CN114480147A - 一株哈茨木霉及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株哈茨木霉及其应用，它涉及农业领域，本发明的目的是为了解决植株扦插，尤其是红瑞木扦插繁殖成活率低的问题。本发明哈茨木霉（Trichoderma harzianum）NECC10059，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年7月16日，保藏号为CGMCC NO.11122。它用于促进扦插后植株的生长。本发明的哈茨木霉有利于红瑞木硬枝扦插繁殖、哈茨木霉对红瑞木扦插成活率、成活后植株健康的促进作用，对利用操作简便的木霉诱导方法促进红瑞木高效、经济的扦插扩繁有重要意义。本发明应用于红瑞木领域。
Description
技术领域
本发明涉及农业领域，具体涉及一株哈茨木霉及其应用。
背景技术
扦插繁殖是指：插条繁殖即取植株营养器官的一部分，插入疏松润湿的土壤或细沙中，利用其再生能力，使之生根抽枝，成为新植株。
红瑞木（Cornus alba），别名红梗木，生于海拔600-1700米（在甘肃可高达2700米）的杂木林或针阔叶混交林中。红瑞木枝干全年红色，秋叶鲜红，小果洁白，落叶后枝干红艳如珊瑚，是少有的观茎植物，是园林造景的异色树种，常引种栽培作庭园观赏、丛植植物。与常绿乔木相间种植，红绿相映成趣，可布置大型的花坛、花境及立体式背景。其适应能力极强，能耐-50℃的低温，是难得的北方景观树种。对于红瑞木的扩繁可采用分株和扦插繁殖，分株繁殖在早春发芽前或秋季进行，快速繁殖多采用扦插技术。由于红瑞木生根时间较长，插段感染病菌的机会就多，所以扦插用土必须具有很好的保水性和透水性。一般的扦插方式需要对扦插基质进行一定比例的配制和消毒，而且需要用α-萘乙酸粉剂稀释成的药液浸泡插穗，这样扦插红瑞木，能促进其生根，提高成活率，但是该方法成活率较低。目前将微生物用于提高红瑞木扦插繁殖成活率，防止病原菌引起病害较少有报道。因此，需要一种能够利用微生物提高红瑞木扦插繁殖成活率的方法。
发明内容
本发明的目的是为了提供一株哈茨木霉及其应用，利用微生物提高红瑞木扦插繁殖成活率，防止病原菌引起病害，促进生根、保证扦插后红瑞木生长并提高其抗逆性。
本发明的一株哈茨木霉，所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）NECC10059，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年7月16日，保藏号为CGMCC NO. 11122。
本发明将哈茨木霉定殖于红瑞木硬枝剪口尚未见报道。本发明先将红瑞木枝条下端剪成斜口，在哈茨木霉菌悬浮液（浓度为1×109 cfu/mL左右）中浸泡1小时左右，然后将盆土打出深5-6 cm的孔，加入哈茨木霉菌液1 mL左右（浓度与浸泡枝条的木霉菌液相同），把浸泡后的红瑞木枝条置入孔中压实，之后的管理只需正常浇水，保持土壤湿润，经过50 d的栽培养护，红瑞木扦插的成活率可以达到90%。用这种方法扦插的红瑞木对扦插基质没有严格要求，只需要对插穗进行处理，而且操作方法简单，成本低，枝条成活率高。
本发明所选用的哈茨木霉菌能够提高红瑞木插穗发芽率和生根率，提高扦插后红瑞木叶片的叶色值和叶绿素含量，提高扦插后红瑞木叶片的光合能力，提高扦插后红瑞木的防御酶活性和降低了丙二醛含量，降低了红瑞木插穗根腐的致死率。本发明所选用的哈茨木霉菌还可提高植株根系周围的温度、促进生根、保证植物健壮生长、提高幼苗的成活率，还可提高作物抗逆性，降低金黄壳囊孢菌、尖孢镰刀菌、核盘菌等病原真菌引起的植物病害。
本发明的哈茨木霉有利于红瑞木硬枝扦插繁殖。本发明操作简单、管理方便，成本低廉，红瑞木扦插成活率高、成活后增强了植株光合能力和抗逆性，是一种高效、经济的红瑞木扦插扩繁方法。
附图说明
图1为经本发明哈茨木霉对红瑞木硬枝的冬芽的成活率和生根率结果图；
图2 为本发明所用哈茨木霉菌与金黄壳囊孢菌、尖孢镰刀菌、核盘菌对峙培养；图中：a 为接种的金黄壳囊孢菌CFCC 89981（Cytosporachrysosperma CFCC 89981）； b为接种的尖孢镰刀菌CFCC86068（Fusariumoxysporum CFCC86068）； c为接种的核盘菌ACCC36959（Sclerotiniasclerotiorum ACCC 36959）；d、e、f分别为哈茨木霉菌与金黄壳囊孢菌、尖孢镰刀菌和核盘菌的对峙培养；
图3为本发明所用哈茨木霉菌与金黄壳囊孢菌、尖孢镰刀菌、核盘菌抑菌率结果图；其中，a 为接种的金黄壳囊孢菌CFCC 89981（Cytosporachrysosperma CFCC 89981）； b为接种的尖孢镰刀菌CFCC86068（Fusariumoxysporum CFCC86068）； c为接种的核盘菌ACCC36959（Sclerotiniasclerotiorum ACCC 36959）。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
具体实施方式一：本实施方式的一株哈茨木霉，所述的哈茨木霉（Trichoderma
harzianum）NECC10059，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年7月16日，保藏号为CGMCCNO. 11122 。
具体实施方式二：本实施方式一株哈茨木霉用于促进扦插后红瑞木的生长 。
具体实施方式三：本实施方式所述的用于促进扦插后红瑞木的生长，是指提高红瑞木插穗发芽率和生根率。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式所述的用于促进扦插后红瑞木的生长，是指提高扦插后红瑞木叶片的叶色值和叶绿素含量。其它与具体实施方式二相同 。
具体实施方式五：本实施方式所述的用于促进扦插后红瑞木的生长，是指提高扦插
后红瑞木叶片的光合能力。其它与具体实施方式二相同 。
具体实施方式六：本实施方式所述的用于促进扦插后红瑞木的生长，是指提高扦插
后红瑞木的抗逆性；所述的提高扦插后红瑞木的抗逆性是通过提高扦插后红瑞木的防御酶活性和降低丙二醛含量，降低红瑞木插穗根腐的致死率实现的。其它与具体实施方式二相同 。
具体实施方式七：本实施方式所述的扦插后红瑞木是通过红瑞木硬枝扦插获得的，其它与具体实施方式二相同 。
具体实施方式八：本实施方式所述的红瑞木硬枝扦插是通过以下方式实现的：
先将红瑞木枝条下端剪成斜口，在浓度为1×109~ 2×109 cfu/mL哈茨木霉（Trichoderma harzianum）NECC10059悬浮液中浸泡0.5~1.5 h，然后将盆土打出深5-6cm的孔，加入浓度为1×109~ 2×109 cfu/mL哈茨木霉（Trichoderma harzianum）NECC10059菌液0.5~2 mL，将浸泡后的红瑞木枝条置入孔中压实，经过40~60 d的栽培养护，养护期间保持土壤湿润，即完成所述的红瑞木硬枝扦插。其它组成和连接方式与具体实施方式七相同。
具体实施方式九：本实施方式的哈茨木霉菌在抑制根腐病致病菌中的应用 。
具体实施方式十：本实施方式所述的根腐病致病菌为金黄壳囊孢菌、尖孢镰刀菌或
核盘菌。其它组成和连接方式与具体实施方式九相同 。
实施例1
1实验方法
1.1木霉菌液制备
1.1.1木霉菌分离鉴定
东北玉簪根际土壤收集：在黑龙江省哈尔滨市松北区公路隔离带采集园林植物东北玉簪（Hosta ensata F. Maekawa.），连根拔出，抖掉根部土壤，将带土的根部置于无菌PE袋中，用冰盒带回实验室，备用 。
利用稀释平板法分离木霉菌株。将获得的纯化菌株鉴定后提交到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11122（本文简称为NECC10059） 。
将NECC10059接种在PDA培养基上，26℃培养6 d，获得大量分生孢子，配制成1×109 cfu/mL的悬浮液，备用。
1.2木霉菌处理红瑞木硬枝插穗的方法
红瑞木硬枝于2020年冬季采于黑龙江省金龙山风景区（位置：东经E127°05′-127°34′；北纬N45°23′-45°32′）。带回实验室进行修剪为45 cm长的枝条。将修剪后的红瑞木枝条分为对照（CK）和处理组（T），CK 组用自来水浸泡1小时，T组置于木霉菌悬浮液中浸泡1小时，然后用稍粗于插条的木棍在盆中心打出深5-6 cm的孔，加入木霉菌液1 mL，然后将红瑞木插穗置入孔中，插条周围的土用手按实，让插条与土壤紧密接触，插后马上浇透水。对照组（CK）在孔中加入1 mL自来水，以相同的方法扦插红瑞木插穗。每组10个插穗，三次重复 。
1.3红瑞木硬枝插穗发芽率和生根率的统计方法
1.3.1发芽率：首先统计每根红瑞木插穗的冬芽总数量，扦插之后，保持土壤湿润，养护20 d时，统计每个插穗的发芽数，之后每隔15 d统计一次，共统计3次，计算每个时间点的发芽率 。
1.3.2生根率：扦插50 d时，将各组红瑞木插穗从盆土中取出，将根部用自来水洗净泥土，统计每组生根的枝条的数量，分别计算2个实验组的生根率 。
1.4红瑞木叶色值和叶中叶绿素含量的检测方法
1.4.1叶色值（SPAD值）测量方法：采用SPAD-502 PLUS 手持式叶绿素仪（Chlorophyll Meter Model SPAD-502；konica minolta，日本）测量叶片在两种波长（一种是红光，峰波长650 nm，一种是红外线，波长940 nm）范围内的透光系数来确定叶片当前叶绿素的相对数量。每实验组取3株植株。在这些植物上，每株上选取两片长势一致、健康的叶片，每个叶片在相同部位测量三次，计算每实验组叶色值的平均值 。
1.4.2叶绿素含量检测方法
叶绿素含量检测参照史树德的方法，采用丙酮-乙醇浸提法检测叶绿素含量。取0.3 g红瑞木叶片，剪碎后放入25 mL棕色容量瓶中，加入丙酮与乙醇1:1混合液，定容到25mL。避光浸泡24 h，摇匀，测定在645 nm和663 nm的吸光值。计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量 。
1.5红瑞木叶中防御相关酶活性的检测方法
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）采用氮蓝四唑（NBT）法测定；过氧化氢酶（Catalase，CAT）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）和抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbateperoxidase，APX）的活性参照刘萍的方法（刘萍，李明军，丁义峰 主编.植物生理学实验 第2版[M].北京：科学出版社.2016.）进行测定；多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）的活性采用邻苯二酚法测定。
1.6红瑞木叶中丙二醛含量的检测方法
丙二醛含量采用 TBA（硫代巴比妥酸）法进行检测 。
1.7红瑞木叶片光合光响应曲线检测方法
本实验利用LI-6400XT光合测定仪中的内置LED红蓝光源，测量红瑞木在扦插40 d时的光合-光响应曲线。选取长势一致、健康的成熟叶片，在上午进行测量，每个处理选择三株植物，每株植物选取两片健康叶片。参照姜传英的方法进行测定。光照梯度设置为：1200、1000、800、600、400、200、150、100、50、20、0 μmol·m-2·s-1。采用 Farquhar 模型进行光响应曲线非线性回归拟合，计算最大净光合速率（Amax）、暗呼吸速率（Rd）和表观量子效率（AQY）三个参数，并分析在光照强度（PARi）为 800 μmol·m-2·s-1时，2个实验组的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Cond）和胞间 CO2浓度（Ci）等指标的差异。将0-200 μmol·m-2·s-1低光强下的光响应曲线进行线性回归分析，计算光饱和点（LSP）和光补偿点（LCP） 。
2实验结果
2.1木霉菌对红瑞木硬枝的冬芽的成活率和生根率的影响
红瑞木硬枝发芽和生根状态见图1。插穗扦插20 d时，可见CK组冬芽发芽状态优于T组，且冬芽的发芽率显著高于T组（P < 0.05），是T组的1.305倍。但是随着时间的推移，扦插后35 d时T组冬芽发芽状态逐渐变好，生长出的叶片依旧健康，没有出现干枯的现象，而CK组有些枝条的叶片出现枯死现象，冬芽的成活数逐渐低于T组，T组冬芽的成活率是CK组的1.19倍，无显著差异（P > 0.05）。在扦插50 d时，T组的冬芽的成活率显著高于CK组（P <0.05），冬芽的成活率是CK组的1.41倍。（表1） 。
T组的生根率显著高于CK组，是CK组的1.8倍（图1和表1） 。
表1木霉菌对红瑞木硬枝发芽率和生根率的影响
2.2木霉菌对红瑞木叶中叶绿素含量和叶色值的影响
由表2可知，在木霉菌的诱导下，T组的叶绿素a含量是CK组的1.03倍，无显著差异（P > 0.05）；T组的叶绿素b含量是CK组的1.03倍，无显著差异（P > 0.05）；T组的叶绿素总量是CK组的1.09倍，无显著差异（P > 0.05）。T组的叶色值是CK组的1.14倍，无显著差异（P> 0.05）。
表2木霉菌对红瑞木叶中叶绿素含量和叶色值的影响
2.3木霉菌对红瑞木叶中防御相关酶活性的影响
由表3可知，T组的超氧化物歧化酶SOD活性高于CK组，但无显著差异（P > 0.05），是CK的1.087倍；T组的过氧化物酶POD显著高于CK组（P < 0.05），是CK组的1.70倍；T组的过氧化氢酶CAT显著高于CK组（P < 0.05），是CK组的1.208倍；CK组的抗坏血酸过氧化物酶APX活性高于T组，但无显著差异（P > 0.05），CK的APX是T组的1.03倍；T组的多酚氧化酶PPO显著高于CK组（P < 0.05），是CK组的1.33倍。
表3木霉菌对红瑞木叶中防御相关酶活性的影响
2.4木霉菌对红瑞木叶中丙二醛含量的影响
由表4可知，CK组的丙二醛含量与T组的无显著差异（P > 0.05），CK组的丙二醛含量是T组的1.05倍。
表4木霉菌对红瑞木叶中丙二醛含量的影响
2.5木霉菌对红瑞木光合光响应曲线参数的影响
在PARi设置为为0-1200 μmol·m-2·s-1；CO2浓度为350 μL.L-1，叶面温度控制在（30±1)℃时，进行光响应曲线拟合，获得的曲线方程式见表5，这些方程的相关系数均在0.9917-0.999之间（表5）。采用Farquhar模型进行非线性回归分析，获得光合光响应曲线参数A max、AQY和Rd（表6）。将0-200 μmol·m-2·s-1低光强下的光响应曲线进行线性回归分析，获得的线性方程式见表5，其相关系数均在0.9944-0.9993之间。依据线性方程计算获得的光饱和点（LSP）和光补偿点（LCP）见表 6。
由表6可知，T组的最大净光合速率与CK组的无显著差异（P > 0.05），是CK组的1.11倍；CK组的表观量子效率显著高于T组（P < 0.05），是T组的1.32倍；T组的暗呼吸速率显著高于CK组（P < 0.05），是CK组的1.34倍。T组的光饱和点与CK组无显著差异（P >0.05），是CK组的1.175倍；T组的光补偿点显著高于CK组（P < 0.05），是CK组的2.258倍。
表5光合光响应曲线方程及相关系数
表6光合光响应曲线参数
2.6红瑞木的光合特性分析
由表7可知，在光照强度为800 μmol·m-2·s-1时，T组的净光合速率与CK组的无显著差异（P > 0.05），是CK组的1.06倍；T组的气孔导度与CK组的无显著差异（P > 0.05），是CK组的1.17倍；T组的胞间二氧化碳浓度显著高于CK组（P < 0.05），是CK组的1.19倍；CK组的蒸腾速率显著高于T组（P < 0.05），是T组的1.48倍。
表7光合特性分析
以往资料显示，红瑞木的硬枝扦插生根时间较长，一般需60-90 d，成活率最高只有80%。而本发明的哈茨木霉菌不仅降低红瑞木插穗根部腐烂致死率，可提高植株根系周围的温度、促进生根、保证植物健壮生长、提高插穗成活率，还可提高抗逆性，预防金黄壳囊孢菌、尖孢镰刀菌和核盘菌等病原真菌引起的植物病害。本发明的哈茨木霉有利于红瑞木硬枝扦插繁殖、哈茨木霉对红瑞木扦插成活率、成活后植株健康的促进作用，本发明对利用操作简便的木霉诱导方法促进红瑞木高效、经济的扦插扩繁有重要意义。
2.7对峙培养
将哈茨木霉（Trichoderma harzianum）CGMCC NO. 11122菌株分别与金黄壳囊孢菌CFCC 89981（Cytospora chrysosperma CFCC 89981）尖孢镰刀菌CFCC86068（Fusarium oxysporum CFCC86068）核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum ACCC 36959）（其中CFCC为来源于中国林业微生物菌种保藏管理中心；ACCC为来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心）分别接种在PDA培养基上，均在26℃温度下培养6 d，然后用直径6 mm的打孔器打取金黄壳囊孢菌CFCC 89981、尖孢镰刀菌CFCC86068和核盘菌的菌碟，分别置于PDA平板培养基上，在一侧均接种哈茨木霉NECC10059，与其相对的另一侧接种病原菌，每个PDA平板培养基上的哈茨木霉菌碟、病原菌菌碟与培养皿边缘均相距0.5 cm，以在同侧位置接种病原菌的平板为对照，每个处理三次重复。每天观察木霉与病原菌的生长状况，并计算木霉对3种病原菌的抑菌率。抑菌率（％）=（对照病原菌扩展半径-对峙病原菌扩展半径）/对照病原菌扩展半径×100。哈茨木霉NECC10059对3种植物致病病原菌的抑菌率见图2和3，图2中的平板抑菌照片显示的为：上排a、b、c平板菌落图片为三株病原菌单独接种在培养基上培养后的效果图；下排d、e、f平板菌落图片为哈茨木霉NECC10059分别接种在培养基的左侧，3种植物致病病原菌分别接种在培养基右侧培养后的效果图。结合图3抑菌率分别为：对金黄壳囊孢菌的抑菌率为75.70±1.75%；对尖孢镰刀菌的抑菌率为49.91±2.61%；对核盘菌的抑菌率为88.75±3.83%。
Claims (10)
1.一株哈茨木霉，其特征在于哈茨木霉（Trichoderma harzianum）NECC10059，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年7月16日，保藏号为CGMCC NO. 11122。
2.权利要求1所述的一株哈茨木霉的应用，其特征在于它用于促进扦插后红瑞木的生长。
3.根据权利要求2所述的一株哈茨木霉的应用，其特征在于它用于促进扦插后红瑞木的生长，是指提高红瑞木插穗发芽率和生根率。
4.根据权利要求2所述的一株哈茨木霉的应用，其特征在于它用于促进扦插后红瑞木的生长，是指提高扦插后红瑞木叶片的叶色值和叶绿素含量。
5.根据权利要求2所述的一株哈茨木霉的应用，其特征在于它用于促进扦插后红瑞木的生长，是指提高扦插后红瑞木叶片的光合能力。
6.根据权利要求2所述的一株哈茨木霉的应用，其特征在于它用于促进扦插后红瑞木的生长，是指提高扦插后红瑞木的抗逆性；所述的提高扦插后红瑞木的抗逆性是通过提高扦插后红瑞木的防御酶活性和降低丙二醛含量，降低红瑞木插穗根腐的致死率实现的。
7.根据权利要求2至6中的任意一项所述的一株哈茨木霉的应用，其特征在于扦插后红瑞木是通过红瑞木硬枝扦插获得的。
8.根据权利要求7所述的一株哈茨木霉的应用，其特征在于红瑞木硬枝扦插是通过以下方式实现的：
先将红瑞木枝条下端剪成斜口，在浓度为1×109~ 2×109 cfu/mL哈茨木霉（Trichoderma harzianum）NECC10059悬浮液中浸泡0.5~1.5 h，然后将盆土打出深5-6cm的孔，加入浓度为1×109~ 2×109 cfu/mL哈茨木霉（Trichoderma harzianum）NECC10059菌液0.5~2 mL，将浸泡后的红瑞木枝条置入孔中压实，经过40~60 d的栽培养护，养护期间保持土壤湿润，即完成所述的红瑞木硬枝扦插。
9.权利要求1所述的一株哈茨木霉的应用，其特征在于哈茨木霉菌在抑制根腐病致病菌中的应用。
10.根据权利要求9所述的一株哈茨木霉的应用，其特征在于根腐病致病菌为金黄壳囊孢菌、尖孢镰刀菌或核盘菌。
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