CN114470865B - 简便快捷分离温敏性聚合物及其连接体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种简便快捷分离温敏性聚合物及其连接体的方法，所述连接体包括偶联物和目标物；所述偶联物为与温敏聚合物共价或非共价偶联并能识别、结合或吸附目标物的物质；所述目标物为待分离的目标物质。该方法包括以下步骤：先将含有温敏聚合物及其连接体的水溶液在高于聚合物临界相变温度条件下加热一定时间，再根据所述目标物及其水溶液中其他溶质的尺寸和耐有机溶剂性能，选择萃取分离或膜过滤分离的分离方式进行固液分离，得到分离后的温敏聚合物及其连接体。该方法无需借助离心机等高速离心设备，也不依赖操作人员掌握复杂的仪器操作技巧，适用于现场及即时检测等场景，具有操作简便、快捷、分离效果好等优势。

Description

简便快捷分离温敏性聚合物及其连接体的方法

技术领域

本发明属于高分子科学和生物分离技术领域，具体涉及一种简便快捷分离温敏性聚合物及其连接体的方法。

背景技术

温敏性聚合物是一类具有温度响应性质的聚合物，其中最具代表性的是聚N-异丙基丙烯酰胺(Poly(N-Isopropylacrylamide)，PNIPAM)，PNIPAM溶液的低临界相转变温度(Lower Critical Solution Temperature，LCST)为32℃，高于该温度时，聚合物分子链会发生线团-球体转变(Coil-to-globule transition)，并从水溶液中析出。由于PNIPAM对温度变化的响应速度快，且相转变温度与人体体温接近，结构简单，易于功能化，在智能驱动器、生物传感、药物递送、组织工程等领域具有良好的应用前景(L.Tang et al,Prog.Mater.Sci.2021,115,100702)。同时，基于其相变特性，PNIPAM也被广泛应用于生物分离分析(B.Gomes et al,Nat Rev Chem.2018,2,0120)。

然而，目前温敏性聚合物连接体分离时都需要使用高速离心机，不仅给现场检测和即时检测带来不变，并且高速离心还会对某些生物样品造成不可逆的损害。因此，亟待研发能够简便快速分离温敏性聚合物及其连接体的新方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种无需借助高速离心设备实现温敏性聚合物及其连接体分离的方法，该方法操作简便、快捷，且分离效果好。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种简便快捷分离温敏性聚合物及其连接体的方法，所述连接体包括偶联物和目标物；所述偶联物为与温敏聚合物共价或非共价偶联并能识别、结合或吸附目标物的物质；所述目标物为待分离的目标物质；该方法包括以下步骤：

先将含有温敏聚合物及其连接体的水溶液在高于所述温敏聚合物的临界相变温度条件下加热一定时间，获得第一产物；再根据所述目标物及所述水溶液中其他溶质的尺寸和耐有机溶剂性能，选择萃取分离或膜过滤分离的分离方式对所述第一产物进行固液分离，得到分离后的温敏聚合物及其连接体。

在本发明中，充分利用了温敏聚合物对温度变化的响应速度快、高于临界相变温度下从水溶液中析出的特性，再借助萃取分离或膜过滤分离的方式，进行固液分离，即得到分离后的温敏聚合物及其连接体。该方法能够在不使用离心机的条件下，将温敏聚合物、偶联物以及待分离的目标分子从其水溶液中进行快速分离，操作简便，满足现场检测、即时检测，特别是少量或单个样品快速检测的需求。

在本发明中，所述的分离是指利用聚合物及偶联物将待分离的目标物从溶液或其他介质(如血清等)中分离富集的过程，分离得到的温敏聚合物及其连接体是指聚合物-偶联物-目标物的整体。

所述偶联物包括适配体核酸、单链核酸、地高辛受体、亲和素/链霉亲和素、一抗、酶等；

所述目标物包括适配体对应的靶标、互补序列核酸、地高辛标记分子、生物素化核酸或蛋白质、二抗、底物分子等。

所述根据所述目标物及所述水溶液中其他溶质的尺寸和耐有机溶剂性能，选择萃取分离或膜过滤分离进行固液分离，包括：

当所述目标物及所述水溶液中其他溶质的直径小于或等于0.2μm且耐有机溶剂性能好，选择萃取分离或膜过滤分离中的任意一种；

当所述目标物及所述水溶液中其他溶质的直径大于0.2μm且耐有机溶剂性能好，选择萃取分离；

当所述目标物及所述水溶液中其他溶质的直径小于或等于0.2μm，但不耐有机溶剂，选择膜过滤分离。

在本发明中，为了实现更好的分离效果，进一步的将目标物及其水溶液中其他溶质的尺寸和耐有机溶剂性能作为判断因素，对于目标物及其水溶液中其他溶质直径较小且耐有机溶剂性能好的情况，提供了萃取分离和膜过滤分离两种可选的分离方式，分离操作更具选择性，可根据现场情况灵活调整；而对于耐有机溶剂性能好的目标物及其水溶液，优选萃取分离的方式；对于不耐有机溶剂且直径较小的目标物及其水溶液，优选膜过滤分离的方式。上述分离方法不仅可以应用于纯水体系或缓冲溶液，也适用于大部分生理液体(如尿液、血液)，可对常见的靶标分子(如糖类、核酸、蛋白等)进行有效的分离富集，具有成本低、灵敏度高、分离速度快等优势。

进一步的，所述耐有机溶剂性能好是指目标物及其水溶液中其他溶质能够在一定时间内(不低于10min)与有机溶剂接触且不会发生理化反应；所述目标物及其水溶液中其他溶质的直径以0.2μm为判断标准。

进一步的，当选择萃取分离时，所述方法包括以下步骤：

A1、将含有温敏聚合物及其连接体的水溶液在高于所述温敏聚合物的临界相变温度条件下加热一定时间，获得第一产物；

A2、将有机溶剂加入所述第一产物中，震荡至有聚合物团块析出，得到第二产物；

A3、弃去所述第二产物中的液体或取出第二产物中的固体，得到分离后的温敏聚合物及其连接体。

本发明所采取的萃取分离方法，对传统的萃取方法进行了改进，并结合温敏聚合物在相变温度上下表现的宏观性质，当处于临界温度之上时，聚合物链坍缩析出，外层倾向于与疏水溶剂亲和但不至于溶解，故分散于水相的悬浮状聚合物在震荡后会团聚在两相之间。只需弃去第二产物中的液体或取出第二产物中的固体，即可得到分离后的温敏聚合物及其连接体，操作简便快捷。

进一步的，所述步骤A2中，有机溶剂与水溶液体积比为1:2～1:1；有机溶剂选自环己烷、四氯化碳、氯仿、二氯甲烷中的任意一种。

在本发明中，有机溶剂的加入量会影响震荡后的分离效果，当有机溶剂过多或过少时，都不易与水溶液充分震荡混匀。优选地，有机溶剂与水溶液体积比为1:2～1:1，在该范围内，有机溶剂能够与析出的聚合物更充分的接触并通过疏水作用将其结合再一起并悬浮于两相之间。进一步的，所述震荡操作可以采取上下摇晃的方式进行，震荡时间控制在5～10s。

进一步的，所述萃取分离还包括：

A4、将所述分离后的温敏聚合物及其连接体溶解于缓冲液中进行洗涤；

A5、重复步骤A1-A4多次，收集含有所述目标物的溶液。

上述操作能够去除物理吸附在聚合物表面的杂质分子。优选地，重复上次操作两次。

在本发明中，当选择膜过滤分离时，所述方法包括以下步骤：

B1、将含有温敏聚合物及其连接体的水溶液在高于所述温敏聚合物的临界相变温度条件下加热一定时间，获得第一产物；

B2、将所述第一产物迅速转移至注射器式微孔滤膜过滤器中进行过滤，得到分离后的温敏聚合物及其连接体。

本发明采取的膜过滤分离方法，结合温敏聚合物相变过程的可逆性以及温敏聚合物及其连接体的直径特点，对传统的膜分离过滤方法进行了改进，利用滤膜截留无法通过滤膜孔径的析出的固体物质，即可实现快速分离。当目标物及其水溶液耐有机溶剂性能差时，如血清样品，利用上述萃取分离方式进行固液分离时，由于血清中蛋白等物质丰富，容易出现乳化现象导致聚合物无法悬浮分离，而基于本发明提供的膜过滤分离即可解决上述问题，并获得很好的分离效果。其中，迅速转移是指在10s之内进行转移，以避免第一产物发生溶解。

进一步的，所述步骤B2中，注射器式微孔滤膜过滤器的膜孔径为0.22μm。该尺寸为市售微孔滤膜的常见尺寸，实验材料获取方便，且与聚合物相变后的粒径相匹配。

进一步的，所述膜过滤分离还包括：

B3、向所述分离后的温敏聚合物及其连接体中加入缓冲液，使其溶解；

B4、重复步骤B1-B3多次，收集含有所述目标物的溶液。

上述操作能够去除物理吸附在聚合物表面的杂质分子。优选地，重复上次操作两次。特别地，对于本发明的膜过滤分离的方式，上述洗脱步骤能够根据温度的变化，使聚合物及其连接体多次析出、复溶，由于析出时固体的尺寸和溶解时液态的尺寸存在很大差异，先利用微孔滤膜进行截留，再于冷却状态下溶解过滤，能够极大地减少聚合物及其连接体在过滤容器中的残留。

进一步的，本发明所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tri-HCl缓冲液、HEPES缓冲液等生化实验常用缓冲液体。优选地，所述缓冲液的温度为0～25℃。

在本发明中，所述温敏聚合物选自聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙烯基己内酰胺、聚甲基乙烯基醚、聚噁唑啉中的任意一种。所述温敏聚合物的临界相变温度为T₁，所述加热的温度为T₂，T₁+5≤T₂≤T₁+25。在该温度范围内，聚合物既能快速析出，又不至于温度过高造成对目标物结构和功能的损伤。

进一步的，所述加热的时间为20～40s。优选地，所述加热的时间为30s，即可发挥温敏聚合物的特性，使其从水溶液中析出。结合本发明后续的萃取分离或膜过滤分离，可将单次分离时间控制在1.5min以内。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的分离温敏性聚合物及其连接体的方法，不需要借助离心机等高速离心设备，减少了分离过程对设备的依赖性，也不需要依赖于操作人员无需掌握复杂的仪器操作技巧，适用于现场及即时检测等场景。

(2)采用本发明提供的方法进行温敏聚合物及其连接体的分离，每个样品的单次分离时间仅需1～2分钟，且能够获得更好的分离效果；该方法涉及的试剂及耗材可重复使用，且有机溶剂或过滤器均为实验室常见物品，容易获得且成本较低，特别适用于单个或少量样品的分离处理。

(3)本发明提供的分离温敏聚合物及其连接体的方法，与高速离心分离法相比，能够避免高速离心过程对生物样品造成的不可逆损害，还能够避免分离过程对样品活性、生物大分子间的结合作用以及生物标记物造成的不利影响。

(4)本发明提供的分离方法不仅可以应用于纯水体系或缓冲溶液，也适用于大部分生理液体(如尿液、血液)，可对常见的靶标分子(如糖类、核酸、蛋白等)进行有效的分离富集，具有成本低、灵敏度高、分离速度快等优势。

附图说明

图1为本发明实施例提供的分离温敏性聚合物及其连接体的方法的原理图；

图2为本发明实施例1实际操作过程中的照片；

图3为本发明实施例1-3所使用的PNIPAM-SA的差式扫描量热(DSC)图；

图4为本发明实施例1-3所使用的PNIPAM-SA的透射电镜(TEM)图。

图5为本发明实施例1-3与对比例1分离聚合物及其连接体的效果对比图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

实施例1

采取萃取分离法利用环己烷分离缓冲液中的单链核酸

1)向2mL离心管中加入50μL连接了链霉亲和素(Streptavidin,SA)的温敏性聚合物(PNIPAM-SA)，再分别加入0.4、1.0、2.0、4.0nM的3’端修饰生物素(Biotin)、5’端修饰6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein,FAM)及碱基序列为AAAAAAAAAAAAAAAAAA的单链DNA(BF-DNA)，加入pH为7.4的磷酸盐缓冲至500μL，用旋涡混合仪使其充分混匀，常温下反应5分钟。

2)将离心管置于40℃水浴锅内30秒，并向离心管中加入300μL环己烷，摇晃震荡5秒，使两相充分接触，待相界面上方的环己烷乳化产生的气泡消散后，可观察到原本呈悬浊液的聚合物水溶液凝聚成团并悬浮于两相之间，此时用2mL的注射器针头挑出聚合物团块，放入事先备好的500μL冷的磷酸盐缓冲液中，或者直接吸出所有液体，向聚合物团块中加入500μL冷的磷酸盐缓冲液，重新溶解，收集环己烷以便循环备用。重复以上操作两次以便除去杂质。

3)对最终的产物进行荧光光谱分析，以485nm激发，在520nm处测得最大发射值，其荧光强度值记为E1、E2、E3、E4，并记录原始荧光强度值O1、O2、O3、O4。每个数据皆重复三次以减小随机误差。

参见图2，本实施例步骤2)中，水浴加热后得到的第一产物呈浑浊状态；当加入环己烷后，呈现明显的分层，其上层为环己烷，下层浑浊状态的为含有聚合物及其连接体的水溶液；经震荡摇晃后，聚合物聚集成团块，悬浮于两相之间，水相再次澄清；吸出离心管内液体，得到聚合物团块(即得到分离后的聚合物及其连接体)。

经不同实验人员多次测量统计，排除反应时间，单个样品单次分离用时在1分钟以内。

实施例2

采取萃取分离法利用四氯化碳分离缓冲液中的单链核酸：

本实施例除步骤2)中所用溶剂为四氯化碳外，其余操作与实施例1相同。

本实施例经不同实验人员多次测量统计，排除反应时间，单个样品单次分离用时在1分钟以内。

实施例3

采取膜过滤分离法分离缓冲液中的单链核酸

本实施例步骤1)和3)与实施例1相同。

2)将离心管置于40℃水浴锅内30秒，此时聚合物完全析出，迅速转移至2mL的事先已套有直径13mm、孔径0.22μm的针筒式微孔滤膜过滤器(天津津腾试验设备有限公司生产)的注射器内，左手按住过滤器防止脱出，右手推动注射器活塞使液体滤出，过滤后聚合物截留在滤膜上。加入100μL冷的磷酸盐缓冲液，慢慢推动活塞重新溶解聚合物及其连接体，再分两次各加入200μL冷的磷酸盐缓冲液使聚合物及其连接体充分溶解，收集溶解液。

本实施例经不同实验人员多次测量统计，排除反应时间，单个样品单次分离用时在1分半以内。

实施例4

采用膜过滤分离法分离血清样品中的二抗蛋白

本实施例步骤2)与实施例相同。

1)向2mL离心管中加入50μL连接了人免疫球蛋白G(human IgG)的温敏性聚合物(PNIPAM-IgG)，再分别加入20、50、80、100ng/mL异硫氰酸荧光素标记的兔抗人免疫球蛋白G(FITC-rabbit-anti-human IgG)，加入10倍稀释的血清至500μL，用旋涡混合仪使其充分混匀，常温下反应5分钟。

本实施例经不同实验人员多次测量统计，排除反应时间，单个样品单次分离用时在1分半以内。

对比例1

采用离心法分离缓冲液中的单链核酸

本对比例步骤1)和3)与实施例1相同。

2)将离心管置于40℃水浴锅内30秒，此时聚合物完全析出，迅速转移至40℃空气浴的高速离心机内，以12000rpm的转速离心2分钟，然后用2mL的注射器将液体吸出弃掉，加入500μL冷的磷酸盐缓冲液重新溶解，重复以上操作两次。最后将沉淀溶解于500μL冷的磷酸盐缓冲液中。

本对比例经不同实验人员多次测量统计，排除反应时间与离心机参数设定时间，单个样品单次分离用时在3分钟左右。

对比例2

采用离心法分离血清中的二抗蛋白

本对比例步骤1)与实施例4相同，步骤2)与对比例1相同。

本对比例经不同实验人员多次测量统计，排除反应时间与离心机参数设定时间，单个样品单次分离用时在3分钟左右。

将实施例1-3与对比例1所使用的聚合物连接体PNIPAM-SA采用差式扫描量热仪，测得其相变温度如图3所示为32.5℃，与文献报道一致。经透射电镜表征，如图4所示，a为真空冻干后拍摄的透射电镜图，其粒径约为10nm，b为45℃烘箱内烘干后拍摄的透射电镜图，其粒径约为50nm，且更加聚集，聚集态粒径普遍大于200nm，为滤膜分离法创造了条件。

对实施例1-3与对比例1所得产物的荧光强度与目标物浓度作图，并进行线性拟合得到图5。荧光强度越高，分离得到的目标物浓度就越大，并且拟合直线斜率越大，分离效果也就越好。由图5可知，四种方法的分离率：四氯化碳萃取＞环己烷萃取＞滤膜过滤＞离心。

对实施例4和对比例2同等目标物投入量下所得产物的荧光强度进行比较，膜过滤分离法可分离出更多的目标蛋白质，且更为简便快捷。

综上，本发明提供的分离温敏性聚合物及其连接体的方法，与传统的高速离心方法相比，在不借助离心设备的前提下，不仅分离耗时更短(仅需1～2分钟)，而且分离效率更高，在生物分离分析领域有着极大的应用潜力与价值。

以上仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种简便快捷分离温敏性聚合物及其连接体的方法，所述连接体包括偶联物和目标物，所述偶联物为与温敏聚合物共价或非共价偶联并能识别、结合或吸附目标物的物质，所述目标物为待分离的目标物质；其特征在于，

先将含有温敏聚合物及其连接体的水溶液在高于所述温敏聚合物的临界相变温度条件下加热一定时间，获得第一产物；再根据所述目标物及所述水溶液中其他溶质的耐有机溶剂性能，进行固液分离，得到分离后的温敏聚合物及其连接体；

所述目标物及所述水溶液中其他溶质耐有机溶剂性能好；

所述方法包括以下步骤：

A1、将含有温敏聚合物及其连接体的水溶液在高于所述温敏聚合物的临界相变温度条件下加热一定时间，获得第一产物；

A2、将有机溶剂加入所述第一产物中，震荡至有聚合物团块析出，得到第二产物；

A3、弃去所述第二产物中的液体或取出第二产物中的固体，得到分离后的温敏聚合物及其连接体；

所述有机溶剂与所述水溶液体积比为1:2~1:1；

所述有机溶剂选自环己烷、四氯化碳、氯仿、二氯甲烷中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

A4、将所述分离后的温敏聚合物及其连接体溶解于缓冲液中进行洗涤；

A5、重复步骤A1-A4多次，收集含有所述目标物的溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述温敏聚合物选自聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙烯基己内酰胺、聚甲基乙烯基醚、聚噁唑啉中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述温敏聚合物的临界相变温度为T₁，所述加热的温度为T₂，T₁+5≤T₂≤T₁+25；所述加热的时间为20~40s。

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