大的限制其应用性，也极大的降低了其商业价值。通过对其冻干和冻干配方的调整，得到了热稳定性优异的虫荧光素酶冻干粉，使其应用和商业价值得到了进一步提升。针对上述情况，本申请提出了一种荧光素酶冻干粉制备工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光素酶冻干粉制备工艺，制备得到的虫荧光素酶干粉的热稳定性以及保存稳定性优异。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题的：
一种荧光素酶冻干粉制备工艺，包括以下步骤：
S1、对虫荧光素酶溶液使用亲和层析方法进行纯化；
S2、加入相对于虫荧光素酶溶液体积为5-50％虫荧光素酶冻干保存液；
S3、进行冻干程序：首先使得步骤S2中混合溶液在5℃条件下进行预冻2-3h，预冻后在真空状态在进行冻干，所述冻干的温度曲线为：在-30～-25℃保持4-5h，在-18～-10℃保持1-3h，在0～10℃保持6～8h；结束后冻干完成。
进一步地，所述冻干保存液包括葡萄糖、海藻糖、甘露醇、BSA、氯化钠和缓冲液中的一种或几种。
进一步地，所述葡萄糖、海藻糖、甘露醇、BSA、氯化钠和缓冲液的体积比为1-10:1-10：5-15:1-5：1-5:0.1-1。
进一步地，所述葡萄糖、海藻糖、甘露醇、BSA、氯化钠和缓冲液的体积比为4:5:8:3:1:0.1。
进一步地，所述缓冲液为磷酸氢二钠。
本发明的优点在于：本发明一种荧光素酶冻干粉制备工艺，操作简单、成本低廉，制备得到的虫荧光素酶干粉热稳定性以及保存稳定性优异。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1
本实施例提供一种荧光素酶冻干粉制备工艺，包括以下步骤：
S1、对虫荧光素酶溶液使用亲和层析方法进行纯化；
S2、总体积为1mL，虫荧光素酶溶液中加入虫荧光素酶冻干保存液，具体包括葡萄糖4％，海藻糖5％，甘露醇8％，BSA 3％，氯化钠1％，磷酸氢二钠0.1％；
S3、进行冻干程序：首先使得步骤S2中混合溶液在5℃条件下进行预冻2.5h，预冻后在真空状态在进行冻干，所述冻干的温度曲线为：在-30℃保持4.5h，在-15℃保持2h，在5℃保持7h；结束后冻干完成。
实施例2
本实施例提供一种荧光素酶冻干粉制备工艺，包括以下步骤：
S1、对虫荧光素酶溶液使用亲和层析方法进行纯化；
S2、总体积为1mL，虫荧光素酶溶液中加入虫荧光素酶冻干保存液，具体包括葡萄糖5％，海藻糖5％，甘露醇10％，BSA 5％，氯化钠5％，磷酸氢二钠1％；
S3、进行冻干程序：首先使得步骤S2中混合溶液在5℃条件下进行预冻2.5h，预冻后在真空状态在进行冻干，所述冻干的温度曲线为：在-30℃保持4.5h，在-15℃保持2h，在5℃保持7h；结束后冻干完成。
实施例3
本实施例提供一种荧光素酶冻干粉制备工艺，包括以下步骤：
S1、对虫荧光素酶溶液使用亲和层析方法进行纯化；
S2、总体积为1mL，虫荧光素酶溶液中加入虫荧光素酶冻干保存液，具体包括葡萄糖1％，海藻糖1％，甘露醇5％，BSA 1％，氯化钠1％，磷酸氢二钠0.1％；
S3、进行冻干程序：首先使得步骤S2中混合溶液在5℃条件下进行预冻2.5h，预冻后在真空状态在进行冻干，所述冻干的温度曲线为：在-30℃保持4.5h，在-15℃保持2h，在5℃保持7h；结束后冻干完成。
实施例4
本实施例提供一种荧光素酶冻干粉制备工艺，包括以下步骤：
S1、对虫荧光素酶溶液使用亲和层析方法进行纯化；
S2、总体积为1mL，虫荧光素酶溶液中加入虫荧光素酶冻干保存液，具体包括葡萄糖2％，海藻糖5％，甘露醇10％，BSA 2％，氯化钠2％，磷酸氢二钠0.3％；
S3、进行冻干程序：首先使得步骤S2中混合溶液在5℃条件下进行预冻2.5h，预冻后在真空状态在进行冻干，所述冻干的温度曲线为：在-30℃保持4.5h，在-15℃保持2h，在5℃保持7h；结束后冻干完成。
对比例1
本实施例提供一种荧光素酶冻干粉制备工艺，包括以下步骤：
S1、对虫荧光素酶溶液使用亲和层析方法进行纯化；
S2、总体积为1mL，虫荧光素酶溶液中加入虫荧光素酶冻干保存液，具体包括葡萄糖4％，海藻糖5％，甘露醇8％，BSA 3％，氯化钠1％，磷酸氢二钠0.1％；
S3、进行冻干程序：首先使得步骤S2中混合溶液在5℃条件下进行预冻2.5h，预冻后在真空状态在进行冻干，所述冻干的温度曲线为：在-20℃保持4.5h，在-5℃保持2h，在15℃保持7h；结束后冻干完成。
对比例1与实施例1的区别是虫荧光素酶冻干的温度曲线不同。
对比例2
本实施例提供一种荧光素酶冻干粉制备工艺，包括以下步骤：
S1、对虫荧光素酶溶液使用亲和层析方法进行纯化；
S2、总体积为1mL，虫荧光素酶溶液中加入虫荧光素酶冻干保存液，具体包括葡萄糖4％，海藻糖5％，甘露醇8％，BSA 3％，氯化钠1％，磷酸氢二钠0.1％；
S3、进行冻干程序：使得步骤S2中混合溶液在真空状态在进行冻干，所述冻干的温度曲线为：在-30℃保持4.5h，在-15℃保持2h，在5℃保持7h；结束后冻干完成。
对比例2与实施例1的区别是未进行预冻。
将上述实施例1-4和中得到的冻干粉进行测试，结果如下：
实施例1中冻干粉形态完好，活性保持99％，37℃下7天活性保持98％，14天活性保持95％，21天活性保持90％。
实施例2中冻干粉形态完好，活性保持98％，37℃下7天活性保持90％，14天活性保持82％，21天活性保持80％。
实施例3中冻干粉形态完好，活性保持99％，37℃下7天活性保持95％，14天活性保持86％，21天活性保持82％。
实施例4中冻干粉形态完好，活性保持98％，37℃下7天活性保持98％，14天活性保持92％，21天活性保持89％。
对比例1中冻干粉形态完好，活性保持85％，37℃下7天活性保持65％，14天活性保持15％，21天活性保持10％。
对比例2中冻干粉形态完好，活性保持70％，37℃下7天活性保持40％，14天活性保持6％，21天活性保持2％。
汇总如下表所示：
| 活性保持比例 | 冻干粉活性 | 37℃下7天 | 37℃下14天 | 37℃下21天 |
| 实施例1 | 99％ | 98％ | 95％ | 90％ |
| 实施例2 | 98％ | 90％ | 82％ | 80％ |
| 实施例3 | 99％ | 95％ | 86％ | 82％ |
| 实施例4 | 98％ | 98％ | 92％ | 89％ |
| 对比例1 | 85％ | 65％ | 15％ | 10％ |
| 对比例2 | 70％ | 40％ | 6％ | 2％ |
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
Claims (5)
1.一种荧光素酶冻干粉制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1、对虫荧光素酶溶液使用亲和层析方法进行纯化；
S2、加入相对于虫荧光素酶溶液体积为5-50％虫荧光素酶冻干保存液；
S3、进行冻干程序：首先使得步骤S2中混合溶液在5℃条件下进行预冻2-3h，预冻后在真空状态在进行冻干，所述冻干的温度曲线为：在-30～-25℃保持4-5h，在-18～-10℃保持1-3h，在0～10℃保持6～8h；结束后冻干完成。
2.根据权利要求1所述的一种荧光素酶冻干粉制备工艺，其特征在于，所述冻干保存液包括葡萄糖、海藻糖、甘露醇、BSA、氯化钠和缓冲液中的一种或几种。
3.据权利要求2所述的一种荧光素酶冻干粉制备工艺，其特征在于，所述葡萄糖、海藻糖、甘露醇、BSA、氯化钠和缓冲液的体积比为1-10:1-10：5-15:1-5：1-5:0.1-1。
4.据权利要求2所述的一种荧光素酶冻干粉制备工艺，其特征在于，所述葡萄糖、海藻糖、甘露醇、BSA、氯化钠和缓冲液的体积比为4:5:8:3:1:0.1。
5.根据权利要求2所述的一种荧光素酶冻干粉制备工艺，其特征在于，所述缓冲液为磷酸氢二钠。
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| Title |
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| SHINGO KIKUTA等: "Towards water-free biobanks: long-term dry-preservation at room temperature of desiccation- sensitive enzyme luciferase in air- dried insect cells", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 7, pages 6540 * |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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