CN114452283A - Bmnp在保护肠道免受电离辐射损伤中的应用 - Google Patents

Bmnp在保护肠道免受电离辐射损伤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了BMNP在保护肠道免受电离辐射损伤中的应用。研究证明纳米颗粒BMNP对电离辐射诱导的放射性肠炎有很好的防护作用，能够通过清除自由基的方式抑制肠道细胞的凋亡和焦亡过程，并保护肠道干细胞免受辐射损伤，从而维护肠道稳态和功能。

Description

BMNP在保护肠道免受电离辐射损伤中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及BMNP在保护肠道免受电离辐射损伤中的应用。
背景技术
当肿瘤患者在接受腹部、盆腔或直肠放射治疗时，肠道可能会受到辐射损伤。其主要症状包括厌食、呕吐、脱水、疼痛、腹胀、腹泻、恶心、全身感染和直肠出血，在极端情况下还可能出现感染性休克和死亡,即放射性肠病，它是一种进行性、缺血性、促纤维化的病理过程。放射性肠病根据放射治疗后出现的时间分为早期性或延迟性放射性肠病。延迟性放射性肠病主要表现为血管硬化和进行性肠壁纤维化,是癌症幸存者的主要问题之一；更为致命的是发生在放射治疗后3个月内的早期性放射性肠病(肠道辐射毒性)，其产生的原因是克隆原性隐窝细胞死亡、上皮屏障破坏和粘膜炎症。肠上皮是一个由重复的隐窝-绒毛单位组成的单层组织。大量研究表明，具有有丝分裂活性的Lgr5+ISCs，通常称为隐窝基底柱状体干细胞或CBCs，位于隐窝的增殖龛中，每个隐窝的肠干细胞数量在4到6个之间，他们可以产生快速增殖的转运扩增(TA)细胞。后者又可以分化为肠细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞，这些细胞在“出生”后平均5天向上迁移、分化并从绒毛尖端丢失。因此，单个Lgr5+肠干细胞就可以不断产生肠上皮的所有子代分化细胞类型，并具有自我更新的能力，是辐射暴露后维持常稳态和肠再生不可缺少的细胞。不同地是，另外一种细胞Paneth细胞，它们向下迁移到隐窝的底部并维持长达2个月，这对维持上皮细胞更新至关重要。此外，Paneth细胞作为一种分泌性肠上皮细胞，可产生溶菌酶。这些细胞对于维持肠道内稳态同样重要。肠道上皮细胞经历快速转换，肠道一旦经历辐射损伤，上述细胞出现大量死亡，可触发再生反应来修复损伤。在小鼠体内，大多数上皮细胞在3到5天内被替换。肠上皮细胞，特别是肠干细胞的高增殖率使肠道成为最易受辐射损伤的器官之一，这也是腹部或盆腔肿瘤患者放射治疗产生毒副作用的最重要原因。目前，放射性肠病几乎没有可用的治疗手段。临床上传统的止泻剂、止吐剂、解痉剂和消泡剂是治疗急性肠道毒性的主要药物，但是却不能从根本上缓解辐射对小肠造成的损伤。有研究发现许多小分子化合物通过促进Lgr5+肠干细胞的增殖和分化，对IR诱导的肠损伤起到保护作用。然而，它们大多处于临床前研究阶段，尚未实现临床转化。因此，开发高效低毒的放射性肠损伤防护剂尤为重要。
随着纳米技术的发展，纳米科学几乎渗透至科学研究的各个领域，尤其在生物医学方面，纳米材料发挥着越来越重要的作用。聚多巴胺(BMNP)作为一种纳米材料，是一种黑色素的合成类似物，通过多巴胺单体的一系列氧化聚合反应生成。由于它与皮肤中自然产生的黑色素非常相似，因此具有极好的生物相容性。但BMNP能否在放射性肠病中发挥作用尚无文献报道。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供BMNP在保护肠道免受电离辐射损伤中的应用，用于解决现有技术中缺乏生物体遭受电离辐射时导致的肠道损伤药物的问题。
本发明一方面提供了BMNP在制备保护肠道免受电离辐射损伤药物中的用途。
进一步地，所述药物具有至少以下功效之一：
抑制ROS产生；
改善小肠的隐窝绒毛结构和功能损伤；
缓解TBI诱导的Lgr5+(ISCs)及其子代细胞的减少；
降低了小肠细胞的凋亡；
降低了小肠细胞的焦亡；
降低小鼠受全身照射诱导的致死率。
进一步地，所述BMNP的平均粒径为200-250nm，优选为210.3nm，多分散指数为0.074。
所述BMNP可以通过市购获得，也可以通过本领域技术人员自行制备，所述制备方法可采用如下文实施例中记载方案。
进一步地，所述电离辐射可以为放疗引起或者其他意外遭受辐射情况，因此电离辐射可以是生物体全身或者部分遭受电离辐射。例如，如果是针对生物体放射治疗，其辐射剂量一般大于7.5Gy。
本发明的另一方面提供了一种保护肠道免受电离辐射损伤药物，所述药物包含治疗有效剂量的BMNP。
进一步地，所述药物具有至少以下功效之一：
抑制ROS产生；
改善小肠的隐窝绒毛结构和功能损伤；
缓解TBI诱导的Lgr5+(ISCs)及其子代细胞的减少；
降低了小肠细胞的凋亡；
降低了小肠细胞的焦亡；
降低小鼠受全身照射诱导的致死率。
进一步地，所述药物中还包含人体可接受的辅料。
进一步地，所述药物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
进一步地，所述药物可在对象遭受辐射之前服用。
本发明的另一方面提供了一种保护肠道免受电离辐射损伤药物组合物，所述药物组合物的有效成分之一为治疗有效剂量的BMNP。
如上所述，本发明的BMNP在保护肠道免受电离辐射损伤中的应用，具有以下有益效果：
我们的研究证明纳米颗粒BMNP对电离辐射诱导的放射性肠炎有很好的防护作用，能够通过清除自由基的方式抑制肠道细胞的凋亡和焦亡过程，并保护肠道干细胞免受辐射损伤，从而维护肠道稳态和功能。
附图说明
图1A.BMNP合成的模式。
图1B.BMNP粒径大小分布。
图1C.BMNP的SEM图像(比例尺:2μm)。
图1D.BMNP的TEM图像(比例尺:200nm)。
图1E.BMNP的的元素组成图。
图1F.不同浓度的BMNP在800nm处的吸光度。
图1G.不同浓度的BMNP的[·OH]ESR光谱。
图1H.不同浓度的BMNP的ESR峰值直方图。数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图1I.BMNP的Zeta电位分布。
图2A.暴露于7.5Gy IR后小鼠的Kaplan-Meier生存分析(n＝10)。
图2B.10Gy IR后肠的解剖外观。
图2C.10Gy IR后肠的H&E染色(比例尺＝50μm)。
图2D.每个视野内的隐窝数量统计图。数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图2E.每个视野内的隐窝深度统计图。数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图2F.暴露于15Gy ABI小鼠的Kaplan-Meier生存分析，n＝10。
图3A.7.5Gy辐射伤后粪便形态。
图3B.5Gy辐射伤后粪便计数(n＝3)。数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图3C.5Gy辐射伤后粪便计数(n＝3)。数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图3D.10Gy辐射伤后血清中FITC-葡聚糖的水平(n＝3)。数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图3E.10Gy辐射伤后血清中DAO的水平(n＝3)。数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图3F.10Gy辐射后ZO-1的表达(n＝3，比例尺＝50μm)。
图3G.每个视野内ZO-1染色阳性比例(n＝3)。数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图3H.10Gy辐射后PAS染色(n＝3，比例尺＝50μm)。
图3I.每个视野内的杯状细胞数(n＝3)。数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图4A.10Gy辐射后隐窝中FISH Lgr5+细胞的变化。
图4B.每个视野中Lgr5+细胞计数(n＝5)。数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图4C.10Gy TBI后Paneth细胞溶菌酶免疫组化染色。
图4D.每5个隐窝中溶菌酶细胞计数。数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图4E.10Gy辐射后肠绒毛蛋白的表达(比例尺:50m)。
图4F.每个肠绒毛中Villin+细胞的数量(n＝15)。数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图4G.10Gy辐射后小鼠小肠Ki67染色。
图4H.每5个隐窝中Ki67+细胞计数。数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图5A.10Gy TBI后TUNEL染色。
图5B.每个视野中TUNEL阳性细胞数(n＝5)。数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图5C.Western blot分析10Gy TBI组织凋亡和炎症蛋白的表达。
图5D.Western blot分析10Gy TBI组织中焦亡蛋白的表达。
图5E.10Gy TBI后代表性的8-OHdG染色图像(比例尺:50μm)。
图5F.每个视野中8-OHdG阳性细胞定量(n＝3)。数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图5G.Western blot检测8Gy辐照后细胞中凋亡和焦亡蛋白的表达。
图5H.Western blot检测8Gy辐照细胞中焦亡蛋白的表达。
图5I.采用CCK-8法检测HIEC细胞毒性。(n＝3)数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图5J.8Gy照射前用8μg/ml BMNP预处理HIEC细胞，用CCK-8法测定细胞活力。(n＝3)数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
图5K.8Gy照射前分别用8μg/mL BMNP和50μM多巴胺预处理HIEC细胞，用CCK-8法测定细胞活力。(n＝3)数据以均数±SEM表示，*p<0.05,**p<0.01。
具体实施方式
在腹部或骨盆肿瘤的放射治疗过程中，肠道可能会受到损伤。这种进展性疾病几乎没有可用的治疗，并可能导致大量的长期的发病率和死亡率。新型纳米材料BMNP已被证明具有良好的活性氧清除能力和抗炎活性，具有作为活性氧清除剂和抗炎因子的潜力，BMNP对辐射诱导的肠道损伤的治疗效果和机制尚未确定。
相较于传统的小分子药物，纳米材料大大增加了药物的比表面积，增加了药效发挥量，发挥器官靶向作用，提高了药物的生物利用度。目前，一些药物和聚合物被制成纳米颗粒，用于预防和治疗各种疾病，包括药物传递、癌症治疗、抗菌材料、潜在疫苗佐剂等。其中，部分具有固有抗氧化特性的纳米材料具备成为生物相容性好的自由基清除剂。有研究报道黑色素纳米颗粒是有效的辐射防护剂，可防止辐射诱导小鼠造血和DNA损伤并具有清除自由基和免疫调节剂的特性。黑色素类似物多巴胺的特殊结构决定了其在各种生命过程中的关键作用。其结构中存在的不同官能团，如胺、亚胺和邻苯二酚基团，可以作为各种不同共轭反应的起点。在碱性条件下，DA中的邻苯二酚基团经历快速氧化形成醌基，巯基或胺基可通过Michael加成或Schiff碱反应生成BMNP纳米颗粒。与类真黑素性质相同，BMNP纳米颗粒显示出优异的清除自由基的特性。单剂量BMNP纳米粒注射后的急性腹膜炎和急性肺损伤小鼠模型证实了这一特性。但BMNP纳米颗粒对电离辐射诱导的肠道损伤的影响尚不清楚。
在本研究中，我们研究了BMNP是否对肠道具有辐射防护作用。在这里，我们证明给予BMNP不仅可以降低小鼠免受全身照射(TBI)诱导的致死率。且还可以改善小肠的隐窝绒毛结构和功能损伤。此外，BMNP治疗显著缓解了TBI诱导的Lgr5+(ISCs)及其子代细胞(包括溶菌酶Paneth细胞、绒毛肠细胞和Ki67瞬时扩增细胞)的减少，从而促进TBI后的小肠修复,并且降低了小肠的凋亡以及焦亡。细胞实验与动物实验一致。这些数据表明，BMNP可能通过抗凋亡及焦亡保护辐射诱导的肠道损伤。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实验方法：
BMNP的合成及表征
将90mg盐酸多巴胺(购自Abmole Bioscience,Shanghai,China)溶解于45mL超纯水中，以制备含有盐酸多巴胺的水溶液(pH 9.8)。溶液搅拌加热至50℃，快速加入380μL 1MNaOH，所得产品呈淡黄色。大力搅拌反应6小时后，溶液的颜色逐渐从透明变为淡黄色，最后变为深棕色。11000rpm，25分钟离心4次，以去除多余的未反应物。收集沉淀，溶于超纯水定容，取0.5mL冻干称重定量,4℃储藏备用。
分别使用扫描电子显微镜(SEM)(Regulus-8230)和纳米粒度分析仪ZS90(Malvern,UK)对合成的BMNP的尺寸和多分散指数(PDI)进行表征。在扫描电镜下，将溶液样品取5μl滴在硅片上烘干，BMNP粉末精细地粘在导电胶上，并在样品表面喷铂60s。对于DLS，将分散在水中的10μL BMNP(5mg/ml)添加到玻璃反应杯中的990μL水中，用移液器充分吹打混匀，并进行测量。
ESR
利用电子自旋共振(ESR 5000，China)仪记录DMPO-OH特征波谱，取400mmol/L 5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)、0.4mmol/l硫酸亚铁按、去离子水(pH4.5)、4％H2O2各10UL迅速混匀，吸人石英毛细管中，反应30S后在330-340mT之间进行ESR波谱扫描。观察BMNP对Fenton反应瞬时产生羟自由基([·OH])的清除能力,将不同浓度梯度的BMNP 10μL依次加入Fenton反应体系，用DMPO捕捉，用ESR记录特征波谱，重复上述操作，观察ESR波谱。
动物
6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠(平均体重约20g)购自斯贝福(北京)生物科技有限公司，饲养于解放军火箭军特色医学中心动物房。所有实验程序均按照《实验动物护理和使用指南》(第8版，美国国家科学院出版社，华盛顿特区，2011年)进行，并由IRM、CAMS机构动物护理和使用委员会批准(许可证编号2017053)。动物按照《中国国家动物福利法》的指导方针进行护理。
辐照和处理
小鼠暴露于剂量率为1.0Gy/min(225kV,13.2mA)的X射线(VWAT)。在生存实验(n＝10)和粪便收集中，小鼠暴露于7.5Gy TBI。其余实验暴露于10Gy TBI。将小鼠随机分为以下4组：(1)对照组；(2)BMNP组；(3)IR组；(4)IR+BMNP组。IR+BMNP组中的每只小鼠在照射前24小时和2小时通过灌胃给予5mg/kg BMNP。对照组和IR组中的小鼠均给予载体处理。HIEC和MODE-K细胞暴露于单一剂量的8Gy X射线照射，同时设置相同条件下的平行对照细胞。
组织学分析
IR后第1天和3.5天，处死小鼠，取小肠，苏木精-伊红(H&E)染色，显微镜下分析。对于形态学分析，使用光学显微镜(Nikon,JPN)和ImageJ软件以盲法测量绒毛长度和隐窝数量。
FITC-葡聚糖渗透性测定
在AIR后第3天，用0.6mg/g体重的FITC-葡聚糖溶液(4kD大小；Sigma)对动物进行管饲。灌胃后4小时，处死小鼠并通过眼球取血获得血清。使用在酶标仪(Varioskan FlashVarioska,MA)490nm处测量样品荧光强度以确定不同处理组中FITC-葡聚糖的血清水平。
免疫组化分析
获取小鼠的整个小肠并固定在4％甲醛中，脱水，包埋在石蜡中，切成3μm厚的切片，苏木素、高碘酸希夫(PAS)和免疫组织化学试剂(IHC)染色，石蜡包埋小肠的3μm厚切片用柠檬酸盐缓冲液脱蜡和再水化。然后，根据标准程序将切片在10mM/L柠檬酸盐缓冲溶液(pH 9.0)中煮沸以进行抗原修复。抗原修复后，切片与血清室温孵育1小时以封闭非特异性抗原结合位点；然后，将切片与Ki67抗体(1:800稀释，Servicebio)、抗溶菌酶(1:1000稀释，Servicebio)、ZO-1抗体(1:200稀释，Servicebio)或抗绒毛(1:2000稀释，Servicebio)在4℃下孵育过夜。然后将切片在二抗中37℃孵育1小时。使用DAB试剂盒检测阳性细胞。苏木素复染细胞核。捕获图像，并通过显微镜客观量化阳性染色。
免疫荧光分析
如上所述对石蜡包埋的小肠切片进行抗原修复，然后用PBS彻底清洗。切片在室温下滴加BSA封闭30分钟，然后与抗8-OHdG(Cell Signaling Technology,MA)一起在4℃下孵育过夜。用PBS洗涤后，切片在二抗中37℃避光孵育50分钟。最后用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的密封剂密封切片。这些图像是通过荧光显微镜捕获的。
荧光探针原位杂交
如上所述对石蜡包埋的小肠切片进行抗原修复并消化，然后用PBS彻底清洗。滴加预杂交液，37℃孵育1h,倾去预杂交液，滴加含探针Lgr5+杂交液，浓度1μM，恒温箱42℃杂交过夜。充分洗涤杂交液并用DAPI复染核。切片于正置荧光显微镜(Nikon,JPN)下观察并采集图像。
TUNEL检测
根据试剂盒的协议处理3μm厚的切片。通过光学显微镜分析切片。
蛋白质印迹
小鼠肠组织或细胞用RIPA裂解缓冲液蛋白酶和磷酸酶抑制剂充分研磨并放置在4℃下裂解。使用BCA Protein Assay试剂盒(Beyotime，China)测定蛋白质浓度。20μg总量通过10％SDS-PAGE分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad，美国)。膜在室温下用5％脱脂牛奶在Tris缓冲盐水(TBST)中封闭1h，然后与抗体TNF-α,IL-6,Caspase-1,GSDMD(1:1000,Abcam,Cambridge,UK),Caspase-3,Bax,Bcl-2,AIM2,IL-18,IL-1β(1:1000,CellSignaling Technology,MA),GAPDH(1:1000,YTHX Biotechnology Co.,Ltd,China)。在4℃下孵育过夜。在TBST中洗涤膜3次(每次10min)后，将二抗(1:5000，Abcam，UK)在室温下孵育1h，然后用TBST洗涤3次(每次10min)。使用凝胶成像系统(Chemidoc MP,China)检测蛋白质条带。
统计
使用Graphpad Prism 7(San Diego,CA,USA)，进行统计分析。所有结果数据均以平均值±标准误差表示。统计差异性两两比较采用t检验，多组间比较采用方差分析(ANOVA)进行评估。P<0.05被认为具有统计学意义。
实施例1 BMNP的合成及表征
在碱性条件下，通过多巴胺的氧化和自聚合很容易制备BMNP(图1A)。反应溶液的颜色由透明到浅黄色，再到深棕色。DLS数据显示，BMNP的平均水动力粒径为210.3nm(图1B)，多分散指数为0.074。BMNP的zeta电位为-18.9mV(图1I)，这对保持良好的胶体分散稳定性至关重要。具有代表性的SEM和TEM图像如图1C和图1D所示，所制备的BMNP呈球形，分散性好，形状均匀，结构致密，直径在107～183nm之间。BMNP的元素分析表明，碳原子率占75.43％，氧原子率占18.07％，硅原子率占6.5％(图1E)。这些结果表明BMNP的制备是成功的。BMNP溶液在800nm处的吸光度与质量浓度呈线性关系(图1F)。这一特性可用于纳米粒子的精确定量。通过ESR检测BMNPs对氧自由基的清除能力(图1G)，从而对其抗氧化性能进行测定。BMNPs具有清除氧自由基的能力，且随着药物浓度的依次增大，其清除率也越高(图1H)。
实施例2 BMNP可提高TBI后小鼠的存活率并减轻肠损伤
为了评估BMNP对致死剂量照射小鼠的辐射保护作用，在TBI前24小时和2小时口服5mg/kg BMNP(图2A)，并对小鼠进行长达30天的监测。IR组小鼠11d内全部死亡，而IR+BMNP组小鼠2只存活至30d，存活率显著提高至20％，TBI后平均生存时间从6d(IR组)提高至10.2d(IR+BMNP组)(图2B)。同样，我们用15Gy ABI治疗小鼠，与BMNP治疗组(IR+BMNP组；)(图2F)。照射后，肠绒毛可能受到不同程度的破坏和缩短。为了确定BMNP对小鼠肠道辐射损伤的保护作用，我们研究了小鼠肠道的一般变化。照射后3天，IR使肠内内容物减少，导致肠内容物向肠壁外泄，使肠和肠粘膜变薄，导致大量水样腹泻。BMNP治疗后，损伤减轻，肠内容物恢复正常。H&E染色进一步证实了上述现象(图2C)。与对照组相比，IR组小鼠上皮坏死、绒毛长度、炎症细胞浸润、隐窝减少明显(图2D-E)。然而，BMNP处理的小鼠小肠组织病理损伤更少，上皮厚度增加，存活的隐窝更多，绒毛更高。因此，我们认为BMNP可以减轻TBI所致小鼠的肠道损伤。
实施例3 BMNP保护TBI后的肠道功能
粪便形态和数量是判断肠道功能的重要指标。我们观察了照射后粪便形态、数量和重量的变化。IR组的粪便发生了显著变化(图3A)，0、1、3、7d的粪便数量(图3B)和重量(图3C)逐渐减少。BMNP给药组虽然粪便数量也有所减少，但总体数量差异不大。血清中FITC-D已被用作评价肠细胞旁通透性的指标。与IR组相比(图3D)，BMNP治疗显著降低了血清中FITC-D的摄取。此外，血清中的DAO通常被认为是肠道通透性的间接指标，这进一步证实了BMNP可以维持肠道正常的屏障功能(图3D)。对小鼠小肠紧密连接蛋白ZO-1进行免疫组化分析。与IR组相比，BMNP降低了血清中DAO的水平(图3E)，减轻了辐照引起的肠道紧密连接蛋白ZO-1的下降(图3F-G)。杯状细胞(GCs)是一种特殊的上皮细胞，分布在粘膜表面，通过分泌粘液来维持粘膜屏障。GCs数量在照射后1天显著下降至55.5％(图3H-I)，而BMNP治疗显著防止了这种变化；BMNP组肠内GCs数为93.8％，表明BMNP能有效抑制IR诱导的GCs下降。这些结果表明BMNP可能对IR诱导的肠损伤有保护作用。
实施例4 BMNP促进TBI后肠道干细胞的存活和再生
单个Lgr5+ISCs可以在体外生成小肠类器官，包括所有分化肠细胞类型。当Lgr5+ISCs丢失时，后代细胞的数量会减少。为评价BMNP对小鼠隐窝细胞增殖和分化的影响，阐明BMNP在小鼠肠道细胞保存和再生中的作用，采用FISH或IHC染色法对ISCs(Lgr5+)、Paneth细胞(Lysozyme+)、CBCs(Ki67+)和肠道细胞(Villin+)进行染色。我们发现，IR治疗3.5天后，BMNP治疗组Lgr5+ISCs数量增加(图4A-B)，分化为更多Paneth细胞(图4C-D)和绒毛状肠细胞(图4E-F)。增殖标志物Ki67通常在CBC中呈阳性。Ki67免疫染色识别增殖细胞，提示细胞处于循环再生状态。在BMNP处理的小鼠中，Ki67的表达较照射组增高(图4G-H)，说明在IR诱导的损伤后，肠道细胞恢复正常。因此，BMNP可能通过促进Lgr5+ISCs的增殖和分化，对IR诱导的肠道损伤起到保护作用。
实施例5 BMNP减少TBI后小肠的凋亡和焦亡及DNA损伤
为了评估BMNP对IR诱导的细胞凋亡的影响，我们在TBI后24h监测了小鼠肠隐窝上皮细胞的凋亡(图5A-B)。小鼠肠隐窝中凋亡细胞核数量增加，BMNP治疗逆转了这一现象。我们的研究发现凋亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18显著增加。这些数据表明BMNP可以通过抑制细胞凋亡和焦亡途径来改善IR诱导的肠道损伤(图5C-D)。此外，IR组肠道炎症标志物TNF-α、Il-6水平明显升高，BMNP逆转了这一现象。这些结果在接下来的体外实验中得到了进一步的验证(图5G-H)。采用HIEC方法研究BMNP介导的辐射防护机制。首先，我们采用CCK-8法评价BMNP对细胞活力的影响。低于20μg/ml的BMNP对HIEC细胞的增殖无细胞毒性作用(图5I)。然后，为了确定BMNP的辐射保护作用，在8Gy IR前用8μg/ml BMNP预处理HIEC细胞，并测定细胞活力(图5J)。结果表明，IR可降低细胞活力，而BMNP可逆转细胞活力。因此，后续实验中使用浓度为8μg/ml的BMNP。
清除自由基已被证明是最有效的辐射防护方法。我们采用ESR法检测BMNP对氧自由基的清除能力(图1G-H)。如图所示，BMNP具有良好的清除氧自由基的能力。清除率随BMNP浓度的增加而增加。如果[·OH]自由基攻击DNA中的鸟嘌呤碱，则会转化为8-OHdG。8-OHdG染色结果显示，10Gy X线照射1d和3.5d时肠隐窝中8-OHdG升高，BMNP治疗可抑制8-OHdG升高(图5E-F)。我们的研究表明，纳米材料BMNP通过抑制8-OHdG的生成，在预防IR诱导的DNA损伤中发挥了关键作用。我们在体外证明BMNP具有放射保护作用，而其多巴胺单体表现不佳(图5K)。然而，BMNP对电离辐射引起的肠道损伤的作用尚不清楚。本研究提示BMNP对放射性肠病有较好的保护作用；BMNP治疗使肠道内容物保持接近正常状态，小肠杯状细胞数量增加，FITC-葡聚糖和DAO进入血清的摄取明显减少，缓解了照射后肠道紧密连接蛋白ZO-1的下降，随着药物浓度的增加，[·OH]清除率增加，8-OHdG的形成减少，IR暴露后肠上皮内细胞凋亡和焦亡炎症反应减轻。
分析与讨论
BMNP的粒径主要分布在10nm之间，平均水动力粒径为210.3nm。Zeta电势的测定结果显示BMNP粒子在水溶液中带负电，平均电势为-18.9mV，具有良好的稳定性。通过SEM对BMNP的形态和尺寸进行表征。SEM图像显示BMNP纳米颗粒呈球形，分散良好且未出现聚集，其直径为107～183nm。BMNP的元素分析显示，碳和氧元素原子数量占比别为75.43％和18.07％。
通过ESR检测BMNP对氧自由基的清除能力，从而对其抗氧化性能进行测定。BMNP具有清除氧自由基的能力，且随着药物浓度的依次增大，其清除率也越高。小鼠接受辐射后，小肠绒毛可能发生不同程度的断裂和缩短。隐窝上皮以及绒毛上皮细胞衰减、增生和隐窝严重缺失、高度缩短导致上皮细胞稳态和上皮紧密连接完整性降低。辐射暴露可引起病理生理学损伤，包括上皮细胞空泡化、绒毛缩短和炎性细胞浸润。我们给予BMNP治疗可诱导肠上皮的修复和再生，保留了辐射暴露后小肠组织的正常隐窝绒毛结构，维持了肠道细胞的再生能力，并提高对致死剂量照射的存活率。
单个Lgr5+细胞可以在体外产生“迷你肠道”结构，包括所有分化的肠道细胞类型。随着Lgr5+干细胞的丢失，其子代细胞的数量减少。我们发现，3.5天后，BMNP治疗组的Lgr5+肠干细胞数量增加，TBI后的Lgr5+肠干细胞分化为更多的潘氏细胞和绒毛肠细胞。CBC细胞通常对增殖标记物Ki67呈阳性，对Ki67免疫染色识别增殖细胞，表明细胞通常处于循环状态，是上皮层再生的标志，在BMNP处理的小鼠中，Ki67的表达增加，表明肠细胞在IR诱导的损伤后恢复。因此，BMNP可能通过促进Lgr5+肠干细胞的增殖和分化，对IR诱导的肠损伤起到保护作用。上皮屏障功能是胃肠道的第一道防线，防止细菌毒素扩散到肠粘膜，最终进入体循环。紧密连接是一种高度特化的细胞间连接，使胃肠道上皮具有屏障功能。右旋糖酐是一种不易消化的多糖，分子量为3-kDa至2000kDa。一旦口服，这种荧光标记物就会穿过胃肠道并被动穿过肠上皮。血浆中4-kDa FITC葡聚糖的浓度可通过荧光计轻松测定，代表肠上皮细胞旁通透性的测量。BMNP处理组在辐照后维持肠道内容物接近正常状态，减轻水样便，显著降低血清FITC-葡聚糖的摄取，缓解辐射导致的肠道紧密连接蛋白ZO-1的减少，从而维系肠道正常的屏障功能。
这些结果表明BMNP可能对辐射诱导的肠道损伤具有保护作用。在放射治疗期间，IR与生物系统相互作用导致肠道干细胞损伤，其中很大一部分原因是产生自由基或活性氧(ROS)造成的。ROS攻击细胞核中的DNA、蛋白质和膜脂等关键大分子，并诱导Lgr5+肠干细胞损伤，以及潜在的细胞功能障碍和死亡，破坏整个绒毛结构，这一过程是不可修复的。由于肠上皮是体内增殖最快的组织之一，肠隐窝上皮细胞在IR暴露后容易发生凋亡。细胞凋亡是辐射诱导的一种主要细胞死亡类型，辐射介导的线粒体损伤导致线粒体膜电位降低、Caspase-3激活和Cyto C释放的紊乱。Bax是一种促进死亡的蛋白，Bcl-2是一种抑制死亡的蛋白。在体内和体外模型中，BMNP治疗可有效减少IR诱导的细胞凋亡。
除细胞凋亡外，细胞焦亡是一种新近提出的参与氧化应激的细胞程序性死亡方式，又称炎性坏死。尽管利用Western Blot检测发现电离辐射能够上调Caspase-1，从而导致GSDMD的剪切，以及焦亡通路的激活，促进下游细胞因子IL-1β和IL-18的成熟和释放。
DNA氧化损伤可以导致细胞(尤其是干细胞)的氧化应激。ROS的典型代表，是具有极强攻击力的羟基自由基(·OH)。如果·OH自由基进攻DNA中的鸟嘌呤碱基，则生成鸟嘌呤碱基自由基，进一步生成8-羟基-2’-脱氧鸟嘌呤核苷(8-OHdG)。我们的研究表明，BMNP具有清除氧自由基的能力，且随着药物浓度的依次增大，其清除率也越大，ROS和8-OHdG在IR暴露后在肠上皮细胞中被诱导，随后被BMNP抑制。这些结果证实了BMNP可以通过抑制8-OHdG的生成从而对抗辐射诱导的DNA损伤，
由此我们认为纳米材料BMNP通过抑制ROS产生，清除羟自由基，减轻凋亡/焦亡双通路对肠道的影响发挥辐射防护作用，进而保护肠道干细胞和肠屏障功能。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (7)

1.BMNP在制备保护肠道免受电离辐射损伤药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物具有至少以下功效之一：
抑制ROS产生；
改善小肠的隐窝绒毛结构和功能损伤；
缓解TBI诱导的Lgr5+(ISCs)及其子代细胞的减少；
降低了小肠细胞的凋亡；
降低了小肠细胞的焦亡；
降低小鼠受全身照射诱导的致死率。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述BMNP的平均粒径为200-250nm。
4.一种保护肠道免受电离辐射损伤药物，所述药物包含治疗有效剂量的BMNP。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物具有至少以下功效之一：
抑制ROS产生；
改善小肠的隐窝绒毛结构和功能损伤；
缓解TBI诱导的Lgr5+(ISCs)及其子代细胞的减少；
降低了小肠细胞的凋亡；
降低了小肠细胞的焦亡；
降低小鼠受全身照射诱导的致死率。
6.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述药物中还包含人体可接受的辅料。
7.一种保护肠道免受电离辐射损伤药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效成分之一为治疗有效剂量的BMNP。
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