CN114470224A - 一种酸敏性多肽脂质体、制备方法及其在mRNA药物递送中的应用 - Google Patents

一种酸敏性多肽脂质体、制备方法及其在mRNA药物递送中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114470224A
CN114470224A CN202210079591.0A CN202210079591A CN114470224A CN 114470224 A CN114470224 A CN 114470224A CN 202210079591 A CN202210079591 A CN 202210079591A CN 114470224 A CN114470224 A CN 114470224A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acid
liposome
sensitive
polypeptide
sensitive polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210079591.0A
Other languages
English (en)
Inventor
王宇恩
张凌云
戴政清
马亚平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Shenchuang Biopharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Shenchuang Biopharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Shenchuang Biopharmaceutical Co ltd filed Critical Shenzhen Shenchuang Biopharmaceutical Co ltd
Priority to CN202210079591.0A priority Critical patent/CN114470224A/zh
Publication of CN114470224A publication Critical patent/CN114470224A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

一种酸敏性多肽脂质体、制备方法及其在mRNA药物递送中的应用，属于药物载体技术领域。本发明酸敏性多肽脂质体是通过靶向型pH敏感性多肽借助酸感性化学键连接修饰聚乙二醇化的脂质体得到的。所述靶向型pH敏感性多肽为对多肽的C‑末端经过RGD环肽修饰后的片段，所述多肽包括TAT、H7R8或AibCys。本发明还提供了一种抗肿瘤药物复合体包括酸敏性多肽脂质体及其包裹的mRNA抗肿瘤药物。本发明提供一种靶向型pH敏感性多肽脂质体可实现对mRNA等药剂的静电包裹，进而实现mRNA等药剂的细胞内靶向运输。利用靶向型pH敏感性多肽脂质体运输mRNA等药剂实现对癌症的治疗，增强了肿瘤细胞对脂质体的细胞摄取。

Description

一种酸敏性多肽脂质体、制备方法及其在mRNA药物递送中的 应用
技术领域
本发明属于药物载体技术领域，具体涉及一种酸敏性多肽脂质体、制备方法及其在mRNA药物递送中的应用。
背景技术
癌症是目前造成人类死亡的第一大杀手，失衡的机体不断选择对肿瘤细胞有利的连续遗传变化逐步使得原有的癌基因和抑癌基因之间的平衡被打破，最终形成癌症。癌症相关的基因功能变化通常是由DNA序列的扰动(例如染色体易位，缺失或插入，扩增和单核苷酸突变)或表观基因组修饰引起的。近十几年大量RNA研究结果发现，前体mRNA(pre-mRNA)的异常加工也会引发癌症并推动肿瘤的发展。前体mRNA的加工，包括通过剪接去除内含子和通过切割和聚腺苷酸化形成3'末端，这些在肿瘤发生发展的过程中经常发生变化。
mRNA药物已成为目前肿瘤治疗非常有效的一种手段，简单来讲就是利用化学修饰后的mRNA分子进入细胞质中，利用细胞质内的自有核苷酸进行转录表达，生成机体所需要的蛋白质。mRNA药物开发的主要技术门槛在于稳定性和递送，若相关难点能够得以解决，mRNA药物就可作为蛋白质补充或替代疗法治疗相关疾病。
脂质体作为一种新型给药系统，具有组织相容性，细胞亲和性，靶向性和缓释性等优点，可包载水溶性和脂溶性药物，由于药物以非共价键结合的方式被包裹，有利于药物的释放，且制备工艺简单适合大量生产。然而脂质体也有一些缺点，如低溶解、物理化学稳定性差、出现药物渗漏等。
环境敏感性脂质体是一种智能的药物递送系统，主要通过外界或自身内环境刺激下，产生某种物理或化学性质变化，从而将药物分子以一种可控的方式从脂质体内释放出来。常见的环境敏感性脂质体包括温敏脂质体、光敏脂质体、声敏脂质体、磁敏脂质体、还原敏感脂质体、pH敏感脂质体等。pH敏感脂质体通常使用具有pH敏感性的生物高分子材料或具有pH敏感性的磷脂材料制备。pH敏感脂质体可以包载脂溶性药物和水溶性药物，还可以包载蛋白类药物和基因类药物，它可以降低对正常细胞毒性的同时提高药物靶向性，从而提高治疗效果。pH敏感脂质体设计原理在于：肿瘤间质的pH为6.5，低于正常组织间质的pH(pH为7.4)，而pH敏感脂质体进入肿瘤部位后，脂肪酸基发生质子化，导致膜聚集、融合，从而释放药物。
由于多肽链上氨基酸残基具有不同的侧链基团,因此氨基酸残基之间甚至多肽之间可以通过范德华力、静电作用、氢键及疏水作用等实现一定的二级结构或三级、四级结构。酸敏感多肽中的侧链基团(碱性氨基酸的含氮官能团)都具有质子化或去质子化的能力，这些侧链基团的表面电荷的改变可以引起残基间作用力发生改变，从而影响多肽的二级、三级结构。根据氨基酸侧链基团的不同，氨基酸可以分为3大类：酸性氨基酸、碱性氨基酸和中性氨基酸。而酸敏感多肽的侧链起作用的主要是碱性氨基酸的侧链，不同的碱性氨基酸侧链包含：胍基、氨基或咪唑基,常见的酸敏感氨基酸主要包括：含有胍基基团的精氨酸、含有咪唑基团的组氨酸、含有氨基侧链的赖氨酸。当环境pH值从中性降至酸性时，酸敏感多肽的这些残基侧链基团质子化，影响静电相互作用，从而使这些多肽具有酸敏感性。
靶向型穿膜肽(CPPs)是一类能够穿过细胞膜或组织屏障的短肽。CPPs可通过内吞和直接穿透等机制，运载所携带的蛋白质、核酸及纳米颗粒等生物大分子进入细胞内发挥其效应功能，因此成为提高药物递送效率的重要技术工具，并在生物医学研究领域具有良好的应用前景。CPPs可通过与PEG脂质体之间的化学键偶联，实现脂质体对细胞递送能力的提升。
内吞作用是脂质体进入肿瘤细胞的重要方式之一，进入细胞后，脂质体会被内体包裹，影响载药释放。要进一步发挥药效，脂质体需从内体中逃脱。将重组蛋白与阳离子多肽(如九聚精氨酸等)融合是一种将重组蛋白转入哺乳动物细胞内的方法。许多阳离子多肽具有穿透细胞的能力，这些多肽可以作为蛋白转导结构用于转运小分子药和大分子(如蛋白质)。尽管转运的具体机制还不是特别清楚，但是这些多肽自身携带的大量正电荷对穿透功能是至关重要的。可能是通过正电荷与细胞表面的阴离子分子(如硫酸肝素)的库伦作用完成的。研究表明，多肽的长度和阳离子多肽的组成对内化作用十分重要，一般认为7-9氨基酸是最优的，而且精氨酸、组氨酸优于赖氨酸。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种酸敏性多肽脂质体、制备方法及其在mRNA药物递送中的应用。本发明提供一类靶向型pH敏感性多肽脂质体在mRNA药物递送中的应用，可实现对mRNA在细胞内靶向运输。其主要特点有：1)提高mRNA的正电荷，增强他们的结合能力。2)可能会增强RNA的构象稳定性。3)可以帮助蛋白质进入细胞内。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种酸敏性多肽脂质体，其特征在于所述酸敏性多肽脂质体是通过靶向型pH敏感性多肽借助酸感性化学键连接修饰聚乙二醇化的脂质体得到的。
所述的一种酸敏性多肽脂质体，其特征在于所述靶向型pH敏感性多肽为对多肽的C-末端经过RGD环肽修饰后的片段，所述多肽包括TAT、H7R8或AibCys。
所述的一种酸敏性多肽脂质体，其特征在于所述靶向型pH敏感性多肽包括Succinic acid-YGRKKRRQRRRK-c(RGD)、Succinic acid-HHHHHHHRRRRRRRRK-c(RGD)、Succinic acid-AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHILCK-c(RGD)；
所述Succinic acid-YGRKKRRQRRRK-c(RGD)的结构式(a)为：
Figure BDA0003485360670000031
所述Succinic acid-HHHHHHHRRRRRRRRKc(RGD)的结构式(b)为：
Figure BDA0003485360670000032
所述Succinic acid-AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHILCKc(RGD)的结构式(c)为：
Figure BDA0003485360670000033
所述的一种酸敏性多肽脂质体，其特征在于所述酸感性化学键包括腙键、乙烯基醚键或原酸酯键，优选腙键；
所述腙键的结构式(d)为：
Figure BDA0003485360670000041
所述乙烯基醚键的结构式(e)为：
Figure BDA0003485360670000042
所述原酸酯键的结构式(f)为：
Figure BDA0003485360670000043
所述的一种酸敏性多肽脂质体，其特征在于所述聚乙二醇化的脂质体中聚乙二醇结构位于脂质体的外侧，并通过酸感性化学键与靶向型pH敏感性多肽相连。
任一所述的酸敏性多肽脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)合成靶向型pH敏感性多肽；
(2)将上述步骤(1)合成的靶向型pH敏感性多肽与聚乙二醇偶联，获得酸敏性多肽脂质体。
一种抗肿瘤药物复合体，其特征在于所述抗肿瘤药物复合体包括所述的酸敏性多肽脂质体及其包裹的抗肿瘤药物。
任一所述的酸敏性多肽脂质体在制备抗肿瘤药物中的用途。
任一所述的酸敏性多肽脂质体在包裹mRNA并在体内靶向运输中的应用。
任一所述的酸敏性多肽脂质体在包裹mRNA并在体内靶向运输的应用方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取酸敏性多肽脂质体与mRNA置于高糖培养基或磷酸盐缓冲液中稀释，混匀，室温下静置，获得靶向型多肽脂质体培养液；
(2)选取细胞膜表面富含靶向基团受体的细胞系，加入上述步骤(1)得到的靶向型多肽脂质体培养液，4h后将靶向型多肽脂质体培养液更换为正常细胞生长液，提取细胞内RNA采用定量RT-PCR对mRNA的表达量进行测定；
(3)通过酸敏性多肽脂质体运输的mRNA刺激细胞内的荧光素酶信号变化，判断生物活性。
本发明酸敏性多肽脂质体的结构如图1所示，其中Peptide可以是TAT、H7R8、AibCys等这一类多肽，Link可以是包含酸感性化学键的小分子化合物。
本发明选用聚乙二醇化的脂质体具有长循环特性，但该保护链的存在限制了肿瘤细胞对脂质体的后期摄取。当PEG修饰脂质体通过被动或主动策略安全到达肿瘤部位后，周围酸性微环境水解脂质体表面的酸感性化学键，剥离保护的聚乙二醇，可实现肿瘤细胞对脂质体的高效吸收。腙(hydrazone，HZ)是肼与醛或酮缩合产生的一类化合物，其C＝N键具有酸性易水解特性。本发明合成了一种pH敏感性脂材，将聚乙二醇通过腙键与靶向型pH敏感性多肽TAT/H7R8/AibCys连接(PEG-HZ-TAT、PEG-HZ-H7R8、PEG-HZ-AibCys)。当脂质体通过EPR效应被动靶向到肿瘤细胞后，腙键由于酸性pH而发生水解，使PEG脱离脂质体表面，增强了肿瘤细胞对脂质体的细胞摄取。酸性环境随后导致脂质体结构被破坏，引起脂质体的裂解，进而释放包封药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种靶向型pH敏感性多肽脂质体可实现对mRNA等药剂的静电包裹，进而实现mRNA等药剂的细胞内靶向运输。利用靶向型pH敏感性多肽脂质体运输mRNA等药剂实现对癌症的治疗。基于化学键断裂的药物释放，具有稳定性高，释放速度快等优点，增强了肿瘤细胞对脂质体的细胞摄取。
附图说明
图1为本发明酸敏性多肽脂质体的结构；
图2为靶向型pH敏感性多肽TAT高效液相色谱结果；
图3为靶向型pH敏感性多肽TAT质谱结果；
图4为TAT活性联氨中间体合成路线图；
图5为PEGB(PEG活性中间体)合成路线图；
图6为PEG-HZ-TAT的结构；
图7为PEG-HZ-TAT合成路线图；
图8为PEG-HZ-TAT对IL-15mRNA的包裹动态散射图；
图9为PEG-HZ-TAT对IL-15mRNA的包裹ZETA电势分析图；
图10为U87MG细胞荧光素酶实验结果图；
图11为结肠组织和结肠肿瘤组织的质量和体积比较图。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：靶向型pH敏感性多肽TAT的合成
1、称取1mmol(3.33g)Fmoc-Asp-OtBu-2-Chlorotrityl chloride resin(Sub＝0.30mmol/g)于反应柱中，用DMF清洗3次，再用DMF溶胀30分钟。然后用DBLK脱除Fmoc保护基团，然后用DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH 1.87克(5mmol)，HOBt 0.81克(6mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入1.15克DIC(9mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用DBLK脱除Fmoc保护基团。重复上述操作，按照序列偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Alloc-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Mono-tert-butyl succinate。反应结束后，用DMF、DCM、甲醇依次清洗，干燥后得到肽树脂。
2、将1中得到的全保护肽树脂，用DCM清洗3次，称取1.72克的苯硅烷，量取50mL的DCM，加入反应柱中，反应5分钟之后，加入0.45克的Pd0(Ph3P)4，反应1小时。然后用DCM清洗3次树脂，用DMF溶液清洗肽树脂30分钟，DMF清洗树脂3次，再用DCM清洗树脂3次，得到选择性脱除Lys主链氨基保护基Oall的肽树脂。
3、将2中得到的肽树脂，加入20％三氟乙醇/二氯甲烷的溶液(50mL)反应2小时后，将树脂过滤，滤液加入到600mL无水乙醚中析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥得到白色固体。
4、将3中得到白色固体用二氯甲烷溶解后，称取HOAt 1.36克(10mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入1.89克DIC(15mmol)，加入肽树脂，反应2小时，反应结束后，旋蒸干后，用无水乙醚重结晶3次，析出的白色固体经真空干燥后用于下一步。
5、将4得到白色固体加入到100mL单口烧瓶中，预先配制50mL裂解液，TFA：TIS：EDT：PhOH：H2O＝90:3:3:2:2(体积比)，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2小时后，加入到500mL无水乙醚中析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥的到白色固体为产品靶向型pH敏感性多肽TAT。本发明酸敏性多肽脂质体的结构如图1。如图2和3所示，产品靶向型pH敏感性多肽TAT总收率20.88％，产品纯度为：95.22％；质谱测试其分子量为：2096.16，与实际分子量(2096.21)一致。
实施例2：靶向型pH敏感性多肽TAT和PEG的偶联
1、TAT(0.5mmol)溶解在20mL二氯甲烷中，加0.5mL亚硫酰氯在室温下反应2小时，真空旋蒸得到油性产品，再加入50mL苯进行重结晶，在减压条件下，苯被去除，残渣溶解于20mL二氯甲烷。将上述溶液置于冰浴中，加入水合肼(0.3mL)搅拌反应1小时，反应液浓缩、减压干燥得到油状固体，油状固体再用二氯甲烷溶解过滤，滤液减压浓缩干燥后得到白色固体(TAT活性联氨中间体)，总收率为50％。反应过程如图4。
2、将PEG2000(1mmol)加入20mL二氯甲烷中溶解，称取4-羧基苯甲醛(10mmol)、DCC(10mmol)，DMAP(2.5mmol)常温搅拌反应24小时，得到反应混合物，过滤后得到固体产物，用异丙醇、乙醚重结晶，再真空干燥得到淡黄色粉末(PEGB)，产率80％。反应过程如图5。
3、取2mL氯仿溶解0.06mmol的PEGB和TAT-1活性联氨中间体(0.09mmol)，置于密闭的反应容器中，常温过夜搅拌反应(24小时)，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，用纯化水溶解后调节pH至7.4，用Sephadex G-25柱层析，收集浑浊的该组份溶液，溶液合并后于-80℃下冷冻干燥24小时得到靶向型pH敏感性多肽TAT和PEG的偶联物(PEG-HZ-TAT)，其结构如图6所示，反应过程如图7所示。
实施例3：PEG-HZ-TAT脂质体对mRNA的包裹及运输效果测试
1、PEG-HZ-TAT对IL-15mRNA的包裹
取100pmol IL-15mRNA溶解于100μLDMEM中，后将1，3，5，7，9μL(浓度10mmol/mL)PEG-HZ-TAT分别加入到DMEM中，得到五组不同摩尔比的混合液，将混合液置于室温中放置60分钟。
2、凝胶电泳分析
配制2％琼脂糖凝胶，分别取上述混合液进行电泳分析，并用溴化乙锭对IL-15mRNA进行显色。当PEG-HZ-TAT的摩尔比逐渐升高时，IL-15mRNA与之结合也在增加。利用动态光散射和ZETA电势分析仪对其进行分析，如图8所示证明了随着PEG-HZ-TAT的摩尔比逐渐升高时纳米尺寸的颗粒也在逐渐形成，电位也在逐渐变为正电性(图9)。透射电镜图表明当摩尔比为30:1时，两者形成了均一分散的纳米颗粒，直径大约为500nm。
3、靶向细胞内运输
将U87MG细胞种入24孔板中，12小时后，将含40pmol IL-15mRNA的混合液加入到细胞培养基中，2小时后将细胞培养液换成含2％FBS，1％PS的高糖DMEM培养液继续培养12小时后，用TRIZOL提取细胞内RNA。实时荧光定量PCR结果显示PEG-HZ-TAT摩尔比逐渐升高时进入细胞的IL-15mRNA的量也在逐渐增加，当摩尔比达到30:1时基本可以达到饱和。
取不含RGD受体的293T细胞作为对照，进行上述相同实验。在293T细胞中没有观察到类似的结果，表明该方法可以实现IL-15mRNA的靶向运输。
4、荧光素酶实验
荧光素酶实验是以荧光素(luciferin)为底物来检测待测基因活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。
使用HindIII和Spel(I Takara)内切酶剪切Luciferase报告质粒(Promega)的3’UTR端，将得到的片断进行电泳分离纯化。IL-15mRNA的互补序列分别通过DNA连接酶，T4ligase(Takara)，插入到纯化得到的luciferase报告质粒中，并转化到感受态大肠杆菌内，再通过含有氨苄的筛选平板筛选得到可能的阳性质粒。最终将该质粒进行测序确认。
将报告基因质粒共转染进入U87MG细胞中，共转染时，由于内参具有很强的启动子，因此报告基因质粒：内参转染量一般为10:1～50:1。
共转染完成后，先将细胞种到24孔板中，当细胞密度达到70％-80％时，将0.25μgIL-15mRNA报告质粒和0.15μgβ-galactosidase内参质粒用Lipo-2000fectamine试剂转染进细胞，转染操作遵循Invitrogen产品说明。在转染4小时后，将20pmol IL-15mRNA用靶向型PEG-HZ-TAT多肽脂质体运输到细胞中。2小时后，将细胞培液换成含2％FBS，1％PS的高糖DMEM培养液继续培养48小时后，测定luciferase和β-galactosidase内参信号。
数据处理：首先计算出每管的luciferase/β-galactosidase的比值，再以control组的比值为单位1，即可得到不同处理组的相对luciferase活性，如图10所示结果表明以靶向型PEG-HZ-TAT多肽脂质体运输的IL-15mRNA在进入细胞后仍然具有生物学功能。
实施例4：PEG-HZ-TAT包裹IL-15mRNA脂质体对抗结肠肿瘤生长试验
用BalB/c小鼠(5-8周龄)建立结肠癌模型。将体外培养的C26结肠癌细胞用胰蛋白酶消化，并定容在无血清、无抗生素的DMEM培养基中，在每只小鼠的静脉接种3×105个细胞，细胞接种4天后，按以下进行随机分组治疗(每组5只)：
A)空白对照组：5％的葡萄糖溶液；
B)IL-15mRNA脂质体治疗组：PEG-HZ-TAT包裹IL-15mRNA脂质体置于5％的葡萄糖溶液中。
采取尾静脉注射方式进行治疗，IL-15mRNA脂质稀释在葡萄糖溶液中，并调整使得葡萄糖终浓度为5％。每次每只小鼠的注射体积为5000μL。每天给药1次，共治疗10次。治疗结束后第5天将动物处死并解剖，分离结肠组织并进行称重(去掉最大值和最小值后取平均值)及肿瘤组织大小测量(去掉最大值和最小值后取平均值)。
从图11可以看出，PEG-HZ-TAT包裹IL-15mRNA脂质体治疗组的肿瘤生长缓慢，而对照组的肿瘤生长较快，PEG-HZ-TAT包裹IL-15mRNA脂质体表现出极强的抑制肿瘤生长的作用，实验组重量比对照组轻77.5％，实验组比对照组肿瘤组织体积小62.5％。
以上实验结果表明，PEG-HZ-TAT包裹IL-15mRNA脂质体具有显著的抗结肠癌生长的作用。
上述具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种酸敏性多肽脂质体，其特征在于所述酸敏性多肽脂质体是通过靶向型pH敏感性多肽借助酸感性化学键连接修饰聚乙二醇化的脂质体得到的。
2.如权利要求1所述的一种酸敏性多肽脂质体，其特征在于所述靶向型pH敏感性多肽为对多肽的C-末端经过RGD环肽修饰后的片段，所述多肽包括TAT、H7R8或AibCys。
3.如权利要求1所述的一种酸敏性多肽脂质体，其特征在于所述靶向型pH敏感性多肽包括Succinic acid-YGRKKRRQRRRK-c(RGD)、Succinic acid-HHHHHHHRRRRRRRRK-c(RGD)、Succinic acid-AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHILCK-c(RGD)；
所述Succinic acid-YGRKKRRQRRRK-c(RGD)的结构式(a)为：
Figure FDA0003485360660000011
所述Succinic acid-HHHHHHHRRRRRRRRK-c(RGD)的结构式(b)为：
Figure FDA0003485360660000012
所述Succinic acid-AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHILCK-c(RGD)的结构式(c)为：
Figure FDA0003485360660000021
4.如权利要求1所述的一种酸敏性多肽脂质体，其特征在于所述酸感性化学键包括腙键、乙烯基醚键或原酸酯键，优选腙键；
所述腙键的结构式(d)为：
Figure FDA0003485360660000022
所述乙烯基醚键的结构式(e)为：
Figure FDA0003485360660000023
所述原酸酯键的结构式(f)为：
Figure FDA0003485360660000024
5.如权利要求1所述的一种酸敏性多肽脂质体，其特征在于所述聚乙二醇化的脂质体中聚乙二醇结构位于脂质体的外侧，并通过酸感性化学键与靶向型pH敏感性多肽相连。
6.如权利要求1-5任一所述的酸敏性多肽脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)合成靶向型pH敏感性多肽；
(2)将上述步骤(1)合成的靶向型pH敏感性多肽与聚乙二醇偶联，获得酸敏性多肽脂质体。
7.一种抗肿瘤药物复合体，其特征在于所述抗肿瘤药物复合体包括如权利要求1-5任一所述的酸敏性多肽脂质体及其包裹的抗肿瘤药物。
8.如权利要求1-5任一所述的酸敏性多肽脂质体在制备抗肿瘤药物中的用途。
9.如权利要求1-5任一所述的酸敏性多肽脂质体在包裹mRNA并在体内靶向运输中的应用。
CN202210079591.0A 2022-01-24 2022-01-24 一种酸敏性多肽脂质体、制备方法及其在mRNA药物递送中的应用 Pending CN114470224A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210079591.0A CN114470224A (zh) 2022-01-24 2022-01-24 一种酸敏性多肽脂质体、制备方法及其在mRNA药物递送中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210079591.0A CN114470224A (zh) 2022-01-24 2022-01-24 一种酸敏性多肽脂质体、制备方法及其在mRNA药物递送中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114470224A true CN114470224A (zh) 2022-05-13

Family

ID=81474246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210079591.0A Pending CN114470224A (zh) 2022-01-24 2022-01-24 一种酸敏性多肽脂质体、制备方法及其在mRNA药物递送中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114470224A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103748078B (zh) 可裂解脂质
US8569065B2 (en) Compositions and methods for the delivery of biologically active RNAs
US20100004316A1 (en) Multifunctional carriers for the delivery of nucleic acids and methods of use thereof
SK111897A3 (en) Pharmaceutical composition suitable for nucleic acid transfection and use such composition for transferring nucleic acid
WO2011154331A1 (en) Polymers for delivery of nucleic acids
CN114073677B (zh) 一种脂质纳米颗粒
US20230000999A1 (en) Compositions and methods for nucleic acid delivery
WO2023284554A1 (zh) 一种无载体蛋白质胞内递送前药及其制备方法与应用
KR20220110174A (ko) 핵산 치료제를 위한 종양-표적화 폴리펩티드 나노입자 전달 시스템
CN114470224A (zh) 一种酸敏性多肽脂质体、制备方法及其在mRNA药物递送中的应用
WO2023093596A1 (zh) 一种用于有效递送核酸的环状多肽载体及其变化形式
CN106466485B (zh) 一种具有细胞内吞介导功能的靶向配体-药物偶联体
KR101448800B1 (ko) 핵산 전달 복합체
US20030065033A1 (en) Lipid derivatives of polythiourea
JP2002510706A (ja) Ｄｎａトランスフェクションのための新規化合物
CN113403313B (zh) 一种特异识别人PLK1位点的sgRNA、质粒、纳米复合物和应用
CN113292616B (zh) 一种单糖配体功能化的阳离子脂质类化合物及其制备方法与应用
CN114748640B (zh) 一种pH响应性的siRNA递送系统
WO2024041372A1 (zh) 一种用于有效递送核酸的分支链结构多肽载体及其变化形式
AU2018455720B2 (en) Mutated human 2IG-B7-H3 protein coding gene, recombinant vector, host cell containing same, pharmaceutical composition and application thereof
RU2611399C1 (ru) Меченые дендримерные пептиды
EP2395041A1 (en) Polymers for delivery of nucleic acids
CN116789758A (zh) 一种rgd靶向多肽、rgd靶向多肽-核酸纳米复合物及其制备与应用
Mudhakir et al. TARGETING DESIGN TO THE LUNGAND PULMONARY INTRACELLULAR STRUCTURE OF ENDOGENOUS GENE BY IRQ MODIFIED NANO CARRIER
CN116555185A (zh) 一种靶向gpc3阻断免疫抑制信号的car-巨噬细胞及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination