CN114480216A - 嗜热脂肪芽孢杆菌菌株及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株新分离的嗜热脂肪芽孢杆菌菌株及其制备方法和应用。所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株于2021年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.24125。所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株用于降解聚苯乙烯，用于培养堆肥接种剂；所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株和所述堆肥接种剂用于有机固体废弃物堆肥减量化、资源化时，其可以提高堆肥发酵温度；不仅能够解决城镇污水处理厂污泥堆肥过程中微塑料难以降解的问题，还能够解决发酵温度无法提升、堆肥质量差等问题；通过本发明所述嗜热微生物分解发酵，能够在不依靠外源热源加热的条件下使堆肥产生极端高温的效果。

Description

嗜热脂肪芽孢杆菌菌株及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及有机固体废弃物资源化利用领域，具体涉及一种嗜热脂肪芽孢杆菌菌株及其制备方法和应用。
背景技术
污水处理厂是陆地微塑料污染物的主要接收体，它吸纳了来自于工厂、垃圾填埋场、民用污水还有洪水等来源的微塑料。
据研究结果发现，每公斤干污泥中含有大约4196～15385个微塑料颗粒。现阶段，污水处理厂进水来源复杂，包含的组分种类也多，但是现阶段一般的污水处理工艺则是主要针对水中的氨氮、COD、BOD、总氮、总磷等指标进行处置，而并未设置对微塑料等组分的降解等处理环节。
目前，废弃塑料的处理方式主要有物理化学回用、焚烧、填埋和微生物降解四种方式。用物理化学回用、焚烧、填埋等处置方式均存在污染大、副产物多等技术问题。而微生物降解方式中，聚苯乙烯能够被昆虫、细菌和真菌等不同种类的微生物所降解。但是，在对污泥进行堆肥处理时，一般堆肥温度为45～70℃，原因在于当堆肥温度达到或者超过70℃后，由于该温度超过了现有微生物的温度耐受范围，因此温度难以继续提升，进而也影响了堆肥的质量。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一株耐高温、耐碱、能降解聚苯乙烯的嗜热脂肪芽孢杆菌菌株(Bacillus stearothermophilus)及其制备方法和应用；所述的嗜热脂肪芽孢杆菌菌株可用于降解聚苯乙烯和培养堆肥接种剂；所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株和所述堆肥接种剂用于有机固体废弃物堆肥减量化、资源化时，其可以提高堆肥发酵温度；不仅能够解决城镇污水处理厂污泥堆肥过程中微塑料难以降解的问题，还能够解决发酵温度无法提升、堆肥质量差等问题；通过本发明所述嗜热微生物分解发酵，能够在不依靠外源热源加热的条件下使堆肥产生极端高温的效果。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一株嗜热脂肪芽孢杆菌菌株(Bacillus stearothermophilus)，已于2021年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.24125。
上述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株(Bacillus stearothermophilus)是首次从80℃以上的堆肥污泥样品中多次富集并筛选出来的。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
以上述的嗜热脂肪芽孢杆菌菌株DNA为模板，PCR扩增其16SrRNA 基因序列如SEQID NO：1。
获得的上述16SrRNA序列通过EzTaxon数据库(http： //www.ezbiocloud.net/)进行比对，与菌株Bacillus stearothermophilus的相似度最高，同源性为99.25％。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种根据前述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的制备方法，其包括以下步骤：
1)向灭菌的LB液体培养基中加入堆肥样品，在搅拌条件下培养；
2)将所得的培养液转接至灭菌的LB液体培养基中，在搅拌条件下培养；将转接后得到的培养液继续进行两次转接和培养，得菌悬液；
3)将菌悬液在无菌水中梯度稀释；取每个梯度的稀释液均涂布于LB 固体培养基平板上进行培养；
4)从平板上挑取菌落分散好的单菌落进行纯化，得到嗜热脂肪芽孢杆菌菌株。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种根据前述的嗜热脂肪芽孢杆菌菌株在聚苯乙烯降解中的应用。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术方案来实现。依据本发明提出一种含有前述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的堆肥接种剂。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
优选的，前述的堆肥接种剂，其中所述堆肥接种剂的形式为液体或粉剂。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种根据前述的堆肥接种剂的培养方法，其包括以下步骤：
将嗜热脂肪芽孢杆菌菌株接种于LB液体培养基中，培养发酵，得到发酵液；所述发酵液即为液体的堆肥接种剂；或者，将所述发酵液脱水、干燥，得到粉剂的堆肥接种剂。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
优选的，前述的培养方法，其中从嗜热脂肪芽孢杆菌菌株平板上取菌苔，并将菌株在LB固体培养基上重新划线，将划线后的菌株接种于LB液体培养基中进行培养，培养温度为60℃～80℃，搅拌速度为60～400转/分钟，通气量为1：0.1～0.5(v/v·min)，检测OD600值，至OD600值≥2.0时结束培养，得到发酵液。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种根据前述的嗜热脂肪芽孢杆菌菌株在有机固体废弃物堆肥减量化、资源化中的应用。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的根据前述的堆肥接种剂在有机固体废弃物堆肥减量化、资源化中的应用。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
优选的，前述的应用，其中所述有机固体废弃物选自厨余垃圾、城镇污水处理厂污泥、畜禽粪便、农作物秸秆、动物尸体和菌渣中的至少一种。
优选的，前述的应用，其包括以下步骤：
1)用水分调理剂将有机固体废弃物的水分调至含水率为50％～70％；将堆肥接种剂接种于有机固体废弃物中，混合均匀，好氧发酵；其中所述有机固体废弃物的碳氮质量比为(20～40):1；所述堆肥接种剂的重量为总物料湿重的0.5‰～5‰；
2)堆体发酵过程中，间隔2～5天翻抛1次；
3)堆体发酵7～30天后，将发酵剩余的物料过筛，得到有机肥料。
借由上述技术方案，本发明提出的一株嗜热脂肪芽孢杆菌菌株及其制备方法和应用至少具有下列优点：
本发明首次从80℃以上的堆肥污泥样品中多次富集并筛选出来一株嗜热脂肪芽孢杆菌菌株。所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株具有耐高温的特性，其在65℃～75℃生长活跃，最高生长温度在90℃～100℃。所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株具有耐碱特性，其在pH范围为6.8～9.5下生长活跃，生长最适宜的pH为8.5，能够在碱性环境下生长。所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株能够降解聚苯乙烯，可以将聚苯乙烯作为碳源进行生长。所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株应用于堆肥时，能帮助堆体跨越升温阶段，使堆体升温至80℃以上，可以有效实现城镇污水处理厂污泥减量化、资源化处置。所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株不仅能够解决城镇污水处理厂污泥堆肥过程中微塑料难以降解的问题，还能够解决发酵温度无法提升、堆肥质量差等问题；通过本发明所述嗜热微生物分解发酵，能够在不依靠外源热源加热的条件下使堆肥产生极端高温(80℃及以上)的效果，比传统高温堆肥更高效、更环保。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
附图说明
图1为实施例1嗜热脂肪芽孢杆菌菌株系统进化树；
图2为实施例1嗜热脂肪芽孢杆菌菌株凝胶成像图；
图3为实施例4嗜热脂肪芽孢杆菌降解聚苯乙烯质量下降图；
图4为实施例4嗜热脂肪芽孢杆菌降解聚苯乙烯分子量变化图；
图5a为实施例5堆肥接种剂降解的微塑料丰度图(3～5mm)；
图5b为实施例5堆肥接种剂降解的微塑料丰度图(1.25～3mm)；
图5c为实施例5堆肥接种剂降解的微塑料丰度图(0.5～1.25mm)；
图5d为实施例5堆肥接种剂降解的微塑料丰度图(0.3～0.5mm)；
图5e为实施例5堆肥接种剂降解的微塑料丰度图(＜0.3mm)；
图6为实施例6堆肥接种剂堆肥发酵污泥的温度变化曲线；
图7为实施例6堆肥接种剂堆肥发酵污泥的含水率变化曲线。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效, 以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的嗜热脂肪芽孢杆菌菌株及其制备方法和应用其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
本发明提出一株嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，已于2021年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码： 100101)，保藏编号为：CGMCC NO.24125。
上述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株(Bacillus stearothermophilus)是首次从80℃以上的堆肥污泥样品中多次富集并筛选出来的。所述细菌为革兰氏阳性菌，细胞宽0.6～1μm、长2.0～3.5μm，在固体培养基上呈圆端长杆状，表面粗糙湿润、呈浅黄色，属于需氧细菌。
以上述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株(Bacillus stearothermophilus)为DNA模板，PCR扩增其16SrRNA基因序列，获得的16SrRNA序列如SEQ ID NO： 1所示。通过EzTaxon数据库(http：//www.ezbiocloud.net/)进行比对，其与Bacillus stearothermophilus的相似度最高，同源性为99.25％。
本发明还提出一种前述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的制备方法，其包括以下步骤：在装有玻璃珠的100mL锥形瓶中放入灭菌的LB液体培养基30mL；所述LB液体培养基市售采购，其配比如下：蒸馏水1000mL，胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物5g/L和氯化钠10g/L。向上述的100mL锥形瓶中加入堆肥样品3g，所述堆肥样品取自深度约1m，且发酵温度为80℃以上的堆肥中；以220rpm的速度搅拌，于80℃培养两天。取所得的培养液3mL转接至30mL已灭菌的LB液体培养基中，以220rpm的速度搅拌，于80℃培养两天；将转接后的培养液继续转接、培养两次，得菌悬液。取菌悬液100μL，将其加入到装有900μL的无菌水的试管中，以梯度稀释法将其配制成10-1、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀释梯度。每个梯度分别取100μL的样品，将其涂布于LB固体培养基平板上，于80℃条件下倒置，培养2天，在菌落分散较好的平板上，挑取形成的单菌落，采用平板划线法进行纯化。
本发明还提出一种前述的嗜热脂肪芽孢杆菌菌株在聚苯乙烯降解中的应用。
本发明还提出一种含有前述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的堆肥接种剂；所述堆肥接种剂的形式为液体或粉剂。
本发明还提出一种前述的堆肥接种剂的培养方法，其包括以下步骤：将嗜热脂肪芽孢杆菌菌株接种于LB液体培养基中，经由摇瓶种子液、种子罐种子液以及发酵液几个阶段进行培养；培养温度为60℃～80℃，搅拌速度为60～400转/分钟，通气量为1：0.1～0.5(v/v·min)，当OD600＞2时停止培养，得到菌株的发酵液。所述发酵液即为液体的堆肥接种剂。也可以通过将所述发酵液脱水、干燥，得到粉剂的堆肥接种剂。
优选的，从保存嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的平板上取菌苔，并将菌株在 LB固体培养基上重新划线，将划线后的菌株接种于LB液体培养基中进行培养。
优选的，液体的堆肥接种剂的培养条件如下：培养温度为60℃～80℃，搅拌速度为60～400转/分钟，通气量为1：0.1～0.5(v/v·min)，检测OD600值，至OD600值≥2.0时结束培养，得到种子液。
优选的，液体的堆肥接种剂的培养条件如下：培养温度为60℃～80℃，搅拌速度为100～400转/分钟，通气量为1：0.3～0.5(v/v·min)，检测OD600值，至OD600值≥2.0时结束培养，得到种子液。
优选的，液体的堆肥接种剂的培养条件如下：培养温度为65℃～80℃，搅拌速度为200转/分钟，通气量为1：0.5(v/v·min)，检测OD600值，至 OD600值≥2.0时结束培养，得到种子液。
优选的，将种子液按照0.2～3％的接种量接种于LB液体培养基中，培养温度60℃～80℃，转速180～280rpm，通气量1：(0.1～0.5)(v/v·min)，当 OD600≥2时停止培养，得到菌株的发酵液。
本发明还提出一种前述的嗜热脂肪芽孢杆菌菌株或者前述的堆肥接种剂在有机固体废弃物堆肥减量化、资源化中的应用。所述有机固体废弃物选自厨余垃圾、城镇污水处理厂污泥、畜禽粪便、农作物秸秆、动物尸体和菌渣中的至少一种。
所述堆肥接种剂的应用包括以下步骤：用水分调理剂将物料的水分调至含水率为50％～70％；将堆肥接种剂接种于有机固体废弃物中，混合均匀，好氧发酵；其中物料的碳氮质量比为(20～40):1；所述堆肥接种剂的重量为总物料湿重的0.5‰～5‰；在发酵过程中通气，使堆体保持氧气体积含量为8％～15％，间隔2～5天翻抛1次；在堆体发酵7～30天后，将发酵剩余的物料过筛，得到有机肥料。上述堆肥接种剂的添加量以菌株的发酵液，也即液体堆肥接种剂计。若堆肥接种剂经过干燥、脱水处理之后的粉剂堆肥接种剂则需先进行用量换算。
下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不能理解为是对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据上述本发明的内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
若无特殊说明，以下所涉及的材料、试剂等均为本领域技术人员熟知的市售商品；若无特殊说明，所述方法均为本领域公知的方法。除非另外定义，所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内的普通技术人员所理解的通常意义。
实施例1：嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的分离和鉴定
从发酵温度为80℃以上的堆肥污泥中，自1m深处取3g堆肥污泥样品，将其置于装有玻璃珠的100mL的锥形瓶中；所述锥形瓶中内提前装有30mL 已灭菌的LB液体培养基，转速220rpm，80℃环境下培养。
培养两天后，自其中取3mL转接至30mL已灭菌的LB液体培养基中进行培养，培养条件同前；转接后的培养液在与前步骤相同的培养条件下继续进行两次转接和培养，得菌悬液。
取培养后的菌悬液100μL，将其加入到装有900μL的无菌水试管中，以稀释梯度法分别将其配置成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀释梯度。每个梯度分别取100μL涂布于LB固体培养基平板上，于80℃条件下倒置，培养2天，在菌落分散较好的平板上，挑取形成的单菌落，采用平板划线法进行纯化，即可分离出嗜热脂肪芽孢杆菌菌株。
以本实施例1分离的上述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株DNA为模板，PCR扩增其16SrRNA基因序列，引物为(27F)：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’和(1492R)：5’-TAC GGC TACCTT GTT ACG ACT T-3’。PCR反应程序如下：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸90秒，30个循环，72℃延伸10分钟。
通过电泳检测可知，得到约1.5kb大小的核酸片段。
上述扩增产物经电泳检测其纯度后再进行测序，测序结果见序列表1 所示。获得的16SrRNA序列通过EzTaxon数据库(http： //www.ezbiocloud.net/)进行比对，与菌株Bacillus stearothermophilus的相似度最高，同源性为99.25％。
附图1为基于嗜热脂肪芽孢杆菌16SrRNA基因序列，利用Mega5.0系统进化软件构建的系统进化树(最大似然法)，说明其系统进化关系与嗜热脂肪芽孢杆菌最近。附图2为嗜热脂肪芽孢杆菌菌株凝胶成像图，图中左侧的数据表示各条带的分子量，以碱基对数量bp表示。
实施例2：嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的微生物学性质和理化性质
将实施例1得到的嗜热脂肪芽孢杆菌种接种到2％～4％的NaCl、pH为 5～9的LB固体培养基中，于65℃下培养24h，研究其微生物学性质。结果如表1所示。
表1
Figure RE-GDA0003583836480000081
将实施例1得到的嗜热脂肪芽孢杆菌种接种到2％～4％的NaCl、pH为 5～9的LB固体培养基中，于80℃下培养48h，研究不同环境条件下菌株的生长情况。结果如表2所示。
表2
温度 生长情况 NaCl 生长情况 pH 生长情况
50℃ 弱生长 0％ 正常生长 5 不生长
55℃ 弱生长 2％ 正常生长 6 弱生长
60℃ 弱生长 4％ 正常生长 7.5 正常生长
65℃ 正常生长 6％ 弱生长 9 正常生长
70℃ 正常生长 9.5 正常生长
75℃ 正常生长 10 弱生长
80℃ 弱生长
实施例3：由嗜热脂肪芽孢杆菌菌株培养的液体的堆肥接种剂
在100mL锥形瓶中放入30mL的LB液体培养基，从4℃保存的固体培养基上取少量菌种，将该菌种接种至装有LB液体培养基的100mL锥形瓶中进行培养。培养温度80℃，摇床220rpm，培养2天，至OD600值大于2 时停止培养，为摇瓶种子液。
将上述摇瓶种子液接种至1000mL的LB液体培养基中进行培养。培养温度80℃，通气量为1：0.3(v/v·min)，转速为220rpm，培养时间36h，至OD600值大于2时停止培养，为种子罐种子液。
将上述种子罐种子液按3％接种量，接种至LB液体培养基中进行发酵培养。培养温度80℃，通气量为1：0.4(v/v·min)，转速220rpm，培养时间24h，至OD600值大于2时停止培养，为菌株发酵液，即为本发明的液体剂型的堆肥接种剂。本实施例制备的堆肥接种剂将在实施例5中用于处置生活污泥中所含的微塑料降解以及在实施例6中用于堆肥发酵处理城镇污水处理厂污泥的实验。
实施例4：嗜热脂肪芽孢杆菌对聚苯乙烯的降解
将嗜热脂肪芽孢杆菌接种到LB液体培养基中，220rpm、70℃水浴摇床培养48h，离心收集菌体，用生理盐水洗涤菌种，直至洗去培养基颜色，去除菌体中代谢物和培养基，再将菌体用生理盐水制作成浓度为1×105cfu/mL 的菌悬液。
取2mL的菌悬液接种到含有100.0mg聚苯乙烯样品的液体无碳培养基中，培养基中的碳源由聚苯乙烯替代，放置培养基在70℃的水浴摇床环境下进行培养，对照组中除不接种菌液之外其它条件相同。设置5组样品重复测试，每周对培养基中的聚苯乙烯进行采集测定。
将采集的聚苯乙烯由四氢呋喃溶解，放置到90℃的水浴中萃取12h，萃取液用旋转蒸发仪蒸馏至5.0mL，经过0.45μm滤膜过滤后，称重，按照下式计算其质量下降率：
WL(％)＝(IW-RW)/IW×100％
式中，WL代表聚苯乙烯的质量下降率(％)，IW代表聚苯乙烯的初试质量(g)，RW代表聚苯乙烯的剩余质量(g)。
实验组和对照组的聚苯乙烯质量下降见图3曲线以及表3数据所示。由图3曲线及表3数据可见，本发明菌种具有较高的生物转化效率，使用本发明菌种对于聚苯乙烯的降解具有明显的效果。
表3
培养时间 嗜热脂肪芽孢杆菌 对照组
7d 1.56％ 0.21％
14d 2.17％ 0.25％
21d 2.56％ 0.47％
28d 3.38％ 0.51％
35d 3.57％ 0.58％
42d 3.64％ 0.62％
49d 3.89％ 0.69％
56d 4.33％ 0.73％
将过滤后的聚苯乙烯样品放置到凝胶渗透色谱仪中测定聚苯乙烯的重均分子质量(Mw)和数均分子质量(Mn)。随机选用第6周剩余的聚苯乙烯样品若干测量其重均分子质量和数均分子质量变化见图4及表4所示。
表4
PS原样 对照组 嗜热脂肪芽孢杆菌
Mw×10<sup>4</sup> 26.12 24.57 22.41
Mn×10<sup>4</sup> 19.23 17.73 9.51
由上述测试结果可见，使用本发明的嗜热脂肪芽孢杆菌菌株对聚苯乙烯进行降解具有较好的效果。一方面表现在聚苯乙烯的质量减少，说明部分聚苯乙烯被彻底降解；另一方面表现在聚苯乙烯的分子量降低，说明聚苯乙烯的链在缩短，也即大分子被降解为较小的分子。
实施例5：利用嗜热脂肪芽孢杆菌菌株培养的堆肥接种剂处理生活污泥所含微塑料
将300m3生活污泥的含水率调节至65％左右，通气量111.95m3/h的条件下进行堆肥，设置不添加堆肥接种剂的发酵样以及添加质量含量2‰的实施例3的液体剂型堆肥接种剂的发酵样两个实验组，以堆肥原料为对照组。
按照上述工艺发酵45天后，对添加菌剂和不添加菌剂的腐熟样品、以及堆肥原料进行取样。具体操作为：分别在堆体的四角和中心5个点采集样品，样品深度均为35cm，每个取样点均进行三次重复取样，每采样点每次采集5kg，将所取得样品混合均匀。将样品于40℃烘干后，取50g样品放入250mL的锥形瓶中，加入100mL的蒸馏水，置于220rpm，30℃的摇床上30min。之后将混合均匀的泥水分别过5mm、3mm、1.25mm、0.50mm、 0.30mm的筛，用ZnCl2溶液将筛孔上的微塑料洗脱，取得含微塑料的上清液。室温下干燥，并对微塑料的量进行统计。堆肥原料中的微塑料丰度见表5-1所示。
表5-1
Figure RE-GDA0003583836480000111
备注：总微塑料含量的单位为×104n/kg干污泥，也即每千克干污泥中包含几万个微塑料颗粒
原料经堆肥处理后的微塑料丰度如图5a至5e以及表5-2所示。
表5-2
Figure RE-GDA0003583836480000112
Figure RE-GDA0003583836480000121
备注：表5-2中的数据单位同表5-1
由上述测试结果可见，未加菌的发酵实验组，其对于生活污泥中微塑料的降解有一定作用，但是效果不明显；而使用本发明的嗜热脂肪芽孢杆菌菌株制备的实施例3的堆肥接种剂对生活污泥中微塑料的降解则具有较好的降解效果。一方面表现在大粒径、较大粒径的微塑料丰度大幅下降，而＜0.3mm粒径的微塑料丰度上升，说明微塑料的粒径明显由大变小，多数都被降解为粒径小于0.3mm的微小粒子；另一方面表现在微塑料的总量明显降低，由原来的11.17×104n/kg干污泥降低至8.36×104n/kg干污泥，说明使用本发明的菌剂制备的堆肥接种剂，其仅仅发酵45天，即可将生活污泥中四分之一以上的微塑料彻底降解，且微塑料的粒径也快速地由大粒径和较大粒径降解为析晶小于0.3mm的微小粒子，说明本发明的菌剂、堆肥接种剂具有极好的技术效果。
实施例6：利用嗜热脂肪芽孢杆菌菌株培养的堆肥接种剂堆肥发酵处理城镇污水处理厂污泥
将300m3生活污泥的含水率调节至65％左右，通气量111.95m3/h的条件下进行堆肥，设置不添加堆肥接种剂的发酵样作为对照组，添加质量含量为0.5‰、1.0‰、1.5‰、2‰的实施例3的液体剂型堆肥接种剂的发酵样作为四个实验组，分别记为处理一、处理二、处理三和处理四。具体如下：
所述生活污泥中碳氮比C/N值均为32：1，采用好氧堆肥方法。堆肥发酵时间为30天，每3天翻抛1次，期间每天测试堆体的温度和含水率。
温度测定方法如下：将表式热敏温度计从堆体顶部至25cm深处测定堆肥温度，取堆体四角和中心5个点的平均值作为测试结果，同时测定环境温度。堆肥温度变化情况见图6及表6所示。
表6
Figure RE-GDA0003583836480000122
Figure RE-GDA0003583836480000131
Figure RE-GDA0003583836480000141
备注：表中数据的单位均为℃
由上述测试结果可见，使用菌剂处理后的实验组堆肥的温度普遍高于对照组堆肥的温度；且，对照组的堆肥温度在发酵第7、8天时达到其最高发酵温度，为65℃；而本发明实验组的温度变化则如下：堆肥接种剂添加量为0.5‰的实验组在发酵第6天至第11天时达到其最高发酵温度，为 73～75℃；堆肥接种剂添加量为1.0‰的实验组在发酵第5天至第13天时达到其最高发酵温度，为68～75℃；堆肥接种剂添加量为1.5‰的实验组在发酵第6天至第12天时达到其最高发酵温度，为72～80℃；堆肥接种剂添加量为2.0‰的实验组在发酵第7天至第14天时达到其最高发酵温度，为 69～76℃(忽略第11天的温度可能存在取样或测量误差)。由此可见，通过本发明的堆肥接种剂处理的堆肥，不仅仅是在堆肥周期内的多数日期的堆肥发酵温度高于对照组的发酵温度，而且通过本发明的堆肥接种剂处理的堆肥的最高发酵温度更高，且处于高发酵温度的周期更长，对于堆肥发酵具有更好的效果。
含水率测定，在堆体的四角和中心5个点，深35cm出取200g，105℃下烘干至恒重。堆肥含水率变化情况见图7及表7所示。
表7
Figure RE-GDA0003583836480000142
由上述测试结果可见，接种堆肥接种剂后，堆肥的含水率下降普遍较快。在发酵30d后，堆肥接种剂含量为0.5‰、1.0‰、1.5‰、2‰的堆肥，其含水率分别降低为18％、16％、17％、16％，而对照组的含水率降低仅为 12％；相比对照组来讲，堆肥接种剂含量为0.5‰、1.0‰、1.5‰、2‰的堆肥，其含水率的下降率分别提高了50％、33.33％、41.67％、33.33％，说明添加本发明堆肥接种剂的堆肥发酵温度更高，导致其失水速度更快。由此可以知道，在添加堆肥接种剂的堆肥过程中应注意含水率的控制以使其保持较佳的堆肥条件。
本发明权利要求和/或说明书中的技术特征可以进行组合，其组合方式不限于权利要求中通过引用关系得到的组合。通过权利要求和/或说明书中的技术特征进行组合得到的技术方案，也是本发明的保护范围。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
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ACTTTGACACTTCGGCGGCTGGCTCCCTTGCGGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTGCA 60
AGCTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATG 120
CTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGA 180
ACTGAGAGCGGCTTTTTGGGATTCGCTCCCCCTCGCGGGTTCGCAGCCCTTTGTACCGCC 240
CATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCAC 300
CTTCCTCCGACTTGTCGCCGGCAGTCCCTCTAGAGTGCCCAACCGAATGCTGGCAACTAG 360
AGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGAC 420
AACCATGCACCACCTGTCACCCTGTCCCCCCGAAGGGGGAACGCCCAATCTCTTGGGTTG 480
TCAGGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTC 540
CACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCC 600
AGGCGGAGTGCTTATCGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGTGTGACCCCTCTAACACTTAG 660
CACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTT 720
CGCGCCTCAGCGTCAGGTRCAGGCCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACAT 780
CTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCGCTCTCCTCTCCTGCCCTCAAGTCCCC 840
CAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAGACCG 900
CCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTCGCCCCCTACGTATTACCGCG 960
GCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGGGCTTTCTCGTGAGGTACCGTCACCGCGCCGCCCTCT 1020
TCGAACGGCGCTCCTTCGTCCCTCACAACAGAGCTTTACGACCCGAAGGCCTTCTTCGCT 1080
CACGCGGCGTCGCTCCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCC 1140
CGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTA 1200
CGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCCCATC 1260
CGCAAGTGACAGCCCAAAGGCCGCCTTTCAACCGAAGACCATGCGGTCTTCGGTGTTATC 1320
CGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCGGTCTTGCGGGCAGGTTGCCCACGTGTT 1380
ACTCACCCGTCCGCCGCTGACCGAATCAAGGCAAGCCCCAATCCGGTCCGCTCGACTTGC 1440
ATGTATAGCAGCCCGCAAG 1459

Claims (12)

1.一株嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，于2021年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.24125。
2.根据权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，其特征在于，其16SrRNA基因序列如SEQ ID NO：1。
3.一种根据权利要求1所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
1)向灭菌的LB液体培养基中加入堆肥样品，在搅拌条件下培养；
2)将所得的培养液转接至灭菌的LB液体培养基中，在搅拌条件下培养；将转接后得到的培养液继续进行两次转接和培养，得菌悬液；
3)将菌悬液在无菌水中梯度稀释；取每个梯度的稀释液均涂布于LB固体培养基平板上进行培养；
4)从平板上挑取菌落分散好的单菌落进行纯化，得到嗜热脂肪芽孢杆菌菌株。
4.一种根据权利要求1或2所述的嗜热脂肪芽孢杆菌菌株在聚苯乙烯降解中的应用。
5.一种含有权利要求1或2所述嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的堆肥接种剂。
6.根据权利要求5所述的堆肥接种剂，其特征在于，所述堆肥接种剂的形式为液体或粉剂。
7.一种根据权利要求5或6所述的堆肥接种剂的培养方法，其特征在于，其包括以下步骤：
将嗜热脂肪芽孢杆菌菌株接种于LB液体培养基中，培养发酵，得到发酵液；所述发酵液即为液体的堆肥接种剂；或者，将所述发酵液脱水、干燥，得到粉剂的堆肥接种剂。
8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，从嗜热脂肪芽孢杆菌菌株平板上取菌苔，并将菌株在LB固体培养基上重新划线，将划线后的菌株接种于LB液体培养基中进行培养，培养温度为60℃～80℃，搅拌速度为60～400转/分钟，通气量为1：0.1～0.5(v/v·min)，检测OD600值，至OD600值≥2.0时结束培养，得到发酵液。
9.一种根据权利要求1或2所述的嗜热脂肪芽孢杆菌菌株在有机固体废弃物堆肥减量化、资源化中的应用。
10.一种根据权利要求5或6所述的堆肥接种剂在有机固体废弃物堆肥减量化、资源化中的应用。
11.根据权利要求9或10所述的应用，其特征在于，所述有机固体废弃物选自厨余垃圾、城镇污水处理厂污泥、畜禽粪便、农作物秸秆、动物尸体和菌渣中的至少一种。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，其包括以下步骤：
1)用水分调理剂将有机固体废弃物的水分调至含水率为50％～70％；将堆肥接种剂接种于有机固体废弃物中，混合均匀，好氧发酵；其中所述有机固体废弃物的碳氮质量比为(20～40):1；所述堆肥接种剂的重量为总物料湿重的0.5‰～5‰；
2)堆体发酵过程中，间隔2～5天翻抛1次；
3)堆体发酵7～30天后，将发酵剩余的物料过筛，得到有机肥料。
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Denomination of invention: Thermophilic Fatty Bacillus Strains and Their Preparation Methods and Applications

Granted publication date: 20230117

Pledgee: Zhongguancun Branch of Bank of Beijing Co.,Ltd.

Pledgor: Zhongnongchuangda (Beijing) Environmental Protection Technology Co.,Ltd.

Registration number: Y2024110000059

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