CN114478733A

CN114478733A - α-芋螺毒素肽LvID和LvIB、其药物组合物及用途

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Publication number: CN114478733A
Application number: CN202011268303.3A
Authority: CN
Inventors: 罗素兰; 长孙东亭; 吴勇; 于津鹏
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2020-11-13
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2040-11-13
Also published as: CN114478733B

Abstract

本发明属于生物和医药领域，涉及α‑芋螺毒素肽LvID和LvIB、其药物组合物及用途。具体地，本发明涉及一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NOs:4‑5和SEQ ID NOs:7‑12中任一序列所示。本发明的多肽能够特异性地阻断α7乙酰胆碱受体(nAChRs)，对α7 nAChRs具有高选择性强阻断活性，具有用于制备预防和/或治疗与α7 nAChRs相关疾病的药物的潜力。

Description

α-芋螺毒素肽LvID和LvIB、其药物组合物及用途

技术领域

本发明属于生物和医药领域，涉及α-芋螺毒素肽LvID和LvIB、其药物组合物及用途。具体地，本发明涉及一种新的α-芋螺毒素肽LvID和LvIB，以及LvIB的突变体。

背景技术

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)是细胞膜上的五聚体变构蛋白，属于配体门控离子通道，介导众多中枢和外周神经系统、以及免疫系统等的生理功能(Zoli M,Pucci S,Vilella A,Gotti C.Neuronal and Extraneuronal Nicotinic AcetylcholineReceptors.Current neuropharmacology 2018；16:338-349.Fujii T,Mashimo M,Moriwaki Y,Misawa H,Ono S,Horiguchi K,Kawashima K.Expression and Function ofthe Cholinergic System in Immune Cells.Frontiers in immunology 2017；8:1085.)，包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等。nAChRs激活多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、γ-氨基丁酸等多种神经递质的释放，具有重要的生理功能和临床意义(Giribaldi J,Dutertre S.α-Conotoxins to explore the molecular,physiological andpathophysiological functions of neuronal nicotinic acetylcholinereceptors.Neurosci Lett.2017Dec 2.pii:S0304-3940(17)30972-2.)。

nAChRs由不同的α和β亚基组装成很多种亚型，肌肉型乙酰胆碱受体由5个亚基构成，含2个α1亚基，1个β亚基，1个δ亚基和1个γ或ε亚基，γ或ε亚基取决于其是否为胎儿或成体的乙酰胆碱受体。哺乳动物神经型nAChRs亚型比肌肉型nAChRs复杂得多(Bertrand D,Terry AV,Jr.The wonderland of neuronal nicotinic acetylcholinereceptors.Biochemical pharmacology 2018；151:214-225.)，至少有8种α亚基、3种β亚基，分别为α2-α7,α9，α10(在雏鸡中存在α8)，以及β2-β4。其中α2、α3和α4可以分别同β2或者β4结合，形成功能性受体，比如α2β2、α3β2、α2β4等。此外，α7和α9可以形成同源多聚体。

每种亚型都有截然不同的药理学特征，这些亚型是筛选诊断和治疗一大类重要疾病药物的关键靶点，如疼痛、成瘾、炎症、帕金森病、抑郁、痴呆、癌症等(Rollema H,Bertrand D,Hurst RS.Nicotinic Agonists and Antagonists.2014.Hone AJ,McIntoshJM.Nicotinic acetylcholine receptors in neuropathic and inflammatorypain.FEBS letters 2018；592:1045-1062.)。至今对乙酰胆碱受体各种亚型的精细结构和功能知之甚少，对于与各个受体亚型相关的诸多疾病还没有对症治疗的特效药物，其发病机理也不清楚。因而，急需发现能区分各个亚型的分子探针或工具药，这将有助于各个亚型结构与功能的研究、、揭示与各个亚型相关的疾病的发病机理，以及治疗新药的研发。

由于缺乏针对各种亚型的高选择性配体化合物，要研究和阐明各种各样的nAChRs亚型的精细结构和功能面临诸多挑战。α-芋螺毒素是nAChRs各个亚型选择性最好的特异阻断剂，其分子量较小，一般由12～19个氨基酸残基组成，富含二硫键(P.GopalakrishnakoneLJC,Sulan Luo.Toxins and Drug Discovery.Springer Nature(Publisher)2017；ISBN978-94-007-6451-4:Conotoxin:p148-187.)。α-芋螺毒素种类繁多，活性多样，结构变化复杂。通过其高度保守的信号肽序列、药理学活性及半胱氨酸模式可对α-芋螺毒素进行分类(Kaas Q,Yu R,Jin AH,Dutertre S and Craik DJ.ConoServer:updated content,knowledge,and discovery tools in the conopeptide database.Nucleic AcidsResearch(2012)40(Database issue):D325-30)。α-芋螺毒素的半胱氨酸模式为CC-C-C，其中二硫键连接方式为C1-C3与C2-C4，二硫键间形成2个loop环，根据二三及三四半胱氨酸间氨基酸数量不同又可把α-芋螺毒素分为α3/5，α4/7，α4/6，α4/4和α4/3等多种亚家族，每个loop的特征和残基组成的不同是毒素作用于不同受体亚型的基础(Ying Fu,Cheng Li,Shuai Dong,Yong Wu,Dongting Zhangsun and Sulan Luo*.Discovery Methodology ofNovel Conotoxins from Conus Species.Marine Drugs,2018,16,417；doi:10.3390/md16110417.)

α7乙酰胆碱受体(缩写为α7 nAChRs)与其他亚型相比，具有相对较高的钙离子(Ca²⁺)渗透率，并能快速激活和逐渐脱敏，在哺乳动物中枢神经系统、特别是在脑中高表达[Yuko Tanibuchi,Jin Wu,Jun Toyohara,et al.(2010)Characterization of[3H]CHIBA-1001 binding toα7 nicotinic acetylcholine receptors in the brain from rat,monkey,and human.[J]Brain Research.1348(2010)200-208]。α7nAChRs主要分布在整个末梢及中枢神经系统，免疫系统，以及许多种外周组织中[Caterina M.Hernandez,Ibdanelo Cortez,Zhenglin Gu,et al.(2014)Research tool:validation of floxedα7nicotinic acetylcholine receptor conditional knockout mice using in vitro andin vivo approaches.[J]Physiol 592.15(2014)pp 3201-3214.]，是神经系统中仅次于α4β2nAChRs的第二普遍存在的亚型，在前额叶皮层的记忆力和注意力方面发挥重要作用[Pragya Komal,Jasem Estakhr,Melad Kamran,et al.(2015)cAMP-dependent proteinkinase inhibits α7 nicotinic receptor activity in layer 1corticalinterneurons through activation of D1/D5 dopamine receptors.[J]Physiol 593.16(2015)pp 3513-3532]。同时，α7 nAChRs也是胆碱能抗炎通路中的关键亚型，负责联系大脑和免疫系统，分布于T细胞、B细胞等参与组织器官抗炎[王雪,李晓.(2015)α7烟碱型乙酰胆碱受体在心血管疾病中的研究进展.[J]新药学.2015年2月第46卷第2期73-76]。非神经元的α7nAChRs与败血症、癌症、精神错乱、炎症、神经炎症(神经痛)、疼痛等密切相关(AdonisSfera,Michael Cummings,Carolina Osorio.Non-Neuronal Acetylcholine:The MissingLink Between Sepsis,Cancer,and Delirium？2015Aug 21；2:56.doi:10.3389/fmed.2015.00056.eCollection 2015)。衰老引起的内源性神经递质乙酰胆碱(ACh)分泌减少或缺乏，有可能是微小核苷酸microRNA-6775(miR-6775)引起的α7 nAChRs基因沉默。α7亚基基因被沉默后，导致α7受体的表达下降，促进老年人产生炎症、神经炎症(神经痛)、精神错乱等疾病；还会引起淋巴细胞、T-细胞中相应基因和受体的表达，促使易患癌症和败血症引起的免疫抑制和免疫力低下等多种疾病。

α7 nAChRs对于思维过程来说很重要，由于在人类大脑海马和皮层区域具有极高的表达，所以与认知以及记忆功能密切相关[Dean F.Wong,Hiroto Kuwabara,MartinPomper,et al.(2014)Human Brain Imaging ofα7 nAChR with[18F]ASEM:a New PETRadiotracer for Neuropsychiatry and Determination of Drug Occupancy.[J]MolImaging Biol(2014)16:730-738]。临床研究表明，α7 nAChRs与认知障碍、阿尔茨海默症、帕金森症、癫痫、精神分裂症等神经疾病密切相关。目前药物研究集中在α7 nAChRs激动剂对阿尔茨海默症和精神分裂症的治疗方面[谢冰雪,张桂森,张亮仁.(2015)以α7 nAChR为靶点的药物研究进展.[J]中国药物化学杂志.Aug.2015Sum 126.Vol.25No.4p313.Cecilia Bouzat,Mat′las Lasala,Beatriz Elizabeth Nielsen,etal.Molecular function of alpha7 nicotinic receptors as drug targets[J].JPhysiol,2018,596(10):1847-1861]。从动物和人类研究中观察到，α7 nAChRs激动剂可以不同程度地改善阳性和阴性症状以及认知能力，进一步支持了这种受体亚型参与精神分裂症的多重缺陷，因此提示开发新的治疗方法来治疗精神分裂症疾病的所有领域是可行的[Candace Jones,BS.α7Nicotinic Acetylcholine Receptor[J].Journal of ClinicalPsychopharmacology,2018,38(3):247-249.Aaron J.Kucinski,Michal K.Stachowiak,Scott R.Wersinger,et al.Alpha7 neuronal nicotinic receptors as targets fornovel therapies to treat multiple domains of schizophrenia[J].Currentpharmaceutical biotechnology,2011,12(3):437-448.Alvin V.Terry Jr,PatrickM.Callahan.alpha7 nicotinic acetylcholine receptors as therapeutic targets inschizophrenia:Update on animal and clinical studies and strategies for thefuture[J].Neuropharmacology,2020,170:108053]。同源性α7 nAChRs对认知能力如记忆力和注意力方面有重要意义，随着近些年的研究已经充分展示出该位点可以作为认知障碍的治疗靶点，其中部分α7 nAChR激动剂已经进入Ⅲ期临床试验[Bertrand,D.,Lee,C.H.,Flood,D.,et al.Therapeutic Potential of alpha7 Nicotinic AcetylcholineReceptors[J].Pharmacol Rev,2015,67(4):1025-1073]。选择性α7 nAChR激动剂PNU28298能有效的辅助治疗精神分裂症[Marcus,M.M.,Bjorkholm,C.,Malmerfelt,A.,etal.Alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonists and PAMs as adjunctivetreatment in schizophrenia.An experimental study[J].Eur Neuropsychopharmacol,2016,26(9):1401-1411]。

胆管癌是最致命的恶性肿瘤之一。研究表明，α7 nAChRs在胆管癌组织中高表达，与患者生存期缩短密切相关。α7 nAChRs基因敲除降低了细胞增殖能力，增加了早期凋亡，减弱了细胞的迁移和侵袭。当α7 nAChRs基因敲除后，上皮-间质转换过程中的凋亡相关蛋白和组分发生改变[Shuhai Chen,Xiaoliang Kang,Guangwei Liu,et al.α7-NicotinicAcetylcholine Receptor Promotes Cholangiocarcinoma Progression andEpithelial–Mesenchymal Transition Process[J].Digestive Diseases and Sciences,2019,64(10):2843-2853]。胰腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)的死亡率近乎100％，因其发现时就已经是晚期了，现有的抗癌药医治无效。研究发现，α7nAChRs是胰腺癌的主要调节子，它通过胁迫神经递质介导的激活β-肾上腺素能信号传递，促进PDAC胰腺癌的发生(Hildegard M Schuller,Hussein An Al-Wadei.Neurotransmitterreceptors as central regulators of pancreatic cancer.2010Feb；6(2):221-8.doi:10.2217/fon.09.171.)。肺神经内分泌细胞(Pulmonary neuroendocrine cells，PNECs)在小细胞肺癌(SCLC)和小儿哮喘这两种疾病的发生中起着很重要的作用，其α7 nAChRs表达上调促使这两种疾病的发生并恶化，且抽烟是这两种疾病发生的危险因素(Hildegard MSchuller,Howard K Plummer 3rd,Brian A Jull.Receptor-mediated effects ofnicotine and its nitrosated derivative NNK on pulmonary neuroendocrinecells.2003Jan；270(1):51-8.doi:10.1002/ar.a.10019)。同样，吸烟也是患非小细胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma，NSCLC)的危险因素，受尼古丁刺激，α7 nAChRs的表达上调促进非小细胞肺癌的发生(H A N Al-Wadei,M H Al-Wadei,M F Ullah,H MSchuller.Gamma-amino butyric acid inhibits the nicotine-imposed stimulatorychallenge in xenograft models of non-small cell lung carcinoma.2012Feb；12(2):97-106.doi:10.2174/156800912799095171)。因此，用α7 nAChRs的特异性阻断剂，可有效抑制胆管癌、胰腺癌、小细胞肺癌、小儿哮喘、非小细胞肺癌等的α7 nAChRs的活性，下调其表达，有望治疗这些重大疾病。

鉴于α7 nAChRs重要的生理和病理功能，寻找新的活性强选择性高的α7 nAChRs阻滞剂，特别是能够区分与之结构相似、分布重叠的其他nAChRs亚型的阻滞剂，对于与α7nAChRs有关的疾病机理研究、新药筛选、以及治疗新药的研发具有非常重要的意义。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，发现了新的α-芋螺毒素肽(分别命名为LvID和LvIB)，并进一步制得了LvIB的突变体。本发明人惊奇地发现，LvID或LvIB或LvIB突变体能够特异性地阻断α7乙酰胆碱受体，具有高选择性强阻断活性，具有用于制备或用于筛选治疗或预防与α7乙酰胆碱受体相关疾病的药物的潜力。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NOs:4-5和SEQID NOs:7-12中任一序列所示。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其中，

所述多肽的N末端起的第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键，并且第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键；或所述多肽的N末端起的第一个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键，并且第二个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键；或所述多肽的N末端起的第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸形成二硫键，并且第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键；

优选地，所述多肽的羧基末端是酰胺化的。

本发明的另一方面涉及一种分离的融合蛋白，其包含至少一种本发明中任一项所述的多肽。

本发明的再一方面涉及一种分离的多核苷酸，其编码本发明中任一项所述的多肽或者本发明的融合蛋白。

本发明的再一方面涉及一种核酸构建体，其含有本发明的多核苷酸；优选地，所述核酸构建体为重组载体；优选地，所述核酸构建体为重组表达载体。

本发明的再一方面涉及一种转化的细胞，其含有本发明的多核苷酸，或者含有本发明的核酸构建体。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸在制备阻断乙酰胆碱受体的药物中的用途；其中，所述乙酰胆碱受体是α7乙酰胆碱受体。

根据本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸，其用于治疗和/或预防癌症或者哮喘；

优选地，所述癌症为选自胆管癌、胰腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌中的一种或多种；

优选地，所述哮喘为小儿哮喘。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其含有至少一种本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸；可选地，其还包含一种或多种药学上可接受的辅料。

在一些实施方案中，含有治疗有效量的本发明多肽的药物组合物以利于药用的方式配制和给药，并需考虑到个体病人的临床状况、运送位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸在制备治疗和/或预防癌症或者哮喘的药物中的用途；

优选地，所述哮喘为小儿哮喘。

本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防癌症或者哮喘的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸的步骤；

优选地，所述哮喘为小儿哮喘。

给药剂量取决于许多因素，例如所治疗病况的严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。本领域通常的做法是，剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

本发明的再一方面涉及一种在体内或在体外阻断乙酰胆碱受体或者调节乙酰胆碱水平的方法，包括施加给细胞有效量的本发明中任一项所述的多肽或者本发明的融合蛋白的步骤；其中，所述乙酰胆碱受体是α7乙酰胆碱受体。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸在制备药物筛选模型中的用途，其中，

所述药物筛选模型为细胞模型或者动物模型，

所述药物为用于治疗或预防精神分裂症、阿尔茨海默症、精神错乱、炎症、神经痛、或者由癌症或败血症引起的免疫抑制或免疫力低下的药物；

优选地，所述精神错乱、炎症或神经痛为发生在老年人的精神错乱、炎症或神经痛。

本发明的再一方面涉及一种制备药物筛选模型的方法，包括给予目标细胞或者目标动物以有效量的本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸的步骤，其中，

所述药物筛选模型为细胞模型或者动物模型，

在本发明的一些实施方式中，所述的细胞模型或者动物模型，其α7乙酰胆碱受体水平降低或者α7乙酰胆碱受体被阻断。在本发明的一些实施方式中，细胞模型或者动物模型中的α7乙酰胆碱受体水平降低或者α7乙酰胆碱受体被阻断可以通过包括但不限于如下之一的方法实现：施加给目标细胞或者目标动物以有效量的本发明中任一项所述的多肽或者本发明的融合蛋白；或者通过基因转导的方法，将本发明的多核苷酸或者核酸构建体转入目标细胞或者目标动物，以产生有效量的本发明中任一项所述的多肽或者本发明的融合蛋白。

本发明的再一方面涉及一种制备本发明中任一项所述的多肽的方法，包括下述步骤：

1)在ABI Prism 433a多肽合成仪、或其它多肽合成仪上，或者手工方法合成线性多肽，Fmoc氨基酸的侧链保护基为:Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr)、OBut(Asp)、Boc(Lys)；半胱氨酸用Trt或Acm保护基团，分别在相应的半胱氨酸之间定点形成二硫键；

2)将步骤1)中得到的线性多肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性多肽粗品，用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化；

3)将步骤2)中得到的产物进行两步氧化折叠。

本发明中：

术语“核酸构建体”，在文中定义为单链或双链核酸分子，优选是指人工构建的核酸分子。可选地，所述核酸构建体还包含有可操作地连接的1个或多个调控序列。

在本发明中，术语“可操作地连接”是指两个或多个核苷酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。所述“可操作地连接”可以通过基因重组的手段实现。

在本发明中，术语“载体”指的是，可将抑制某蛋白的多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件。

在本发明中，术语“宿主细胞”指的是导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。

术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

本发明中，如果没有特别说明，浓度单位μM表示μmol/L，mM表示mmol/L，nM表示nmol/L。

本发明中，提到细胞中的加药量时，如果没有特别说明，一般是指加药后药物的终浓度。

本发明中提到术语“氨基酸”或者具体的氨基酸名称时，如果没有特别说明，是指L型的氨基酸。

发明的有益效果

本发明取得了如下的技术效果中的一种或多种：

(1)本发明的芋螺毒素肽(LvID、LvIB、LvIB突变体)能够有效地阻断α7 nAChRs。

(2)本发明的芋螺毒素肽(LvID、LvIB、LvIB突变体)能够特异性地阻断α7 nAChRs。

(3)本发明的芋螺毒素肽可通过结合α7乙酰胆碱受体(nAChR)发挥作用，具有抗癌活性。

(4)本发明的芋螺毒素肽可应用于研究、诊断、筛选和治疗癌症、痴呆、精神分裂症、神经痛、帕金森病、抑郁等神经系统疾病、以及作为有用的分子探针用于研究等方面。不同的α-芋螺毒素对脊椎动物受体的亲和性不同,有时相差几个数量级。这种种系间的差异使得α-芋螺毒素可作为有用的探针用于研究脊椎动物nAChRs的种系发生，可作为分子探针来确定nAchRs的不同亚型。它们是新药开发的候选药物、先导药物和治疗药物。

附图说明

图1：α-芋螺毒素LvID的序列及其二硫键连接方式Cys(I-III,II-IV)。每个取代的氨基酸以下划线标出。半胱氨酸用斜体标出。#表示C-末端酰胺化。

图2：α-芋螺毒素LvID前肽基因序列及其编码产生的前肽与翻译后修饰产生的成熟肽。箭头所指为翻译后修饰的加工位点。推断的蛋白酶水解加工位点1(processing site1)在碱性氨基酸赖氨酸(K)的后面；C-末端酰胺化加工位点可能在箭头所指的两个甘氨酸的位置，即processing site 2。成熟肽C-末端紧挨半胱氨酸(Cys)的甘氨酸残基往往是酰胺化翻译后修饰的加工位点，从processing site 2进行酰胺化产生的成熟肽命名为LvID，序列为：DCCSEPPCILQNPDIC#(#表示C-末端酰胺。前肽区用斜体字表示，成熟肽用下划线表示，其中的半胱氨酸(C)用加粗字体显示。

图3A：LvID的高压液相色谱图。

HPLC分析条件为：C18柱(Vydac)，洗脱线性梯度为在0-40min内10-40％B60(含60％的乙腈水溶液)，监测波长为214nm。溶剂B60是含90％乙腈(ACN，acetonitrile),0.05％TFA(trifluoroacetic acid)的水溶液；溶剂A是0.05％TFA的水溶液；

HPLC色谱图中的分钟数，表示该色谱峰的保留时间；

横坐标是洗脱时间，单位为分钟(min)；纵坐标是在波长为214nm下的紫外吸收值(UV₂₁₄)。

图3B：LvID的ESI-MS质谱图。

图4：α-CTx LvID(10μM)对表达在非洲爪蟾卵母细胞中nAChRs各个亚型电流的影响。所有数据代表Mean±S.E.M，n＝4-6。横坐标是电流反应百分数％，计算公式为：每种nAChR亚型在LvID 10μM浓度下的电流除以各自的Control电流(对照ND96)的百分数。此处Control是指与药物LvID相同体积的ND96缓冲液加入细胞槽中孵育5min后，Ach激发产生的电流，即为对照电流。

图5A-5F：LvID阻断大鼠α7的电流轨迹图,是大鼠α7的高选择性特异阻断剂。图中“C”是指的对照(ND96)电流，紧接“C”后面的是多肽的浓度。箭头所指的是温育5分钟后，多肽阻断相应受体亚型的第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。其中：

图5A：100nM LvID对大鼠α7 nAChR的电流影响情况；

图5B：10μM LvID对大鼠α3β4 nAChR的电流影响情况；

图5C：10μM LvID对大鼠α6/α3β2β3 nAChR的电流影响情况；

图5D：10μM LvID对大鼠α3β2 nAChR的电流影响情况；

图5E：10μM LvID对大鼠α9α10 nAChR的电流影响情况；

图5F：10μM LvID对大鼠肌肉nAChR的电流影响情况；

大鼠α7表达在非洲爪蟾卵母细胞中，电生理记录时的钳制电压是-70mV，根据实验操作程序每隔1分钟给1秒(s)的Ach脉冲。LvID能完全阻断大鼠α7(图5A)的电流，对大鼠α3β4(图5B)有微弱阻断活性，但对大鼠α6/α3β2β3(图5C)，大鼠α3β2(图5D)，大鼠α9α10(图5E)，大鼠肌肉型nAChR(图5F)无阻断活性。

图6：LvID对所有nAChRs亚型的浓度剂量反应曲线，图中横坐标为所用LvID多肽的摩尔浓度(M)的对数值(Log[Peptide]M)；纵坐标为浓度反应百分数(Response％)，是指相应浓度的多肽作用下，乙酰胆碱受体电流与对照电流的比值百分数。图中各个数值是取自4-6个非洲爪蟾卵母细胞的电流平均值，即Mean±S.E.M，n＝4-6。

图7：α-芋螺毒素LvIB(SEQ ID NO：1)前肽基因序列及其编码产生的前肽与翻译后修饰产生的成熟肽。

图8A-8J：分别是LvIB及其突变体的HPLC和ESI-MS谱图。其中：

图8A-8B：分别是LvIB(SEQ ID NO：1)的HPLC和ESI-MS谱图。

图8C-8D：分别是[Q1G]LvIB(SEQ ID NO：2)的HPLC和ESI-MS谱图。

图8E-8F：分别是[Q1G,ΔR14]LvIB(SEQ ID NO：3)的HPLC和ESI-MS谱图。

图8G-8H：分别是[ΔR14]LvIB(SEQ ID NO：4)的HPLC和ESI-MS谱图。

图8I-8J：分别是[ΔQ1,ΔR14]LvIB(SEQ ID NO：5)的HPLC和ESI-MS谱图。

其中HPLC分析条件：C18柱(Vydac)，线性梯度为0-40min内10％-40％B90，检测波长214nm。溶剂B：含90％乙腈(ACN，acetonitrile),0.05％TFA(trifluoroacetic acid)的水溶液；溶剂A：0.075％TFA的水溶液。

图9A-9E：分别是LvIB及其突变体对多种nAChRs的浓度反应曲线图。其中：

图9A：LvIB对多种nAChRs的浓度反应曲线图。

图9B：[Q1G]LvIB对多种nAChRs的浓度反应曲线图。

图9C：[Q1G,ΔR14]LvIB对多种nAChRs的浓度反应曲线图。

图9D：[ΔR14]LvIB对多种nAChRs的浓度反应曲线图。

图9E：[ΔQ1,ΔR14]LvIB对多种nAChRs的浓度反应曲线图。

图10A-10E：分别是LvIB及其突变体对rα7 nAChRs的电流轨迹图。其中：

图10A：LvIB对rα7 nAChRs的电流轨迹图。

图10B：[Q1G]LvIB对rα7 nAChRs的电流轨迹图。

图10C：[Q1G,ΔR14]LvIB对rα7 nAChRs的电流轨迹图。

图10D：[ΔR14]LvIB对rα7 nAChRs的电流轨迹图。

图10E：[ΔQ1,ΔR14]LvIB对rα7 nAChRs的电流轨迹图。

图11A-11D：分别是[Q1G,ΔR14]LvIB对α3β2,α3β4,α6/α3β2β3,和α6/α3β4nAChRs的电流轨迹图。其中：

图11A：[Q1G,ΔR14]LvIB对α3β2nAChRs的电流轨迹图。

图11B：[Q1G,ΔR14]LvIB对α3β4nAChRs的电流轨迹图。

图11C：[Q1G,ΔR14]LvIB对α6/α3β2β3 nAChRs的电流轨迹图。

图11D：[Q1G,ΔR14]LvIB对α6/α3β4 nAChRs的电流轨迹图。

图12：[Q1G,ΔR14]LvIB(SEQ ID NO：3)对人源与鼠源α7nAChRs的浓度剂量曲线。数据表示平均值±SEM。n＝6-8。

图13：人源与鼠源α7 nAChRs的结合区段差异氨基酸。

图14A-14D：[Q1G,ΔR14]LvIB(SEQ ID NO：3)对人源与鼠源α7 nAChRs正向突变体的浓度剂量曲线。数据表示平均值±SEM。n＝6-8。

图15：[Q1G,ΔR14]LvIB(SEQ ID NO：3)对人源与鼠源α7nAChRs反向突变体的浓度剂量曲线。数据表示平均值±SEM。n＝6-8。

本发明涉及的部分序列如下面的表A所示：

表A：本发明涉及的部分序列

表A中，#代表C-末端酰胺化。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)、相应的参考文献、或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：α-芋螺毒素LvID基因的克隆和序列分析

1.疣缟芋螺基因组DNA的提取

分别以从海南岛、西沙群岛等沿海采集的疣缟芋螺(Conus lividus)活体为材料，储存在-80℃备用。先将芋螺毒腺解剖出来，并称重。然后用海洋动物基因组DNA提取试剂盒(购自中国北京天根生化科技有限公司)，提取毒腺的基因组DNA，具体操作参见试剂盒说明书。

将提取的芋螺基因组总DNA溶于100μL TE中，取5μL进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，以λ-EcoT14 I digest DNA Marker为标准，检测所得DNA的完整性和大小。用核酸蛋白质分析仪测定DNA溶液的OD260、OD280值以及OD260/OD280比值，并计算DNA的浓度(μg·ml^-1)、纯度和DNA产率(μg·g^-1)。所提取的完整DNA用于下一步PCR扩增进行芋螺毒素基因克隆的模板。

2.PCR反应及其产物的克隆、测序、和序列分析

根据α-芋螺毒素前体基因内含子序列及其3’端非翻译区(3’-UTR)序列，设计α-芋螺毒素特异引物，每条引物均为18个碱基的寡核苷酸片段。

上游内含子引物序列为5’-GTGGTTCTGGGTCCAGCA-3’(SEQ ID NO：1)；

下游3’-UTR引物序列为5’-GTCGTGGTTCAGAGGGTC-3’(SEQ ID NO：2)。

将所提取的基因组DNA原液稀释后作为PCR扩增的模板。回收PCR特异扩增产物，与T-easy载体(Promega)连接后转化大肠杆菌XL1菌株，利用蓝白菌落和氨苄青霉素抗性挑选重组子，抽提纯化重组子质粒用于测序分析。

所获PCR特异扩增产物序列经DNAStar软件分析，获知其编码蛋白序列、3’-非翻译区(UTR)序列。芋螺毒素前体蛋白的信号肽、前肽以及成熟肽的预测，采用在线ProP1.0Server进行分析(Duckert,P.；Brunak,S.；Blom,N.,Prediction of proproteinconvertase cleavage sites.Protein engineering,design&selection:PEDS 2004,17(1),107-12.)。

经序列分析比较，获得了一种新的α-芋螺毒素(命名为LvID)前体基因(图2)：

TCTGATGGCAGGAATGCTGCAGCCAACGACAAAGCATTTGACCTGTTGGCTCTGGCAGTCAAGGACTGCTGTTCCGAGCCTCCCTGTATCCTGCAAAATCCAGATATCTGTGGCAGAAGACGCTGA(SEQ ID NO:3)

因为内含子引物(SEQ ID NO：1)在α-芋螺毒素前体基因的信号肽之后、成熟肽之前的Pro-region区域中间，所以没有完整的编码框，即没有含有起始密码子的信号肽和部分前肽区。

根据前体基因及芋螺毒素特点，推测出LvID芋螺毒素前肽，它的氨基酸序列如下：

根据前肽序列再推测出成熟肽LvID，其氨基酸序列为DCCSEPPCILQNPDIC^#(SEQ IDNO：5，^#代表C-末端酰胺化)，推断的方法和原理请参考Luo S,Zhangsun D,Zhang B,QuanY,Wu Y.Novel alpha-conotoxins identified by gene sequencing from cone snailsnative to Hainan,and their sequence diversity.J Pept Sci.2006,12(11):693-704。推导结果详见图1、图2。

LvID是新的α-芋螺毒素，其C-末端具有酰胺化的修饰。LvID含有CC-C-C半胱氨酸模式，其二硫键连接方式为Cys(I-III,II-IV)(图1)，即在第一和第三个半胱氨酸之间，以及第二和第四个半胱氨酸之间分别形成两对二硫键。LvID与其它已知的α-芋螺毒素都不同。

实施例2：α-芋螺毒素LvID人工合成

根据α-芋螺毒素成熟肽LvID氨基酸序列(SEQ ID NO：5所示，C-末端具有酰胺化修饰)，采用Fmoc方法人工合成线性肽(图1)。具体方法如下：

树脂肽采用Fmoc化学方法进行人工合成，可用多肽合成仪或手工合成法合成树脂肽。除了半胱氨酸外，其余氨基酸用标准的侧链保护基团。LvID的第1和第3个半胱氨酸(Cys)的-SH用Trt(S-trityl)保护，第2和第4个半胱氨酸的-SH用Acm(S-acetamidomethyl)成对保护。

具体的合成步骤为：采用固相合成法中的Fmoc与FastMoc方法，在ABI Prism 433a多肽合成仪上合成了图1中的线性肽。Fmoc氨基酸的侧链保护基为：Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr),OBut(Asp),Boc(Lys)。采用Fmoc HOBT DCC方法,Rink酰胺化树脂及Fmoc氨基酸，合成步骤参考仪器合成手册进行。为反应完全,在哌啶脱保护及偶合时间上分别适当延长，对难接氨基酸采用双偶合，获得树脂肽。用reagent K(trifluoroaceticacid/water/ethanedithiol/phenol/thioanisole；90:5:2.5:7.5:5,v/v/v/v/v)将线性肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性肽粗品,用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化，洗脱线性梯度为在0-40min内10-40％B90，监测波长为214nm。溶剂B90是含90％乙腈(CAN，acetonitrile),0.05％TFA(trifluoroacetic acid)的水溶液；溶剂A是0.05％TFA的水溶液。

纯化后的线性肽用分析型的HPLC C18柱(Vydac)进行纯度检测，其洗脱条件同上，流速为1mL/min。其纯度达95％以上，用于氧化折叠。

参照文献(Dowell,C.；Olivera,B.M.；Garrett,J.E.；Staheli,S.T.；Watkins,M.；Kuryatov,A.；Yoshikami,D.；Lindstrom,J.M.；McIntosh,J.M.,Alpha-conotoxin PIA isselective for alpha6 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors.TheJournal of neuroscience 2003,23(24),8445-52.)对LvID的线性肽进行两步氧化折叠反应，过程简述如下:

首先通过铁氰化钾氧化法(20mM potassium ferricyanide,0.1M Tris,pH 7.5，45min)，在Trt保护基团的两个半胱氨酸之间形成第一对二硫键。单环肽经反相HPLC C18柱(Vydac)纯化后，进行碘氧化(10mM iodine in H₂O:trifluoroacetic acid:acetonitrile(78:2:20by volume，10min)，移去另外2个半胱氨酸上的Acm,同时在这2个半胱氨酸之间形成第二对二硫键。二环肽再经反相HPLC C18柱(Vydac)纯化，即获得按照从N端至C端的顺序在相应的半胱氨酸之间定向形成二硫键的α-芋螺毒素，并通过质谱(electrospray-massspectroscopy，ESI-MS)鉴定。

氧化折叠后的LvID的HPLC色谱图、ESI-MS质谱图如图3A和3B所示。合成的LvID的纯度均在95％以上。LvID实测分子量(1747.18Da)与理论分子量(1745.0Da)一致，所合成多肽的分子量正确，纯度高。多肽浓度用280nm波长下比色测定，根据Beer-Lambert方程(equation)计算多肽浓度和质量。这些定量过的折叠好的多肽用于后面的活性测试。

实施例3：α-芋螺毒素LvID对大鼠α7nAChR，以及其它所有nAChRs亚型的活性研究

参照文献(Azam L,Yoshikami D,McIntosh JM.Amino acid residues thatconfer high selectivity of the alpha6 nicotinic acetylcholine receptorsubunit to alpha-conotoxin MII[S4A,E11A,L15A].J Biol Chem.2008；283(17):11625-32.)中的方法，以及体外转录试剂盒(mMessage mMachine in vitro transcription kit(Ambion,Austin,TX))说明书，制备各种大鼠神经型nAChR亚型(α3β2，α6/α3β2β3，α6/α3β4，α9α10，α4β2，α4β4，α3β4，α2β2，α2β4，α7)、以及大鼠肌肉型nAChRs(α1β1δε)的cRNA，其浓度用UV 260nm下的OD值进行测算。解剖收集非洲爪蟾(Xenopus laveis)卵母细胞(蛙卵)，将cRNA注射入蛙卵中，每个亚基的注射量为5ng cRNA。大鼠肌肉型nAChR每个亚基注射0.5-2.5ng DNA。蛙卵在ND-96中培养。蛙卵收集后的1－2天内注射cRNA，注射后1－4天内用于nAChRs的电压钳记录。

将1个注射过cRNA的蛙卵置于50μL的Sylgard记录槽中(直径4mm×深度2mm)，重力灌注含有0.1mg/ml BSA(bovine serum albumin)的ND96灌流液(96.0mM NaCl,2.0mM KCl,1.8mM CaCl₂,1.0mM MgCl₂,5mM HEPES,pH 7.1-7.5)或含有1mM atropine的ND96(ND96A)，流速为1ml/min。所有的芋螺毒素溶液也含有0.1mg/ml BSA以减少毒素的非特异性吸附，用转换阀(SmartValve,Cavro Scientific Instruments,Sunnyvale,CA)可以在灌注毒素或乙酰胆碱(ACh)之间进行自由切换，以及一系列三通螺线阀(solenoid valves,model161TO31,Neptune Research,Northboro,MA)使灌注ND96与ACh等之间进行自由切换。Ach门控的电流由双电极电压箝放大器(model OC-725B,Warner Instrument Corp.,Hamden,CT)设置在“慢”箝，以及clamp gain在最大值(×2000)位置时进行在线记录。用1mm外径×0.75内径mm的玻璃毛细管(fiber-filled borosilicate capillaries，WPI Inc.,Sarasota,FL)拉制玻璃电极，并充满3M KCl作为电压和电流电极。膜电压箝制在-70mV.整个系统均由电脑控制和记录数据。ACh脉冲为每隔5min自动灌注1s的ACh。ACh的浓度分别为，表达大鼠肌肉型和神经型α9α10nAChRs为10μM；表达大鼠神经型的nAChR之α7为200μM,其它的亚型都为100μM。至少记录4个卵表达某个亚型对不同毒素浓度的电流反应情况，以及电流轨迹。

测试的电流数据用GraphPad Prism软件(San Diego,CA)进行统计分析，绘制剂量反应曲线，计算芋螺毒素的半阻滞浓度IC₅₀等多种有关多肽阻断nAChRs的各种参数(表1)。

表1：LvID分别作用于不同烟碱型乙酰胆碱受体亚型的IC₅₀值

^a代表在10μM的浓度下，抑制率小于50％。

结果表明(表1)，LvID(实施例3制备)对大鼠α7 nAChR的阻断活性最强，其半阻断剂量(IC₅₀)仅为13.7nM，其次为大鼠α3β4nAChR，其半阻断剂量(IC₅₀)为9965nM。LvID对大鼠α7 nAChR的阻断活性，比对大鼠α3β4亚型的阻断活性要强727倍，LvID在10μM的高浓度下，对其它所有亚型的受体几乎都没有阻断作用(图4、图5B-5F和图6)。100nM LvID几乎完全阻断了由Ach门控的大鼠α7 nAChR开放产生的电流。LvID阻断大鼠α7 nAChR后，洗脱速率较慢，20min也未洗脱回对照电流的大小(图5A)，LvID对大鼠α7nAChR阻断是不可逆的。

实施例4：α-芋螺毒素LvIB基因的克隆和序列分析

以在海南海域采集的疣缟芋螺(C.lividus)作为原材料，经过解剖获取毒腺组织后，使用海洋动物基因组DNA提取试剂盒(购自中国北京天根生化科技有限公司)提取毒腺的基因组DNA，具体操作参见试剂盒说明书。根据α-芋螺毒素前体基因内含子序列及其3’端非翻译区(3’-UTR)序列，设计两条α-芋螺毒素特异引物：

上游内含子引物序列为5’-GTGGTTCTGGGTCCAGCA-3’(SEQ ID NO：1)；

下游3’-UTR引物序列为5’-GTCGTGGTTCAGAGGGTC-3’(SEQ ID NO：2)。

提取的基因组DNA原液经过稀释后作为PCR扩增的模板，随后回收PCR特异扩增产物，并与T载体连接后转化入大肠杆菌，利用氨苄青霉素抗性挑选重组子，最后测序分析抽提纯化后的重组子质粒。

经序列分析比较，获得了一种新的α-芋螺毒素(命名为LvIB)前体基因(图7)：

TCTGATGGCAGGGACGCTGCAGCCGACTACAAACCGTCTGACTTGATCGCTCTGGCCATCAAGCAATGCTGCTCCAATCCACCCTGTGCCCATGAACATTGTCGTCGAAGACGCTGA(SEQ ID NO：6)

根据前体基因及芋螺毒素特点，推测出LvIB芋螺毒素前肽，它的氨基酸序列如下：

SDGRDAAADYKPSDLIALAIKQCCSNPPCAHEHCRRRR(SEQ ID NO：7)

根据前肽序列再推测出成熟肽LvIB，其氨基酸序列为QCCSNPPCAHEHCR(SEQ IDNO：8)，推断的方法和原理请参考Luo S,Zhangsun D,Zhang B,Quan Y,Wu Y.Novel alpha-conotoxins identified by gene sequencing from cone snails native to Hainan,and their sequence diversity.J Pept Sci.2006,12(11):693-704。

LvIB(SEQ ID NO：8)是新的α-芋螺毒素，含有CC-C-C半胱氨酸模式，其二硫键连接方式为Cys(I-III,II-IV)，即在第一和第三个半胱氨酸之间，以及第二和第四个半胱氨酸之间分别形成两对二硫键，并且其间的氨基酸数目均为4个。LvIB的氨基酸序列与其它已知的α-芋螺毒素都不同。

实施例5：α-芋螺毒素LvIB突变体的设计

在LvIB(SEQ ID NO：8)的序列结构基础上，针对首尾氨基酸进行删减突变，设计了4个突变体(表2),其氨基酸序列如SEQ IDNOs：9-12所示。

表2：LvIB及其突变体的多肽序列

表2中，^#表示C-末端酰胺化。

实施例6：α-芋螺毒素LvIB及其突变体的人工合成

根据α-芋螺毒素成熟肽LvIB及其突变体的氨基酸序列(表2)，采用Fmoc方法人工合成线性肽(C末端酰胺化修饰)。除了半胱氨酸外，其余氨基酸用标准的侧链保护基团。LvIB及其突变体的第1和第3个半胱氨酸(Cys)的-SH用Trt(S-trityl)保护，第2和第4个半胱氨酸的-SH用Acm(S-acetamidomethyl)成对保护；氨基酸的侧链保护基为:Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr),OBut(Asp),Boc(Lys)。采用Fmoc HOBT DCC方法,Rink酰胺化树脂及Fmoc氨基酸，合成步骤参考仪器合成手册进行。为反应完全,在哌啶脱保护及偶合时间上分别适当延长，对难接氨基酸采用双偶合，获得树脂肽。用reagent K(trifluoroaceticacid/water/ethanedithiol/phenol/thioanisole；90:5:2.5:7.5:5,v/v/v/v/v)将线性肽从树脂上切割下来，用冰乙醚沉淀线性粗肽，并多次洗涤回收,用制备型RP-HPLC C18柱(Vydac)纯化，洗脱线性梯度为在0-40min内10-40％B90，监测波长为214nm。溶剂B90是含90％乙腈(ACN，acetonitrile),0.05％TFA(trifluoroacetic acid)的水溶液；溶剂A是0.075％TFA的水溶液。纯化后的线性肽用分析型的RP-HPLC C18柱(Vydac)进行纯度检测，其洗脱条件同上，流速为1mL/min。其纯度达95％以上，用于氧化折叠。

参照文献(Dowell,C.；Olivera,B.M.；Garrett,J.E.；Staheli,S.T.；Watkins,M.；Kuryatov,A.；Yoshikami,D.；Lindstrom,J.M.；McIntosh,J.M.,Alpha-conotoxin PIA isselective for alpha6 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors.TheJournal of neuroscience 2003,23(24),8445-52.)对LvIB及其突变体的线性肽进行两步氧化折叠反应，过程简述如下:

首先通过铁氰化钾氧化法(20mM potassium ferricyanide,0.1M Tris,pH 7.5，45min)，在Trt保护基团的两个半胱氨酸之间形成第一对二硫键。经RP-HPLC C18柱(Vydac)纯化后，进行碘氧化(10mM iodine in H₂O:trifluoroacetic acid:acetonitrile(78:2:20by volume，10min)，移去另外2个半胱氨酸上的Acm,同时在这2个半胱氨酸之间形成第二对二硫键。再经RP-HPLC C18柱(Vydac)纯化，即获得定向形成二硫键的α-芋螺毒素，并通过质谱(electrospray-mass spectroscopy，ESI-MS)鉴定其相对分子质量是否与理论值一致。

氧化折叠后的LvIB及其突变体通过HPLC和ESI-MS进行检测(图8A-8J)。合成的LvIB及其突变体的纯度均在95％以上，且实测分子量与理论分子量一致。多肽浓度用280nm波长下比色测定，根据Beer-Lambert方程(equation)计算多肽浓度和质量。这些定量过的折叠好的多肽用于后面的活性测试。

实施例7：α-芋螺毒素LvIB及其突变体对α7nAChRs，以及其它nAChRs亚型的活性研究

参照文献(Azam L,Yoshikami D,McIntosh JM.Amino acid residues thatconfer high selectivity of the alpha6 nicotinic acetylcholine receptorsubunit to alpha-conotoxin MII[S4A,E11A,L15A].J Biol Chem.2008；283(17):11625-32.)中的方法，以及体外转录试剂盒(mMessage mMachine in vitro transcription kit(Ambion,Austin,TX))说明书，制备各种大鼠神经型nAChRs亚型(α3β2，α6/α3β2β3，α6/α3β4，α9α10，α4β2，α4β4，α3β4，α2β2，α2β4，α7)、以及小鼠肌肉型nAChRs(α1β1δε)的cRNA，其浓度用UV 260nm下的OD值进行测算。解剖收集非洲爪蟾(Xenopus laveis)卵母细胞(蛙卵)，将cRNA注射入蛙卵中，每个亚基的注射量为5ng cRNA。肌肉nAChRs每个亚基注射0.5-2.5ngDNA。蛙卵在ND-96中培养。蛙卵收集后的1－2天内注射cRNA，注射后1－4天内用于nAChRs的电压钳记录。

将1个注射过cRNA的蛙卵置于30μL的Sylgard记录槽中(直径4mm×深度2mm)，重力灌注含有0.1mg/ml BSA(bovine serum albumin)的ND96灌流液(96.0mM NaCl,2.0mM KCl,1.8mM CaCl₂,1.0mM MgCl₂,5mM HEPES,pH 7.1-7.5)或含有1mM atropine的ND96(ND96A)，流速为1ml/min。所有的芋螺毒素溶液也含有0.1mg/ml BSA以减少毒素的非特异性吸附，用转换阀(SmartValve,Cavro Scientific Instruments,Sunnyvale,CA)可以在灌注毒素或乙酰胆碱(ACh)之间进行自由切换，以及一系列三通螺线阀(solenoid valves,model161TO31,Neptune Research,Northboro,MA)使灌注ND96与ACh等之间进行自由切换。Ach门控的电流由双电极电压箝放大器(model OC-725B,Warner Instrument Corp.,Hamden,CT)设置在“慢”箝，以及clamp gain在最大值(×2000)位置时进行在线记录。用1mm外径×0.75内径mm的玻璃毛细管(fiber-filled borosilicate capillaries，WPI Inc.,Sarasota,FL)拉制玻璃电极，并充满3M KCl作为电压和电流电极。膜电压箝制在-70mV.整个系统均由电脑控制和记录数据。ACh脉冲为每隔5min自动灌注1s的ACh。ACh的浓度分别为，表达肌肉型的nAChRs和神经型α9α10nAChRs卵为10μM；表达神经型的nAChRs之α7为200μM,其它的亚型都为100μM。至少记录4个卵表达某个亚型对不同毒素浓度的电流反应情况，以及电流轨迹。

测试的电流数据用GraphPad Prism软件(San Diego,CA)进行统计分析，绘制剂量反应曲线，计算芋螺毒素的半阻滞浓度IC₅₀等多种有关多肽阻断nAChRs的各种参数。

结果表明，LvIB(SEQ ID NO：8)对大鼠α7 nAChRs具有阻断活性，其半阻断剂量(IC₅₀)为1760nM(图9A，表3)，且对其他受体活性较弱。[Q1G]LvIB(SEQ ID NO：9)对大鼠α7nAChRs的阻断活性与LvIB相近，其半阻断剂量(IC₅₀)为1100nM(图9B，表3)。[Q1G,ΔR14]LvIB(SEQ ID NO：10)对大鼠α7 nAChRs的阻断活性最强，其半阻断剂量(IC₅₀)为97nM(图9C，表3)，对α6/α3β2β3nAChRs也具有较强活性，其半阻断剂量(IC₅₀)为150nM(图9C，表3)。[ΔR14]LvIB(SEQ ID NO：11)对大鼠α7 nAChRs的阻断活性相比LvIB略有增强，其半阻断剂量(IC₅₀)为460nM(图9D，表3)。

结果显示，[ΔQ1,ΔR14]LvIB(SEQ ID NO：12)对大鼠α7 nAChRs的阻断活性与LvIB类似，其半阻断剂量(IC₅₀)为1810nM(图9E，表3)。图10A-图10E总结了LvIB及其突变体阻断大鼠α7 nAChRs的电流轨迹图，可以很明显的看出，在相同浓度下，[Q1G,ΔR14]LvIB(SEQ ID NO：10)的抑制活性强于其它4个多肽，且洗脱速率较慢。

这一系列多肽中，活性最强的[Q1G,ΔR14]LvIB(SEQ ID NO：10)具有很高的受体区分性，对其它相似亚型的受体，如rα3β2，rα3β4，rα6/α3β2β3和rα6/α3β4nAChRs的阻断作用较弱(图11A-图11D，表3)。

表4：[Q1G,ΔR14]LvIB对r和hα7 nAChRs的IC₅₀值汇总表

nAChRs	IC<sub>50</sub>(nM)	斜率	比值<sup>a</sup>
				rα7	97(82-110)	1.25(0.98-1.52)	1
hα7	1490(1250-1770)	1.51(1.20-1.82)	15.4

括号中的值为95％置信区间。r，大鼠亚基；h，人亚基。^aIC₅₀值相对于rα7 nAChRs的比率。数值为6至8个卵母细胞的平均值±SEM。

值得注意的是，[Q1G,ΔR14]LvIB(SEQ ID NO：10)对不同种属的α7 nAChRs也具有区分性，结果表明，[Q1G,ΔR14]LvIB对人源hα7nAChRs的活性(实验方法参考上面的实施例7)比对鼠源rα7 nAChRs低15.4倍，其半阻断剂量(IC₅₀)为1490nM(图12，表4)。因此，[Q1G,ΔR14]LvIB是比本体LvIB靶向α7 nAChRs活性更强的突变体多肽，并且是具有不同种属特异性的新颖分子探针。

实施例8：α-芋螺毒素[Q1G,ΔR14]LvIB突变体对rα7与hα7nAChRs的构效关系研究

通过基因比对，人源与鼠源α7的配体结合区段仅存在10个的氨基酸差异位点，因此本发明人通过定点诱变逐一突变这些位点(图13，表5)。随后使用[Q1G,ΔR14]LvIB进行测试，结果显示，140、183和185位出现差异，其中，140位点由鼠源变向人源，活性下降约3.1倍；183位点由鼠源变向人源，活性下降约7.3倍；185位点由鼠源变向人源，活性下降约4.4倍(图14A-图14D，表5)。针对以上结果，本发明人进行了反向突变，结果显示，140位点由人源变向鼠源，人鼠区分度由原来15倍变为11.0倍；183位点由人源变向鼠源；人鼠区分度由原来15倍变为8.8倍，185位点由人源变向鼠源，人鼠区分度由原来15倍变为11.6。最后，本发明人将上述三个位点同时进行了反向突变。

表5：[Q1G,ΔR14]LvIB对r和hα7 nAChRs的正向与反向突变体的IC₅₀值汇总表

结果显示，140+183+185三位点反向突变使人鼠区分度由原来15倍变为2.3倍(图15，表5)。因此，[Q1G,ΔR14]LvIB区分人鼠α7nAChRs的关键机制很可能在于受体上的140、183和185这三个位点。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西大学

<120> α-芋螺毒素肽LvID和LvIB、其药物组合物及用途

<130> IDC200464

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 1

gtggttctgg gtccagca 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 2

gtcgtggttc agagggtc 18

<210> 3

<211> 126

<212> DNA

<213> Conus lividus

<400> 3

tctgatggca ggaatgctgc agccaacgac aaagcatttg acctgttggc tctggcagtc 60

aaggactgct gttccgagcc tccctgtatc ctgcaaaatc cagatatctg tggcagaaga 120

cgctga 126

<210> 4

<211> 41

<212> PRT

<213> Conus lividus

<400> 4

Ser Asp Gly Arg Asn Ala Ala Ala Asn Asp Lys Ala Phe Asp Leu Leu

1 5 10 15

Ala Leu Ala Val Lys Asp Cys Cys Ser Glu Pro Pro Cys Ile Leu Gln

20 25 30

Asn Pro Asp Ile Cys Gly Arg Arg Arg

35 40

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> Conus lividus

<400> 5

Asp Cys Cys Ser Glu Pro Pro Cys Ile Leu Gln Asn Pro Asp Ile Cys

1 5 10 15

<210> 6

<211> 117

<212> DNA

<213> Conus lividus

<400> 6

tctgatggca gggacgctgc agccgactac aaaccgtctg acttgatcgc tctggccatc 60

aagcaatgct gctccaatcc accctgtgcc catgaacatt gtcgtcgaag acgctga 117

<210> 7

<211> 38

<212> PRT

<213> Conus lividus

<400> 7

Ser Asp Gly Arg Asp Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Pro Ser Asp Leu Ile

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ile Lys Gln Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ala His Glu

20 25 30

His Cys Arg Arg Arg Arg

35

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> Conus lividus

<400> 8

Gln Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ala His Glu His Cys Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

Gly Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ala His Glu His Cys Arg

1 5 10

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 10

Gly Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ala His Glu His Cys

1 5 10

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 11

Gln Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ala His Glu His Cys

1 5 10

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 12

Cys Cys Ser Asn Pro Pro Cys Ala His Glu His Cys

1 5 10

Claims

1.一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NOs:4-5和SEQ ID NOs:7-12中任一序列所示。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中，

优选地，所述多肽的羧基末端是酰胺化的。

3.一种分离的融合蛋白，其包含至少一种权利要求1至2中任一权利要求所述的多肽。

4.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至2中任一权利要求所述的多肽或者权利要求3所述的融合蛋白。

5.一种核酸构建体，其含有权利要求4所述的多核苷酸；优选地，所述核酸构建体为重组载体；优选地，所述核酸构建体为重组表达载体。

6.一种转化的细胞，其含有权利要求4所述的多核苷酸，或者含有权利要求5所述的核酸构建体。

7.一种药物组合物，其含有至少一种权利要求1至2中任一权利要求所述的多肽、权利要求3所述的融合蛋白或者权利要求4所述的多核苷酸；可选地，其还包含一种或多种药学上可接受的辅料。

8.权利要求1至2中任一权利要求所述的多肽、权利要求3所述的融合蛋白或者权利要求4所述的多核苷酸在制备阻断乙酰胆碱受体的药物中的用途；其中，所述乙酰胆碱受体是α7乙酰胆碱受体。

9.权利要求1至2中任一权利要求所述的多肽、权利要求3所述的融合蛋白或者权利要求4所述的多核苷酸在制备治疗和/或预防癌症或者哮喘的药物中的用途；

优选地，所述哮喘为小儿哮喘。

10.一种在体外阻断乙酰胆碱受体或者调节乙酰胆碱水平的方法，包括施加给细胞有效量的权利要求1至2中任一权利要求所述的多肽或者权利要求3所述的融合蛋白的步骤；其中，所述乙酰胆碱受体是α7乙酰胆碱受体。

11.权利要求1至2中任一权利要求所述的多肽、权利要求3所述的融合蛋白或者权利要求4所述的多核苷酸在制备药物筛选模型中的用途，其中，

所述药物筛选模型为细胞模型或者动物模型，