CN112010959B

CN112010959B - αO-芋螺毒素肽GeXIVA新突变体、其药物组合物及用途

Info

Publication number: CN112010959B
Application number: CN201910468256.8A
Authority: CN
Inventors: 罗素兰; 长孙东亭; 朱晓鹏; 吴勇
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2039-05-31
Also published as: CN112010959A; WO2020238692A1

Abstract

本发明属于生物化学与分子生物学和神经科学领域，涉及一种αO‑芋螺毒素肽GeXIVA新突变体、其药物组合物及用途。具体地，本发明涉及一种分离的多肽，其氨基酸序列为将母序列中的一个或多个氨基酸去掉，或者将母序列中的一个或多个氨基酸替换为相同数目的L型氨基酸或D型氨基酸，其中，所述母序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:63；并且所述多肽具有阻断α9α10 nAChR的活性。本发明的多肽能够特异地阻断α9α10 nAChR，具有在制备镇痛药物、有关精神疾病与癌症治疗药物、以及神经科学工具药等方面的良好应用前景。

Description

αO-芋螺毒素肽GeXIVA新突变体、其药物组合物及用途

技术领域

本发明属于药学、生物化学与分子生物学和神经科学领域，涉及αO-芋螺毒素肽GeXIVA及其一系列新突变体、其药物组合物、其制备方法及用途。本发明还涉及一种阻断烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)的方法、以及所述芋螺毒素肽的制药用途。

背景技术

生活在热带海洋中的肉食性软体动物芋螺毒液中产生的各种各样的多肽毒素，称为芋螺毒素或芋螺肽(Conotoxin或Conopeptide)。芋螺毒素具有特异结合动物体内各种离子通道和受体等的特殊功能^[1]，已跃居动物毒素研究的首位，被誉为“海洋药物宝库”与“尚未开发的金库”。芋螺毒素已成为当今神经科学研究和新药研发的热点。

芋螺毒素具有多样化的三维结构而被认为是微小蛋白质，其种类多、活性强、选择性高，已成为新药开发的新来源^[2-3]，它们在镇痛、戒烟戒毒、抗癌，以及治疗帕金森症、痴呆、癫痫、精神病等多种疑难杂症方面具有极好的应用前景。其疗效确切、不成瘾，可代替吗啡、杜冷丁等治疗神经痛^[4-6]。作用于N-型钙离子通道的ω-芋螺毒素MVIIA已被美国FDA批准为治疗新药^[1，7-8]。

在我国，芋螺是海南特有而宝贵的药用海洋生物资源，至少有15万种海南产芋螺毒素潜在药源急待开发。我国还没有芋螺毒素药物进入临床试验。芋螺毒素大多是由7－50个氨基酸残基组成的、富含半胱氨酸(Cys)的神经肽毒素。芋螺毒素(肽)按其受体靶位可分为α、ω、μ、δ等多种药理学家族。其中的α-家族(α*-)芋螺毒素具有特异阻断烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)不同亚型的特殊功能。

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)是动物界普遍存在的具有重要生理作用和临床研究意义的细胞膜蛋白，介导众多中枢和外周神经系统的生理功能，包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等^[9-10]。nAChRs激活多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、γ-氨基丁酸等多种神经递质的释放。已证实nAChRs是筛选诊断和治疗一大类重要疾病药物的关键靶点，这些疾病包括成瘾、疼痛、癌症、智障、帕金森症、精神病、抑郁、重症肌无力等疑难杂症。常用的非选择性的nAChR激动剂如烟碱，虽然可以缓解上述神经疾病的症状，但它们对心脏和胃肠道产生强烈的副作用，且有成瘾性。因此，开发针对nAChRs各种亚型具有选择性的配体药物是治疗上述疾病的关键所在^[11-13]。

然而，开发这样的药物的前提是，要获得可以特异结合nAChRs各种亚型的选择性化合物，作为工具药来研究和鉴定各种亚型的精细组成和生理功能，或直接作为相关疾病的治疗药物。另外，在乳腺癌与小细胞肺癌中，肿瘤细胞膜上烟碱乙酰胆碱受体的激活促进肿瘤细胞增殖，用药物阻断这些受体的激活，或可治疗这些灾难性癌症。目前，芋螺毒素备受关注，已被用于系统地研究与开发nAChRs各种亚型的特异阻断剂。

nAChRs由不同的α和β亚基组装成很多种亚型，每种亚型都有截然不同的药理学特征。由于缺乏针对各种亚型的高选择性配体化合物，要研究和阐明各种各样的nAChRs亚型的精细结构和功能面临诸多挑战。研究表明，存在于外周神经系统的α9α10nAChR是治疗神经痛药物的新靶点，可通过肌肉注射发挥药效^[14-15]。α9α10nAChR阻断剂具有治疗神经痛和加速受伤神经恢复的功能，可能是通过免疫机制发挥作用^[16-17]。角化细胞上的α9α10nAChR在伤口愈合的病理生理学过程中起着很重要的作用^[18]。α9nAChR亚基在乳腺癌组织中过表达，α9亚基变体影响支气管细胞的转化与增殖，该亚基在肺癌的治疗中具有非常重要的意义^[19]。在大鼠动物模型上，α9α10nAChR的阻断剂还可预防和逆转由于癌症化疗引起的神经痛，从而可加大抗癌药物的剂量，减少抗癌药的副作用，达到癌症治疗的目的^[20]。因而，α9α10nAChR被认为是治疗神经痛^[21-22]、癌症化疗、乳腺癌、肺癌等的新靶点。

镇痛药市场潜力非常巨大。据流行病学调查研究结果显示，神经痛(慢性痛)影响约20％的人群，已成为世界性公认的健康难题^[23]。人类社会为此付出了沉重的经济负担，例如，美国约有1亿成年人遭受神经痛(慢性痛)的折磨，所花费的医疗费用每年高达约6350－6500美金^[24]。神经痛造成的医疗损失比心脏病、癌症和糖尿病三大类疾病的总和还要多^[25]。广大的发展中国家人口数量众多，神经痛所造成的医疗损失更加巨大。神经痛往往表现为顽固性疼痛，很难治疗，现有治疗神经痛的方法，主要是局部麻醉用药，来阻断由外周神经、神经丛、背根神经、交感神经系统等产生的疼痛信号，但这些治疗只能短时间有镇痛效果，并不能根治神经痛，反复使用很容易引起成瘾。很多疾病都会引起神经痛，包括癌症与癌症化疗、坐骨神经痛、糖尿病、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病等等。随着世界人口数量逐渐增加，人口加速老年化，65岁以上的人群中，一半以上(>50％)的老年人都有神经痛的困扰。全球镇痛药市场年均复合增长率达在25％以上。目前离实现WHO提出的“让癌症患者不痛”的战略还相差甚远，中、重度疼痛的患者尚未得到充分止痛治疗，无成瘾性的镇痛药市场拥有巨大的上升空间。

2004年12月，美国FDA批准了世界上第一个海洋芋螺毒素新药Ziconotide(中文译名为奇考诺肽)，不成瘾，被认为是第一个真正针对神经痛的镇痛药，目前美国允许鞘内给药的镇痛药只有2种(芋螺毒素Prialt与吗啡)，该新药仅专利转让费就高达8亿美元，产生了巨大的社会效益和经济效益。奇考诺肽是通过特异阻断N-型钙离子通道发挥镇痛效应，其作用靶点N-型钙离子通道仅存于中枢神经系统，所以需要通过编程泵内置于人体内给药至脊髓，给药途径很麻烦，该给药泵非常昂贵，目前仅限于美欧等发达国家应用，很难在广大的发展中国家使用^[26]。以α9α10nAChR为靶点的神经痛治疗药物可通过肌肉注射发挥镇痛效应^[22,27]，比目前商业化的芋螺毒素镇痛药物Ziconotide给药途径更简便，市场更广阔。α9α10nAChR阻断剂还可作为分子探针来研究该亚型的结构与功能，作为工具药探讨与之相关的神经痛、癌症化疗、乳腺癌、肺癌等重大疾病的发病机理，为更好地了解、预防和治疗这些疾病提供最佳途径。

本发明人经过多年的努力，筛选鉴定出1个强阻断α9α10nAChR的αO-新家族芋螺毒素GeXIVA，有3种可能的二硫键异构体，均已人工合成成功，分别命名为GeXIVA[1,2]、GeXIVA[1,3]和GeXIVA[1,4]。其中GeXIVA[1,2]异构体对α9α10nAChR的半阻断剂量(IC₅₀)仅为3.8nM/4.6nM^[27]，是α9α10nAChR亚型活性极强的特异阻断剂。GeXIVA的作用靶点清楚，蕴涵着巨大的经济价值和社会效益，并已申请了国家发明专利^[28]和国际PCT专利^[29]。后续研究发现，GeXIVA的3种二硫键异构体，保持了对大鼠和人类α9α10nAChRs相似的阻断活性和选择性^[30]，这预示着GeXIVA在人类神经痛等的治疗新药研发领域具有广阔的应用前景。而之前发现的α-芋螺毒素RgIA和Vc1.1，对大鼠α9α10nAChRs的阻断活性很强，而对人类α9α10nAChRs的阻断活性很微弱，二者相比下降了300－400倍^[30]。这也是导致α-芋螺毒素Vc1.1在II期临床试验中被终止的直接原因。

目前，尚需要开发更多有效的α9α10nAChRs特异阻断剂。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性地劳动，发现了一个αO-芋螺毒素GeXIVA的一系列新突变体，其能够特异性地阻断α9α10乙酰胆碱受体，该受体是神经痛、癌症化疗、乳腺癌、肺癌等的药物作用靶点。其在制备镇痛药物，有关乳腺癌、肺癌、神经精神疾病等治疗药物的研发，以及工具药等方面具有极好的应用前景。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种分离的多肽，其氨基酸序列为将母序列中的一个或多个氨基酸去掉，或者将母序列中的一个或多个氨基酸替换为相同数目的L型氨基酸或D型氨基酸，其中，所述母序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:63；并且所述多肽具有阻断或抑制α9α10nAChR的活性；

优选地，所述L型氨基酸或D型氨基酸选自：丙氨酸、丝氨酸、2-氨基丁酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、苏氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、谷氨酸和天冬氨酸；优选为丙氨酸、D-苏氨酸或D-天冬氨酸；

优选地，所述的多肽，其特征在于如下的1)－3)项中的任意1项、2项或3项：

1)与母序列相比，所述多肽具有基本相同或者提高的阻断α9α10nAChR的活性；

2)与母序列相比，相对于α7nAChR和/或α1β1δεnAChR，所述多肽具有基本相同或提高的对α9α10nAChR的选择性或特异性；

3)与母序列相比，所述多肽具有在生物体内(例如在消化道如肠道内，或在血液中)延长的半衰期；优选地，所述生物体为哺乳动物例如人或大鼠。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第1)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第2)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第3)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第1)项和第2)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第1)项和第3)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第2)项和第3)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第1)项至第3)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其中，被去掉或被替换的一个或多个氨基酸不是精氨酸。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其中，所述多个氨基酸是指2－9个氨基酸，例如2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。

本发明中，所述“基本相同”是指与母序列相比，阻断α9α10nAChR的活性或者对α9α10nAChR的选择性或特异性没有显著的变化(提高或者降低)，例如变化在±10％以内、±20％以内、±30％以内、±40％以内或±50％以内。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述的分离的多肽，其特征在于如下的(1)－(6)项中的任意的1项、2项、3项、4项或5项：

(1)将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:62中的除了半胱氨酸和丙氨酸之外的任意一个氨基酸替换为一个丙氨酸；

(2)将SEQ ID NO:1中的9个精氨酸中的任意2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个替换为相同数目的丙氨酸和/或丝氨酸；

(3)将SEQ ID NO:63中的任意一个氨基酸替换为一个丙氨酸；

(4)将SEQ ID NO:1中的4个半胱氨酸中的任意1个、2个、3个或4个替换为相同数目的丙氨酸和/丝氨酸；

(5)将SEQ ID NO:1中的氮末端的苏氨酸替换为D-苏氨酸，碳末端的缬氨酸替换为D-缬氨酸，和/或将SEQ ID NO:1中的9个精氨酸中的任意2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个替换为相同数目的D-精氨酸；

(6)将SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:63中的除了半胱氨酸和天冬氨酸之外的任意一个氨基酸替换为一个天冬氨酸。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(1)项和第(4)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(1)项和第(5)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(4)项和第(6)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(3)项和第(6)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(1)项、第(4)项和第(5)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(2)项和第(4)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(2)项和第(5)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(2)项、第(4)项和第(5)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(6)项和第(4)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(6)项和第(5)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(6)项、第(4)项和第(5)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(1)项、第(6)项、第(4)项和第(5)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(2)项、第(6)项、第(4)项和第(5)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(1)项、第(2)项、第(4)项和第(5)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(1)项、第(2)项、第(6)项和第(5)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(1)项、第(2)项、第(4)项和第(6)项。

在本发明的一些实施方式中，所述的多肽，其特征在于第(1)项、第(2)项、第(6)项、第(4)项和第(5)项。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述的多肽，其中，所述多肽含有0个、1个或2个二硫键；

优选地，当母序列为SEQ ID NO:1且所述多肽含有1个或二个二硫键时，所述二硫键选自：

所述多肽的N末端起的第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸形成的二硫键，以及第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成的二硫键；

所述多肽的N末端起的第一个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成的二硫键，以及第二个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键；和

所述多肽的N末端起的第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成的二硫键，以及第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成的二硫键。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述的多肽，其中，所述多肽的羧基末端是酰胺化的。

本发明还涉及一种分离的多肽，其氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:2－24、26－117中的任一序列所示；

优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:62、SEQID NO:75、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:94所示；

更优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:94所示；

特别优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:75所示。

在本发明的一个实施方案中，SEQ ID NOs:2－24、26－117中的任一序列表示氨基酸线性序列。

在本发明的一个实施方案中，SEQ ID NOs:2－24、26－117中的任一序列表示氨基酸线性序列以及对所示蛋白的修饰，例如二硫键、羧基末端酰胺化和/或D型氨基酸替换等。

虽然野生型αO-芋螺毒素GeXIVA已经在本发明人之前的专利和文章中公开，但很多研究表明，对于芋螺毒素肽，序列上一个氨基酸的差异就可能产生新的受体特异性、活性或选择性的变化，意味着在受体研究中提供了一种新的工具，在新药开发上提供了一种新的候选药物和先导药物^[31-35]。本发明的研究结果(表8－表22)更加证实了这个事实。

本发明鉴定出了GeXIVA及其突变体与α9α10nAChR之间相互作用的关键氨基酸(如表3，表12)，序列中的多个精氨酸对于与受体相互结合起着至关重要的作用，无论哪两个或两个以上的精氨酸同时被丙氨酸(Ala，A)取代，它们对α9α10nAChR的阻断活性显著下降。大多数突变肽(SEQ ID NOs:52－61)对α9α10nAChR的阻断活性至少下降10倍以上，其半阻断剂量(IC₅₀)均在130nM以上；有的突变肽(SEQ ID NOs:49－51)的阻断活性甚至全部丧失，其半阻断剂量(IC₅₀)均在10000nM以上，即在10μM高浓度下，这些突变体对α9α10nAChR的电流阻断超不过50％，或者完全没有阻断作用。详见表12。

GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)和GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)的丙氨酸扫描突变体(表1－2，SEQ ID NOs:2－24，26－48)，以及半胱氨酸替换突变体(表5，SEQ ID NOs:76－87)，除了[R22A]GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:44)外(表9)，均保持了对α9α10nAChR的强阻断活性，其半阻断剂量(IC₅₀)均在90nM以下，它们的活性变化不大，都在8倍以内(表8－9、表15)。[R22A]GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:44)与野生型的GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)相比，活性下降了约12倍，其IC₅₀为185nM(表8－9、表15)。其余各种各样的突变体对α9α10nAChR的阻断活性，详见表13－14与表19－22。

特别是，发现了活性显著增强的([I23A]GeXIVA[1,4]，SEQ ID NO:45)、选择性明显提高的(SEQ ID NO:6，8，15，16，18，23)、稳定性大幅度提高的(Mf-GeXIVA，SEQ ID NO:92；GeFlex-GeXIVA，SEQ ID NO:94)、活性保持序列变短的合成成本更低的(^△6-22GeXIVA，SEQ ID NO:62；^△10-19[D5A]GeXIVA#，SEQ ID NO:75)，以及活性保持无二硫键的合成成本更低的([C2A,C9A,C20S,C27S]GeXIVA，SEQ ID NO:86)优化突变体等。

所有这些研究结果，对于设计和研发针对α9α10nAChR结构与功能研究的分子探针、以及新药研发都具有极高的应用价值。

本发明的再一方面涉及一种分离的融合蛋白，其包含至少一种本发明的多肽。

本发明还包括在本发明αO-芋螺毒素突变肽的N-末端和/或C末端融合了其它肽/多肽的融合多肽或可裂解的融合多肽。产生融合多肽的技术为本领域内已知，包括连接编码本发明肽的编码序列与编码所述其它肽/多肽的编码序列，使它们在同一读框中，并且融合多肽的表达受控于相同的启动子和终止子。

本发明的再一方面涉及一种分离的多核苷酸，其编码本发明中任一项所述的多肽。

本发明的再一方面涉及一种核酸构建体，其含有本发明的多核苷酸；优选地，所述核酸构建体为重组载体；优选地，所述核酸构建体为重组表达载体。

本发明的再一方面涉及一种转化的细胞，其含有本发明的多核苷酸，或者本发明的核酸构建体。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其含有至少一种本发明的多肽；可选地，其还包含药学上可接受的辅料。

所述药物组合物可用于研究、诊断、缓解或治疗与神经痛、癌症、智障、疼痛、帕金森症、精神病、抑郁、重症肌无力等有关的疾病或病症。在一个实施方案中，含有治疗有效量的本发明肽的药物组合物以利于药用的方式配制和给药，并需考虑到个体病人的临床状况、运送位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。

含治疗有效量的本发明多肽的药物组合物非肠道给药、口服、脑池内给药、鞘内给药等。“药学可接受载体”指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊材料或任何类型的配方辅助物。本文所用术语“非肠道的”表示的给药方式包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下、鞘内和关节内注射和输注。本发明多肽还可通过缓释系统恰当地给药。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的多肽在制备阻断或抑制α9α10nAChR的药物中的用途。

现有技术研究表明，α9α10nAChR是治疗神经痛(慢性痛)、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、癌症化疗、伤口愈合等的药物作用靶点。因此，本发明的新的αO-芋螺毒素GeXIVA突变体在上述疾病的机理研究、诊断、治疗方面具有极高的应用价值。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的多肽在制备治疗和/或预防神经系统疾病或癌症的药物中的用途，或者在制备杀灭害虫、镇痛、抗癌的药物中的用途；

优选地，所述神经系统疾病为神经痛(慢性痛)、帕金森症、痴呆、精神分裂症和抑郁中的至少一种；

优选地，所述神经痛选自如下的至少一种：坐骨神经痛、三叉神经痛、淋巴神经痛、多点运动神经痛、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛以及复合神经痛；

优选地，所述神经痛由如下因素中的至少一种导致：癌症、癌症化疗、酒精中毒、糖尿病、硬化症、带状疱疹、机械伤、手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、骨髓瘤、慢性先天性感觉神经病、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎或过敏症；

优选地，所述癌症为乳腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、白血病、神经细胞瘤、或其它上皮细胞癌变引起的癌症等中的至少一种。

本发明的再一方面涉及一种在体内或体外阻断或抑制α9α10nAChR或者调节乙酰胆碱水平的方法，包括给予受试者或者施加给细胞有效量的本发明中任一项所述的多肽的步骤。

根据本发明中任一项所述的多肽，其用于阻断或抑制α9α10nAChR。

根据本发明中任一项所述的多肽，其用于治疗和/或预防神经系统疾病或癌症，或者用于杀灭害虫、镇痛、抗癌等；

优选地，所述神经系统疾病为神经痛、帕金森症、痴呆、精神分裂症和抑郁中的至少一种；

优选地，所述神经痛(慢性痛)选自如下的至少一种：坐骨神经痛、三叉神经痛、淋巴神经痛、多点运动神经痛、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛以及复合神经痛；

本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防神经系统疾病或癌症的方法，或者一种杀灭害虫、镇痛、抗癌的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的本发明中任一项所述的多肽的步骤；

给药剂量取决于许多因素，例如所治疗病况的严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。本领域通常的做法是，剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

本发明的多肽的制备方法，包括下述步骤：

1)通过多肽合成仪或者手工方法合成线性多肽，Fmoc氨基酸的侧链保护基为：Pmc(Arg)、But(Thr、Ser、Tyr)、OBut(Asp)、Boc(Lys)；半胱氨酸用Trt或Acm保护基团；

2)将步骤1)中得到的线性多肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性多肽粗品，用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化；

3)将步骤2)中得到的产物进行纯化，或进行一步或两步氧化折叠后再纯化。

本发明中，

术语“核酸构建体”，在文中定义为单链或双链核酸分子，优选是指人工构建的核酸分子。可选地，所述核酸构建体还包含有可操作地连接的1个或多个调控序列。

在本发明中，术语“可操作地连接”是指两个或多个核苷酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。所述“可操作地连接”可以通过基因重组的手段实现。

在本发明中，术语“载体”指的是，可将抑制某蛋白的多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件。

在本发明中，术语“宿主细胞”指的是导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。

术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

本发明中，如果没有特别说明，浓度单位μM表示μmol/L，mM表示mmol/L，nM表示nmol/L。

本发明中，提到细胞中的加药量时，如果没有特别说明，一般是指加药后药物的终浓度。

本发明中提到术语“氨基酸”或者具体的氨基酸名称时，如果没有特别说明，是指L型的氨基酸。

发明的有益效果

本发明对GeXIVA进行了各种各样的结构优化与改造，研究它们的构效关系，揭示它们与受体相互作用的分子机理，发现了一系列对α9α10nAChRs保持了阻断活性的新型突变体。与野生型肽相比，有的突变体活性增强、有的突变体的选择性进一步提高，有的突变体氨基酸残基数更少，有的突变体合成成本更低等，这为新型工具药和相关疾病治疗药物的研发提供了更多的候选新药。

附图说明

图1：αO-芋螺毒素GeXIVA的氨基酸序列及其3种可能的二硫键异构体(isomer)，分别命名为GeXIVA[1,2](珠状异构体，bead isomer)、GeXIVA[1,4](带状异构体，ribbonisomer)、GeXIVA[1,3](球状异构体，globular isomer)。3种异构体的二硫键连接方式分别为：GeXIVA[1,2]为[C1-C2，C3-C4]；GeXIVA[1,4]为[C1-C4，C2-C3]；GeXIVA[1,3]为[C1-C3，C2-C4]^[27]。

图2A-2D：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](Peptide 1，SEQ ID NO:1)及突变肽16(Peptide 16，SEQ ID NO:16，即第17位精氨酸被丙氨酸替换的突变体[R17A]GeXIVA[1,2])的超高压液相色谱图(UPLC)(2A、2C)与电喷雾质谱图(ESI-MS)(2B、2D)。(2A)Peptide 1的UPLC色谱图。(2B)Peptide 1的ESI-MS质谱图。(2C)Peptide 16的UPLC色谱图。(2D)Peptide16的ESI-MS质谱图。

UPLC分析的条件为：反向C18Vydac分析柱；所用缓冲液A(Buffer A)为0.075％TFA的水溶液，缓冲液B(Buffer B)组成为0.05％TFA+90％乙腈(ACN)+10％水；线性洗脱梯度为0－3.5min内，buffer B从10％增加到40％。UPLC色谱图中的RT表示该色谱峰的保留时间。

图3A-3B：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](Peptide 1，SEQ ID NO:1)(3A)及其第17位精氨酸被丙氨酸替换的突变体[R17A]GeXIVA[1,2](Peptide 16，SEQ ID NO:16)3(B)对大鼠α9α10，α7与小鼠肌肉型α1β1δεnAChRs的浓度反应曲线。曲线上每个点是3－10个蛙卵(非洲爪蟾卵母细胞，n＝3－10)的平均值±误差(mean±S.E.)。这两个肽对α9α10:α7和α9α10:α1β1δε的活性选择性分别为207倍和232倍。

图4A-4D：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,4](Peptide 25，SEQ ID NO:25)及突变肽45(Peptide 45，SEQ ID NO:45，即第23位的异亮氨酸被丙氨酸替换的突变体[I23A]GeXIVA[1,2])的超高压液相色谱图(UPLC)(4A、4C)与电喷雾质谱图(ESI-MS)(4B、4D)。(4A)Peptide25的UPLC色谱图。(4B)Peptide 25的ESI-MS质谱图。(4C)Peptide45的UPLC色谱图。(4D)Peptide 45的ESI-MS质谱图。

UPLC分析的条件为：反向C18Vydac分析柱；所用缓冲液A(Buffer A)为0.075％TFA的水溶液，缓冲液B(Buffer B)组成为0.05％TFA+90％乙腈(ACN)+10％水；线性洗脱梯度为0-3.5min内，buffer B从10％增加到40％。UPLC色谱图中的RT表示该色谱峰的保留时间。

图5A-5B：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,4](Peptide 25，SEQ ID NO:25)(5A)与突变肽45(Peptide 45，SEQ ID NO:45)(5B)对大鼠α9α10(rα9α10)nAChR的电流影响图。

在非洲爪蟾卵母细胞中表达大鼠α9α10nAChR，细胞膜的钳制电压为-70mV，每隔1分钟给1s(秒)的乙酰胆碱(Ach)脉冲。每个图中显示的是1个多肽在1个卵母细胞上的代表性电流轨迹。获得对照电流后，加入10nM的多肽，温育5min之后的第一个Ach脉冲电流即是该多肽对受体产生影响的电流轨迹，图上用箭头标示。然后对多肽进行洗脱，洗脱过程中对Ach脉冲产生的电流大小及其轨迹也被同时测定。图中的“C”表示ACh激发产生的对照电流。后面的图8A-8C、9A-9C、11A-11F、13A-13F、15A-15B、17A-17E、18A-18H以及19A-19H中的电流轨迹图中的标识，与此说明相同。

图6A-6B：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,4](Peptide 25，SEQ ID NO:25)(6A)及其第23位被丙氨酸替换的突变体[I23A]GeXIVA[1,2](Peptide 45，SEQ ID NO:45)(6B)对大鼠α9α10，α7与小鼠α1β1δεnAChRs的浓度反应曲线。曲线上每个点是3-10个蛙卵(n＝3-10)的平均值±误差(mean±S.E.)。

图7A-7J：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,4](Peptide 25，SEQ ID NO:25，用虚线表示)及其第23位被丙氨酸替换的突变体[I23A]GeXIVA[1,2](Peptide 45，SEQ ID NO:45)对大鼠α9α10，α7，α3β2，α3β4，α6/α3β4，α2β2，α4β2，α2β4，α4β2与小鼠α1β1δεnAChRs的浓度反应曲线。曲线上每个点是3-5个蛙卵(n＝3-10)的平均值±误差(mean±S.E.)。

图8A-8C：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,4](Peptide 25，SEQ ID NO:25)(8A)及其突变体[I23A]GeXIVA[1,2](Peptide 45，SEQ ID NO:45)(8B)对人类α9α10nAChR的电流影响图；以及对人类α9α10nAChR的浓度反应曲线(8C),曲线上每个点是4-6个蛙卵(n＝4-6)的平均值±误差(mean±S.E.)。

图9A-9C：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](Peptide 1，SEQ ID NO:1)的部分精氨酸突变体，即SEQ ID NO:49、50、51对大鼠α9α10(rα9α10)nAChR的电流影响图。

在非洲爪蟾卵母细胞中表达大鼠α9α10nAChR，细胞膜的钳制电压为-70mV，每隔1分钟给1s(秒)的乙酰胆碱(Ach)脉冲。每个图中显示的是1个多肽在1个卵母细胞上的代表性电流轨迹。获得对照电流后，加入10μM的多肽，温育5min之后的第一个Ach脉冲电流即是该多肽对受体产生影响的电流轨迹，图上用箭头标示。然后对多肽进行洗脱，洗脱过程中对Ach脉冲产生的电流大小及其轨迹也被同时测定。图中的“C”表示ACh激发产生的对照电流。

图10：^△10-19GeXIVA(SEQ ID NO:63)及其丙氨酸扫描突变肽(SEQ ID NOs:64-73；表4)对大鼠α9α10nAChR电流的影响。该柱状图显示各个多肽在10μM浓度下，对由Ach(乙酰胆碱)诱发的大鼠α9α10nAChR电流反应百分数，每个柱子的长度代表3-8个(n＝3-8)非洲爪蟾卵母细胞电流的平均值±误差(mean±S.E.)。各个肽的电流与^△10-19GeXIVA(SEQ ID NO:63)的电流相比，进行了差异统计学分析，＊＊＊＊表示概率p<0.0001，具有极显著差异。

图11A-11F：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](Peptide 1，SEQ ID NO:1)及其截短突变体^△6-22GeXIVA(SEQ ID NO:62)对大鼠(r)和人类(h)α9α10的电流影响(11A-11D)和浓度反应曲线(11E-11F)。

(11A)GeXIVA[1,2]在10nM浓度下对rα9α10nAChR的电流影响图。(11B)^△6-22GeXIVA在10nM浓度下对rα9α10nAChR的电流影响图。(11C)GeXIVA[1,2]在50nM浓度下对hα9α10nAChR的电流影响图。(11D)^△6-22GeXIVA在50nM浓度下对hα9α10nAChR的电流影响图。(11E)GeXIVA[1,2]与^△6-22GeXIVA对大鼠α9α10的浓度反应曲线。(11F)GeXIVA[1,2]与^△6- ²²GeXIVA对人类α9α10的浓度反应曲线。E-F曲线上每个点是4-12个蛙卵(n＝4-12)的平均值±误差(mean±S.E.)。

图12：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](Peptide 1，SEQ ID NO:1)(红色曲线)及其截短突变体SEQ ID NOs:63、74、68(黑色曲线)与SEQ ID NO:75(蓝色曲线)对大鼠α9α10nAChR的浓度反应曲线。曲线上每个点是6-10个蛙卵(n＝6-10)的平均值±误差(mean±S.E.)。

图13A-13F：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](Peptide 1，SEQ ID NO:1)及其截短突变体^△10-19[D5A]GeXIVA#(SEQ ID NO:75)对大鼠(r)和人类(h)α9α10的电流影响(13A-13D)和浓度反应曲线(13E-13F)。

(13A)GeXIVA[1,2]在10nM浓度下对rα9α10nAChR的电流影响图。(13B)^△10-19[D5A]GeXIVA#在10nM浓度下对rα9α10nAChR的电流影响图。(13C)GeXIVA[1,2]在50nM浓度下对hα9α10nAChR的电流影响图。(13D)^△10-19[D5A]GeXIVA#在50nM浓度下对hα9α10nAChR的电流影响图。(13E)GeXIVA[1,2]与^△10-19[D5A]GeXIVA#对大鼠α9α10的浓度反应曲线。(13F)GeXIVA[1,2]与^△10-19[D5A]GeXIVA#对人类α9α10的浓度反应曲线。E-F曲线上每个点是4-6个蛙卵(n＝4-6)的平均值±误差(mean±S.E.)。

图14A-14D：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](Peptide 1，SEQ ID NO:1)及突变肽[C2A,C9A,C20S,C27S]GeXIVA(SEQ ID NO:86，表5)的超高压液相色谱图(UPLC)(14A、14C)与电喷雾质谱图(ESI-MS)(14B、14D)。(14A)Peptide 1的UPLC色谱图。(14B)Peptide 1的ESI-MS质谱图，其实测分子量为3452.70Da。(14C)SEQ ID NO:86的UPLC色谱图。(14D)SEQ ID NO:86的ESI-MS质谱图，其实测分子量为3360.96Da。

图15A-15B：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](Peptide 1，SEQ ID NO:1)及突变肽[C2A,C9A,C20S,C27S]GeXIVA(SEQ ID NO:86，表5)在10nM的浓度下，对大鼠α9α10nAChR的电流影响图。

图16A-16H：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](Peptide 1，SEQ ID NO:1，用虚线表示)及突变肽[C2A,C9A,C20S,C27S]GeXIVA(SEQ ID NO:86，表5)对大鼠各个神经型与小鼠肌肉型nAChRs的浓度反应曲线。曲线上每个点是4-12个蛙卵(n＝4-12)的平均值±误差(mean±S.E.)。

图17A-17E：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](Peptide 1，SEQ ID NO:1)与突变肽[C2A,C9A,C20S,C27S]GeXIVA(SEQ ID NO:86，表5)对人类α9α10nAChR的电流影响图(17A-D)，以及浓度反应曲线(17E)。(17A)50nM的GeXIVA[1,2]对人类α9α10nAChR的电流影响图。(17B)50nM的[C2A,C9A,C20S,C27S]GeXIVA对人类α9α10nAChR的电流影响图。(17C)100nM的GeXIVA[1,2]对人类α9α10nAChR的电流影响图.(17D)100nM的[C2A,C9A,C20S,C27S]GeXIVA对人类α9α10nAChR的电流影响图。(17E)浓度反应曲线上每个点是4-6个蛙卵(n＝4-6)的平均值±误差(mean±S.E.)。

图18A-18H：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](Peptide 1，SEQ ID NO:1，18A)及其D-型氨基酸突变体(表6)，即1t-GeXIVA(SEQ ID NO:88，18B)、28v-GeXIVA(SEQ ID NO:89，18C)、1t,28v-GeXIVA(SEQ ID NO:90，18D)、Mt-GeXIVA(SEQ ID NO:91，18E)、Mf-GeXIVA(SEQ IDNO:92，18F)、GeArg-GeXIVA(SEQ ID NO:93，18G)、GeFlex-GeXIVA(SEQ ID NO:94，18H)，在1μM或100nM浓度下，对大鼠α9α10(rα9α10)nAChR的电流影响图。

图19A-19H：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](Peptide 1，SEQ ID NO:1，19A)及其D-型氨基酸突变体(表6)，即1t-GeXIVA(SEQ ID NO:88，19B)、28v-GeXIVA(SEQ ID NO:89，19C)、1t,28v-GeXIVA(SEQ ID NO:90,19D)、Mt-GeXIVA(SEQ ID NO:91，19E)、Mf-GeXIVA(SEQ IDNO:92，19F)、GeArg-GeXIVA(SEQ ID NO:93，19G)、GeFlex-GeXIVA(SEQ ID NO:94，19H)，在1μM或100nM浓度下，对人类α9α10(hα9α10)nAChR的电流影响图。

图20A-20B：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](Peptide 1，SEQ ID NO:1)及其D-型氨基酸突变体(表6，SEQ ID NO:88-94)对大鼠α9α10nAChRs的浓度反应曲线。曲线上每个点是6-16个蛙卵(n＝6-16)的平均值±误差(mean±S.E.)。

图21A-21E：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](Peptide 1，SEQ ID NO:1)及其D-型氨基酸取代突变体(SEQ ID NO:93GeArg-GeXIVA，94GeFlex-GeXIVA，91GeMT＝Mt-GeXIVA，92GeMF＝Mf-GeXIVA；表6)在100％人类血清中的稳定性。图中横坐标表示该多肽在血清中温育的时间(分钟或小时)；纵坐标表示该多肽在某个时间点血清中剩余的百分数。其中Geflex的半衰期从母体肽GeXIVA[1,2]的40分钟增加到8小时。

图22：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](Peptide 1，SEQ ID NO:1，黑色曲线)及其D-型氨基酸取代突变体GeFlex-GeXIVA(SEQ ID NO:94，红色曲线)在人工模拟肠液中的稳定性。图中横坐标表示该多肽在人工模拟肠液中温育的时间(分钟)；纵坐标表示该多肽在某个时间点剩余的百分数。

图23A-23B：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)及其部分天冬氨酸扫描突变体(表7；SEQ ID NOs:95-101，110-115)在10μM(23A)或1μM(23B)的浓度下，对大鼠α9α10nAChR的电流反应百分数柱状图(n＝3)。图中ND96是空白对照，其电流的大小定义为100％，其余多肽产生的电流与对照电流的百分比，即为电流反应百分数(％Response)。

图24A-24H：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)及其部分天冬氨酸扫描突变体(表7；SEQ ID NOs:95，100，110-115)对大鼠α9α10nAChR的浓度反应曲线图。曲线上每个点是3-4个蛙卵(n＝3-4)的平均值±误差(mean±S.E.)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：αO-芋螺毒素GeXIVA新突变体的序列设计及其人工合成

在αO-芋螺毒素GeXIVA氨基酸序列的基础上(图1，表1-2中的SEQ ID NOs:1与25)，本发明人创造性地设计了一系列新的多肽突变体，其氨基酸序列如表1-7中的SEQ ID NOs:2-24，25-117所示。

采用Fmoc方法人工合成表1-7中所列多肽的线性肽。具体方法如下：

树脂肽采用Fmoc化学方法进行人工合成，可用多肽合成仪或手工合成法合成树脂肽。除了半胱氨酸外，其余氨基酸用标准的侧链保护基团。对于含有4个半胱氨酸(Cys)的多肽，若其二硫键连接方式为[C1-C4，C2-C3]，则其第2和第3个半胱氨酸(Cys)的-SH用Trt(S-trityl)保护，第1和第4个半胱氨酸的-SH用Acm(S-acetamidomethyl)成对保护；若其二硫键连接方式为[C1-C2，C3-C4]，则其第1和第2个半胱氨酸的-SH用Trt(S-trityl)保护，第2和第4个半胱氨酸的-SH用Acm(S-acetamidomethyl)成对保护；以此类推。对于含有2个半胱氨酸(Cys)的多肽，则其两个半胱氨酸的-SH均用Trt(S-trityl)保护。

各个线性肽(没形成二硫键的肽)的合成步骤为：采用固相合成法中的Fmoc与FastMoc方法，在ABI Prism 433a多肽合成仪上合成了线性肽。Fmoc氨基酸的侧链保护基为:Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr)、OBut(Asp)、Boc(Lys).采用Fmoc HOBT DCC方法，Rink酰胺化树脂及Fmoc氨基酸，合成步骤参考仪器合成手册进行。为反应完全，在哌啶脱保护及偶合时间上分别适当延长，对难接氨基酸采用双偶合，获得树脂肽。用reagent K(trifluoroacetic acid/water/ethanedithiol/phenol/thioanisole；90:5:2.5:7.5:5，v/v/v/v/v)将线性肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性肽粗品，

用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化每个线性肽，其纯度达95％以上。对含有二硫键的多肽继续用于氧化折叠。

参照文献^[27，36]，对上述线性肽进行一步或两步氧化折叠反应，过程简述如下:

首先通过铁氰化钾氧化法(20mM potassium ferricyanide，0.1M Tris，pH 7.5，30min)在Trt保护基团的两个半胱氨酸之间形成第一对二硫键；或用0.1M NH₄HCO₃，pH 8.0-8.2的缓冲液进行空气氧化，搅拌过夜，形成第一对二硫键。含有一对二硫键的多肽称为单环肽，纯化后可直接使用或根据需要进行第二步碘氧化，形成第二对二硫键。

对于含有两对二硫键的多肽，经过上述第一步氧化形成的单环肽，经反相HPLCC18柱(Vydac)纯化后，进行碘氧化(10mM iodine in H₂O:trifluoroacetic acid:acetonitrile(75:3:25by volume，15min)，移去另外2个半胱氨酸上的Acm，同时在这2个半胱氨酸之间形成第二对二硫键。二环肽再经反相HPLC C18柱(Vydac)纯化。HPLC洗脱线性梯度为在0－60min内10％-35％buffer B(B90)。Buffer A是0.1％的TFA(三氟乙酸)水溶液，Buffer B是0.05％TFA，90％CAN(乙腈)。紫外吸收值分析在214nm波长下进行。即获得按照从N端至C端的顺序在相应的半胱氨酸之间定向形成二硫键的芋螺毒素GeXIVA突变体。

经氧化折叠且纯化后的多肽，用超高压液相色谱图(UPLC)进行纯度鉴定，用质谱(ESI-MS)鉴定其分子量。UPLC分析的条件为：反向C18Vydac分析柱；所用缓冲液A(BufferA)为0.075％TFA的水溶液，缓冲液B(Buffer B)组成为0.05％TFA+90％乙腈(ACN)+10％水；线性洗脱梯度为0-3.5min内，buffer B从10％增加到40％。UPLC色谱图中的RT表示该色谱峰的保留时间。

纯度达到95％以上，质谱测定分子量与其理论分子量一致的多肽，即为合成成功。例如，图2A-2D显示了αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)及突变肽16(SEQ ID NO:16，即第17位精氨酸被丙氨酸替换的突变体[R17A]GeXIVA[1,2])的超高压液相色谱图(UPLC)(图2A、2C)与电喷雾质谱图(ESI-MS)(图2B、2D)。这两个肽氧化折叠后的理论分子量与它们的测定分子量完全一致，说明所合成的肽是正确的。

经过上述步骤，表1-7中所列的117个多肽全部正确合成，并形成了二硫键连接方式正确的氧化折叠肽。均可用于后续的活性研究。多肽浓度用280nm波长下比色测定，根据Beer-Lambert方程(equation)计算多肽浓度和质量，用于下面实施例中的各项实验。

表1－表7中，^a表示各个突变体的突变位点，用下划线标出。

表1：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]及其丙氨酸扫描突变体的序列，其二硫键连接方式为[C1-C2，C3-C4]

表2：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,4]及其丙氨酸扫描突变体的序列，其二硫键连接方式为[C1-C4，C2-C3]

表3：αO-芋螺毒GeXIVA[1,2]的2个或2个以上的精氨酸被替换的突变体序列，其二硫键连接方式为[C1-C2，C3-C4]

表4：αO-芋螺毒GeXIVA的截短突变体序列，

含有1对二硫键或无二硫键

SEQ ID NO:	多肽名称	氨基酸序列<sup>a</sup>
			62	<sup>△6-22</sup>GeXIVA	<u>G</u>RYCRSPYDRRRRYCRR
63	<sup>△10-19</sup>GeXIVA	RSPYDRRRRY
			64	<sup>△10-19</sup>[R1A]GeXIVA	<u>A</u>SPYDRRRRY
65	<sup>△10-19</sup>[S2A]GeXIVA	R<u>A</u>PYDRRRRY
			66	<sup>△10-19</sup>[P3A]GeXIVA	RS<u>A</u>YDRRRRY
67	<sup>△10-19</sup>[Y4A]GeXIVA	RSP<u>A</u>DRRRRY
			68	<sup>△10-19</sup>[D5A]GeXIVA	RSPY<u>A</u>RRRRY
69	<sup>△10-19</sup>[R6A]GeXIVA	RSPYD<u>A</u>RRRY
			70	<sup>△10-19</sup>[R7A]GeXIVA	RSPYDR<u>A</u>RRY
71	<sup>△10-19</sup>[R8A]GeXIVA	RSPYDRR<u>A</u>RY
			72	<sup>△10-19</sup>[R9A]GeXIVA	RSPYDRRR<u>A</u>Y
73	<sup>△10-19</sup>[Y10A]GeXIVA	RSPYDRRRR<u>A</u>
			74	<sup>△10-19</sup>GeXIVA#	RSPYDRRRRY#
75	<sup>△10-19</sup>[D5A]GeXIVA#	RSPY<u>A</u>RRRRY#
			117	<sup>△7-22</sup>GeXIVA	RYCRSPYDRRRRYCRR

#indicates a C-terminal amide。#，表示C-末端酰胺化。

△后面的数字依次表示在母序列(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:25)中的起始位点和终止位点。

表5：αO-芋螺毒GeXIVA的半胱氨酸(Cys，C)替换突变体序列，含有1对二硫键或无二硫键

表6：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]的D-型氨基酸突变体序列，其二硫键连接方式为[C1-C2，C3-C4]。相应位置上的L-型氨基酸被D-型氨基酸替换后，用小写字母和下划线显示

SEQ ID NO:	多肽名称	氨基酸序列<sup>a</sup>
			88	1t-GeXIVA	<u>t</u>CRSSGRYCRSPYDRRRRYCRRITDACV
89	28v-GeXIVA	TCRSSGRYCRSPYDRRRRYCRRITDAC<u>v</u>
			90	1t,28v-GeXIVA	<u>t</u>CRSSGRYCRSPYDRRRRYCRRITDAC<u>v</u>
91	GeMT，Mt-GeXIVA	TCRSSGRYCRSPYD<u>rr</u>RRYCRRITDACV
			92	GeMF，Mf-GeXIVA	TCRSSGRYCRSPYD<u>rrrr</u>YCRRITDACV
93	GeArg-GeXIVA	TC<u>r</u>SSG<u>r</u>YC<u>r</u>SPYD<u>rrrr</u>YC<u>rr</u>ITDACV
			94	GeFlex-GeXIVA	<u>t</u>C<u>r</u>SSG<u>r</u>YC<u>r</u>SPYD<u>rrrr</u>YC<u>rr</u>ITDAC<u>v</u>

表7：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)的天冬氨酸(Asp，D)扫描突变体的序列，突变氨基酸用下划线显示，其二硫键连接方式为[C1-C4，C2-C3]

实施例2：检测αO-芋螺毒素GeXIVA及其突变体的受体结合活性的方法。

参照文献^[27，37]中的方法，以及体外转录试剂盒(mMessage mMachine in vitrotranscription kit(Ambion，Austin，TX))说明书，制备各种大鼠神经型nAChRs亚型(α3β4，α6/α3β4，α9α10，α4β2，α4β4，α3β4，α2β2，α2β4，α7)、人类α9α10，以及小鼠肌肉型nAChRs(α1β1δε)的cRNA，其浓度用UV 260nm下的OD值进行测算。解剖收集非洲爪蟾(Xenopus laveis)卵母细胞(蛙卵)，将cRNA注射入蛙卵中，每个亚基的注射量为5－10ng cRNA。蛙卵在ND-96中培养。蛙卵收集后的1－2天内注射cRNA，注射后1－4天内用于nAChRs的电压钳记录。

将1个注射过cRNA的蛙卵置于30μL的Sylgard记录槽中(直径4mm×深度2mm)，重力灌注含有0.1mg/ml BSA(bovine serum albumin)的ND96灌流液(96.0mM NaCl，2.0mM KCl，1.8mM CaCl₂，1.0mM MgCl₂，5mM HEPES，pH 7.1－7.5)或含有1mM atropine的ND96(ND96A)，流速为1ml/min。所有的芋螺毒素溶液也含有0.1mg/ml BSA以减少毒素的非特异性吸附，用转换阀(SmartValve，Cavro Scientific Instruments，Sunnyvale，CA)可以在灌注毒素或乙酰胆碱(ACh)之间进行自由切换，以及一系列三通螺线阀(solenoid valves，model161TO31，Neptune Research，Northboro，MA)使灌注ND96与ACh等之间进行自由切换。Ach门控的电流由双电极电压箝放大器(model OC-725B，Warner Instrument Corp.，Hamden，CT)设置在“慢”箝，以及clamp gain在最大值(×2000)位置时进行在线记录。用1mm外径×0.75内径mm的玻璃毛细管(fiber-filled borosilicate capillaries，WPI Inc.，Sarasota，FL)拉制玻璃电极，并充满3M KCl作为电压和电流电极。膜电压箝制在-70mV.整个系统均由电脑控制和记录数据。ACh脉冲为每隔5min自动灌注1s的ACh。ACh的浓度分别为，表达肌肉型的nAChRs和神经型α9α10nAChRs卵为10μM；表达神经型的nAChRs之α7为200μM，其它的亚型都为100μM。至少记录3个卵表达某个亚型对不同多肽浓度的电流反应情况，以及电流轨迹。

测试的电流数据用GraphPad Prism软件(San Diego，CA)进行统计分析，绘制剂量反应曲线，计算芋螺毒素的半阻滞浓度IC₅₀等多种参数。

表1-7中所有多肽(SEQ ID NOs:1-117)的受体结合活性均使用上述方法进行检测。

实施例3：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]及其丙氨酸扫描突变体对nAChRs不同亚型的阻断活性

αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1，图1)及其丙氨酸扫描突变体(SEQ IDNOs:2-24)(表1)对大鼠神经型α9α10、α7、以及小鼠肌肉型α1β1δεnAChRs这三种极其相近的受体亚型的阻断活性，即半阻断剂量(IC₅₀)的结果，总结在表8中。这些突变体对这3种亚型的阻断活性之间的比值也总结在表8中。

表8：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)及其丙氨酸扫描突变体(SEQ IDNOs:2-24)对大鼠神经型α9α10、α7、以及小鼠肌肉型α1β1δεnAChRs的阻断活性

^a括号外的数字是指半阻断剂量(IC₅₀)，单位是纳摩尔(nM)；括号中的数据是95％置信区间的半阻断剂量(IC₅₀)的范围。

^b该列数据是指各个多肽针对某个受体亚型的半阻断剂量(IC₅₀)与1号多肽的半阻断剂量(IC₅₀)之间的比值。

^c各个多肽对α7与α9α10两个亚型的半阻断剂量(IC₅₀)之间的比值(α7:α9α10)。

^d各个多肽对α1β1δε与α9α10两个亚型的半阻断剂量(IC₅₀)之间的比值(α1β1δε:α9α10)。

结果显示：

SEQ ID NOs:2－24所示的23个突变体(实施例1制备)对大鼠α9α10nAChR均有很低的纳摩尔级的阻断作用，它们的IC₅₀均在80nM以下，其活性与野生型的GeXIVA[1,2](SEQ IDNO:1)相比差异不大。这些突变体对大鼠α9α10nAChR的活性与野生型相比，其变化倍数在0.7－6.2倍，无一超过10倍的变化。这表明，GeXIVA[1,2]序列中的各个被丙氨酸替换的单个氨基酸，对α9α10nAChR的阻断活性影响很小，可以被替换，而不会明显影响它们的受体结合活性(表8)。

SEQ ID NOs:2－24所示的23个突变体(表8)，对大鼠α7nAChR表现出较微弱的阻断活性，它们的IC₅₀在640－6690nM之间。这些突变体对α7nAChR的活性与野生型的GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)相比差异也不大。它们对大鼠α7nAChR的活性与野生型相比，其变化倍数在0.9－10.3倍，除了SEQ ID NO:17(10.3倍)以外，其变化在8.6倍以内。除了SEQ ID NOs:6、11、13、19和24这5个突变体对α7nAChR的活性与野生型的活性相似外，其余突变体对α7nAChR的活性都下降了2倍以上，也就是说，相对于α7nAChR亚型，大部分突变体对α9α10nAChR的选择性提高了，这是一个很难得的优点。

SEQ ID NOs:2－24所示的23个突变体(表8)，对小鼠肌肉型α1β1δεnAChR也表现出微弱的阻断活性，它们的IC₅₀在370－6290nM之间。这些突变体对α1β1δεnAChR的活性与野生型的GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)相比差异也不是特别大。它们对α1β1δεnAChR的活性与野生型相比，其变化倍数在0.7－12.1倍，除了SEQ ID NOs:16，17，20(>10倍)以外，其变化在9.3倍以内。除了SEQ ID NOs:2，4，5，11，12，13，这6个突变体对α1β1δεnAChR的活性与野生型的活性相似外，其余突变体对α1β1δεnAChR的活性都下降了2倍以上，也就是说，相对于α1β1δεnAChR亚型，大部分突变体对α9α10nAChR的选择性提高了，这也是一个很好的优点。

α9α10、α7、α1β1δεnAChRs这三种亚型极其相似，一般情况下很难区分。本发明人发现的野生型GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)对它们有较好的区分度，对α9α10nAChR相对于α7与α1β1δεnAChRs有约50倍的区分度。但在高浓度下(>500nM)，GeXIVA[1,2]对α7与α1β1δεnAChRs有一定的阻断活性。从表8可以看出，有6个突变体，即SEQ ID NOs:6，8，15，16，18，23，对α9α10nAChR相对于α7与α1β1δεnAChRs的选择性明显提高了，其区分度均在100倍以上。也就是说，SEQ ID NOs:6，8，15，16，18，23保持了对α9α10nAChR的阻断活性，对α7与α1β1δεnAChRs的活性都降低了，是选择性显著提高的优化突变体。

譬如，SEQ ID NO:16(表1，8)是将野生型GeXIVA[1,2]的第17位精氨酸用丙氨酸替换后的突变体，即[R17A]GeXIVA[1,2]，其对α9α10、α7、α1β1δεnAChRs这三种亚型的浓度剂量反应曲线如图3A-3B所示，其选择性显著提高。SEQ ID NO:16对α9α10nAChR的IC₅₀为27nM，对α7nAChRs的IC₅₀为5610nM，对α1β1δεnAChRs的IC₅₀为6290nM(表8，图3A-3B)。SEQ ID NO:16对α9α10nAChR相对于α7nAChRs的选择性高达207.8倍，比GeXIVA[1,2]提高了约4倍。SEQID NO:16对α9α10nAChR相对于α1β1δεnAChRs的选择性高达232.9倍，比GeXIVA[1,2]提高了约5.4倍。与此类似，SEQ ID NOs:6，8，15，18，23的选择性比GeXIVA[1,2]也显著提高(表8)。

实施例4：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,4]及其丙氨酸扫描突变体对nAChRs不同亚型的阻断活性

αO-芋螺毒素GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25，图1)及其丙氨酸扫描突变体(SEQ IDNOs:26-48)(表2)对α9α10、α7、α1β1δεnAChRs这三种极其相近的受体亚型的阻断活性结果，以及对这3种亚型的阻断活性之间的比值总结在表9中。

表9：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)及其丙氨酸扫描突变体(SEQ IDNOs:26-48)对大鼠神经型α9α10、α7、以及小鼠肌肉型α1β1δεnAChRs的阻断活性

^b该列数据是指各个多肽针对某个受体亚型的半阻断剂量(IC₅₀)与25号多肽的半阻断剂量(IC₅₀)之间的比值。

^e其半阻断剂量(IC₅₀)大于10μM，是指在10μM高浓度下，某个多肽对该亚型的电流阻断小于50％。

结果显示：

SEQ ID NOs:26-48所示的23个突变体(实施例1制备)对α9α10nAChR均有很强的阻断活性，它们的IC₅₀在1.4－120nM之间，其活性与野生型的GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)相比，绝大部分的差异不大。这些突变体对α9α10nAChR的活性与野生型相比，其变化倍数在0.1－11.6倍(表9)。其中，SEQ ID NO:44([R22A]GeXIVA[1,4])对α9α10nAChR的活性比野生型GeXIVA[1,4]下降了11.6倍；而SEQ ID NO:37([D14A]GeXIVA[1,4])，SEQ ID NO:45([I23A]GeXIVA[1,4])对α9α10nAChR的活性比野生型GeXIVA[1,4]却分别增强了3.4倍与11.4倍。除了这三个突变肽之外，其余的20个突变体的活性与野生型GeXIVA[1,4]的活性相比，其变化在0.6－7.5倍的范围内。这说明GeXIVA[1,4]序列中，除了第22位的精氨酸(R)、第14位的天冬氨酸(D)、以及第23位的异亮氨酸(I)被丙氨酸替换后，活性变化较大外，其余位置的单个氨基酸被丙氨酸替换后，对α9α10nAChR的阻断活性影响很小，且不会明显影响它们的受体结合活性(表9)。

SEQ ID NO:26-48所示的23个突变体(表9)，对α7nAChR的阻断活性极弱，它们的IC₅₀都在1360nM以上。有的甚至完全失活(IC₅₀>10000nM)，包括SEQ ID NOs:31，39，40，41，43，44这6个突变体。这些突变体对α7nAChR的活性与野生型的GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)相比差异不大。它们对大鼠α7nAChR的活性与野生型相比，其变化倍数在0.5－3.2倍。所有突变体对α7nAChR的活性与野生型的活性和选择性相似，它们对α9α10相对于α7nAChR亚型的选择性都很高。其中SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:45对α9α10的活性分别增强了3.4倍与11.4倍。相对于α7nAChR亚型，SEQ ID NOs:37、45这两个优化突变体对α9α10nAChR的选择性分别为1625倍和971.4倍，比野生型的区分度176.9倍分别提高了9.2倍和5.5倍(表9)。

SEQ ID NOs:26－48所示的23个突变体(表9)，对α1β1δεnAChR有微弱的阻断活性，它们的IC₅₀在520－3500nM之间。这些突变体对α1β1δεnAChR的活性与野生型GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)的很接近。它们对α1β1δεnAChR的活性与野生型相比，其变化倍数在0.7－2.8倍，对α1β1δεnAChR的活性变化很小。

α9α10、α7、α1β1δεnAChRs这三种亚型极其相似，本发明人发现的野生型GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)对它们有很高的区分度，对α9α10nAChR相对于α7与α1β1δεnAChRs分别有177倍和52倍的区分度。但在高浓度下(>500nM)，GeXIVA[1,4]对α1β1δεnAChRs有一定的阻断活性。从表9可以看出，有2个优化突变体，即SEQ ID NO:37([D14A]GeXIVA[1,4])，SEQ IDNO:45([I23A]GeXIVA[1,4])，对α9α10nAChR的阻断活性增加了，相对于α7nAChR和α1β1δεnAChRs的选择性明显提高。SEQ ID NO:37对α9α10nAChR相对于α7nAChR与α1β1δεnAChRs的区分度分别为1625倍和187倍。SEQ ID NO:45(表9)对α9α10nAChR相对于α7nAChR与α1β1δεnAChRs的区分度分别为971倍和664倍，它们比野生型的177倍和52倍分别提高了5.5倍和13倍。

对SEQ ID NO:45([I23A]GeXIVA[1,4])与野生型的GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)进行了更加深入的对比研究(表10-11，图4A-4D、图5A-5B、图6A-6B、图7A-7J、图8A-8C)。它们在超高压液相色谱图(UPLC)上的出峰时间，即保留时间(RT)略有差异，SEQ ID NO:45的出峰时间为2.04分钟，略早于野生型GeXIVA[1,4]的2.32分钟，SEQ ID NO:45的亲水性略微增强(图4A、4C)。SEQ ID NO:25的实测分子量为3453.95Da，其理论分子量为3453.96Da。SEQID NO:45的实测分子量为3410.46Da，其理论分子量为3410.86Da。二者的实测分子量与其理论分子量一致(图4B、4D)，说明合成的这两个多肽完全正确。

表10：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)与突变体[I23A]GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:45)对大鼠多种神经型nAChRs、以及小鼠肌肉型α1β1δεnAChRs(Mα1β1δε)的阻断活性比较

^b该列数据是指第45号多肽针对某个受体亚型的半阻断剂量(IC₅₀)与25号多肽的半阻断剂量(IC₅₀)之间的比值。

表11.αO-芋螺毒素GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)与突变体[I23A]GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:45)对人类α9α10nAChR亚型(hα9α10)的阻断活性比较

^a括号外的数字是指半阻断剂量(IC₅₀)或浓度反应曲线的斜率(Hill slope)，IC₅₀的单位是纳摩尔(nM)；括号中的数据是95％置信区间的IC₅₀或Hill slope的范围。

^b该列数据是指第45号多肽针对人类α9α10nAChR亚型的半阻断剂量(IC₅₀)与25号多肽的半阻断剂量(IC₅₀)之间的比值。

图5A-5B显示了GeXIVA[1,4](Peptide 25，SEQ ID NO:25)与突变肽45(Peptide45，SEQ ID NO:45)对大鼠α9α10(rα9α10)nAChR的电流影响图，10nM的SEQ ID NO:45几乎可以完全阻断大鼠α9α10nAChR的电流，明显比野生型的活性要强很多。而野生型的SEQ IDNO:25只能阻断大鼠α9α10nAChR约50％的电流。二者对大鼠α9α10、α7、以及小鼠α1β1δεnAChRs这三种亚型的浓度剂量反应曲线如图6A-6B所示。SEQ ID NO:45对α9α10nAChR的浓度剂量反应曲线与对α7和α1β1δεnAChRs的曲线之间的距离，要比野生型的远很多。这充分证明了相对于α7nAChR和α1β1δεnAChRs，SEQ ID NO:45对α9α10nAChR的活性和选择性显著提高。

SEQ ID NO:45([I23A]GeXIVA[1,4])与野生型GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)对nAChRs更多亚型的阻断活性结果如表10和图7A-7J所示。检测过的亚型包括大鼠α9α10、α7、α3β2、α3β4、α6/α3β4、α2β2、α4β2、α2β4和α4β2以及小鼠α1β1δεnAChRs共10个亚型。SEQ IDNO:45对α9α10nAChR的活性最强，其IC₅₀仅为1.4nM，对其它所有亚型的活性很微弱，它们的IC₅₀在930－8240nM之间(表10，图7A-7J)。SEQ ID NO:25对α9α10nAChR的IC₅₀为16nM，对其它所有亚型的活性较弱，它们的IC₅₀在440－4290nM之间(表10，图7A-7J)。很显然，SEQ IDNO:45对α9α10nAChR相对于其它所有nAChRs亚型的活性和选择性，均比野生型SEQ ID NO:25的活性和选择性显著提高。

SEQ ID NO:45([I23A]GeXIVA[1,4])与野生型GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)对人类α9α10nAChR亚型的阻断活性结果如表11和图8A-8C所示。10nM的野生型SEQ ID NO:25不能阻断人类α9α10nAChR的电流(图8A)；而10nM的SEQ ID NO:45可阻断人类α9α10nAChR的约50％电流(图8B)，明显比野生型的活性要强很多。二者对人类α9α10nAChR的浓度剂量反应曲线如图8C所示。SEQ ID NO:45对人类α9α10nAChR的活性很强，其IC₅₀仅为11nM，SEQ IDNO:25对人类α9α10nAChR的IC₅₀为111nM。SEQ ID NO:45对人类α9α10nAChR的活性比SEQ IDNO:25增强了10倍。本发明中涉及的所有突变体对大鼠和人类α9α10nAChRs的活性都是相似的，它们并不区分大鼠和人类α9α10nAChRs。

实施例5：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]及其多个精氨酸替换突变体对α9α10 nAChR的阻断活性

表3列出了GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)序列中的2个以上的精氨酸被替换后的突变体序列(SEQ ID NO:49-61)。它们对大鼠α9α10nAChR亚型的阻断活性急剧下降(表12，图9A-9C)。当GeXIVA[1,2]中的3个精氨酸(R)被丙氨酸(A)替换后(SEQ ID NO:51)，或4个精氨酸(R)被丙氨酸(A)替换后(SEQ ID NO:50)，或其所有的9个精氨酸(R)被丙氨酸(A)替换后(SEQ ID NO:49)，这三个突变肽对α9α10nAChR的阻断活性完全丧失，其IC₅₀>10000nM(表3，表12，图9A-9C)。在10μM高浓度下，SEQ ID NOs:49，50，51对大鼠α9α10nAChR的电流几乎没有阻断作用(图9A-9C)。其它的2个精氨酸(R)被丙氨酸(A)替换后的突变肽(SEQ ID NOs:52-61)对α9α10nAChR的阻断活性与野生型GeXIVA[1,2](其IC₅₀为12nM)相比，下降了10－48倍，它们的IC₅₀在130－590nM之间(表12)。SEQ ID NOs:52-61突变肽对α9α10nAChR的活性弱了很多，这说明GeXIVA[1,2]中的多个精氨酸(2个以上)协同起效，对α9α10nAChR的结合起着关键作用，当其中2个以上的精氨酸被替换后其活性丧失严重(表3，表12)。

表12：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)及其多个精氨酸替换突变体(SEQID NOs:49-61)对大鼠神经型α9α10nAChR亚型的阻断活性

^b该列数据是指某个多肽针对大鼠α9α10nAChR亚型的半阻断剂量(IC₅₀)与1号多肽的半阻断剂量(IC₅₀)之间的比值。

^c其半阻断剂量(IC₅₀)大于10μM，是指在10μM高浓度下，某个多肽对该亚型的电流阻断小于50％。

实施例6：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]及其截短突变体对α9α10 nAChR等的阻断活性

对GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)的序列从两头往中间逐步截短，对其中一个截短突变体^△10-19GeXIVA(SEQ ID NO:63)再进行丙氨酸扫描突变，之后再进行C-末端酰胺化修饰突变。这些截短突变体的序列、命名与编号(SEQ ID NOs:62-75，SEQ ID NO:117)如表4所示。检测了这些截短突变体对大鼠α9α10nAChR的结合活性(图10，表13-14)。

表13.αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)及其截短突变体对大鼠神经型α9α10nAChR亚型的阻断活性

表14：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)及其截短突变体^△6-22GeXIVA(SEQID NO:62)和^△10-19[D5A]GeXIVA#(SEQ ID NO:75)对大鼠α9α10与α7，以及小鼠肌肉型Mα1β1δεnAChRs的阻断活性

^a括号外的数字是指半阻断剂量(IC₅₀)，其单位是纳摩尔(nM)；括号中的数据是95％置信区间的IC₅₀的范围。

^b该列数据是指某个多肽针对α7与α9α10nAChR亚型的半阻断剂量(IC₅₀)之间的比值(α7:α9α10)。

^c该列数据是指某个多肽针对α1β1δε与α9α10nAChR亚型的半阻断剂量(IC₅₀)之间的比值(α1β1δε:α9α10)。

结果发现，在10μM浓度下，^△10-19GeXIVA(SEQ ID NO:63)与^△10-19[D5A]GeXIVA(SEQID NO:68)可阻断大鼠α9α10nAChR的80％以上的电流，其阻断活性很强，而其它所试丙氨酸扫描突变肽(SEQ ID NOs:64-67，69-73；表4)突变体对大鼠α9α10nAChR的电流阻断均在25％以下，其影响很小或完全没有作用，它们的电流反应百分数>75％(图10)。

与野生型GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)相比，截短突变体^△6-22GeXIVA(SEQ ID NO:62)保持了对大鼠(r)和人类(h)α9α10的阻断活性，二者的活性相似(图11A-11F，表13-14)。GeXIVA[1,2]和^△6-22GeXIVA在10nM浓度下对大鼠α9α10nAChR的电流有阻断作用(图11A-11B)。GeXIVA[1,2]和^△6-22GeXIVA在50nM浓度下对人类α9α10nAChR的电流阻断作用明显(图11C-11D)。二者对大鼠(r)和人类(h)α9α10受体的浓度反应曲线几乎重合或离得很近(图11E-11F)。GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)与^△6-22GeXIVA(SEQ ID NO:62)对大鼠α9α10的IC₅₀分别为15nM和14nM，几乎完全相同(表13-14，图11E)。^△7-22GeXIVA(SEQ ID NO:117)对α9α10的活性与^△6-22GeXIVA(SEQ ID NO:62)相近。

^△10-19GeXIVA(SEQ ID NO:63)对大鼠α9α10的IC₅₀为1110nM，活性较弱。^△10-19[D5A]GeXIVA(SEQ ID NO:68)与^△10-19GeXIVA#(SEQ ID NO:74)对大鼠α9α10的IC₅₀分别为120nM和130nM，活性相近。SEQ ID NOs:63，68，74对α9α10nAChR的活性与野生型SEQ ID NO:1相比，活性均下降了。而^△10-19[D5A]GeXIVA#(SEQ ID NO:75)对大鼠α9α10的IC₅₀为17nM，保持了与GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)相当的活性(表13，图12)。

^△10-19[D5A]GeXIVA#(SEQ ID NO:75)同样保持了对人类α9α10nAChR的强阻断活性(图13A-13F)，与GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)的活性相当。GeXIVA[1,2]和^△10-19[D5A]GeXIVA#(SEQ ID NO:75)在10nM浓度下对大鼠α9α10nAChR的电流有阻断作用(图13A-13B)。GeXIVA[1,2]和^△10-19[D5A]GeXIVA#在50nM浓度下对人类α9α10nAChR的电流阻断作用明显(图13C-13D)。GeXIVA[1,2]和^△10-19[D5A]GeXIVA#对大鼠(r)和人类(h)α9α10受体的浓度反应曲线几乎重合或离得很近(图13E-13F)，二者之间的活性和选择性均很相似。这是很难得的优点，因为^△10-19[D5A]GeXIVA#(SEQ ID NO:75)只含有10个氨基酸，与含有28个氨基酸的野生型GeXIVA相比，其线性肽合成成本大幅度下降；且SEQ ID NO:75不含有二硫键，人工合成时无需氧化折叠，更进一步降低了纯化成本，大大缩短了人工合成的时间。

GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)及其截短突变体^△6-22GeXIVA(SEQ ID NO:62)和^△10-19[D5A]GeXIVA#(SEQ ID NO:75)对大鼠α9α10nAChR的阻断活性极其相似(表14)，其IC₅₀分别为15nM、14nM和17nM。它们对大鼠α7和小鼠肌肉型Mα1β1δεnAChRs的阻断活性较弱，其IC₅₀都在500nM以上，其对α9α10nAChR相对于α7nAChR的选择性与野生型GeXIVA[1,2]差不多。SEQ ID NO:75对α9α10相对于肌肉型nAChRs的选择性与野生型GeXIVA[1,2]相比显著提高，提高了3.4倍(表14)。因此，SEQ ID NO:75不但保持了对α9α10nAChR的强阻断活性，对肌肉型受体的活性明显下降了，从而提高了其选择性，加之它的合成成本十分低廉，是很宝贵的优化突变体。

实施例7：αO-芋螺毒素GeXIVA及其半胱氨酸替换突变体对α9α10 nAChR等的阻断活性

αO-芋螺毒GeXIVA(SEQ ID NOs:1或25)序列中的半胱氨酸(Cys，C)成对被丙氨酸(A)或丝氨酸(S)替换所获得的突变体(SEQ ID NOs:76-87)如表5所示。这些突变体均人工合成成功，并经过色谱与质谱分析进行了确证，它们含有1对二硫键或无二硫键。例如，GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)与无二硫键的突变肽[C2A,C9A,C20S,C27S]GeXIVA(SEQ IDNO:86，表5)的超高压液相色谱图(UPLC)(图14A、14C)显示，SEQ ID NO:86的出峰时间为2.08分钟，略早于GeXIVA[1,2]的出峰时间2.36分钟。这说明SEQ ID NO:86的亲水性相对于GeXIVA[1,2]有所增强，合成纯化后的终产物在色谱图上只有一个峰，其纯度至少在95％以上，符合纯度要求。GeXIVA[1,2]的实测分子量为3452.70Da，计算的理论分子量为3452.94Da(图14B)，[C2A,C9A,C20S,C27S]GeXIVA(13)的实测分子量为3360.90Da，计算的理论分子量为3360.70Da(图14D)。二者的电喷雾质谱图(ESI-MS)(图14B、14D)显示它们的实测分子量与理论分子量一致，合成的多肽完全正确。

SEQ ID NOs:76-87(表5，表15)对大鼠α9α10nAChR的阻断活性都很强，其IC₅₀都在6.1－36nM之间，与野生型的SEQ ID NO:1(IC₅₀，12nM)或SEQ ID NO:25(IC₅₀，16nM)的差不多，其活性差异都小于3倍。也就是说GeXIVA中的半胱氨酸和所形成的二硫键对维持其受体结合活性不重要，被丙氨酸或丝氨酸取代后其活性变化很小。这意味着不含半胱氨酸的GeXIVA线性肽突变体仍然具有相似的活性，人工合成时无需进行氧化折叠和繁多的纯化步骤，从而合成成本大大降低。

其中[C2A,C9A,C20S,C27S]GeXIVA(SEQ ID NO:86)对大鼠α9α10nAChR的阻断活性比野生型SEQ ID NO:1还增强了两倍(表15)，其IC₅₀仅为6.1nM。SEQ ID NO:86在10nM的低浓度下，对大鼠α9α10nAChR的电流阻断超过了一半，比GeXIVA[1,2]的活性要强(图15A-15B)。测试了SEQ ID NO:86对其它亚型的活性，包括α1β1δε，α7，α6/α3β4，α3β2，α3β4，α2β2nAChRs，对这些亚型的活性很弱，其IC₅₀都在520nM以上，甚至没活性(IC₅₀>10000nM)，大部分突变体的IC₅₀均在1000nM以上，即微摩尔(μM)级(表16，图16A-16H)。与GeXIVA[1,2]相比，SEQ ID NO:86的活性增强，选择性也提高了。SEQ ID NO:86对人类α9α10nAChR的阻断活性也很强，与GeXIVA[1,2]对人类α9α10nAChR的阻断活性有所增强(表17，图1717A-17E)。在50nM和100nM浓度下，SEQ ID NO:86对人类α9α10nAChR的电流阻断很显然，比GeXIVA[1,2]阻断的电流要多(图17A-17D)。SEQ ID NO:86对人类α9α10nAChR的浓度反应曲线与GeXIVA[1,2]的挨得很近，说明它们对人类α9α10nAChR的阻断活性都很强。

并不是所有的半胱氨酸取代突变，都不影响多肽的活性(表18)。事实上，半胱氨酸之间形成的二硫键对大多数的多肽和蛋白的结构和生物活性起着很关键的作用，有的芋螺毒素肽，其二硫键连接方式改变都有可能完全失活，这在大多数芋螺毒素中是普遍存在的。表18中总结的替换半胱氨酸减少或去掉二硫键的突变，对大多数多肽的活性影响巨大，突变体的活性显著下降(IC₅₀比野生型明显增大)或完全失活(IC₅₀>10000nM)。因此，对于半胱氨酸能否被取代进行突变而保持多肽活性，要依特定的多肽而定，必须通过实验结果才能下结论。

表15：αO-芋螺毒素GeXIVA的半胱氨酸(Cys，C)替换突变体(SEQ ID NOs:76-87)，对大鼠α9α10nAChR亚型的阻断活性

SEQ ID NO:	IC<sub>50</sub>(nM)<sup>a</sup>	Hill slope<sup>a</sup>	Ratio<sup>b</sup>
				1	12(9-14)	1.00(0.82-1.20)	1.0
76	16(13-20)	1.33(0.99-1.66)	1.3
				77	12(9-15)	1.07(0.84-1.29)	0.9
78	14(11-18)	1.02(0.79-1.25)	1.1
				79	11(8-14)	1.01(0.75-1.27)	0.9
25	16(13-20)	1.04(0.83-1.24)	1.3
				80	17(12-23)	0.98(0.71-1.26)	1.4
81	21(17-27)	1.02(0.82-1.22)	1.8
				82	36(30-43)	1.34(1.02-1.65)	2.9
83	13(10-17)	0.99(0.76-1.22)	1.0
				84	14(12-17)	1.11(0.88-1.34)	1.2
85	16(11-22)	1.11(0.76-1.47)	1.3
				86	6.1(4.8-7.6)	0.81(0.69-0.94)	0.5
87	13(10-16)	1.02(0.83-1.22)	1.0

^b该列数据是指各个多肽针对大鼠α9α10nAChR亚型的半阻断剂量(IC₅₀)与1号多肽的半阻断剂量(IC₅₀)之间的比值。

表17：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]与半胱氨酸替换突变体SEQ ID NO:86，对人类α9α10nAChR亚型的阻断活性

SEQ ID NO:	IC<sub>50</sub>(nM)<sup>a</sup>	Hill slope<sup>a</sup>	Ratio<sup>b</sup>
				1	52(41-67)	1.00(0.66-1.35)	1
86	33(25-42)	1.13(0.83-1.43)	0.63

^b该列数据是指第86号多肽针对人类α9α10nAChR亚型的半阻断剂量(IC₅₀)与1号多肽的半阻断剂量(IC₅₀)之间的比值。

表18：对已报道的其它芋螺毒素半胱氨酸进行过替换改造的多肽序列及其活性总结

*表示C-末端酰胺化。nAChR:乙酰胆碱受体的英文缩写.VGSCs:电源门控钠离子通道的英文缩写。

实施例8：αO-芋螺毒素GeXIVA及其D-型氨酸突变体对α9α10nAChR等的阻断活性

将GeXIVA[1,2]序列中的首尾氨基酸、中间的2个或更多个精氨酸(R)用相应的D-型氨基酸进行替换，所获得的突变体编号(SEQ ID NOs:88-94)、命名和序列见表6。它们对大鼠和人类的α9α10nAChRs均有很强的阻断活性(图18A-18H、图19A-19H、图20A-20B，表19-20)。GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1，图18A)及其D-型氨基酸突变体SEQ ID NOs:88-94(表6)，在1μM或100nM浓度下，对大鼠α9α10(rα9α10)nAChR的90％以上甚至100％的电流全都阻断了(图18A-18H)。类似地，这些突变体在1μM或100nM浓度下，对人类α9α10(hα9α10)nAChR的电流几乎全部阻断(图19A-19H)。其浓度反应曲线(图20A-20B)彼此相隔很近，大部分突变体与GeXIVA[1,2]的曲线相互重叠，活性相似的。

GeXIVA[1,2](SEQ ID NO:1)与这些D-型氨基酸突变体SEQ ID NOs:88-94对大鼠α9α10(rα9α10)nAChR的IC₅₀都在11－32nM之间(表19)；对人类α9α10(hα9α10)nAChR的IC₅₀都在15－49nM之间(表20)。SEQ ID NOs:88-94对大鼠和人类α9α10nAChRs的阻断活性很接近，且与野生型GeXIVA[1,2]的活性相差不大。这说明用D-型氨基酸进行替换对其受体结合活性的影响很小。这些突变体对大鼠其它亚型的阻断活性很微弱，或完全没有作用(表21)，这些亚型包括α3β4、α3β2、α1β1δε、α7、α6/α3β4、α4β2、α2β4、α4β4和α2β2nAChRs，对这些亚型的活性很弱，其IC₅₀都在470nM以上，甚至没活性(IC₅₀>10000nM)，大部分突变体的IC₅₀均在1000nM以上(表21，图20A-20B)。这些突变体对α9α10nAChRs相对于其它亚型来说，它们的选择性都很高。其中的SEQ ID NO:92(GeMF，Mf-GeXIVA)对大鼠和人类α9α10nAChRs的阻断活性比GeXIVA[1,2]分别提高了2.6倍与2.8倍(表19－20)。

对GeXIVA[1,2]进行D-型氨基酸替换突变的主要目的是想提高其稳定性。因为多肽本身在生物体内很容易被各种蛋白酶降解导致多肽的稳定性差。GeXIVA[1,2]中含有9个精氨酸，很容易受胰蛋白酶的攻击而水解。为此，设计合成了这一系列D-型氨基酸替换突变体，幸好这些D-型氨基酸替换保持了其受体结合活性，并没有大的改变。对其中活性增强的4个突变体的血清稳定性进行了研究，结果如图21A-21E所示。这4个突变体(SEQ ID NOs:91-93)分别是SEQ ID NO:91(GeMT＝Mt-GeXIVA)，SEQ ID NO:92(GeMF＝Mf-GeXIVA，SEQ IDNO:93(GeArg-GeXIVA)与SEQ ID NO:94(GeFlex-GeXIVA),)(表6，图21A-21E)。SEQ ID NOs:91-93在100％人类血清中的稳定性与GeXIVA[1,2]相比显著增强。在人类血清中，GeXIVA[1,2]在120分钟内已被降解殆尽，所剩多肽不到原来起始量的20％；而SEQ ID NOs:91-93经过24小时后还剩有约20％。其中SEQ ID NO:94(Geflex)的半衰期从野生型GeXIVA[1,2]的40分钟增加到8小时之久(图21A-21E)。进而测定了SEQ ID NO:94(Geflex)在人工模拟肠液中的稳定性(图22)，其降解速率比GeXIVA[1,2]慢了许多。GeXIVA[1,2]在加入人工模拟肠液的一开始，几乎是瞬间即被完全降解，而SEQ ID NO:94(Geflex)在半小时内还有约40％的多肽留存，75分钟后才被降解完全(图22)。所以，一般的多肽药物不能经过口服发挥药效，多肽经胃肠道被消化降解掉，能进入血液循环的多肽微乎其微，达不到治疗效果。该研究结果说明通过D-型氨基酸替换，的确大幅度地提高了GeXIVA的稳定性，且保持了原有的受体结合活性，这是一个提高多肽药物稳定性的有效途径。

表19：αO-芋螺毒GeXIVA[1,2]的D-型氨基酸突变体对大鼠α9α10nAChR亚型的阻断活性

表20：αO-芋螺毒GeXIVA[1,2]的D-型氨基酸突变体对人类α9α10nAChR亚型的阻断活性

SEQ ID NO:	芋螺毒素名称	半阻断剂量IC<sub>50</sub>(nM)	浓度反应曲线斜率
				1	GeXIVA[1,2]	44.19(39.45-49.51)	1.196(1.366-1.025)
88	1t-GeXIVA	45.65(39.83-52.34)	1.131(1.327-0.9338)
				89	28v-GeXIVA	48.58(43.61-54.12)	1.143(1.307-0.9799)
90	1t,28v-GeXIVA	47.54(41.06-55.05)	1.130(1.345-0.9154)
				91	Mt-GeXIVA	39.39(33.44-46.40)	1.299(1.589-1.009)
92	Mf-GeXIVA	15.62(13.52-18.05)	1.145(1.309-0.9801)
				93	GeArg-GeXIVA	36.94(31.16-43.79)	1.161(1.395-0.9271)
94	GeFlex-GeXIVA	34.34(30.19-39.06)	0.9445(1.038-0.8508)

表21：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]的D-型氨基酸突变体对大鼠其它nAChR亚型的阻断活性(半阻断剂量，IC₅₀nM)

实施例9：αO-芋螺毒素GeXIVA及其天冬氨酸(Asp，D)扫描突变体对α9α10 nAChR的阻断活性

将GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)序列中的每个非半胱氨酸分别用天冬氨酸(Asp，D)进行替换，获得天冬氨酸扫描突变体。这些突变体的编号(SEQ ID NOs:95-116)、命名和序列见表7，它们对大鼠α9α10nAChR均有不同程度的阻断活性(图23A-23B、图24A-24H，表22)。譬如，在10μM高浓度下，SEQ ID NOs:110-115对大鼠α9α10nAChR的约90％以上的电流都阻断了(图23A，表7)；在1μM浓度下，SEQ ID NOs:95-101以及SEQ ID NOs:110-115对大鼠α9α10nAChR的约60％以上、甚至是90％以上的电流都阻断了(图23B，表7)。

表22：αO-芋螺毒素GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)的部分天冬氨酸(Asp，D)扫描突变体SEQ ID NOs:95，100，110-115对大鼠α9α10nAChR亚型的阻断活性(IC₅₀)

^b该列数据是指各个多肽针对大鼠α9α10nAChR亚型的半阻断剂量(IC₅₀)与25号多肽的半阻断剂量(IC₅₀)之间的比值。

GeXIVA[1,4](SEQ ID NO:25)及其部分天冬氨酸扫描突变体(表7；SEQ ID NOs:95，100，110-115)对大鼠α9α10nAChR的浓度反应曲线如图24所示，它们的IC₅₀等列于表22中，其IC₅₀范围在27－590nM之间。有的突变体与野生型GeXIVA[1,4]的活性相似(表22)，如SEQ ID NO:95(图24A)和SEQ ID NO:115(图24H)。有的突变体比野生型GeXIVA[1,4]的活性明显减弱(表22)，如SEQ ID NO:100(图24B)和SEQ ID NOs:111-112(图24D-24E)。有的突变体比野生型GeXIVA[1,4]的活性轻微减弱(表22)，如SEQ ID NO:110(图24C)和SEQ ID NOs:113-114(图24F-24G)。其余突变体对α9α10nAChR都有活性，与野生型GeXIVA[1,4]的活性相比差异不是特别大。

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28中国发明专利申请，发明人：罗素兰，长孙东亭，吴勇，朱晓鹏，胡远艳，J.Michael McIntosh。申请人：海南大学。专利名称：αO-超家族芋螺毒素肽、其药物组合物及用途。申请号：201210197589.X；申请日：2012-06-15.

29 PCT申请，发明人：罗素兰，长孙东亭，吴勇，朱晓鹏，胡远艳，J.MichaelMcIntosh。申请人：海南大学。专利名称：αO-超家族芋螺毒素肽、其药物组合物及用途。国际申请号：PCT/CN2013/076967；申请日：2013-6-8.

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尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 海南大学

<120> αO-芋螺毒素肽GeXIVA新突变体、其药物组合物及用途

<130> IDC190049

<160> 117

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> GeXIVA[1,2]

<400> 1

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 2

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [T1A]GeXIVA[1,2]

<400> 2

Ala Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 3

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R3A]GeXIVA[1,2]

<400> 3

Thr Cys Ala Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 4

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [S4A]GeXIVA[1,2]

<400> 4

Thr Cys Arg Ala Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 5

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [S5A]GeXIVA[1,2]

<400> 5

Thr Cys Arg Ser Ala Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 6

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [G6A]GeXIVA[1,2]

<400> 6

Thr Cys Arg Ser Ser Ala Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 7

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R7A]GeXIVA[1,2]

<400> 7

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Ala Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 8

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [Y8A]GeXIVA[1,2]

<400> 8

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Ala Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 9

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R10A]GeXIVA[1,2]

<400> 9

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Ala Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 10

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [S11A]GeXIVA[1,2]

<400> 10

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ala Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 11

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [P12A]GeXIVA[1,2]

<400> 11

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Ala Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 12

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [Y13A]GeXIVA[1,2]

<400> 12

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Ala Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 13

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [D14A]GeXIVA[1,2]

<400> 13

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Ala Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 14

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R15A]GeXIVA[1,2]

<400> 14

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Ala Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 15

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R16A]GeXIVA[1,2]

<400> 15

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Ala

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 16

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R17A]GeXIVA[1,2]

<400> 16

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Ala Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 17

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R18A]GeXIVA[1,2]

<400> 17

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Ala Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 18

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [Y19A]GeXIVA[1,2]

<400> 18

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Ala Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 19

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R21A]GeXIVA[1,2]

<400> 19

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Ala Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 20

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R22A]GeXIVA[1,2]

<400> 20

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Ala Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 21

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [I23A]GeXIVA[1,2]

<400> 21

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ala Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 22

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [T24A]GeXIVA[1,2]

<400> 22

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Ala Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 23

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [D25A]GeXIVA[1,2]

<400> 23

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Ala Ala Cys Val

20 25

<210> 24

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [V28A]GeXIVA[1,2]

<400> 24

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Ala

20 25

<210> 25

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> GeXIVA[1,4]

<400> 25

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 26

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [T1A]GeXIVA[1,4]

<400> 26

Ala Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 27

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R3A]GeXIVA[1,4]

<400> 27

Thr Cys Ala Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 28

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [S4A]GeXIVA[1,4]

<400> 28

Thr Cys Arg Ala Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 29

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [S5A]GeXIVA[1,4]

<400> 29

Thr Cys Arg Ser Ala Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 30

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [G6A]GeXIVA[1,4]

<400> 30

Thr Cys Arg Ser Ser Ala Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 31

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R7A]GeXIVA[1,4]

<400> 31

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Ala Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 32

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [Y8A]GeXIVA[1,4]

<400> 32

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Ala Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 33

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R10A]GeXIVA[1,4]

<400> 33

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Ala Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 34

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [S11A]GeXIVA[1,4]

<400> 34

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ala Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 35

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [P12A]GeXIVA[1,4]

<400> 35

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Ala Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 36

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [Y13A]GeXIVA[1,4]

<400> 36

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Ala Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 37

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [D14A]GeXIVA[1,4]

<400> 37

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Ala Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 38

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R15A]GeXIVA[1,4]

<400> 38

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Ala Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 39

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R16A]GeXIVA[1,4]

<400> 39

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Ala

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 40

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R17A]GeXIVA[1,4]

<400> 40

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Ala Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 41

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R18A]GeXIVA[1,4]

<400> 41

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Ala Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 42

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [Y19A]GeXIVA[1,4]

<400> 42

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Ala Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 43

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R21A]GeXIVA[1,4]

<400> 43

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Ala Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 44

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R22A]GeXIVA[1,4]

<400> 44

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Ala Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 45

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [I23A]GeXIVA[1,4]

<400> 45

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ala Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 46

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [T24A]GeXIVA[1,4]

<400> 46

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Ala Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 47

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [D25A]GeXIVA[1,4]

<400> 47

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Ala Ala Cys Val

20 25

<210> 48

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [V28A]GeXIVA[1,4]

<400> 48

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Ala

20 25

<210> 49

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R3A/R7A/R10A/R15A/ R16A/R17A/R18A/R21A/R22A] GeXIVA[1,2]

<400> 49

Thr Cys Ala Ser Ser Gly Ala Tyr Cys Ala Ser Pro Tyr Asp Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Tyr Cys Ala Ala Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 50

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R15A/R16A/R17A/R18A]GeXIVA[1,2]

<400> 50

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 51

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R3A/R7A/R10A]GeXIVA[1,2]

<400> 51

Thr Cys Ala Ser Ser Gly Ala Tyr Cys Ala Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 52

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R3A，R7A]GeXIVA[1,2]

<400> 52

Thr Cys Ala Ser Ser Gly Ala Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 53

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R3A，R10A]GeXIVA[1,2]

<400> 53

Thr Cys Ala Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Ala Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 54

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R7A，R10A]GeXIVA[1,2]

<400> 54

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Ala Tyr Cys Ala Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 55

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R15A，R16A]GeXIVA[1,2]

<400> 55

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Ala Ala

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 56

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R15A，R17A]GeXIVA[1,2]

<400> 56

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Ala Arg

1 5 10 15

Ala Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 57

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R15A，R18A]GeXIVA[1,2]

<400> 57

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Ala Arg

1 5 10 15

Arg Ala Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 58

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R16A，R17A]GeXIVA[1,2]

<400> 58

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Ala

1 5 10 15

Ala Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 59

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R16A，R18A]GeXIVA[1,2]

<400> 59

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Ala

1 5 10 15

Arg Ala Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 60

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R17A，R18A]GeXIVA[1,2]

<400> 60

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Ala Ala Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 61

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R21A，R22A]GeXIVA[1,2]

<400> 61

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Ala Ala Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 62

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> △6-22GeXIVA

<400> 62

Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg Arg Arg Tyr Cys Arg

1 5 10 15

Arg

<210> 63

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> △10-19GeXIVA

<400> 63

Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg Arg Arg Tyr

1 5 10

<210> 64

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> △10-19[R1A]GeXIVA

<400> 64

Ala Ser Pro Tyr Asp Arg Arg Arg Arg Tyr

1 5 10

<210> 65

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> △10-19[S2A]GeXIVA

<400> 65

Arg Ala Pro Tyr Asp Arg Arg Arg Arg Tyr

1 5 10

<210> 66

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> △10-19[P3A]GeXIVA

<400> 66

Arg Ser Ala Tyr Asp Arg Arg Arg Arg Tyr

1 5 10

<210> 67

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> △10-19[Y4A]GeXIVA

<400> 67

Arg Ser Pro Ala Asp Arg Arg Arg Arg Tyr

1 5 10

<210> 68

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> △10-19[D5A]GeXIVA

<400> 68

Arg Ser Pro Tyr Ala Arg Arg Arg Arg Tyr

1 5 10

<210> 69

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> △10-19[R6A]GeXIVA

<400> 69

Arg Ser Pro Tyr Asp Ala Arg Arg Arg Tyr

1 5 10

<210> 70

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> △10-19[R7A]GeXIVA

<400> 70

Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Ala Arg Arg Tyr

1 5 10

<210> 71

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> △10-19[R8A]GeXIVA

<400> 71

Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg Ala Arg Tyr

1 5 10

<210> 72

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> △10-19[R9A]GeXIVA

<400> 72

Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg Arg Ala Tyr

1 5 10

<210> 73

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> △10-19[Y10A]GeXIVA

<400> 73

Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg Arg Arg Ala

1 5 10

<210> 74

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> △10-19GeXIVA#

<400> 74

Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg Arg Arg Tyr

1 5 10

<210> 75

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> △10-19[D5A]GeXIVA#

<400> 75

Arg Ser Pro Tyr Ala Arg Arg Arg Arg Tyr

1 5 10

<210> 76

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [C2A,C9A]GeXIVA

<400> 76

Thr Ala Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Ala Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 77

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [C2S,C9S]GeXIVA

<400> 77

Thr Ser Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Ser Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 78

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [C20A,C27A]GeXIVA

<400> 78

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Ile Thr Asp Ala Ala Val

20 25

<210> 79

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [C20S,C27S]GeXIVA

<400> 79

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Ser Arg Arg Ile Thr Asp Ala Ser Val

20 25

<210> 80

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [C2A,C27A]GeXIVA

<400> 80

Thr Ala Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Ala Val

20 25

<210> 81

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [C2S,C27S]GeXIVA

<400> 81

Thr Ser Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Ser Val

20 25

<210> 82

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [C9A,C20A]GeXIVA

<400> 82

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Ala Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 83

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [C9S,C20S]GeXIVA

<400> 83

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Ser Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Ser Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 84

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [C2A,C9A,C20A,C27A]GeXIVA

<400> 84

Thr Ala Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Ala Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Ile Thr Asp Ala Ala Val

20 25

<210> 85

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [C2S,C9S,C20S,C27S]GeXIVA

<400> 85

Thr Ser Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Ser Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Ser Arg Arg Ile Thr Asp Ala Ser Val

20 25

<210> 86

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [C2A,C9A,C20S,C27S]GeXIVA

<400> 86

Thr Ala Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Ala Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Ser Arg Arg Ile Thr Asp Ala Ser Val

20 25

<210> 87

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [C2S,C9S,C20A,C27A]GeXIVA

<400> 87

Thr Ser Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Ser Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Ile Thr Asp Ala Ala Val

20 25

<210> 88

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 1t-GeXIVA

<400> 88

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 89

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 28v-GeXIVA

<400> 89

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 90

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 1t,28v-GeXIVA

<400> 90

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 91

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> GeMT，Mt-GeXIVA

<400> 91

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 92

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> GeMF，Mf-GeXIVA

<400> 92

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 93

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> GeArg-GeXIVA

<400> 93

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 94

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> GeFlex-GeXIVA

<400> 94

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 95

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [T1D]GeXIVA[1,4]

<400> 95

Asp Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 96

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R3D]GeXIVA[1,4]

<400> 96

Thr Cys Asp Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 97

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [S4D]GeXIVA[1,4]

<400> 97

Thr Cys Arg Asp Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 98

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [S5D]GeXIVA[1,4]

<400> 98

Thr Cys Arg Ser Asp Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 99

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [G6D]GeXIVA[1,4]

<400> 99

Thr Cys Arg Ser Ser Asp Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 100

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R7D]GeXIVA[1,4]

<400> 100

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Asp Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 101

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [Y8D]GeXIVA[1,4]

<400> 101

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Asp Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 102

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R10D]GeXIVA[1,4]

<400> 102

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Asp Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 103

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [S11D]GeXIVA[1,4]

<400> 103

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Asp Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 104

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [P12D]GeXIVA[1,4]

<400> 104

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Asp Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 105

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [Y13D]GeXIVA[1,4]

<400> 105

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 106

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R15D]GeXIVA[1,4]

<400> 106

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Asp Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 107

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R16D]GeXIVA[1,4]

<400> 107

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Asp

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 108

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R17D]GeXIVA[1,4]

<400> 108

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Asp Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 109

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R18D]GeXIVA[1,4]

<400> 109

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Asp Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 110

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [Y19D]GeXIVA[1,4]

<400> 110

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Asp Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 111

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R21D]GeXIVA[1,4]

<400> 111

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Asp Arg Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 112

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [R22D]GeXIVA[1,4]

<400> 112

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Asp Ile Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 113

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [I23D]GeXIVA[1,4]

<400> 113

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Asp Thr Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 114

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [T24D]GeXIVA[1,4]

<400> 114

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Asp Asp Ala Cys Val

20 25

<210> 115

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [A26D]GeXIVA[1,4]

<400> 115

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Asp Cys Val

20 25

<210> 116

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> [V28D]GeXIVA[1,4]

<400> 116

Thr Cys Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Ile Thr Asp Ala Cys Asp

20 25

<210> 117

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> △7-22GeXIVA

<400> 117

Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Arg Arg Arg Arg Tyr Cys Arg Arg

1 5 10 15

Claims

1.一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:75所示，并且所述多肽的羧基末端是酰胺化的。

2.一种药物组合物，其含有权利要求1所述的多肽。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的辅料。

4.权利要求1所述的多肽在制备阻断或抑制α9α10nAChR的药物中的用途。

5.权利要求1所述的多肽在制备治疗或预防神经系统疾病或癌症的药物中的用途，其中，

所述神经系统疾病为选自神经痛、帕金森症、痴呆、精神分裂症和抑郁中的至少一种；

所述癌症为选自乳腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、白血病和神经细胞瘤中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述神经痛为慢性痛。

7.根据权利要求5所述的用途，其中，所述神经痛选自如下的至少一种：坐骨神经痛、三叉神经痛、淋巴神经痛、多点运动神经痛、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛以及复合神经痛。

8.根据权利要求5所述的用途，其中，所述神经痛由选自如下因素中的至少一种导致：癌症、癌症化疗、酒精中毒、糖尿病、硬化症、带状疱疹、机械伤、手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、骨髓瘤、慢性先天性感觉神经病、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎和过敏症。

9.权利要求1所述的多肽在制备镇痛的药物中的用途。

10.一种在体外阻断或抑制α9α10nAChR或者下调乙酰胆碱水平的方法，包括施加给细胞有效量的权利要求1所述的多肽的步骤。