CN114470208A - c-MYC抑制剂在预防和/或治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关疾病的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了c‑MYC抑制剂在预防和/或治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关疾病的应用，本发明首次证明了c‑MYC参与PARP1依赖性细胞死亡的发生发展，将c‑MYC纳入了治疗依赖性细胞死亡发生发展相关疾病的潜在的治疗靶点，本发明为深入研究c‑MYC参与依赖性细胞死亡在功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关的疾病的作用机制以及对于c‑MYC作为功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关的疾病的治疗靶点的基础探究提供了支持，为临床上功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关的疾病的治疗提供一条新的思路。

Description

c-MYC抑制剂在预防和/或治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞 死亡相关疾病的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及c-MYC抑制剂在预防和/或治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关疾病的应用。

背景技术

哺乳动物成体后不能再生或者很少再生的功能细胞如心肌细胞，神经元，胰岛细胞，肺泡上皮细胞，皮肤真皮细胞等在受到自身或外界不利因素影响时会发生基因组DNA损伤继而引发PARP1过度激活，过度活化PARP-1会消耗PAR修饰合成的底物—烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+，辅酶Ⅰ)，及二磷酸腺苷 (ADP)，此时线粒体通透性的改变使原本定位在线粒体中的AIF(凋亡诱导因子)携带MIF(巨噬细胞移动抑制因子)入核将DNA片段化继发PARP1依赖性细胞死亡，这些细胞死亡后因为其功能不可替代会对机体造成严重损伤表现为心衰，脑中风，阿兹海默病，帕金森病，糖尿病，肺纤维化，皮肤光老化等疾病。

功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关的疾病主要包括脑，心脏缺血再灌注损伤，神经退行性病包括阿兹海默病，帕金森病，运动神经元病等和视神经节死亡导致的视力障碍，肺泡上皮细胞损伤，胰岛细胞死亡导致的糖尿病，紫外线导致的真皮细胞损伤等。

神经退行性疾病是一类由于神经元结构功能逐渐丧失或神经元丢失而导致机体功能障碍的疾病，其主要特征是特异性神经元的大量死亡，并且神经元在成体中无法再生。神经退行性疾病中神经元无法再生的显著特点提示，想要找到治愈神经退行性疾病的方法就需要从挽救神经元存活方面寻找突破。

阿尔茨海默病，帕金森氏病，亨廷顿舞蹈症，肌萎缩性侧索硬化是四种主要的神经退行性疾病。致残率较高，与衰老相关，所产生的后遗症严重影响患者后续生活等是神经退行性疾病的显著特点。神经退行性疾病的发生不但对患者自身的日常生活产生了很大的不便，也加重了家人的生活负担。从2015-2035年，老龄化是我国现在需要正视的新的社会现状，老年人口占比快速提升至29％。神经退行性疾病做为老年高发性疾病，其发病率显然也在不断升高。在帕金森病患者中，我国65岁以上老年人帕金森疾病发病率为 1.7％，每年新患出现人数在不断高升。65岁以上老年人阿兹海默症患病率为3.21％。在中国，已有800万人患有阿尔兹海默症，毫无疑问，中国已成为阿尔兹海默症患者数增长速度最快且患病人数最多的国家和地区。据世界卫生组织(WHO)公布的数据显示，在将来，神经退行性疾病将会是造成人类死亡的第二大原因。这已然成为影响国民生活质量和社会经济的重大社会问题。神经退行性疾病患病人数的不断激增在警示我们要加快解读神经退行性疾病发病机理，注重寻找治疗神经退行性疾病的新策略。

目前，有关神经退行性疾病的研究是重点、是难点也是热点。解析参与神经退行性疾病中神经元PARP1 依赖性细胞死亡过程的参与者以及参与机制对于找到治愈神经退行性疾病的潜在方法是至关重要的。但是现有技术没有公开过如何阻止功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡及阻止功能性细胞PARP1依赖性细胞死的相关药物。

发明内容

本发明的目的之一在于提供c-MYC基因或c-MYC RNA或c-MYC基因编码蛋白的抑制剂用于筛选或制备预防/治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关疾病的药物的用途。

所述抑制剂选自抗体、小分子化合物、microRNA、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、核酸适配体、基因编辑器中的任意一种或多种的组合。

所述基因编辑器包括DNA基因编辑器、RNA基因编辑器。

所述基因编辑器包括任选的gRNA和基因编辑蛋白。

所述基因编辑器包括2个或多个gNRA和基因编辑蛋白。

所述gRNA是引导基因编辑蛋白特异性结合C-MYC基因的RNA。

所述gRNA引导基因编辑蛋白特异性结合C-MYC基因的mRNA。

所述基因编辑蛋白选自Cas13d、CasRx、Cas13e、CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、 Cas13f、RNA靶向基因编辑蛋白中的任意一种或多种。

所述功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关疾病包括：

(1)心脏的缺血再灌注损伤；

(2哺乳动物帕金森病的运动障碍；

(3)脑缺血再灌注损伤；

(4)与视神经节细胞(RGC)变性有关的神经系统疾病；

(5)紫外线导致真皮细胞损伤；

(6)神经退行性疾病；

(7)毒性肺损伤；

(8)胰岛细胞死亡导致的糖尿病。

所述神经退行性疾病包括帕金森疾病。

所述功能性细胞包括心肌细胞、胰岛细胞、神经元、多巴胺神经元、肺泡上皮细胞、真皮细胞或其组合。

所述c-MYC基因包括野生型c-MYC基因和突变型c-MYC基因。

所述突变型c-MYC基因包括突变后编码蛋白的功能未发生改变的突变形式，即功能与野生型编码蛋白相同或基本相同。

所述突变型c-MYC基因编码的多肽与野生型c-MYC基因所编码的多肽相同或基本相同。

所述C-MYC基因包括cDNA序列、基因组序列、或其组合。

所述c-MYC基因的核苷酸序列选自以下各组：

(a)编码如SEQ ID NO.4所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.5所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.5所示序列的同源性≥95％的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.5所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

所述c-MYC基因编码蛋白包括C-MYC基因编码蛋白的活性片段或其衍生物。

所述活性片段或其衍生物与C-MYC的同源性至少为90％，优选为95％，更优选为98％、99％。

所述活性片段或其衍生物至少具有80％、85％、90％、95％、100％的C-MYC活性。

所述c-MYC基因编码蛋白的氨基酸序列选自以下各组：

(i)具有SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的同源性≥90％的多肽。

所述c-MYC基因或其编码蛋白的降解剂抑制c-MYC的活性和/或表达量。

所述c-MYC基因或其编码蛋白的降解剂对c-MYC的活性和/或表达量的抑制率大于90％，较佳地， 90％-95％。

所述c-MYC基因或其编码蛋白的降解剂的浓度(病毒的滴度)＞1×10¹³，较佳地，为1×10¹³-1×10¹⁴。

所述c-MYC基因来源于哺乳动物；优选来源于人、小鼠、大鼠、或兔；更优选地来源于人。

本发明的目的之二在于提供c-MYC基因作为治疗靶点在筛选或制备预防/治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关疾病的药物的用途。

本发明的目的之二在于提供一种筛选预防和/或治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：

1)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试药物，并观察所述测试组的细胞中c-MYC的表达量(E1) 和/或活性(A1)；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试药物，并观察对照组的所述细胞中c-MYC 的表达量(E0)和/或活性(A0)；

其中，如果测试组中细胞的c-MYC的表达量(E1)和/或活性(A1)显著低于对照组，同时细胞PARP1依赖性细胞死亡显著减少，就表明该测试药物是对c-MYC的表达和/或活性有抑制作用的预防和/或治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关的疾病的候选药物；

2)对于步骤1)中获得的候选药物，进一步测试其对抑制功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡的作用；和/或进一步测试其对C-MYC基因是否有下调的作用。

所述方法还包括：3)将步骤2)中所确定的候选化合物施用于哺乳动物模型，测定其对哺乳动物的影响。

所述的c-MYC的表达量是通过qPCR或者免疫蛋白印迹而得出的。

所述哺乳动物为患有功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的哺乳动物。

所述“显著低于”指E1/E0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。

所述“显著低于”指A1/A0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。

本发明的目的之四在于提供一种组合物，所述组合物包括以下组分：

(A)基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自CasRx、CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、 Cas13b、Cas13c、RNA靶向基因编辑蛋白中的任意一种或多种；

和

(B)gRNA或其表达载体，所述gRNA是引导基因编辑蛋白特异性结合c-MYC基因的DNA或RNA。

所述组合物还包括：

(C)其他预防和/或治疗神经退行性疾病的药物。

(D)其他用于治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关的疾病的药物。

所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述表达载体选自慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)中的任意一种或多种，优选为腺相关病毒(AAV)。

所述腺相关病毒为AAV2或AAV9。

所述基因编辑蛋白的表达载体和gRNA的表达载体为同一载体或不同载体。

所述组合物的剂型为冻干制剂、液体制剂、注射剂型。

所述组合物中，(A)组分与(B)组分的重量比为100:1-0.01:1，优选为10:1-0.1:1，更优选为2:1-0.5:1。

所述组合物中，所述(A)组分的含量为0.001％-99％，优选为0.1％-90％，更优选为1％-70％。

所述组合物中，所述(B)组分的含量为0.001％-99％，优选为0.1％-90％，更优选为1％-70％。

所述组合物中，所述(C)组分的含量为1％-99％，优选为10％-90％，更优选为30％-70％。

所述组合物中，所述(A)组分、(B)组分和(C)组分占所述组合物总重的0.01-99.99wt％，优选为 0.1-90wt％，更优选为1-80wt％。

所述组合物的用途为作为预防/治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关疾病的药物。

本发明的目的之五在于提供一种药盒，所述药盒包括：

(A1)第一容器，以及位于所述第一容器中的基因编辑蛋白或其表达载体，或含有基因编辑蛋白或其表达载体的药物，所述基因编辑蛋白选自CasRx、CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、 RNA靶向基因编辑蛋白的任意一种或多种；

(B1)第二容器，以及位于所述第二容器中的gRNA或其表达载体，或含有gRNA或其表达载体的药物，所述gRNA是引导基因编辑蛋白特异性结合c-MYC基因的DNA或RNA。

所述药盒还包括：

(C1)第三容器，以及位于所述第三容器中的其他用于预防和/或治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关疾病的药物。

所述基因编辑蛋白或其表达载体的作用浓度(病毒滴度)＞1×10¹³，优选为1×10¹³-1×10¹⁴。

所述gRNA或其表达载体的作用浓度(病毒滴度)＞1×10¹³，优选为1×10¹³-1×10¹⁴。

所述其他用于预防和/或治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的药物的作用浓度(病毒滴度)＞ 1×10¹³，优选为1×10¹³-1×10¹⁴。

所述第一容器的药物是含基因编辑蛋白或其表达载体的单方制剂。

所述第二容器的药物是含gRNA或其表达载体的单方制剂。

所述第三容器的药物是含其他预用于治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的药物的单方制剂。

所述药物的剂型包括冻干制剂、液体制剂。

所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。

所述药盒中还含有说明书。

所述药盒中的药物用于预防/治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关疾病。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明首次公开了抑制功能细胞的c-MYC基因或RNA或其编码蛋白的表达或活性，可有效抑制功能性细胞的死亡，从而可治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关的疾病。

2.本发明基于CRISP-CAS9全基因组敲除文库筛选到了一批可能参与依赖性细胞死亡发生发展的重要基因。经过回返验证以及多种干扰方式的确证实验中，确定了c-MYC是与依赖性细胞死亡发生发展相关的重要基因，进而进一步探究c-MYC在依赖性细胞死亡发生发展中的作用及分子机理，解释了c-MYC 在阿尔茨海默病，帕金森氏病等神经退行性病变中表达升高及引发神经元死亡的机制。

3.本发明用基因编辑器，包括基因编辑蛋白和gRNA，抑制功能性细胞中的c-MYC的表达，可抑制不利因素造成的功能性细胞的PARP1依赖性细胞死亡，进而为相关功能性细胞的PARP1依赖性细胞死亡所导致疾病的治疗提供了一种潜在的途径。

附图说明

图1为慢病毒全基因组敲除文库筛选流程及结果；其中，(A)用慢病毒全基因组敲除文库感染海拉细胞后，嘌呤霉素筛选3天，细胞再培养7天，用甲基硝基亚硝基胍处理后2天，绝大部分细胞都死亡了，只保留对甲基硝基亚硝基胍诱发的PARP1依赖性细胞死亡有拮抗作用的敲除了特定基因的克隆，收集所有克隆送二代测序后，发现与PARP1依赖性细胞死亡相关的基因；(B)甲基硝基亚硝基胍处理转染慢病毒全基因组敲除文库的海拉细胞(10倍相差显微镜)，左侧为二甲基亚砜(DMSO)对照组，细胞正常存活，中间为海拉细胞经50uM甲基硝基亚硝基胍处理15分钟再培养24小时后，100％的细胞都已经死亡并悬浮在培养基中，右侧为慢病毒全基因组敲除文库转染的海拉细胞经50微摩尔甲基硝基亚硝基胍处理15 分钟再培养24小时后尽管大量的海拉细胞死亡并悬浮于培养基中，中间有一个细胞克隆存活并贴于培养皿底部；

图2为与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡相关候选基因的回返验证；其中，(A)重叠分析寻找参与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生发展的关键基因：将聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生过程中差异表达上调的基因与基因敲除文库筛选得到的耐受聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡的候选基因以及数据库预测的凋亡诱导因子或者PARP-1结合蛋白做基因重叠分析寻找参与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生发展的关键基因；(B)回返验证：应用候选基因敲除质粒在野生型海拉细胞中敲除相应的候选基因，甲基硝基亚硝基胍诱导细胞发生聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡，检测不同候选基因的敲除对聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡情况；(C)不同候选基因的敲除：在甲基硝基亚硝基胍诱导聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生时不同组别细胞死亡情况统计图；海拉细胞死亡率统计方式：细胞死亡率(实验所需检测时间点)＝死亡细胞总数(某一时间点)/起始点细胞总数目*100％)；数据统计方法：数据均值±数据标准差，组间差异分析使用单向方差分析，*：p<0.05，**：p<0.005；****：p<0.0001.

图3为应用c-MYC-shRNA干扰质粒在海拉细胞中检测c-MYC-shRNA对c-MYC干扰对于聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡情况图；

图4为确证c-MYC的敲减也可有效抑制细胞聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡死亡的结果图；其中，(A)应用qRT-PCR检测c-MYC-siRNA在mRNA水平对c-MYC的干扰是否有效；qPCR检测c-MYC 蛋白表达量统计结果，****代表p<0.0001；(B)WB方法检测c-MYC-siRNA在蛋白层面对c-MYC的干扰是否有效；(C)利用c-MYC-siRNA干扰手段在293T细胞中检测c-MYC-siRNA对c-MYC干扰对甲基硝基亚硝基胍诱导的聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡情况；(D)c-MYC-siRNA对c-MYC干扰对甲基硝基亚硝基胍诱导的聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡情况统计图；细胞死亡率统计结果：某一时间点的细胞死亡率＝在该时间点的死细胞/0h的细胞总数*100％；数据统计方法：数据均值±数据标准差，组间差异分析使用单向方差分析，***代表p<0.001；(E)在海拉细胞中检测c-MYC-shRNA 对c-MYC干扰对于细胞发生聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡情况统计图；细胞死亡率统计公式：细胞死亡率(实验选定检测的时间点)＝在该时间点的死细胞/起始时间点细胞数目*100％，数据统计方法：数据均值±数据标准差，组间差异分析使用单向方差分析，*代表p<0.05，**代表p<0.005，****代表 p<0.0001；(F)在c-MYC-shRNA干扰模型中，甲基硝基亚硝基胍诱发聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡的终点时刻，利用细胞PI/Hoechst荧光双染检测聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡情况；(G) 在c-MYC-shRNA干扰模型中，甲基硝基亚硝基胍诱发聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡的终点时刻，利用细胞PI/Hoechst荧光双染检测聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡情况统计图；

图5为验证c-MYC不通过转录功能影响细胞聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡死亡的结果图，其中，(A)：不同时间点细胞死亡情况；(B)：细胞死亡率统计结果；细胞死亡率统计结果：某一时间点的细胞死亡率＝在该时间点的死细胞/0h的细胞总数*100％；

图6为验证干扰c-MYC表达不影响聚二磷酸腺苷核糖聚合酶活性的结果图；应用免疫印迹方法检测 c-MYC的敲减对聚二磷酸腺苷核糖聚合酶聚二磷酸腺苷核糖聚合酶的聚二磷酸腺苷核糖修饰活性发现没有影响；

图7为验证c-MYC与凋亡诱导因子结合并且影响凋亡诱导因子入核的结果图，其中：(A)甲基硝基亚硝基胍处理后不同时间点凋亡诱导因子的入核情况；(B)甲基硝基亚硝基胍处理后不同时间点凋亡诱导因子入核率统计图，数据统计方法：数据均值±数据标准差，组间差异分析使用单向方差分析，统计结果表示： **代表p<0.005；****代表p<0.0001；(C)应用免疫共沉淀检测野生型细胞内源性存在凋亡诱导因子和 c-MYC之间的相互作用；(D)应用免疫荧光染色检测c-MYC-siRNA干扰模型中甲基硝基亚硝基胍处理后凋亡诱导因子的异位；(E)c-MYC-siRNA干扰模型中甲基硝基亚硝基胍处理后凋亡诱导因子的入核率统计结果，细胞凋亡诱导因子入核率统计结果：实验选定检测某时间点凋亡诱导因子入核率＝相应时间凋亡诱导因子入核细胞数(凋亡诱导因子染色与细胞核重合细胞数目)/0h(起始点)的细胞核总数*100％，数据统计方法：数据均值±数据标准差，组间差异分析使用单向方差分析，***代表p<0.001，****代表p<0.0001； (F)应用免疫印迹检测c-MYC-siRNA干扰模型中甲基硝基亚硝基胍处理后凋亡诱导因子的异位；(G)293T 细胞中过表达GFP-凋亡诱导因子，检测c-MYC-siRNA对c-MYC的干扰对外源过表达的凋亡诱导因子的亚细胞定位的影响；

图8为验证c-MYC-PROTACs降解c-MYC抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡的结果图；其中，(A)c-MYC-PROTACs的合成路径；(B)c-MYC-PROTACs的分子结构；(C)不同浓度c-MYC-PROTACs 预处理降解c-MYC对于聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡的影响；不同浓度c-MYC-PROTACs预处理，甲基硝基亚硝基胍不同处理时间后细胞死亡细胞死亡情况图；(D)不同浓度c-MYC-PROTACs预处理，甲基硝基亚硝基胍不同处理时间后细胞死亡细胞死亡统计图；

图9为在小鼠神经细胞系上验证抑制c-MYC对细胞存活影响图；其中，(A)诱导HT22神经损伤细胞模型的谷氨酸处理条件；选择了50μM、75μM、100μM三个不同的浓度检测在HT22细胞对于Glu的敏感性，相应浓度谷氨酸处理HT22细胞的死亡情况；(B)选择了50μM、75μM、100μM三个不同的浓度检测在HT22细胞对于Glu的敏感性；相应浓度谷氨酸处理HT22细胞的死亡情况统计图；(C)100μM c-MYC-PROTACs降解c-MYC在HT22细胞中对于聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡的影响；100 μM c-MYC-PROTACs预处理，Glu处理后24h细胞死亡情况；(D)100μM c-MYC-PROTACs降解c-MYC 在HT22细胞中对于聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡的影响统计图；数据统计方法：数据均值±数据标准差，组间差异分析使用单向方差分析，****代表p<0.0001。

具体实施方式

功能性细胞聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP1)依赖性细胞死亡相关的疾病主要包括：脑，心脏缺血再灌注损伤，神经退行性病包括阿兹海默病，帕金森病，运动神经元病等和视神经节死亡导致的视力障碍，肺泡上皮细胞损伤，胰岛细胞死亡导致的糖尿病，紫外线导致的真皮细胞损伤等。

功能性神经元变性相关的神经系统疾病包括：青光眼、年龄相关的RGC丧失、视神经损伤、视网膜缺血、Leber遗传性视神经病变、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、精神分裂症、抑郁、吸毒、运动障碍(例如舞蹈病，胆脂过多症和动作障碍)、运动神经元损伤疾病(例如肌萎缩侧索硬化，脊髓损伤)、躁郁症、自闭症谱系障碍(ASD)、功能障碍、帕金森疾病。

功能性神经元指能够通过化学或电信号发送或接收信息的神经元。功能性神经元展现出存在于正常神经系统中的成熟神经元的一种或多种功能特性，包括：兴奋性(例如，表现出动作电位的能力，例如快速上升和随后的下降)(跨细胞膜的电压或膜电位)，与其他神经元形成突触连接，突触前神经递质释放和突触后反应(例如，兴奋性突触后电流或抑制性突触后电流)。

多巴胺能神经元(dopaminergic neuron)含有并释放多巴胺(dopamine，DA)作为神经递质的神经元。多巴胺属于儿茶酚胺类神经递质，在中枢神经系统中发挥重要的生物学作用，大脑内的多巴胺能神经元主要集中在中脑的黑质致密区(substantria nigraparscompacta,SNc)、腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)、下丘脑和脑室周围。很多实验证实多巴胺能神经元与人体的多种疾病密切相关，最典型的就是帕金森疾病。

神经退行性疾病是脑部和脊髓的神经元丧失所致的疾病。神经元是神经系统最重要的组层部分，他的死亡会最终导致神经系统的功能障碍。病人在罹患神经退行性疾病之后，会出现行动或认知障碍，病情的发展往往导致诸多并发症，给患者的生活造成严重伤害。在临床上，神经退行性疾病主要包括有阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症等。帕金森病(PD)是一种严重的神经退行性疾病，其特征是中脑黑质多巴胺神经元的丧失。

本发明基于CRISP-CAS9全基因组敲除文库筛选到了一批可能参与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生发展的重要基因。在回返验证以及多种干扰方式的确证实验中，确定了c-MYC是与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生发展相关的重要基因，进而进一步探究c-MYC在聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生发展中的作用及分子机理，解释c-MYC在阿尔茨海默病，帕金森氏病等神经退行性病变中表达升高及引发神经元死亡的机制。

本申请使用DNA或RNA靶向CRISPR系统对c-MYC进行抑制。CRISPR系统介导通过DNA编辑核酸酶避免了shRNA诱导的实质性脱靶效应的出现和永久性改变基因的风险，提供了一种能够治疗多种疾病的卓越工具。

在本发明中，所述基因编辑器包括DNA基因编辑器和RNA基因编辑器。在一优选实施方式中，本发明的基因编辑器包括基因编辑蛋白和任选的gRNA。

基因编辑蛋白

在本发明中，基因编辑蛋白的核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应 (PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述野生型的基因编辑蛋白的来源包括：黄化瘤胃球菌(Ruminococcus Flavefaciens)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp)、毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)。

在本发明的一个优选例中，所述基因编辑蛋白包括：Cas13d、CasRx、Cas13e、CRISPR/Cas9、Cpf1、 Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13f、RNA靶向基因编辑蛋白。

c-MYC蛋白和多核苷酸

在本发明中，术语“本发明蛋白”、“c-MYC蛋白”、“c-MYC多肽”、“c-MYC”可互换使用，都指具有 c-MYC氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的c-MYC蛋白。此外，该术语还包括全长的c-MYC及其片段。本发明所指的c-MYC蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。

c-MYC蛋白为多聚嘧啶区结合蛋白，是一个RNA结合蛋白，调控着RNA剪接调控。同时也对RNA 的其他功能起到非常关键的左右。

在本发明中，术语“c-MYC基因”、“c-MYC多核苷酸”、“c-MYC基因”可互换使用，都指具有c-MYC 核苷酸序列的核酸序列。

人c-MYC基因的基因组全长7518bp(NCBI GenBank登录号为4609)。

鼠c-MYC基因的基因组全长5021bp(NCBI GenBank登录号为17869)。

人和鼠c-MYC，在DNA水平的相似性为88％，蛋白序列相似性为92％。当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。

在得到了c-MYC的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的c-MYC核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的c-MYC多肽。有以下步骤：

(1)用本发明的编码人c-MYC多肽的多核苷酸或变异体，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导宿主细胞；

(2)在培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，c-MYC多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含c-MYC编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的 DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法，如温度转换或化学诱导，诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法的例子包括：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

腺相关病毒

因腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)较其他病毒载体小，无致病性，可转染正在分裂和未分裂的细胞等特性，基于AAV载体的针对遗传性疾病的基因治疗方法受到了广泛的关注。

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。

重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

在本发明一个优选的实施例中，载体为重组AAV载体。AAV是相对较小的DNA病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。AAV基因组己被克隆、测序及表征。AAV 在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。

AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。复制缺陷重组AAV 可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的质粒，和携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。

在一些实施方案中，重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16 的AAV病毒粒子)中。因此，本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域己知的，并在美国专利US6596535B1中有所描述。

c-MYC降解剂和药物组合物

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与c-MYC基因或蛋白发生相互作用的物质，尤其是降解剂等。

可用于本发明的c-MYC降解剂(或拮抗剂)包括任何可以抑制c-MYC基因或其编码蛋白的表达和/或活性的物质。

例如，所述c-MYC的降解剂包括c-MYC的抗体、c-MYC核酸的反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA、基因编辑器、或c-MYC的活性降解剂。一种优选的c-MYC的抑制剂指的是能够抑制c-MYC表达的基因编辑器。

优选的，本发明的c-MYC的降解剂包括靶向c-MYC基因序列的降解剂。本发明c-MYC降解剂所作用的对象包括神经细胞，心肌细胞，肺泡上皮细胞，视神经细胞，胰岛细胞，真皮细胞等等。

在一种优选的实施方式中，抑制c-MYC的方法和步骤包括利用c-MYC的抗体中和其蛋白，利用病毒 (如腺相关病毒)携带的shRNA或siRNA或基因编辑器进行c-MYC基因的沉默。

对c-MYC的抑制率一般为达到至少50％以上的抑制，优选为60％、70％、80％、90％、95％的抑制，可以基于常规技术，例如流式细胞术、荧光定量PCR或Western blot等方法对c-MYC的抑制率进行控制和检测。

本发明c-MYC蛋白的降解剂(包括抗体、反义核酸、基因编辑器以及其他降解剂)，当在治疗上进行施用(给药)时，可抑制c-MYC蛋白的表达和/或活性，进而诱导胶质细胞分化为功能性神经元，从而治疗功能性神经元变性相关的神经系统疾病。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：局部、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、局部给药、自体细胞提取培养后回输等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明降解剂(如抗体、基因编辑器、反义序列 (如siRNA)、或降解剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。

通用方法

动物伦理：动物的使用和饲养符合中国生物医学研究伦理委员会的指导原则。

c-MYC siRNA序列

c-MYC siRNA正义链1：5’-GGUCAGAGUCUGGAUCACC[dT][dT]-3’，如SEQ ID NO.1所示；

c-MYC siRNA反义链2：5’-GGUGAUCCAGACUCUGACC[dT][dT]-3’，如SEQ ID NO.2所示；

c-MYC sgRNA序列

c-MYC sgRNA3：5’-TGCGTAGTTGTGCTGATGTG-3’，如SEQ ID NO.3所示；

细胞转染实验使用脂质体转染试剂Lipo 3000。

(1)准备好转染所需要的无内毒素质粒，确定浓度符合转染需要；

(2)准备转染所需要的细胞，确定细胞状态良好，细胞密度在转染时达到80％最为适宜；

(3)准备1.5ml EP管，制备转染所用试剂混合物；

(4)取实验所用质粒8μg加入1.5ml EP管，加入Opti-MEM(无血清培养基)将质粒充分混匀，多吹打几次，混合均匀成质粒稀释液备用；

(5)按照转染试剂和所需转染质粒1：1原则，取转染试剂8μL，用Opti-MEM轻混均匀，成转染试剂稀释液；

(6)将准备好的转染试剂稀释液缓慢滴入混匀的质粒稀释液，室温静置30min，不要震荡，给于形成转染复合物充分的孵育时间；

(7)将充分孵育的转染试剂复合物逐滴慢慢加入细胞培养皿，均匀分散滴加进入，左右轻晃动细胞培养皿混匀，放回培养箱定时观察。

细胞转染实验使用PEI(聚乙烯亚胺)。

以12孔板为例

(1)准备好转染所需要的无内毒素质粒，确定浓度符合转染需要；

(2)准备转染实验所需的细胞，铺板密度控制在24h后达到70％。隔天检查细胞密度以及细胞状态是否符合转染所需要求；

(3)准备灭菌1.5ml EP管，50ul PBS稀释1ug pDNA，混匀成DNA稀释液备用；

(4)准备另一灭菌1.5ml EP管，50ul PBS加入3ul PEI(1mg/ml)，混匀成PEI稀释液备用；

(5)将准备好的DNA稀释液与制备好的PEI稀释液混合，轻轻上下吹打两三次，室温孵育3min；

(6)慢慢滴入PEI和DNA复合物到提前铺好板的细胞中，轻轻晃动细胞培养皿混匀，转移至细胞培养箱孵育3h；

(7)3h后，去除旧培养基，加入新鲜的完全培养基，在37℃培养箱继续培养，保持观察。

聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞模型构建

以6孔板为例：

(1)在模型构建之前将海拉(Hela)细胞以70％的密度均匀铺板，铺板12h后细胞融合度达到100％；

(2)本实验中用于构建细胞聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡模型的药物是甲基硝基亚硝基胍(MNNG)，用100μM甲基硝基亚硝基胍处理细胞15min。用无FBS的培养基稀释甲基硝基亚硝基胍，每孔加入2ml稀释好的甲基硝基亚硝基胍，15min后换新鲜的完全培养基；

(3)将细胞放37℃恒温培养箱继续培养，不定时观察细胞状态。

神经损伤细胞模型处理

以6孔板为例：

(1)在模型构建之前将HT22细胞以60％的密度均匀铺板，12h后细胞融合度达到100％；

(2)本实验中所用的用于构建神经损伤细胞模型的药物是谷氨酸，用75mM谷氨酸处理细胞。每孔加入2ml完全培养基稀释好的谷氨酸；

(3)继续将处理后的细胞放37℃恒温细胞培养箱继续培养，不定时观察细胞状态。在谷氨酸浓度为 75mM时，大约100％的细胞在24小时内死亡。

实时定量荧光定量PCR(qPCR)与RNA-seq

将细胞接种在6孔板中。依标准程序使用Lipofectamine 3000(ThermoFisherScientific)。转染两天后，裂解后用于qPCR分析。同时分离视网膜以测定AAV的表达。使用Trizol(Ambion)提取RNA，并使用逆转录试剂盒(用于qPCR的HiScript Q RTSuperMix，Vazyme，Biotech)将其转变为cDNA。使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Vazyme，Biotech)追踪扩增过程。

C-MYC qPCR引物是：上游引物：5’-CCTGGTGCTCCATGAGGAGAC-3’；

下游引物：5’-CAGACTCTGACCTTTTGCCAGG-3’。

GAPDH引物：上游引物：5’-TCACCACCATGGAGAAGGC-3’；

下游引物：5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3’。

对于RNA-seq，在15-cm培养皿中培养海拉细胞，并用100μM浓度的甲基硝基亚硝基胍处理15分钟。甲基硝基亚硝基胍处理6小时后收集细胞，提取RNA，转变为cDNA，然后用于全转录组RNA-seq。

细胞蛋白抽提

蛋白裂解操作开始之前准备足够量的冰，操作过程在冰上，保持低温。

(1)吸掉旧培养基，用预冷PBS洗涤细胞2次，速度尽量快，避免细胞应激反应的发生对蛋白产生影响；

(2)向裂解液中加入蛋白酶抑制剂PMSF和Cocktail蛋白酶抑制剂，以6孔板为例，每孔加入200μl 提前配置好的细胞裂解液，注意要在使用30min内加入PMSF；

(3)充分裂解；裂解30min，每10min用枪吹打混匀至无明显的细胞团块聚集，吹打的过程不要长时间置于冰外，要保持裂解过程的低温环境；

(4)裂解完全后，转移至预冷的1.5ml EP管中，12000rpm离心10min，吸上清移至预冷备用的离心管；

(5)加入适量5×SDS Loading Buffer，所需要的5×SDS Loading Buffer的用量原则为将其稀释成1×， 95℃金属浴加热10min，制备好的蛋白裂解液于-20℃保存；

(6)若长期保存置于-80℃冰箱，也可用于后续实验。

免疫蛋白印迹Western blotting

(1)装板；提前用洗洁精清洗胶板，用去离子水冲洗干净可自然晾干也可吹风机吹干；

(2)配胶；按照实验所需分离蛋白的线性范围所需浓度配置相应浓度的蛋白胶；

(3)预煮蛋白：95℃，2min，使蛋白充分变性；

(4)12000rpm离心1min，按照胶孔大小选择合适的上样量上样；

(5)跑胶；90V，120min；

(6)转膜；300m A，转膜105min。在转膜前准备足够量的冰水混合物，将转膜槽充分置于冰水混合物的泡沫盒子中，保持转膜过程的持续低温环境；

(7)封闭：在转膜即将结束的最后10min配置封闭所用的牛奶，将转膜结束的膜放入10％脱脂牛奶，室温下置于摇床上摇晃，最佳的封闭时间为2.5h；

(8)一抗孵育，将膜表面牛奶用TBST轻轻冲洗，加入稀释好的一抗放4℃冰箱的摇床上缓慢摇晃孵育过夜。稀释一抗所用为一抗稀释液稀释(碧云天P0023A)，使用抗体如下：c-MYC(1：500，abcam)，凋亡诱导因子(1：500，Santa Cruz)，PAR(1：1000，Santa Cruz)，GAPDH(1：1000，Proteintech)，β-actin (1：10000，Abclone)；

(9)隔天，将一抗回收。TBST洗膜，6min/次，洗3次；

(10)使用TBST稀释二抗(1:1000，MS-HRP碧云天A0216 1:1000，Rb-HRP arigoARG65351)。室温孵育120min；

(11)将二抗回收。TBST洗膜，8min/次，洗3次；

(12)Tanon 5000显影仪显影；

免疫荧光染色

(1)润洗细胞：待需要进行免疫荧光染色的细胞在相应实验处理结束后，快速吸掉旧细胞培养基， 1×PBS洗3次，PBS洗的过程可以选择性进行；

(2)细胞固定：使用碧云天公司的4％多聚甲醛，按照操作说明以完全覆盖为最适，避光固定15min，固定结束用1×PBS将细胞表明的多聚甲醛洗去，洗3次以每次3min最适；

(3)打孔：需要荧光标记检测的蛋白均为细胞内蛋白，需要打孔。用PBS稀释TritonX-100，所用 TritonX-100的工作浓度为0.1％。同样以完全覆盖所有细胞为最适，室温15min，1×PBS洗涤细胞去除 TritonX-100，洗3次以每次3min最适；

(4)封闭：选择用碧云天免疫组织化学快速封闭液，将快速封闭液加入细胞中，以完全覆盖为最适用量，室温封闭10min，1×PBS洗涤细胞,每次3min洗3次；

(5)一抗孵育：用PBS(加入0.1％TritonX-100和1％BSA，)稀释一抗，所用抗体如下：c-MYC(1： 100，Abcam)，凋亡诱导因子(1：100，Santa Cruz)，PAR(1：100，Santa Cruz)，置于4℃冰箱，静置过夜孵育；

(6)回收一抗：1×PBS洗3次，每次5min；

(7)二抗孵育：避光条件下，加入1×PBS(PBS+Ca²⁺)均匀稀释的荧光二抗(1:500，不同的抗体可以根据效价的不同调整稀释比例)，室温2h充分孵育；

(8)回收二抗：可以重复使用，加入1×PBS稀释的Hoechs(1：1000)，室温孵育5min；

(9)回收Hoechs：1×PBS(PBS+Ca2+)洗细胞，可多次洗涤，去除非特异性结合，每次3min可洗涤5次；

(10)封片：用无色透明指甲油进行封片，在显微镜下观察染色结果。

胞浆蛋白和胞核蛋白提取

按细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天P0027)使用说明操作

免疫共沉淀

(1)珠子预处理：在珠子(protein A+G)中加入目标抗体，以及在对照IP组中加入相应源性的对照IgG抗体，4℃摇晃反应3h以上；

(2)裂解细胞：将准备的80-90融合度的细胞中的旧培养基吸弃，用预冷的PBS润洗3遍，洗的速度尽量快，避免细胞内出现应激反应。加入1ml的细胞裂解液，用细胞刮子将细胞收集起来，全程都在冰上经行，充分裂解30min，使用不同的蛋白裂解试剂可以参照不同试剂对应的说明书进行操作；

(3)离心：14000g，4℃，离心15min，离心之前离心机提前预冷；

(4)收集Lysis：实验中为了确定IP实验结果的可靠性需要收集Lysis作为Input，吸取上清液80μL到新的EP管，加入等体积的5×SDS Loading Buffer，将其稀释为1×为最适，金属浴加热煮沸，95℃沸腾10min 左右，存放-20℃冰箱备用；

(5)抗体与蛋白结合：在摇床上反应3h以上的抗体和珠子的预处理混合物中加入300-500μL的剩余蛋白裂解液用于IP，4℃摇晃反应过夜；

(6)收集珠子：离心机预冷至4℃，离心沉淀珠子，此时珠子上携带着抗体以及挂在抗体上的蛋白，离心速度不宜过大，3000rpm 5min使珠子沉淀，收集珠子用小量程枪头吸掉上清液，用加入蛋白酶抑制剂的PBS反复洗涤珠子3次，每次颠倒混匀1min作用。最后务必用细枪头将PBS吸干净，以免假阳性结果的出现；

(7)蛋白变性：加入1×loading buffer 50μL，95℃15min，煮沸使蛋白变性；

(8)WB检测。

统计分析

所有值均显示为平均值±s.e.m.。未配对的t检验用于确定统计学显著性(p<0.05)。多组比较使用方差分析，所有实验均为随机化，未使用统计学方法预计样本大小，但我们的样本大小与先前出版物中报道的相似。假设数据分布正常但未经正式测试。

实施例1用sgRNA-CRISPR-Cas9慢病毒文库筛选parthanos相关基因

用覆盖全基因组的sgRNA-CRISPR-Cas9慢病毒文库感染海拉细胞后，嘌呤霉素筛选3天，细胞再培养7天，用甲基硝基亚硝基胍处理后2天，绝大部分细胞都死亡了，只保留对甲基硝基亚硝基胍诱发的聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡有拮抗作用的敲除了特定基因的克隆(图1B， MNNG/CAS9-library)，收集所有克隆送二代测序后，发现与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡相关的基因。

实施例2候选基因回返验证

鉴于筛选过程可能存在一定程度冗杂性，通过生物信息学分析将候选基因排名。借助了Bio GRID网站的蛋白相互作用数据库，在数据库中寻找与凋亡诱导因子和聚二磷酸腺苷核糖聚合酶关系密切的蛋白，辅助在筛选得到的候选基因中准确的找到确定参与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡的候选基因。

通过高通量测序检测了在甲基硝基亚硝基胍诱导聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞模型中表达量发生变化的基因，找出了六百条左右的上调基因。如图2A所示，将六百多条差异表达上调的基因与文库筛选中筛选得到的四百七十条左右的候选基因以及利用Bio GRID网站蛋白相互作用数据库预测得到的与凋亡诱导因子和聚二磷酸腺苷核糖聚合酶关系密切的基因进行重叠分析。最终挑选了一些全基因组敲除筛选时促存活并且与凋亡诱导因子结合以及甲基硝基亚硝基胍处理后表达增加的几条基因，即 HK1(己糖激酶1)、EIF(真核细胞翻译起始因子)、Cullin1以及c-MYC基因作为实验研究的候选基因，探讨其是否与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生相关。

为了找到参与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生发展的关键基因，通过构建候选基因 sgRNA敲除质粒，即HK1、EIF、Cullin1基因以及c-MYC基因敲除质粒。将候选基因sgRNA敲除质粒转入细胞，48h后加入1.0μg/ml嘌呤霉素筛选转染阳性细胞，24h后到达嘌呤霉素筛选终点。以野生型海拉细胞作为空白对照，野生型细胞全部死亡为筛选终点。实验过程中的野生型未转染空白对照组在嘌呤霉素筛选24h后全部死亡。此时筛选得到的具有完整细胞形态的细胞克隆被认为是转染阳性的细胞。扩大培养， 2d～3d后重新均匀铺板用于甲基硝基亚硝基胍处理。甲基硝基亚硝基胍100μM 15min处理后撤除甲基硝基亚硝基胍，镜检各个分组之间细胞死亡情况。如图2B以及统计图2C所示，转染了c-MYC-sgRNA组表现出更加明显的细胞存活现象，提示c-MYC的敲除可能阻止了聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡的发生。如图中所示，同时验证了MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)这个已知的与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生相关的基因的作用。实验结果表明筛选出的c-MYC基因敲除后对细胞的保护作用远远大于MIF敲除后的对细胞的保护作用。

实施例3 c-MYC-shRNA干扰c-MYC可有效抑制细胞死亡

2003年Shunsuke Ishii等研究人员设计构建了一种新的siRNA载体表达系统，这种被新构建的干扰载体被称为shRNA即短发夹RNA(short hairpin RNA)。从在结构上分析，shRNA具有两个短的反向重复序列，中间由一个茎环(loop)序列分隔，三个主要的部分共同组成完整的shRNA。将siRNA序列以“短发夹”形式克隆进质粒载体送入细胞内，该结构表达之后会形成“双链RNA”(dsRNA)，通过RNAi系统降解靶序列。避免干扰素应答和可持续表达长期干扰是shRNA干扰系统的优势。基于以上本发明构建了 shRNA干扰c-MYC的表达来进一步确证干扰c-MYC是否可以有效抑制细胞发生聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡而死亡。

本实施例选择了与前述可以有效干扰c-MYC表达的c-MYC-siRNA干扰序列相同的序列设计构建了 c-MYC-shRNA干扰质粒，在海拉细胞中转染c-MYC-shRNA干扰质粒，转染48h后嘌呤霉素筛选转染阳性的细胞，扩大培养后甲基硝基亚硝基胍处理诱发聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡的发生，随着甲基硝基亚硝基胍处理后时间的延长，细胞逐渐因为发生聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡而死亡，在不同时间镜检细胞的存活情况。如图3以及细胞死亡统计图4E所示，在24h开始c-MYC-shRNA 干扰组相比于对照组出现明显的对于聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡的保护作用，48h 后，对照组所有细胞都因为甲基硝基亚硝基胍的处理发生聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡而死亡，而c-MYC-shRNA还有因为干扰了c-MYC的表达而活下来的细胞。在48h后，进行PI/Hoechst荧光双染，如图4F以及PI阳性细胞统计图4G，结果显示对照组还附着在培养皿上的细胞均为死细胞，但是 c-MYC干扰组还有存活下来的部分活细胞，说明c-MYC-shRNA对c-MYC的干扰对于聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡的发生具有明显的保护作用。以上实验结果都确定了干扰c-MYC的确可以有效抑制细胞发生聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡而死亡。

实施例4 c-MYC不通过转录影响细胞死亡

c-MCY最重要的功能是其具有转录激活活性。因此，首先想要确定c-MYC参与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡是否与c-MYC的转录活性有关联。为此本实施例探究了c-MYC转录活性抑制剂对于聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡的影响。本实施例选择了四种抑制c-MYC转录活性的抑制剂：c-Myc抑制剂10074-G5、Bromodomain 4(BRD4)抑制剂BI2536，其能有效地抑制c-Myc的表达、可抑制AKT1和AKT2的激酶活性的Oridonin、dBET6(BET bromodomainsPROTAC)用于探究c-MYC 的转录活性对于聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡的影响，选择了DPQ作为阳性对照，其是聚二磷酸腺苷核糖聚合酶的一种抑制剂，25μM处理海拉细胞可以有效的阻止甲基硝基亚硝基胍诱导的聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡。

通过上述的四种c-MYC转录活性抑制剂以及DPQ在MNNG处理前12小时加入海拉细胞培养基中，检测c-MYC转录活性的抑制对于聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞模型的存活是否有影响。实验中，利用野生型海拉细胞分别用不同的抑制剂预处理，预处理12h后甲基硝基亚硝基胍诱导细胞发生聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡，甲基硝基亚硝基胍处理后24h镜检细胞的存活情况。如图5A 以及统计图5B所示，四种抑制剂的预处理对于细胞聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡并没有明显的保护作用，以上结果表明c-MYC参与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡的发生与 c-MYC转录调控功能没有关系。

实施例5干扰c-MYC表达不影响聚二磷酸腺苷核糖聚合酶活性

为确定c-MYC与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生过程中最关键的蛋白聚二磷酸腺苷核糖聚合酶的关系，即c-MYC是在聚二磷酸腺苷核糖聚合酶的上游还是下游参与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡。本实施例检测c-MYC干扰后聚二磷酸腺苷核糖聚合酶的PAR催化能力是否还在。

采用免疫印迹探究c-MYC的敲除对甲基硝基亚硝基胍诱导的PAR修饰的影响。海拉细胞分别转染 c-MYC-siRNA干扰质粒，转染48小时后裂解细胞收取蛋白进行免疫印迹检测PAR修饰。如图6所示，实验结果表明，c-MYC干扰后PAR修饰没有明显的变化。以上结果表明c-MYC的干扰没有影响聚二磷酸腺苷核糖聚合酶的PAR修饰活性，也表明，c-MYC参与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶和c-MYC之间的相互作用没有直接的关系，提示c-MYC参与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡的发生发展很可能发生在聚二磷酸腺苷核糖聚合酶的下游。

实施例6 c-MYC与凋亡诱导因子结合并且影响凋亡诱导因子入核

首先明确c-MYC与凋亡诱导因子的关系。

凋亡诱导因子入核是聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生过程中至关重要的分子活动，为了在聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生后的最佳时间点观察凋亡诱导因子的入核情况，本实施例检测了甲基硝基亚硝基胍处理后不同时间凋亡诱导因子的入核情况。甲基硝基亚硝基胍处理野生型海拉细胞，在甲基硝基亚硝基胍处理后不同时间固定细胞，免疫荧光染色检测凋亡诱导因子的亚细胞定位。如图 7A以及统计图7B所示的结果表明，凋亡诱导因子在甲基硝基亚硝基胍处理后3小时凋亡诱导因子入核相比于2小时会显著增高，随着时间的延长凋亡诱导因子的入核比例并不会更高，其原因可能是由于凋亡诱导因子入核会继发细胞死亡，前期发生凋亡诱导因子核转位的细胞会死亡，因此入核的比例并没有明显的变化。因此，根据预实验的结果本实施例选择了3h作为凋亡诱导因子入核的最佳观察时间点，在具体的实验中也会选择5h作为另一个凋亡诱导因子入核观察的时间点。接下来本实施例通过免疫共沉淀确定 c-MYC与凋亡诱导因子之间的是否存在相互作用。

为确定c-MYC与凋亡诱导因子之间是否存在相互作用，本实施例用了野生型的海拉细胞在甲基硝基亚硝基胍处理之后2.5h裂解细胞免疫共沉淀检测c-MYC与凋亡诱导因子之间是否存在内源性的相互作用。如图7C所示，c-MYC与凋亡诱导因子之间的确存在相互作用，并且MMNG的处理会让胞浆中相互作用的c-MYC和凋亡诱导因子减少，可能是因为甲基硝基亚硝基胍的处理会让相互作用的凋亡诱导因子和 c-MYC发生核转位。这些结果表明c-MYC和凋亡诱导因子之间的确发生了相互作用且甲基硝基亚硝基胍的处理会让这种相互作用的蛋白往细胞核转移。

确定了观察凋亡诱导因子入核的的时间点后，接着本实施例在海拉细胞中构建的c-MYC-siRNA干扰模型，检测c-MYC的干扰是否影响凋亡诱导因子的亚细胞定位。实验中采用免疫印迹和免疫荧光染色来探究c-MYC的敲除对甲基硝基亚硝基胍诱导的凋亡诱导因子的核转位是否有影响。海拉细胞转染 c-MYC-siRNA，转染48小时后裂解细胞分别收取胞浆蛋白和胞核蛋白用于免疫印迹，以及同样在48h后固定细胞免疫荧光染色检测凋亡诱导因子的亚细胞定位。

如图7D以及统计图7E所示，免疫荧光染色实验结果显示，不论是在甲基硝基亚硝基胍处理后3h还是甲基硝基亚硝基胍处理后5h c-MYC-siRNA转染组的凋亡诱导因子入核比例都有很明显的降低，即 c-MYC的干扰阻碍了凋亡诱导因子的入核。如图7F图所示，同样在免疫印迹实验中我们也检测到 c-MYC-siRNA对c-MYC的干扰阻碍了甲基硝基亚硝基胍处理细胞时凋亡诱导因子往细胞核移位。

检测了c-MYC-siRNA对c-MYC的干扰阻止了内源性凋亡诱导因子的核转位之后，本实施例在293T 细胞内过表达了GFP-凋亡诱导因子，更直观的检测甲基硝基亚硝基胍处理之后凋亡诱导因子的亚细胞定位。如图7G所示，c-MYC-siRNA干扰组无论是否有甲基硝基亚硝基胍的处理都呈现出更少的凋亡诱导因子在细胞核聚集的现象，再一次验证了关于c-MYC影响凋亡诱导因子入核的假说。

实施例7 PROTACs降解c-MYC抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡

PROTACs(Proteolysis Targeting Chimera；靶向嵌合分子的蛋白水解)是一种纳米分子，是蛋白降解靶向嵌合体，具有特异性且是双功能的。PROTACs在结构上是由两个功能基序连接在一起共同组成的PROTACs 靶向嵌合分子。两个功能基序分别位于两端，一端是小分子配体用于特异性识别c-MYC，而另一端连接的基序可以特异性识别E3连接酶。PROTACs可以将靶蛋白和E3酶连近，给靶蛋白标记上泛素降解标签，然后通过泛素—蛋白酶体降解途径降解靶蛋白。本实施例通过如图8A所示的合成途径，合成了 c-MYC-PROTACs，其最终分子结构如图8B所示，c-MYC-PROTACs的一边是能够特异性靶向c-MYC蛋白的分子10058-F4，另外一边是负责招募E3连接酶的CRBN(是一个E3泛素连接酶复合物 CUL4-RBX1-DDB1-CRBN的底物识别构件，用于催化泛素分子结合到特异的底物蛋白上)。

不同浓度c-MYC-PROTACs降解c-MYC对于聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡的影响

c-MYC-PROTACs作为很有潜力发展成临床应用的一种新型药物，期望能够应用于聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡诱发的功能性细胞死亡相关疾病如神经元死亡相关的神经系统疾病，心肌细胞死亡相关的心脏疾病，肺泡上皮细胞死亡的肺脏疾病，胰岛细胞死亡的糖尿病，真皮细胞受紫外线损伤所致皮肤光老化。为此本实施例将c-MYC-PROTACs应用在了甲基硝基亚硝基胍诱导的海拉细胞聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞模型上，确定c-MYC-PROTACs对于c-MYC的降解是否能够有效的挽救聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡。

首先，本实施例通过化合物合成说明，使用100nM、1μM、10μM、100μM四个不同浓度溶于DMSO 的c-MYC-PROTACs预处理细胞(提前六小时添加入细胞培养基中)，不同浓度c-MYC-PROTACs降解细胞内的c-MYC蛋白，预处理12h，用甲基硝基亚硝基胍处理诱导海拉细胞发生聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡，在甲基硝基亚硝基胍诱导聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生后0h、 2h、4h、6h、8h不同时间点镜检不同组别之间细胞的存活情况。如图8C以及细胞死亡统计图8D所示的实验结果显示，随着预处理细胞所用的c-MYC-PROTACs的浓度的逐渐升高，细胞表现出来的存活越明显。至此初步确定了c-MYC-PROTACs在聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞模型中可以有效干扰c-MYC阻止聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生的有效性。接下来本实施例继续探究了c-MYC-PROTACs应用的最佳条件，最大化阻止聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生的效率。

c-MYC-PROTACs对于c-MYC的降解效率

为了确定c-MYC-PROTACs是能够有效的降解c-MYC且找到c-MYC-PROTACs应用最佳条件，本实施例在体外培养海拉细胞，通过c-MYC-PROTACs预处理海拉细胞，预处理后进行免疫印迹检测，在蛋白水平检测c-MYC的表达量，验证降解效率，寻找最佳的c-MYC-PROTACs预处理条件。为了找到最佳的预处理浓度，查看c-MYC-PROTACs的合成路线，发现c-MYC-PROTACs的设计是以c-MYC抑制剂 10058-F4设计合成的，10058-F4是一种常用的c-MYC抑制剂，特异性抑制c-MYC-Max相互作用，且 10058-F4有效抑制c-MYC转录的浓度本来就很很高，所以测试c-MYC-PROTACs的起始浓度用到了100μM 降解细胞内的c-MYC蛋白量。

实验结果显示，用100μM c-MYC-PROTACs预处理的不同时间与c-MYC的降解效率有明显的相关性，因此在后续的实验中选择了100μM c-MYC-PROTACs预处理6h作为最佳的预处理条件。

实施例8在小鼠神经细胞系上验证抑制c-MYC对细胞存活影响

众所周知，在大脑中存在的氨基酸中谷氨酸是含量最高，作为中枢神经系统重要的兴奋性神经递质广泛存在于大脑中。早在1990年就有人提出Glutamte(一种主要的兴奋性氨基酸神经递质，Glu)有可能加重脑损伤，其中Glu通过与Glu受体相互作用发挥毒性作用，现在研究和应用基础研究最热门的Glu受体是 N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体。临床观察发现，继发性脑缺血患者脑室中的Glu浓度比正常脑病患者高10～12倍，阻断内源性的Glu或者给Glu受体拮抗剂可明显的减轻缺血性脑损伤。Glu诱导的兴奋性毒性在多种神经退行性疾病中扮演重要的角色，如在帕金森综合征，肌萎缩性侧索硬化症以及阿尔兹海默症等都有参与。基于以上的理论支持，Glu暴露作为一种常用的模拟多种神经退行性疾病模型的方法被使用。

诱导HT22神经损伤细胞模型的谷氨酸处理条件

氧化应激和DNA烷基化剂可能通过直接或间接损伤DNA，在神经细胞中过量刺激谷氨酸受体也会导致缺氧、低血糖和炎症，导致DNA损伤。同样发现受损神经元过多谷氨酸的释放导致缺血后的神经元损伤，这种损伤被认为是由N-甲基-D-天冬氨酸酸(NMDA)谷氨酸受体过度激活引起的，将这种现象称为兴奋性中毒。通过兴奋性中毒引起的神经元死亡和损伤是构建中风、PD和其他神经退行性疾病实验模型的基础。本实施例选择了HT22(小鼠海马神经元细胞系)细胞建立神经元损伤细胞模型。用于验证c-MYC 是否在神经细胞中也能有效的阻止聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡的发生。高浓度谷氨酸处理神经细胞会引起细胞内ROS(活性氧)聚集和谷胱甘肽的剥夺。有研究表明，caspase依赖的凋亡途径中凋亡诱导因子的异位与谷氨酸诱发的神经毒性有很大的关系。在本实验中选用了谷氨酸用于HT22 细胞用来构建神经损伤细胞模型来验证。

首先对野生型HT22细胞对于Glu的敏感性经行了检测，寻找用于构建神经损伤模型的最佳处理条件。用50mM、75mM以及100mM来检测在不同浓度的Glu处理下HT22随着时间的死亡情况。如图9A以及统计图9B所示，75mM Glu的处理在24h细胞的死亡率可接近100％，因此选择了75mM作为后续实验Glu的最佳使用条件。

c-MYC-PROTACs降解c-MYC在HT22细胞中对于聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡的影响

进一步在神经损伤细胞模型上确定c-MYC-PROTACs对于聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡的挽救作用。

用c-MYC-PROTACs预处理HT22细胞后用谷氨酸75μM Glu处理细胞，在不同时间以及诱导终点处镜检细胞存活的情况。如图9C以及统计图9D所示，实验结果显示在c-MYC-PROTACs预处理实验组和对照组之间在甲基硝基亚硝基胍处理之后8h、24h都有明显的存活差异，表明c-MYC-PROTACs的预处理降解了HT22细胞内c-MYC蛋白，从而阻止了谷氨酸诱导的神经损伤模型中由于发生聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡而出现的细胞死亡。

本发明首次证明了c-MYC参与着聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡的发生发展，将c-MYC纳入了治疗聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生发展相关疾病的潜在的治疗靶点，为治疗功能性细胞聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡相关的疾病主要包括脑，心脏缺血再灌注损伤，神经退行性病包括阿兹海默病，帕金森病，运动神经元病等和视神经节死亡导致的视力障碍，肺泡上皮细胞损伤，胰岛细胞死亡导致的糖尿病，紫外线导致的真皮细胞损伤等提供了可能性。本发明也在不断的探究中明晰了 c-MYC参与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡的具体机制，为后续聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡发生发展的研究提供了基础。随着功能性细胞聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡相关的疾病对全世界人类健康生活的影响我们也想要找到一种可以治愈功能性细胞聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡相关的疾病的方法。以c-MYC作为靶点，设计了多种干扰方式在细胞层面确定了对于c-MYC 的干扰确实能够有效的阻止聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡的发生，为治愈聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡参与的功能性细胞聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡相关的疾病多了一种可能。本发明为深入研究c-MYC参与聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡细胞死亡在功能性细胞聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡相关的疾病的作用机制以及对于c-MYC作为功能性细胞聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡相关的疾病的治疗靶点的基础探究提供了支持，为临床上功能性细胞聚二磷酸腺苷核糖聚合酶依赖性细胞死亡相关的疾病的治疗提供一条新的思路。

上述参照实施例对c-MYC抑制剂在预防和/或治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关疾病的应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 皖南医学院

<120> c-MYC抑制剂在预防和/或治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关疾病的

应用

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> c-MYC siRNA正义链1

<400> 1

5'-ggucagaguc uggaucacc[dT][dT]-3' 21

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> c-MYC siRNA反义链2

<400> 2

5'-ggugauccag acucugacc[dT][dT]-3' 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> c-MYC sgRNA3

<400> 3

tgcgtagttg tgctgatgtg 20

<210> 4

<211> 454

<212> PRT

<213> c-MYC基因编码蛋白的氨基酸序列

<400> 4

Met Asp Phe Phe Arg Val Val Glu Asn Gln Gln Pro Pro Ala Thr Met

1 5 10 15

Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp

20 25 30

Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln

35 40 45

Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp Ile

50 55 60

Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser Arg

65 70 75 80

Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe Ser

85 90 95

Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp

100 105 110

Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln

115 120 125

Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile

130 135 140

Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val

145 150 155 160

Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser

165 170 175

Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr

180 185 190

Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val

195 200 205

Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala

210 215 220

Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser

225 230 235 240

Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His

245 250 255

Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu

260 265 270

Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro

275 280 285

Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys

290 295 300

Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His

305 310 315 320

Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala

325 330 335

Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser

340 345 350

Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn

355 360 365

Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu

370 375 380

Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu

385 390 395 400

Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala

405 410 415

Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu

420 425 430

Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln

435 440 445

Leu Arg Asn Ser Cys Ala

450

<210> 5

<211> 1375

<212> DNA

<213> c-MYC基因的核苷酸序列

<400> 5

ctggattttt ttcgggtagt ggaaaaccag cagcctcccg cgacgatgcc cctcaacgtt 60

agcttcacca acaggaacta tgacctcgac tacgactcgg tgcagccgta tttctactgc 120

gacgaggagg agaacttcta ccagcagcag cagcagagcg agctgcagcc cccggcgccc 180

agcgaggata tctggaagaa attcgagctg ctgcccaccc cgcccctgtc ccctagccgc 240

cgctccgggc tctgctcgcc ctcctacgtt gcggtcacac ccttctccct tcggggagac 300

aacgacggcg gtggcgggag cttctccacg gccgaccagc tggagatggt gaccgagctg 360

ctgggaggag acatggtgaa ccagagtttc atctgcgacc cggacgacga gaccttcatc 420

aaaaacatca tcatccagga ctgtatgtgg agcggcttct cggccgccgc caagctcgtc 480

tcagagaagc tggcctccta ccaggctgcg cgcaaagaca gcggcagccc gaaccccgcc 540

cgcggccaca gcgtctgctc cacctccagc ttgtacctgc aggatctgag cgccgccgcc 600

tcagagtgca tcgacccctc ggtggtcttc ccctaccctc tcaacgacag cagctcgccc 660

aagtcctgcg cctcgcaaga ctccagcgcc ttctctccgt cctcggattc tctgctctcc 720

tcgacggagt cctccccgca gggcagcccc gagcccctgg tgctccatga ggagacaccg 780

cccaccacca gcagcgactc tgaggaggaa caagaagatg aggaagaaat cgatgttgtt 840

tctgtggaaa agaggcaggc tcctggcaaa aggtcagagt ctggatcacc ttctgctgga 900

ggccacagca aacctcctca cagcccactg gtcctcaaga ggtgccacgt ctccacacat 960

cagcacaact acgcagcgcc tccctccact cggaaggact atcctgctgc caagagggtc 1020

aagttggaca gtgtcagagt cctgagacag atcagcaaca accgaaaatg caccagcccc 1080

aggtcctcgg acaccgagga gaatgtcaag aggcgaacac acaacgtctt ggagcgccag 1140

aggaggaacg agctaaaacg gagctttttt gccctgcgtg accagatccc ggagttggaa 1200

aacaatgaaa aggcccccaa ggtagttatc cttaaaaaag ccacagcata catcctgtcc 1260

gtccaagcag aggagcaaaa gctcatttct gaagaggact tgttgcggaa acgacgagaa 1320

cagttgaaac acaaacttga acagctacgg aactcttgtg cgtaaggaaa agtaa 1375

Claims (10)

1.c-MYC基因或c-MYC RNA或c-MYC基因编码蛋白的抑制剂用于筛选或制备预防/治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关疾病的药物的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抑制剂选自抗体、小分子化合物、microRNA、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、核酸适配体、基因编辑器中的任意一种或多种的组合。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述功能性细胞包括心肌细胞、胰岛细胞、神经元、多巴胺神经元、肺泡上皮细胞、真皮细胞或其组合。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述c-MYC基因的核苷酸序列选自以下各组：

(a)编码如SEQ ID NO.4所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.5所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.5所示序列的同源性≥95％的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.5所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述c-MYC基因编码蛋白的氨基酸序列选自以下各组：

(i)具有SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的同源性≥90％的多肽。

6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述c-MYC基因来源于哺乳动物。

7.c-MYC基因作为治疗靶点在筛选或制备预防/治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关疾病的药物的用途。

8.一种筛选预防/治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关疾病的药物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试药物，并观察所述测试组的细胞中c-MYC的表达量(E1)和/或活性(A1)；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试药物，并观察对照组的所述细胞中c-MYC的表达量(E0)和/或活性(A0)；

其中，如果测试组中细胞的c-MYC的表达量(E1)和/或活性(A1)显著低于对照组同时细胞PARP1依赖性细胞死亡显著减少，就表明该测试药物是对c-MYC的表达和/或活性有抑制作用的预防和/或治疗功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡相关的疾病的候选化合物；

2)对于步骤1)中获得的候选药物，进一步测试其对抑制功能性细胞PARP1依赖性细胞死亡的作用；和/或进一步测试其对C-MYC基因是否有下调的作用。

9.一种组合物，其特征在于：所述组合物包括以下组分：

(A)基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自CasRx、CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、RNA靶向基因编辑蛋白中的任意一种或多种；

和

(B)gRNA或其表达载体，所述gRNA是引导基因编辑蛋白特异性结合c-MYC基因的DNA或RNA。

10.一种药盒，其特征在于，所述药盒包括：

(A1)第一容器，以及位于所述第一容器中的基因编辑蛋白或其表达载体，或含有基因编辑蛋白或其表达载体的药物，所述基因编辑蛋白选自CasRx、CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、RNA靶向基因编辑蛋白的任意一种或多种；

(B1)第二容器，以及位于所述第二容器中的gRNA或其表达载体，或含有gRNA或其表达载体的药物，所述gRNA是引导基因编辑蛋白特异性结合c-MYC基因的DNA或RNA。

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