CN115433265A - α-芋螺毒素肽LvIE和LvIF、其药物组合物及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种新的α‑芋螺毒素肽LvIE和LvIF、其药物组合物及用途。一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQID NOs:4‑5和SEQ ID NOs:7‑8中任一序列所示。本发明的α‑芋螺毒素肽能够有效地、特异地阻断α3β2乙酰胆碱受体和α6β2*nAChRs乙酰胆碱受体，具有防治神经痛、成瘾、帕金森病、痴呆、精神分裂症或抑郁等疾病的潜力，具有良好的应用前景。

Description

α-芋螺毒素肽LvIE和LvIF、其药物组合物及用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种新的α-芋螺毒素肽LvIE和LvIF、其药物组合物及用途。本发明还涉及所述芋螺毒素肽的前肽、其核酸构建体、其表达载体和转化的细胞、以及其融合蛋白。本发明还涉及一种阻断乙酰胆碱受体的方法、以及所述芋螺毒素肽的制药用途。

背景技术

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)属于配体门控离子通道，是细胞膜上的五聚体变构跨膜蛋白，在动物界普遍存在，具有非常重要的生理作用和临床研究意义。nAChRs是人类最早发现的一类受体，可分为肌肉型和神经型两大类，由不同的α和β亚基组装成很多种亚型，每种亚型都有截然不同的药理学特征(Marcovich I,Moglie MJ,Carpaneto Freixas AE,Trigila AP,Franchini LF,Plazas PV,Lipovsek M,Elgoyhen AB.DistinctEvolutionary Trajectories of Neuronal and Hair Cell Nicotinic AcetylcholineReceptors.Mol Biol Evol.2020；37(4):1070-1089.)。

nAChRs由不同的α和β亚基组装成很多种亚型，肌肉型乙酰胆碱受体由5个亚基构成，含2个α1亚基，1个β亚基，1个δ亚基和1个γ或ε亚基，γ或ε亚基取决于其是否为胎儿或成体的乙酰胆碱受体。哺乳动物神经型nAChRs也是由5个亚基构成，其亚型更为复杂，至少涉及8种α亚基、3种β亚基，分别为α2、α3、α4、α5、α6、α7、α9和α10，以及β2、β3和β4。其中α2、α3和α4可以分别同β2或者β4结合，形成功能性受体，比如α2β2、α3β2、α2β4等。此外，α6β4*和α9可以形成同源多聚体(P.Gopalakrishnakone LJC,Sulan Luo.Toxins and DrugDiscovery.Springer Nature(Publisher)2017；ISBN 978-94-007-6451-4:Conotoxin:p148-187.)。

nAChRs广泛分布于中枢、外周神经系统、免疫系统，介导众多中枢和外周神经系统的生理功能，包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等。nAChRs激活多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、γ-氨基丁酸等多种神经递质的释放。(Zoli M,Pucci S,Vilella A,GottiC.Neuronal and Extraneuronal Nicotinic Acetylcholine Receptors.Currentneuropharmacology 2018；16:338-349.Fujii T,Mashimo M,Moriwaki Y,Misawa H,OnoS,Horiguchi K,Kawashima K.Expression and Function of the Cholinergic Systemin Immune Cells.Frontiers in immunology 2017；8:1085.)。已证实nAChRs是筛选诊断和治疗一大类重要疾病药物的关键靶点，这些疾病包括疼痛、烟酒和毒品成瘾、智障、痴呆、精神分裂症、中枢神经紊乱、癫痫症、帕金森病、精神病、神经肌肉阻滞、重症肌无力、抑郁症、高血压、心率不齐、哮喘、肌肉松弛、中风、耳聋、肥胖、乳腺癌和肺癌等(Bertrand D,Terry AV,Jr.The wonderland of neuronal nicotinic acetylcholinereceptors.Biochemical pharmacology 2018；151:214-225.Gu S,Knowland D,Matta JA,O'Carroll ML,Davini WB,Dhara M,Kweon HJ,Bredt DS.Hair cellα9α10nicotinicacetylcholine receptor functional expression regulated by ligand binding anddeafness gene products.Proc Natl Acad Sci U S A.2020；117(39):24534-24544.HoneAJ,McIntosh JM.Nicotinic acetylcholine receptors in neuropathic andinflammatory pain.FEBS letters 2018；592:1045-1062.)。至今对于上述疾病还没有对症治疗的特效药。

由于缺乏针对各种亚型的高选择性配体化合物，要研究和阐明各种各样的nAChRs亚型的精细结构和功能面临诸多挑战。因此，开发针对nAChRs各种亚型的、高选择性的配体药物是治疗上述疾病的关键所在。那么nAChRs某个亚型的特异性配体(阻断剂/抑制剂/拮抗剂或激动剂/开放剂)，将是很宝贵的工具药和重大创新药物的先导化合物，它们在多种疾病机理的研究，以及相关疾病治疗新药研发方面具有极大的应用价值和开发前景。

生活在热带海洋中的肉食性软体动物芋螺(Conus)分泌的芋螺毒素或芋螺肽(Conotoxin，Conopeptide,CTX)，具有调节各种离子通道的特殊功能，在临床上已显示出了重要价值，具有巨大的新药研发潜力(Jin AH,Muttenthaler M,Dutertre S,Himaya SWA,Kaas Q,Craik DJ,Lewis RJ,Alewood PF.Conotoxins:Chemistry and Biology.Chemicalreviews 2019；119:11510-11549.Muttenthaler M,King GF,Adams DJ,AlewoodPF.Trends in peptide drug discovery.Nat Rev Drug Discov.2021 Feb 3.Epub aheadof print.)。芋螺毒素通常含有10－46个氨基酸，富含二硫键，生物活性强，能特异地作用于动物细胞膜上的受体和离子通道。尤其是对电压门控或配体门控离子通道(包括少数G-蛋白相关受体等)具有很好的选择性。芋螺毒素按其受体靶位可分为α、ω、μ、δ等多种药理学家族。

其中的α-芋螺毒素是烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)各个亚型选择性最好的特异阻断剂，其分子量较小，一般由12-19个氨基酸残基组成，富含二硫键(P.Gopalakrishnakone LJC,Sulan Luo.Toxins and Drug Discovery.Springer Nature(Publisher)2017；ISBN 978-94-007-6451-4:Conotoxin:p148-187.)。α-芋螺毒素的种类繁多，活性多样，结构复杂。通过其高度保守的信号肽序列、药理学活性及半胱氨酸模式可对α-芋螺毒素进行分类。α-芋螺毒素的半胱氨酸模式为CC-C-C，其中二硫键连接方式为C1-C3与C2-C4，二硫键间形成2个loop环，根据二三及三四半胱氨酸间氨基酸数量不同又可把α-芋螺毒素分为α3/5，α4/7，α4/6，α4/4和α4/3等多个亚家族，每个loop的特征和残基组成的不同是毒素作用于不同受体亚型的基础(Kaas Q,Yu R,Jin AH,Dutertre S,CraikDJ.ConoServer:updated content,knowledge,and discovery tools in theconopeptide database.Nucleic acids research 2012；40:D325-330.)。因此，α-芋螺毒素及其作用靶点nAChRs在多种疾病机理的研究，以及药物研发方面具有极其重要的价值(Ying Fu,Cheng Li,Shuai Dong,Yong Wu,Dongting Zhangsun and Sulan Luo*.Discovery Methodology of Novel Conotoxins from Conus Species.Marine Drugs,2018,16,417；doi:10.3390/md16110417.)。

α-芋螺毒素天然肽的二硫键连接方式为C1-C3与C2-C4，称为球形异构体(globular isomer)，二硫键间形成2个loop环。含有4个半胱氨酸的α-芋螺毒素线性肽氧化折叠后往往产生3种异构体，除了C1-C3与C2-C4间的天然肽二硫键连接方式(球形异构体)外，另外两种异构体分别是带状异构体(ribbon isomer)与珠子状异构体(bead isomer)。带状异构体的二硫键连接方式为C1-C4与C2-C3；珠子状异构体的二硫键连接方式为C1-C2与C3-C4。球形异构体具有完全的生物活性，带状异构体有时通过不同的作用机制也发挥生物活性，珠子状异构体活性往往减小(Ulens C,Hogg RC,Celie PH,et al.Structuraldeterminants of selective alpha-conotoxin binding to a nicotinicacetylcholine receptor homolog AChBP[J].Proc Natl Acad Sci USA 2006；103:3615–20；Terlau,H.；Olivera,B.M.,Conus venoms:a rich source of novel ion channel-targeted peptides.Physiological reviews 2004,84(1),41-68.Grishin AA,Wang CI,Muttenthaler M,Alewood PF,Lewis RJ,Adams DJ.Alpha-conotoxin AuIB isomersexhibit distinct inhibitory mechanisms and differential sensitivity tostoichiometry of alpha3beta4 nicotinic acetylcholine receptors.J BiolChem.2010,285(29):22254-63)。

神经痛(慢性痛)是中枢或外周神经系统损伤或功能异常导致的疼痛综合征。癌症、创伤(神经外伤、压迫)、代谢紊乱(糖尿病)、和中毒(化疗)等很多疾病都会引起神经痛。神经痛是影响人类生活质量的重大疾病，造成了巨大的社会、经济负担。据美国流行病学以及医药费调查研究表明(Vadivelu N,Kai AM,Kodumudi G,Babayan K,Fontes M,BurgMM.Pain and Psychology-A Reciprocal Relationship.The Ochsner journal 2017；17:173-180)，神经痛折磨着全球范围内超过20％的人口；65岁以上的老人，50％以上都遭受神经痛的折磨，美国的成年慢性痛患者高达1亿人，年均消耗医药费高达6000多亿美元($635-$650billion)。神经痛不仅严重影响患者的身心健康，而且每年消耗着数以千亿美元计的医疗资源，神经痛造成的医疗损失比癌症、心脏病、糖尿病三大类疾病的总和还要多(Gaskin DJ,Richard P.The economic costs of pain in the United States.Thejournal of pain:official journal of the American Pain Society 2012；13:715-724)。我国神经痛患者更多，也为此付出了沉重代价。可是临床上却没有治疗神经痛的特效药。

含有α3-亚基的nAChRs，包括α3β2与α3β4亚型主要表达在外周神经系统，是神经痛药物作用的靶点。阻断α3β2或α3β4 nAChRs的α-芋螺毒素在临床前多种顽固性疼痛(chronic pain)模型上显示出很好的镇痛活性，且不成瘾。顽固性疼痛是一个世界性的健康难题，急需新的治疗药物面世(Napier,I.A.；Klimis,H.；Rycroft,B.K.；Jin,A.H.；Alewood,P.F.；Motin,L.；Adams,D.J.；Christie,M.J.,Intrathecalα-conotoxins Vc1.1,AuIB and MII acting on distinct nicotinic receptor subtypes reverse signs ofneuropathic pain.Neuropharmacology 2012,62(7),2202-2207.Blyth,F.M.；March,L.M.；Brnabic,A.J.；Jorm,L.R.；Williamson,M.；Cousins,M.J.,Chronic pain inAustralia:a prevalence study.PAIN 2001,89(2-3),127-34.Cousins,M.J.；Brennan,F.；Carr,D.B.,Pain relief:a universal human right.PAIN 2004,112(1-2),1-4.Eisenberg,E.；McNicol,E.D.；Carr,D.B.,Efficacy and safety of opioid agonistsin the treatment of neuropathic pain of nonmalignant origin:systematic reviewand meta-analysis of randomized controlled trials.JAMA:the journal of theAmerican Medical Association 2005,293(24),3043-52.)。

药物成瘾既是医疗难题亦是严重的社会问题。烟瘾是由烟草中的烟碱(尼古丁)引起的，其体内受体就是烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)(Azam L,McIntosh JM.Alpha-conotoxins as pharmacological probes of nicotinic acetylcholinereceptors.Acta Pharmacol Sin.2009；30(6):771-783)。研究表明，表达在多巴胺能(DA)神经元的nAChRs是治疗神经精神疾病，如烟碱、吗啡与可卡因等的成瘾、帕金森病、痴呆、精神分裂症、抑郁等的药物作用靶点(Larsson,A.；Jerlhag,E.；Svensson,L.；Soderpalm,B.；Engel,J.A.,Is an alpha-conotoxin MII-sensitive mechanism involved in theneurochemical,stimulatory,and rewarding effects of ethanol？Alcohol 2004,34(2-3),239-50.Jerlhag,E.；Egecioglu,E.；Dickson,S.L.；Svensson,L.；Engel,J.A.,Alpha-conotoxin MII-sensitive nicotinic acetylcholine receptors are involved inmediating the ghrelin-induced locomotor stimulation and dopamine overflow innucleus accumbens.European neuropsychopharmacology，2008,18(7),508-18)。阻断α3β2和α6β2*(*代表其他亚基)nAChRs的α-芋螺毒素MII可部分和区别性地阻断纹状体中烟碱引起的多巴胺释放，突触前的nAChRs至少包含2类亚型，即MII-敏感型与MII-不敏感型，调控多巴胺神经元的DA释放(Kaiser SA,Soliakov L,Harvey SC,Luetje CW,WonnacottS.Differential inhibition byα-conotoxin-MII of the nicotinic stimulation of[3H]dopamine release from rat striatal synaptosomes and slices.J Neurochem1998；70:1069-76)。新近研究报道，阻断含有α6β2的nAChRs可有效防止烟瘾和吗啡毒瘾的发作，显著抑制吸烟和吸毒的欲望(Brunzell DH,Boschen KE,Hendrick ES,BeardsleyPM,McIntosh JM.Alpha-conotoxin MII-sensitive nicotinic acetylcholinereceptors in the nucleus accumbens shell regulate progressive ratioresponding maintained by nicotine.Neuropsychopharmacology,2010；35(3):665-673.)。

哺乳动物脑中纹状体上的α6β2*-nAChRs亚型被认为是治疗烟瘾、毒瘾和酒瘾的药物作用靶点(Exley,R.；Clements,M.A.；Hartung,H.；McIntosh,J.M.；Cragg,S.J.,Alpha6-containing nicotinic acetylcholine receptors dominate the nicotine control ofdopamine neurotransmission in nucleus accumbens.Neuropsychopharmacology 2008,33(9),2158-66。Gao,F.；Chen,D.；Ma,X.；Sudweeks,S.；Yorgason,J.T.；Gao,M.；Turner,D.；Eaton,J.B.；McIntosh,J.M.；Lukas,R.J.；Whiteaker,P.；Chang,Y.；Steffensen,S.C.；Wu,J.Alpha6-containing nicotinic acetylcholine receptor is a highly sensitivetarget of alcohol.Neuropharmacology 2019,149,45-54.)。α6亚基在脑中并不是广泛分布的，但却在中脑部分的多巴胺能神经元区域富集表达，这个区域是与愉快、奖赏与心情控制密切相关的区域，这意味着α6*nAChRs在药物引起的成瘾与情绪控制等的调控中起关键作用

α3β2 nAChRs发挥着如此重要的生理功能，并与疼痛、学习、记忆、运动、体温、抑郁、成瘾、心脑血管疾病等密切相关。由于缺乏α3β2 nAChRs的特异性配体或工具药，对其生理功能和病理机制研究还很缺乏。因此，亟需发现新的高特异性的nAChRs特别是α3β2nAChR阻断剂。研发新的α3β2 nAChRs强阻滞剂，特别是能够区分与其结构相似、分布重叠的nAChRs其他亚型的阻滞剂，以及与α3β2 nAChRs有关的疾病机理研究、新药筛选、以及治疗新药的研发，具有非常重要的科学意义和巨大的经济价值。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，发现了新的α-芋螺毒素肽(命名为LvIE和LvIF，分别对应于SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8)，并进一步人工合成了这两个肽。本发明人惊奇地发现，LvIE和LvIF均能够特异性地阻断α3β2乙酰胆碱受体，具有高选择性强阻断活性，具有用于制备或用于筛选治疗和/或预防与α3β2、α6/α3β2β3(α6β2*)乙酰胆碱受体相关疾病的药物的潜力。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NOs:4-5和SEQID NOs:7-8中任一序列所示。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其中，

所述多肽的N末端起的第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键，并且第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键；或所述多肽的N末端起的第一个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键，并且第二个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键；或所述多肽的N末端起的第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸形成二硫键，并且第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键；

优选地，所述多肽的羧基末端是酰胺化的。

本发明的另一方面涉及一种分离的融合蛋白，其包含至少一种本发明中任一项所述的多肽。

本发明的再一方面涉及一种分离的多核苷酸，其编码本发明中任一项所述的多肽或者本发明的融合蛋白。

本发明的再一方面涉及一种核酸构建体，其含有本发明的多核苷酸；优选地，所述核酸构建体为重组载体；优选地，所述核酸构建体为重组表达载体。

本发明的再一方面涉及一种转化的细胞，其含有本发明的多核苷酸，或者含有本发明的核酸构建体。

根据本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸，其用于制备阻断乙酰胆碱受体的药物；其中，所述乙酰胆碱受体是α3β2乙酰胆碱受体或α6β2*乙酰胆碱受体。

根据本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸，其用于制备治疗和/或预防神经痛、成瘾、帕金森病、痴呆、精神分裂症或抑郁的药物；

优选地，所述神经痛由如下因素中的一个或多个导致：癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎或过敏症；

优选地，所述成瘾为烟瘾、酒瘾或毒瘾；

优选地，所述毒瘾由如下因素中的一个或多个导致：尼古丁、鸦片、海洛因、甲基苯丙胺(冰毒)、吗啡、大麻或可卡因。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其含有至少一种本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸；可选地，其还包含一种或多种药学上可接受的辅料。

在一些实施方案中，含有治疗有效量的本发明多肽的药物组合物以利于药用的方式配制和给药，并需考虑到个体病人的临床状况、运送位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸在制备阻断乙酰胆碱受体的药物中的用途；其中，所述乙酰胆碱受体是α3β2乙酰胆碱受体或α6β2*乙酰胆碱受体。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸在制备治疗和/或预防神经痛、成瘾、帕金森病、痴呆、精神分裂症或抑郁的药物中的用途；

优选地，所述神经痛由如下因素中的一个或多个导致：癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎或过敏症；

优选地，所述成瘾为烟瘾、酒瘾或毒瘾；

优选地，所述毒瘾由如下因素中的一个或多个导致：尼古丁、鸦片、海洛因、甲基苯丙胺(冰毒)、吗啡、大麻或可卡因。

本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防神经痛、成瘾、帕金森病、痴呆、精神分裂症或抑郁的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸的步骤；

优选地，所述神经痛由如下因素中的一个或多个导致：癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎或过敏症；

优选地，所述成瘾为烟瘾、酒瘾或毒瘾；

优选地，所述毒瘾由如下因素中的一个或多个导致：尼古丁、鸦片、海洛因、甲基苯丙胺(冰毒)、吗啡、大麻或可卡因。

给药剂量取决于许多因素，例如所治疗病况的严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。本领域通常的做法是，剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

本发明的再一方面涉及一种在体外阻断乙酰胆碱受体或者调节乙酰胆碱水平的方法，包括施加给细胞有效量的本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸的步骤；其中，所述乙酰胆碱受体是α3β2乙酰胆碱受体或α6β2*乙酰胆碱受体。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸在制备药物筛选模型中的用途，其中，

所述药物筛选模型为细胞模型或者动物模型，

所述药物为用于治疗和/或预防神经痛、成瘾、帕金森病、痴呆、精神分裂症或抑郁的药物；

优选地，所述神经痛由如下因素中的一个或多个导致：癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎或过敏症；

优选地，所述成瘾为烟瘾、酒瘾或毒瘾；

优选地，所述毒瘾由如下因素中的一个或多个导致：尼古丁、鸦片、海洛因、甲基苯丙胺(冰毒)、吗啡、大麻或可卡因。

本发明的再一方面涉及一种制备药物筛选模型的方法，包括给予目标细胞或者目标动物以有效量的本发明中任一项所述的多肽、本发明的融合蛋白或者本发明的多核苷酸的步骤，其中，

所述药物筛选模型为细胞模型或者动物模型；

所述药物为用于治疗和/或预防神经痛、成瘾、帕金森病、痴呆、精神分裂症或抑郁的药物；

优选地，所述神经痛由如下因素中的一个或多个导致：癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎或过敏症；

优选地，所述成瘾为烟瘾、酒瘾或毒瘾；

优选地，所述毒瘾由如下因素中的一个或多个导致：尼古丁、鸦片、海洛因、甲基苯丙胺(冰毒)、吗啡、大麻或可卡因；

优选地，所述神经痛、成瘾、帕金森病、痴呆、精神分裂症或抑郁为α3β2乙酰胆碱受体或α6β2*乙酰胆碱受体相关或者由α3β2乙酰胆碱受体或α6β2*乙酰胆碱受体表达水平高于正常人的表达水平或者高于患者的正常表达水平所导致。

在本发明的一些实施方式中，所述的细胞模型或者动物模型，其α3β2乙酰胆碱受体或α6β2*乙酰胆碱受体水平降低，或者α3β2乙酰胆碱受体或α6β2*乙酰胆碱受体被阻断。在本发明的一些实施方式中，细胞模型或者动物模型中的α3β2乙酰胆碱受体或α6β2*乙酰胆碱受体水平降低，或者α3β2乙酰胆碱受体或α6β2*乙酰胆碱受体被阻断可以通过包括但不限于如下之一的方法实现：施加给目标细胞或者目标动物以有效量的本发明中任一项所述的多肽或者本发明的融合蛋白；或者通过基因转导的方法，将本发明的多核苷酸或者核酸构建体转入目标细胞或者目标动物，以产生有效量的本发明中任一项所述的多肽或者本发明的融合蛋白。

本发明的另一方面涉及本发明任一项所述的多肽的制备方法，包括下述步骤：

1)在ABI Prism 433a多肽合成仪上或者手工方法合成线性多肽，Fmoc氨基酸的侧链保护基为:Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr)、OBut(Asp)、Boc(Lys)；半胱氨酸用Trt或Acm保护基团，分别在相应的半胱氨酸之间定点形成二硫键；

2)将步骤1)中得到的线性多肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性多肽粗品，用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化；

3)将步骤2)中得到的产物进行两步氧化折叠。

本发明中：

术语“核酸构建体”，在文中定义为单链或双链核酸分子，优选是指人工构建的核酸分子。可选地，所述核酸构建体还包含有可操作地连接的1个或多个调控序列。

在本发明中，术语“可操作地连接”是指两个或多个核苷酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。所述“可操作地连接”可以通过基因重组的手段实现。

在本发明中，术语“载体”指的是，可将抑制某蛋白的多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件。

在本发明中，术语“宿主细胞”指的是导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。

本领域技术人员知悉，哺乳动物(例如啮齿类动物、灵长类动物如人类等)的乙酰胆碱受体(肌肉型或神经型)都是由5个相同或不同的亚基组成的五聚体跨膜蛋白，有很多种亚型。各个亚型的结构非常相似，但其药理学特征和生理功能截然不同。例如，α2β2nAChRs表示含有α2和β2这两种亚基组成的功能性受体，且α2亚基的数目和β2亚基的数目合计是5，即五聚体蛋白。其余类推。

α6β2*nAChRs表示受体中含有α6亚基或者含有α6的胞外配体结合区域的嵌合体亚基(如α6/α3)，以及β2亚基。在本发明的一些实施方式中，α6还包括α6/α3，其中α6/α3表示α6的胞外区和α3的跨膜区嵌合体亚基，有助于体外表达α6β2*nAChRs。α6/α3嵌合体亚基在功能上等同于α6亚基。在本发明的一些实施方式中，所述α6β2*乙酰胆碱受体为α6β2 nAChRs或α6/α3β2β3 nAChRs。

术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

本发明中，如果没有特别说明，浓度单位μM表示μmol/L，mM表示mmol/L，nM表示nmol/L。

本发明中，提到细胞中的加药量时，如果没有特别说明，一般是指加药后药物的终浓度。

本发明中提到术语“氨基酸”或者具体的氨基酸名称时，如果没有特别说明，是指L型的氨基酸。

发明的有益效果

本发明取得了如下的技术效果中的一种或多种：

(1)本发明的芋螺毒素肽(LvIE或LvIF)能够有效地阻断α3β2乙酰胆碱受体或α6β2*乙酰胆碱受体。

(2)本发明的芋螺毒素肽(LvIE或LvIF)能够特异性地阻断α3β2乙酰胆碱受体或α6β2*乙酰胆碱受体。

(3)本发明的芋螺毒素肽可通过结合α6β2*乙酰胆碱受体(nAChRs)发挥作用，具有治疗和/或预防神经痛、成瘾、帕金森病、痴呆、精神分裂症或抑郁或者与α3β2乙酰胆碱受体或α6β2*乙酰胆碱受体相关的任何疾病的活性。

(4)本发明的芋螺毒素肽可应用于研究、诊断、筛选和治疗神经痛、成瘾、帕金森病、痴呆、精神分裂症或抑郁或者与α3β2乙酰胆碱受体或α6β2*乙酰胆碱受体相关的任何疾病、以及作为有用的分子探针用于研究等方面。不同的α-芋螺毒素对脊椎动物受体的亲和性不同，有时相差几个数量级。这种种系间的差异使得α-芋螺毒素可作为有用的探针用于研究脊椎动物nAChRs的种系发生，可作为分子探针来确定nAchRs的不同亚型。它们是新药开发的候选药物、先导药物和治疗药物。

本发明的α-芋螺毒素肽能够特异地阻断乙酰胆碱受体(nAChRs)，并且具有强镇痛与戒除成瘾活性，以及治疗帕金森症、痴呆、精神分裂症、抑郁等疾病的功效。

附图说明

图1A-图1B：α-芋螺毒素LvIE(多肽1,Peptide 1)(图1A)和LvIF(多肽2,Peptide2)(图1B)的序列及其二硫键连接方式Cys(I-III,II-IV)。每个取代的氨基酸以下划线标出。半胱氨酸用斜体标出。#表示C-末端酰胺化。

图2A-图2B：α-芋螺毒素LvIE(图2A)和LvIF(图2B)前肽基因序列及其编码产生的前肽与翻译后修饰产生的成熟肽。箭头所指为翻译后修饰的加工位点。推断的蛋白酶水解加工位点1(processing site 1)在碱性氨基酸精氨酸(R)的后面；C-末端酰胺化加工位点可能在箭头所指的两个甘氨酸的位置，即processing site 2。成熟肽C-末端紧挨半胱氨酸(Cys)的甘氨酸残基往往是酰胺化翻译后修饰的加工位点，从processing site 2进行酰胺化产生的成熟肽命名为LvIE，序列为：GCCSHPACAGNNPHIC#(#表示C-末端酰胺。前肽区用斜体字表示，成熟肽用下划线表示，其中的半胱氨酸(C)用加粗字体显示。

图3A和图3C：分别是LvIE和LvIF的高压液相色谱图，其中：

HPLC分析条件为：C18柱(Vydac)，洗脱线性梯度为在0-40min内10-40％B60(含60％的乙腈水溶液)，监测波长为214nm。溶剂B60是含90％乙腈(ACN，acetonitrile),0.05％TFA(trifluoroacetic acid)的水溶液；溶剂A是0.05％TFA的水溶液；

HPLC色谱图中的分钟数，表示该色谱峰的保留时间；

横坐标是洗脱时间，单位为分钟(min)；纵坐标是在波长为214nm下的紫外吸收值(UV₂₁₄)。

图3B和图3D：分别是LvIE和LvIF的ESI-MS质谱图。

图4A-图4B：分别是α-CTx LvIE和LvIF(10μM)对表达在非洲爪蟾卵母细胞中nAChRs各个亚型电流的影响。所有数据代表Mean±S.E.M，n＝4-6。横坐标是电流反应百分数％，计算公式为：每种nAChR亚型在LvIE 10μM浓度下的电流除以各自的Control电流(对照ND96)的百分数。此处Control是指与药物LvIE或LvIF相同体积的ND96缓冲液加入细胞槽中孵育5min后，Ach激发产生的电流，即为对照电流。

图5A-图5D：LvIE或LvIF阻断大鼠α3β2的电流轨迹图,是大鼠α3β2的高选择性特异阻断剂。图中“C”是指的对照(ND96)电流，紧接“C”后面的是多肽的浓度。箭头所指的是温育5分钟后，多肽阻断相应受体亚型的第一个Ach脉冲形成的电流轨迹。其中：

图5A：10nM LvIE对大鼠α3β2 nAChR的电流影响情况；

图5B：10nM LvIE对大鼠α6/α3β2β3 nAChR的电流影响情况；

图5C：100nM LvIF对大鼠α3β2 nAChR的电流影响情况；

图5D：100nM LvIF对大鼠α6/α3β2β3 nAChR的电流影响情况；

大鼠α3β2和α6/α3β2β3 nAChRs表达在非洲爪蟾卵母细胞中，电生理记录时的钳制电压是-70mV，根据实验操作程序每隔1分钟给1秒(s)的Ach脉冲。LvIE和LvIF对大鼠α3β2(图5A图5C)和大鼠α6/α3β2β3 nAChRs(图5B图5D)的电流有良好的阻断作用。

图6A-图6B：LvIE和LvIF对所有nAChRs亚型的浓度剂量反应曲线，图中横坐标为分别所用LvIE和LvIF多肽的摩尔浓度(M)的对数值(Log[Peptide]M)；纵坐标为浓度反应百分数(Response％)，是指相应浓度的多肽作用下，乙酰胆碱受体电流与对照电流的比值百分数。图中各个数值是取自4-6个非洲爪蟾卵母细胞的电流平均值，即Mean±S.E.M，n＝4-6。

本发明涉及的部分序列如下面的表1所示。

表1：LvIE和LvIF的SEQ ID NO和序列

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)、相应的参考文献、或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：α-芋螺毒素LvIE基因的克隆和序列分析

1.疣缟芋螺基因组DNA的提取

分别以从海南岛、西沙群岛等沿海采集的疣缟芋螺(Conus lividus)活体为材料，储存在-80℃备用。先将芋螺毒腺解剖出来，并称重。然后用海洋动物基因组DNA提取试剂盒(购自中国北京天根生化科技有限公司)，提取毒腺的基因组DNA，具体操作参见试剂盒说明书。

将提取的芋螺基因组总DNA溶于100μL TE中，取5μL进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，以λ-EcoT14 I digest DNA Marker为标准，检测所得DNA的完整性和大小。用核酸蛋白质分析仪测定DNA溶液的OD260、OD280值以及OD260/OD280比值，并计算DNA的浓度(μg·ml^-1)、纯度和DNA产率(μg·g^-1)。所提取的完整DNA用于下一步PCR扩增进行芋螺毒素基因克隆的模板。

2.PCR反应及其产物的克隆、测序、和序列分析

根据α-芋螺毒素前体基因内含子序列及其3’端非翻译区(3’-UTR)序列，设计α-芋螺毒素特异引物，每条引物均为18个碱基的寡核苷酸片段。

上游内含子引物序列为5’-GTGGTTCTGGGTCCAGCA-3’(SEQ ID NO:1)；

下游3’-UTR引物序列为5’-GTCGTGGTTCAGAGGGTC-3’(SEQ ID NO:2)。

将所提取的基因组DNA原液稀释后作为PCR扩增的模板。回收PCR特异扩增产物，与T-easy载体(Promega)连接后转化大肠杆菌XL1菌株，利用蓝白菌落和氨苄青霉素抗性挑选重组子，抽提纯化重组子质粒用于测序分析。

所获PCR特异扩增产物序列经DNAStar软件分析，获知其编码蛋白序列、3’-非翻译区(UTR)序列。芋螺毒素前体蛋白的信号肽、前肽以及成熟肽的预测，采用在线ProP1.0Server进行分析(Duckert,P.；Brunak,S.；Blom,N.,Prediction of proproteinconvertase cleavage sites.Protein engineering,design&selection:PEDS 2004,17(1),107-12.)。

经序列分析比较，获得了一种新的α-芋螺毒素(命名为LvIE)前体基因(图2A)：

GTGGTTCTGGGTCCAGCATTTGATGGCAGGAATGCTGCAGCCAGCGACAAAGCGTCTGAGCTGATGGCTCTGGCCGTCAGGGGATGCTGTTCCCATCCTGCCTGTGCTGGGAATAATCCACATATCTGTGGCAGAAGACGCTGATGCCCCAGGACCCTCTGAACCACGAC(SEQ ID NO:3)

根据前体基因及芋螺毒素特点，推测出LvIE芋螺毒素前肽，它的氨基酸序列如下：

VVLGPAFDGRNAAASDKASELMALAVRGCCSHPACAGNNPH ICGRRR(SEQ ID NO:4)

根据前肽序列再推测出成熟肽LvIE，其氨基酸序列为GCCSHPACAGNNPHIC(SEQ IDNO:5)，推断的方法和原理请参考Luo S,Zhangsun D,Zhang B,Quan Y,Wu Y.Novel alpha-conotoxins identified by gene sequencing from cone snails native to Hainan,and their sequence diversity.J Pept Sci.2006,12(11):693-704。推导结果详见图1A，图2A。

LvIE是新的α-芋螺毒素，其C-末端具有酰胺化的修饰。LvIE含有CC-C-C半胱氨酸模式，其二硫键连接方式为Cys(I-III,II-IV)(图1A)，即在第一和第三个半胱氨酸之间，以及第二和第四个半胱氨酸之间分别形成两对二硫键。LvIE与其它已知的α-芋螺毒素都不同。

实施例2：α-芋螺毒素LvIF基因的克隆和序列分析

1.疣缟芋螺基因组DNA的提取

同上述实施例1。

2.PCR反应及其产物的克隆、测序、和序列分析

同上述实施例1。

经序列分析比较，获得了一种新的α-芋螺毒素(命名为LvIF)前体基因(图2B)：

GTGGTTCTGGGTCCAGCATTTGATGGCAGGAATGCTGCAGCCAGCGACAAAGCTTCTGAGCTGATGGCTCTGGCCGTCAGGGGATGCTGTTCCCATCCTGCCTGTGCCGGGAATAATCAAGACATCTGTGGCTGAAGACGCTGATGCCCCAGGACCCTCTGAACCACGAC(SEQ ID NO:6)

根据前体基因及芋螺毒素特点，推测出LvIF芋螺毒素前肽，它的氨基酸序列如下：

VVLGPAFDGRNAAASDKASELMALAVRGCCSHPACAGNNQDICGRRR(SEQ ID NO:7)

根据前肽序列再推测出成熟肽LvIF，其氨基酸序列为GCCSHPACAGNNQDIC(SEQ IDNO:8)，推断的方法和原理请参考Luo S,Zhangsun D,Zhang B,Quan Y,Wu Y.Novel alpha-conotoxins identified by gene sequencing from cone snails native to Hainan,and their sequence diversity.J Pept Sci.2006,12(11):693-704。推导结果详见图1B，图2B。

LvIF是新的α-芋螺毒素，其C-末端具有酰胺化的修饰。LvIF含有CC-C-C半胱氨酸模式，其二硫键连接方式为Cys(I-III,II-IV)(图1B)，即在第一和第三个半胱氨酸之间，以及第二和第四个半胱氨酸之间分别形成两对二硫键。LvIF与其它已知的α-芋螺毒素都不同。

实施例3：α-芋螺毒素LvIE和LvIF人工合成

根据α-芋螺毒素成熟肽LvIE和LvIF氨基酸序列(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8)，采用Fmoc方法人工合成线性肽(图1A和图1B)。

具体方法如下：

树脂肽采用Fmoc化学方法进行人工合成，可用多肽合成仪或手工合成法合成树脂肽。除了半胱氨酸外，其余氨基酸用标准的侧链保护基团。LvIE的第1和第3个半胱氨酸(Cys)的-SH用Trt(S-trityl)保护，第2和第4个半胱氨酸的-SH用Acm(S-acetamidomethyl)成对保护。

具体的合成步骤为：采用固相合成法中的Fmoc与FastMoc方法，在ABI Prism 433a多肽合成仪上合成了图1A和图1B中的线性肽。Fmoc氨基酸的侧链保护基为:Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr),OBut(Asp),Boc(Lys)。采用Fmoc HOBT DCC方法,Rink酰胺化树脂及Fmoc氨基酸，合成步骤参考仪器合成手册进行。为反应完全,在哌啶脱保护及偶合时间上分别适当延长，对难接氨基酸采用双偶合，获得树脂肽。用reagent K(trifluoroaceticacid/water/ethanedithiol/phenol/thioanisole；90:5:2.5:7.5:5,v/v/v/v/v)将线性肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性肽粗品,用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化，洗脱线性梯度为在0-40min内10-40％B90，监测波长为214nm。溶剂B90是含90％乙腈(CAN，acetonitrile),0.05％TFA(trifluoroacetic acid)的水溶液；溶剂A是0.05％TFA的水溶液。

纯化后的线性肽用分析型的HPLC C18柱(Vydac)进行纯度检测，其洗脱条件同上，流速为1mL/min。其纯度达95％以上，用于氧化折叠。

参照文献(Dowell,C.；Olivera,B.M.；Garrett,J.E.；Staheli,S.T.；Watkins,M.；Kuryatov,A.；Yoshikami,D.；Lindstrom,J.M.；McIntosh,J.M.,Alpha-conotoxin PIA isselective for alpha6 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors.TheJournal of neuroscience 2003,23(24),8445-52.)对LvIE的线性肽进行两步氧化折叠反应，过程简述如下:

首先通过铁氰化钾氧化法(20mM potassium ferricyanide,0.1M Tris,pH 7.5，45min)，在Trt保护基团的两个半胱氨酸之间形成第一对二硫键。单环肽经反相HPLC C18柱(Vydac)纯化后，进行碘氧化(10mM iodine in H₂O:trifluoroacetic acid:acetonitrile(78:2:20by volume，10min)，移去另外2个半胱氨酸上的Acm,同时在这2个半胱氨酸之间形成第二对二硫键。二环肽再经反相HPLC C18柱(Vydac)纯化，即获得按照从N端至C端的顺序在相应的半胱氨酸之间定向形成二硫键的α-芋螺毒素，并通过质谱(electrospray-massspectroscopy，ESI-MS)鉴定。

氧化折叠后的LvIE和LvIF的HPLC色谱图、ESI-MS质谱图分别如图3A和图3C、图3B和图3D所示。合成的LvIE和LvIF的纯度均在95％以上。LvIE与LvIF的实测分子量与理论分子量一致(如表2)。

表2：α-CTx LvIE及其突变体的分子量

多肽	理论分子量(Da,平均)	实测分子量(Da)
			LvIE	1580.7	1578.8
LvIF	1589.8	1587.8

结果表明，所合成多肽的分子量正确，纯度高。

多肽浓度用280nm波长下比色测定，根据Beer-Lambert方程(equation)计算多肽浓度和质量。这些定量过的折叠好的多肽用于下面的实施例4。

实施例4：α-芋螺毒素LvIE和LvIF对大鼠α3β2和rα6/α3β2β3nAChRs以及其它所有 nAChRs亚型的活性研究

参照文献(Azam L,Yoshikami D,McIntosh JM.Amino acid residues thatconfer high selectivity of the alpha6 nicotinic acetylcholine receptorsubunit to alpha-conotoxin MII[S4A,E11A,L15A].J Biol Chem.2008；283(17):11625-32.)中的方法，以及体外转录试剂盒(mMessage mMachine in vitro transcription kit(Ambion,Austin,TX))说明书，制备各种大鼠神经型nAChR亚型(α3β2，α6/α3β2β3，α6/α3β4，α9α10，α4β2，α4β4，α3β4，α2β2，α2β4，α7)、以及大鼠肌肉型nAChRs(α1β1δε)的cRNA，其浓度用UV 260nm下的OD值进行测算。解剖收集非洲爪蟾(Xenopus laveis)卵母细胞(蛙卵)，将cRNA注射入蛙卵中，每个亚基的注射量为5ng cRNA。大鼠肌肉肌肉型nAChR每个亚基注射0.5-2.5ng DNA。蛙卵在ND-96中培养。蛙卵收集后的1－2天内注射cRNA，注射后1－4天内用于nAChR的电压钳记录。

将1个注射过cRNA的蛙卵置于50μL的Sylgard记录槽中(直径4mm×深度2mm)，重力灌注含有0.1mg/ml BSA(bovine serum albumin)的ND96灌流液(96.0mM NaCl,2.0mM KCl,1.8mM CaCl₂,1.0mM MgCl₂,5mM HEPES,pH 7.1-7.5)或含有1mM atropine的ND96(ND96A)，流速为1ml/min。所有的芋螺毒素溶液也含有0.1mg/ml BSA以减少毒素的非特异性吸附，用转换阀(SmartValve,Cavro Scientific Instruments,Sunnyvale,CA)可以在灌注毒素或乙酰胆碱(ACh)之间进行自由切换，以及一系列三通螺线阀(solenoid valves,model161TO31,Neptune Research,Northboro,MA)使灌注ND96与ACh等之间进行自由切换。Ach门控的电流由双电极电压箝放大器(model OC-725B,Warner Instrument Corp.,Hamden,CT)设置在“慢”箝，以及clamp gain在最大值(×2000)位置时进行在线记录。用1mm外径×0.75内径mm的玻璃毛细管(fiber-filled borosilicate capillaries，WPI Inc.,Sarasota,FL)拉制玻璃电极，并充满3M KCl作为电压和电流电极。膜电压箝制在-70mV.整个系统均由电脑控制和记录数据。ACh脉冲为每隔5min自动灌注1s的ACh。ACh的浓度分别为，表达大鼠肌肉型和大鼠神经型α9α10nAChRs为10μM；表达大鼠神经型的nAChR之α7为200μM,其它的亚型都为100μM。至少记录4个卵表达某个亚型对不同毒素浓度的电流反应情况，以及电流轨迹。

测试的电流数据用GraphPad Prism软件(San Diego,CA)进行统计分析，绘制剂量反应曲线(图6A至图6B)，计算芋螺毒素的半阻滞浓度IC₅₀等多种有关多肽阻断nAChRs的各种参数(表3)。

表3：LvIE和LvIF(实施例3制备)分别作用于不同烟碱型乙酰胆碱受体亚型的IC₅₀值

^a代表在10μM的浓度下，抑制率小于50％。

“--”表示未进行相关实验或者不适用。

结果表明，LvIE(图6A)和LvIF(图6B)对大鼠rα3β2和rα6/α3β2β3 nAChRs的阻断活性最强，其半阻断剂量(IC₅₀)分别为1.35nM和2.91nM(LvIE)，9.2nM和14.4nM(LvIF)(表2)。LvIE和LvIF在10μM的高浓度下，对其它所有亚型的受体几乎都没有阻断作用(图4A至图4B、表3)，表明特异性良好。10nM LvIE和100nM LvIF对由Ach门控的大鼠rα3β2和rα6/α3β2β3nAChRs开放产生的电流具有良好的阻断作用，LvIE和LvIF阻断大鼠rα3β2和rα6/α3β2β3nAChRs后，洗脱速率快，3min即可洗脱回对照电流的大小(图5A至图5D)，LvIE和LvIF对大鼠rα3β2和rα6/α3β2β3 nAChRs阻断是可逆的。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西大学

<120> α-芋螺毒素肽LvIE和LvIF、其药物组合物及用途

<130> IDC210176

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 1

gtggttctgg gtccagca 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 2

gtcgtggttc agagggtc 18

<210> 3

<211> 170

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LvIE前体基因

<400> 3

gtggttctgg gtccagcatt tgatggcagg aatgctgcag ccagcgacaa agcgtctgag 60

ctgatggctc tggccgtcag gggatgctgt tcccatcctg cctgtgctgg gaataatcca 120

catatctgtg gcagaagacg ctgatgcccc aggaccctct gaaccacgac 170

<210> 4

<211> 47

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LvIE前体蛋白

<400> 4

Val Val Leu Gly Pro Ala Phe Asp Gly Arg Asn Ala Ala Ala Ser Asp

1 5 10 15

Lys Ala Ser Glu Leu Met Ala Leu Ala Val Arg Gly Cys Cys Ser His

20 25 30

Pro Ala Cys Ala Gly Asn Asn Pro His Ile Cys Gly Arg Arg Arg

35 40 45

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LvIE成熟肽

<400> 5

Gly Cys Cys Ser His Pro Ala Cys Ala Gly Asn Asn Pro His Ile Cys

1 5 10 15

<210> 6

<211> 170

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LvIF前体基因

<400> 6

gtggttctgg gtccagcatt tgatggcagg aatgctgcag ccagcgacaa agcttctgag 60

ctgatggctc tggccgtcag gggatgctgt tcccatcctg cctgtgccgg gaataatcaa 120

gacatctgtg gctgaagacg ctgatgcccc aggaccctct gaaccacgac 170

<210> 7

<211> 47

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LvIF前体蛋白

<400> 7

Val Val Leu Gly Pro Ala Phe Asp Gly Arg Asn Ala Ala Ala Ser Asp

1 5 10 15

Lys Ala Ser Glu Leu Met Ala Leu Ala Val Arg Gly Cys Cys Ser His

20 25 30

Pro Ala Cys Ala Gly Asn Asn Gln Asp Ile Cys Gly Arg Arg Arg

35 40 45

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LvIF成熟肽

<400> 8

Gly Cys Cys Ser His Pro Ala Cys Ala Gly Asn Asn Gln Asp Ile Cys

1 5 10 15

Claims (11)

1.一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NOs:4-5和SEQ ID NOs:7-8中任一序列所示。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中，

所述多肽的N末端起的第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键，并且第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键；或所述多肽的N末端起的第一个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键，并且第二个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键；或所述多肽的N末端起的第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸形成二硫键，并且第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键；

优选地，所述多肽的羧基末端是酰胺化的。

3.一种分离的融合蛋白，其包含至少一种权利要求1至2中任一权利要求所述的多肽。

4.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至2中任一权利要求所述的多肽或者权利要求3所述的融合蛋白。

5.一种核酸构建体，其含有权利要求4所述的多核苷酸；优选地，所述核酸构建体为重组载体；优选地，所述核酸构建体为重组表达载体。

6.一种转化的细胞，其含有权利要求4所述的多核苷酸，或者含有权利要求5所述的核酸构建体。

7.一种药物组合物，其含有至少一种权利要求1至2中任一权利要求所述的多肽、权利要求3所述的融合蛋白或者权利要求4所述的多核苷酸；可选地，其还包含一种或多种药学上可接受的辅料。

8.权利要求1至2中任一权利要求所述的多肽、权利要求3所述的融合蛋白或者权利要求4所述的多核苷酸在制备阻断乙酰胆碱受体的药物中的用途；其中，所述乙酰胆碱受体是α3β2乙酰胆碱受体或α6β2*乙酰胆碱受体。

9.权利要求1至2中任一权利要求所述的多肽、权利要求3所述的融合蛋白或者权利要求4所述的多核苷酸在制备治疗和/或预防神经痛、成瘾、帕金森病、痴呆、精神分裂症或抑郁的药物中的用途；

优选地，所述神经痛由如下因素中的一个或多个导致：癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎或过敏症；

优选地，所述成瘾为烟瘾、酒瘾或毒瘾；

优选地，所述毒瘾由如下因素中的一个或多个导致：尼古丁、鸦片、海洛因、冰毒、吗啡、大麻或可卡因。

10.一种在体外阻断乙酰胆碱受体或者调节乙酰胆碱水平的方法，包括施加给细胞有效量的权利要求1至2中任一权利要求所述的多肽或者权利要求3所述的融合蛋白的步骤；其中，所述乙酰胆碱受体是α3β2乙酰胆碱受体或α6β2*乙酰胆碱受体。

11.权利要求1至2中任一权利要求所述的多肽、权利要求3所述的融合蛋白或者权利要求4所述的多核苷酸在制备药物筛选模型中的用途，其中，

所述药物筛选模型为细胞模型或者动物模型，

所述药物为用于治疗和/或预防神经痛、成瘾、帕金森病、痴呆、精神分裂症或抑郁的药物；

优选地，所述神经痛由如下因素中的一个或多个导致：癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎或过敏症；

优选地，所述成瘾为烟瘾、酒瘾或毒瘾；

优选地，所述毒瘾由如下因素中的一个或多个导致：尼古丁、鸦片、海洛因、冰毒、吗啡、大麻或可卡因。

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