CN114480290A - 一种诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法 - Google Patents

一种诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法 Download PDF

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冷毅斌
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Abstract

本发明具体涉及一种诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法。其具体方法是将对数生长期的肿瘤细胞经同步化处理后以悬浮态接种于肿瘤干细胞诱导培养基中，间隔固定的时间周期性施以机械力悬浮，分散已贴壁的肿瘤细胞，继续培养即得。本发明通过同步化无血清处理、悬浮态接种、周期性悬浮分散的方法降低了细胞自身的粘附能力，使细胞直接进入悬浮态并完成干性肿瘤细胞的筛选过程，仅使用普通培养皿、移液枪、离心机等即可完成，在实现优质实验结果的同时打破了贵重耗材、高级设备、复杂技术限制，降低了实验成本、设备限制、技术门槛。

Description

一种诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法
技术领域
本发明涉及肿瘤医学、细胞生物学技术领域，具体涉及一种诱导肿瘤细胞系形成肿瘤干细胞的方法。
背景技术
近年的研究证实，在肿瘤组织中存在着少数具有干细胞性质的细胞群体，这些细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，被称为肿瘤干细胞；肿瘤干细胞可能是导致恶性肿瘤复发和转移的根本原因。绝大部分的实体肿瘤被认为起源于肿瘤干细胞，肿瘤干细胞可能是导致肿瘤临床治疗原发性和获得性耐药的重要原因之一，因此，近年来对于肿瘤干细胞的研究吸引了国内外肿瘤基础研究的广泛关注。但是，仍旧有很多的因素制约着肿瘤干细胞的研究，其中一个关键因素就是肿瘤干细胞的培养和筛选技术还不够成熟，无法大范围、大通量得对各种肿瘤细胞系进行广泛研究。
目前，常见的肿瘤干细胞的培养和筛选方法有以下几种：流式细胞仪分选法、无血清神经干细胞培养基成球培养法、免疫磁珠分离法等，其中成球培养法是最为常用的方法。成球培养法的原理是肿瘤干细胞被发现在无血清但富含一定细胞因子的培养条件下，可以成团生长繁殖，形成如葡萄串样的克隆肿瘤群，而普通肿瘤细胞却无法良好增殖，从而起到筛选和富集作用。
但是，现有的成球培养法的步骤一般是采用先贴壁再诱导的方法，诱导成功率低、实验周期极长、无法诱导粘附性强或高分化的细胞系，且需要采用定制的低粘附细胞培养板来降低肿瘤细胞的粘附作用进而降低细胞与培养板间的粘附力，实验成本较高。
发明内容
基于此，本发明提供了一种新的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，以解决背景技术中所提到的现有的成球培养存在的问题。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供一种诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其不同之处在于，将对数生长期的肿瘤细胞经同步化处理后以悬浮态接种于肿瘤干细胞诱导培养基中，间隔固定的时间周期性施以机械力悬浮，分散已贴壁的肿瘤细胞，继续培养即得。
传统的成球培养法中一般是“静态等待”肿瘤细胞从贴壁细胞中“漂浮”出来，而在本发明的一种实施方式中，培养的过程中采用周期悬浮处理的步骤，使所有细胞全程处于“非贴壁无血清”的生存状态中，加速筛选过程，并且解决了贴壁性强、分化程度高的一类肿瘤细胞在初始贴壁期停滞、死亡导致容易失败的问题。
具体地，周期性悬浮的方法为每10～12h吹打贴壁细胞成单细胞悬液一次。
作为本发明的一种实施方式，同步化处理的步骤如下：在进入对数生长期的肿瘤细胞中加入无血清培养基培养，例如：可采用DMEM/F12培养基，但是对于某些原基础培养基非DM/F12的细胞系，亦可采用原基础培养基替换DM/F12，同步化处理的时间一般为10～12h。相较于传统诱导方法中接种细胞后再诱导的“先贴壁再诱导”方法，本方案通过直接将贴壁肿瘤细胞经同步化处理后收集并视作为悬浮细胞接种于肿瘤干细胞诱导培养基中进行“悬浮诱导”，干扰了接种后的非干性肿瘤细胞的贴壁生存，降低了非干性细胞裹挟干性肿瘤细胞贴壁存活而带来的诱导阻力，缩短了后续诱导实验周期。
作为本发明的一种实施方式，悬浮态接种的步骤如下：将同步化处理后的细胞消化收集，直接接种在肿瘤干细胞诱导培养基中即可。
其中，细胞的消化收集包括以下步骤：加入酶处理后离心收集，细胞消化收集步骤中所采用的消化液为常规的0.25％胰蛋白酶即可。
作为本发明的一种实施方式，在培养过程中每隔20～24h更换一次肿瘤干细胞诱导培养基，具体的更换方式为：离心收集细胞，再将收集的细胞分散在新的肿瘤干细胞诱导培养基中即可。
作为本发明的一种实施方式，所述肿瘤干细胞诱导培养基为含有质量百分数为2％的B27细胞添加剂和1％的P/S(青霉素-链霉素混合液)、浓度为20ng/mL的RecombinantHuman LIF(人白血病抑制因子)、20ng/mL的Recombinant Human FGFb(人碱性成纤维细胞生长因子)和20ng/mL的Recombinant Human EGF(人表皮生长因子)的DMEM/F12培养基。
作为本发明的一种实施方式，所述诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法如下：(1)接种处于对数生长期且生长状态良好的肿瘤细胞于细胞培养皿中，培养基皿中的细胞培养液为：含有质量百分数为10％的FBS(胎牛血清)、和1％的P/S(青霉素-链霉素混合液)的DMEM/F12培养基，(2)无血清同步化处理：待细胞进入对数生长期后，更换无血清培养基持续10～12h；
(3)悬浮态接种：将同步化后的细胞消化收集，直接接种于肿瘤干细胞诱导培养基中，培养24h大部分细胞开始贴壁或呈蛙卵团块状漂浮；(4)周期性悬浮：诱导开始后以12h为周期循环以下操作，使用移液器吹打底部贴壁细胞，借助水流产生的机械力将底部贴壁细胞吹起，并继续吹打成单细胞悬液，周期性循环重复此操作培养至细胞失去贴壁性、粘附性，而后逐渐长出肿瘤干细胞球；(5)换液：定期更换新鲜的肿瘤干细胞诱导培养基，培养至肿瘤细胞小球逐步增殖为体积大、形状规则的肿瘤细胞球。。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明通过同步化预处理降低了非干性肿瘤细胞的增殖能力，提高了干性肿瘤细胞的适应性，可将诱导成功率提高。例如:HEPG2、HEP3B、HCCLM3由于贴壁性强或分化程度高而在传统方法下均失败的细胞系在本发明所述的方法培养均取得成功。
(2)采用“悬浮诱导”方法，干扰了接种后非干性肿瘤细胞的贴壁生存，降低了非干性细胞裹挟干性肿瘤细胞贴壁存活而带来的诱导阻力，可将诱导周期缩短至10～15天；
(3)采用周期性悬浮的方法，使所有细胞全程处于“非贴壁无血清”的生存状态中，解决了贴壁性强的一类肿瘤细胞在初始贴壁期停滞、死亡从而导致实验容易失败的问题；
(4)本发明通过同步化无血清处理、悬浮态接种、周期性悬浮的方法降低了细胞自身的粘附能力，使细胞直接进入悬浮态并完成干性肿瘤细胞的筛选过程，使用普通培养皿即可完成，打破了耗材限制、降低了实验成本。
附图说明
图1为实施例1、2和对比例1、2中培养过程中显微镜下的观察图，其中a、b、c依次为实施例1中0天、5天、10天的效果图，d、e、f依次为实施例2中0天、10天、20天的效果图，g、h、i依次为对比例1中0天、5天和10天的效果图，j、k、l依次为对比例2中0天、10天和20天的效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
原料厂家来源：
DMEM/F12培养基购自武汉普诺赛(Procell)生命科技有限公司；
B27细胞培养添加剂购自美国Gibco；
Recombinant Human EGF(人表皮生长因子)生长因子购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；
Recombinant Human FGFb(人碱性成纤维细胞生长因子)购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；
Recombinant Human LIF(人白血病抑制因子)购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；
P/S(青霉素-链霉素混合液)购自武汉普诺赛(Procell)生命科技有限公司；
肿瘤细胞来自于武汉普诺赛(Procell)生命科技有限公司。
实施例1
本实施例提供一种诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，具体是以HepG2(人肝癌细胞)为实验细胞，包括以下步骤：
(1)配制肿瘤干细胞诱导培养基：向DMEM/F12培养基中分别添加质量百分数为2％的B27细胞添加剂和1％的P/S(青霉素-链霉素混合液)、浓度为20ng/mL的RecombinantHuman LIF(人白血病抑制因子)、20ng/mL的Recombinant Human FGFb(人碱性成纤维细胞生长因子)和20ng/mL的Recombinant Human EGF(人表皮生长因子)。
(2)取处于对数生长期生长状态良好的肿瘤细胞。
(3)接种：准备好实验材料后，将处于对数生长期的肿瘤细胞接种到细胞培养皿中。
(4)无血清同步化：待细胞进入对数生长期，加入无血清DMEM/F12培养基，同步化处理12h。
(5)悬浮态接种：将同步化后的细胞用0.25％胰蛋白酶消化后1200rpm/min离心3min收集沉淀，直接接种于肿瘤干细胞诱导培养基中，培养24h大部分细胞开始贴壁或呈蛙卵团块状漂浮。
(6)周期性悬浮：诱导开始后以12h为周期循环以下操作，使用移液器吹打底部贴壁细胞，借助水流产生的机械力将底部贴壁细胞吹起，并继续吹打成单细胞悬液。周期性循环重复此操作培养至细胞失去贴壁性、粘附性，而后逐渐长出肿瘤干细胞球。
(7)换液：每24h更换新鲜的肿瘤干细胞诱导培养基。
(8)等待：初期(约第1～3天)细胞呈“葡萄样”团块悬浮存活，随后逐渐松散，大部分细胞逐步崩解死亡；筛选期(约3～10天)，出现体积小、连接紧密、形状不规则的肿瘤细胞小球；成熟期(约10～15天)，肿瘤细胞小球逐步增殖为体积大、形状规则的肿瘤细胞球。
实施例2
本实施例提供一种诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，具体是以HCCLM3(人高转移肝癌细胞)为实验细胞，包括以下步骤：
(1)配制肿瘤干细胞诱导培养基：向DMEM/F12培养基中分别添加质量百分数为2％的B27细胞添加剂和1％的P/S(青霉素-链霉素混合液)、浓度为20ng/mL的RecombinantHuman LIF(人白血病抑制因子)、20ng/mL的Recombinant Human FGFb(人碱性成纤维细胞生长因子)和20ng/mL的Recombinant Human EGF(人表皮生长因子)。
(2)取处于对数生长期生长状态良好的肿瘤细胞。
(3)接种：准备好实验材料后，将处于对数生长期的肿瘤细胞接种到细胞培养皿中。
(4)无血清同步化：待细胞进入对数生长期，加入无血清DMEM/F12培养基，同步化处理12h。
(5)悬浮态接种：将同步化后的细胞用0.25％胰蛋白酶消化后1200rpm/min离心3min收集沉淀，直接接种于肿瘤干细胞诱导培养基中，培养24h大部分细胞开始贴壁或呈蛙卵团块状漂浮。
(6)周期性悬浮：诱导开始后以12h为周期循环以下操作，使用移液器吹打底部贴壁细胞，借助水流产生的机械力将底部贴壁细胞吹起，并继续吹打成单细胞悬液。周期性循环重复此操作培养至细胞失去贴壁性、粘附性，而后逐渐长出肿瘤干细胞球。
(7)换液：每24h更换新鲜的肿瘤干细胞诱导培养基。
(8)等待：初期(约第1～3天)细胞呈“葡萄样”团块悬浮存活，随后逐渐松散，大部分细胞逐步崩解死亡；筛选期(约3～10天)，出现体积小、连接紧密、形状不规则的肿瘤细胞小球；成熟期(约10～15天)，肿瘤细胞小球逐步增殖为体积大、形状规则的肿瘤细胞球。
对比例1
本对比例提供一种传统无血清培养基诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，是实施例1的对比例，具体是以HepG2(人肝癌细胞)为实验细胞，包括以下步骤：
(1)配制肿瘤干细胞诱导培养基：向DMEM/F12培养基中分别添加质量百分数为2％的B27细胞添加剂和1％的P/S(青霉素-链霉素混合液)、浓度为20ng/mL的RecombinantHuman LIF(人白血病抑制因子)、20ng/mL的Recombinant Human FGFb(人碱性成纤维细胞生长因子)和20ng/mL的Recombinant Human EGF(人表皮生长因子)。
(2)取处于对数生长期生长状态良好的肿瘤细胞。
(3)接种：准备好实验材料后，将处于对数生长期的肿瘤细胞接种到低粘附的细胞培养皿中。
(4)换液诱导：加入新鲜的肿瘤干细胞诱导培养基开始诱导。
(5)持续等待：持续等待，约20日。
对比例2
本对比例提供一种传统无血清培养基诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，是实施例2的对比例，具体是以HCCLM3(人高转移肝癌细胞为实验细胞)，包括以下步骤：
(1)配制肿瘤干细胞诱导培养基：向DMEM/F12培养基中分别添加质量百分数为2％的B27细胞添加剂和1％的P/S(青霉素-链霉素混合液)、浓度为20ng/mL的RecombinantHuman LIF(人白血病抑制因子)、20ng/mL的Recombinant Human FGFb(人碱性成纤维细胞生长因子)和20ng/mL的Recombinant Human EGF(人表皮生长因子)。
(2)取处于对数生长期生长状态良好的肿瘤细胞。
(3)接种：准备好实验材料后，将处于对数生长期的肿瘤细胞接种到低粘附的细胞培养皿中。
(4)换液诱导：加入新鲜的肿瘤干细胞诱导培养基开始诱导。
(5)持续等待：持续等待，约20日。
结果分析：
定期观察实施例1、2和对比例1、2中的细胞状态，具体结果如下：
HepG2细胞系在对比例1，即传统诱导方式下，表现出始终贴壁生长，直至死亡；在实施例1中，HepG2细胞系短时间内5天左右即开始出现明显的肿瘤干细胞球，至10天时已经长成边缘规则、折光性强、中心致密的规则圆球，标志着肿瘤干细胞球的诱导成功。HCCLM3细胞系在对比例2中，表现为随着诱导时间延长能自发漂浮起来，但是成团块聚集漂浮，始终无法形成干细胞球；在实施例2中，HCCLM3作为一株高分化、高转移的癌细胞系，虽然历时稍长，但最终还是成功形成了肿瘤干细胞球。具体可参见图1。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将对数生长期的肿瘤细胞经同步化处理后以悬浮态接种于肿瘤干细胞诱导培养基中，间隔固定的时间周期性施以机械力悬浮，分散已贴壁的肿瘤细胞，继续培养即得。
2.根据权利要求1所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，周期性悬浮的方法为每10～12h吹打贴壁细胞成单细胞悬液一次。
3.根据权利要求1所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，所述同步化处理的步骤如下：在进入对数生长期的肿瘤细胞中加入无血清培养基培养。
4.根据权利要求3所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，同步化处理的时间为10～12h。
5.根据权利要求1所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，悬浮态接种的步骤如下：将同步化处理后的细胞消化收集，直接接种在肿瘤干细胞诱导培养基中即可。
6.根据权利要求5所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，细胞的消化收集包括以下步骤：酶处理后离心收集。
7.根据权利要求5或6所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，细胞消化收集步骤中所采用的消化液为0.25％胰蛋白酶。
8.根据权利要求1所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，培养过程中每隔20～24h更换肿瘤干细胞诱导培养基。
9.根据权利要求1所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，所述肿瘤干细胞诱导培养基为含有质量百分数为2％的B27细胞添加剂和1％的P/S、浓度为20ng/mL的人白血病抑制因子、20ng/mL的人碱性成纤维细胞生长因子和20ng/mL的人表皮生长因子的DMEM/F12培养基。
10.根据权利要求1所述的诱导肿瘤细胞形成肿瘤干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)接种处于对数生长期且生长状态良好的肿瘤细胞于细胞培养皿中，培养基皿中的细胞培养液为：含有质量百分数为10％的胎牛血清、和1％的P/S的DMEM/F12培养基。
(2)无血清同步化处理：待细胞进入对数生长期后，更换无血清培养基持续10～12h；
(3)悬浮态接种：将同步化后的细胞消化收集，直接接种于肿瘤干细胞诱导培养基中，培养24h大部分细胞开始贴壁或呈蛙卵团块状漂浮；
(4)周期性悬浮：诱导开始后以12h为周期循环以下操作，使用移液器吹打底部贴壁细胞，借助水流产生的机械力将底部贴壁细胞吹起，并继续吹打成单细胞悬液，周期性循环重复此操作培养至细胞失去贴壁性、粘附性，而后逐渐长出肿瘤干细胞球；
(5)换液：定期更换新鲜的肿瘤干细胞诱导培养基，培养至肿瘤细胞小球逐步增殖为体积大、形状规则的肿瘤细胞球。
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