CN114450014A - 活化淋巴细胞性细胞和使用其治疗癌症和感染性病症的方法 - Google Patents

活化淋巴细胞性细胞和使用其治疗癌症和感染性病症的方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于治疗具有HIV、癌症、病毒感染或细菌感染的患者的方法，所述方法包括施用有效量的活化淋巴细胞性细胞组合物。还提供了用于使用所述活化淋巴细胞性细胞组合物调节免疫系统的相关组合物、试剂盒和方法。

Description

活化淋巴细胞性细胞和使用其治疗癌症和感染性病症的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年6月14日提交的美国临时申请第62/861,487号的优先权，所述美国临时申请通过引用完整并入本文。
发明领域
本文提供了治疗具有人免疫缺陷病毒(HIV)、癌症、病毒感染或细菌感染的患者的方法，所述方法包括施用包含活化淋巴细胞性细胞比如自然杀伤(NK)细胞的细胞组合物。还提供了用于使用此类活化细胞调节免疫系统的相关组合物、试剂盒和方法。
背景技术
自然杀伤(NK)细胞是先天淋巴细胞，其对于通过分泌细胞因子和趋化因子以及通过释放细胞毒性颗粒，介导抗病毒和抗癌免疫是重要的(Vivier等人.Science 331(6013):44-49(2011)；Caligiuri,Blood 112(3):461-469(2008)；Roda等人，Cancer Res.66(1):517-526(2006))。因而，NK细胞是身体防御系统的一部分，并且充当防御像病毒之类的入侵者和感染的“军队”。类似地，NK细胞是对抗癌症的重要免疫效应细胞。
使用自体NK细胞的早期临床试验未能证明显著的临床益处。由于癌症患者中的NK细胞高度功能失调且数量减少，因此用于恢复或增加细胞溶解性NK细胞数量并增加其抗肿瘤、抗病毒和/或抗菌活性的方法和组合物是非常需要的。
发明内容
在一些实施方案中，提供了治疗具有HIV、癌症、病毒感染或细菌感染的患者的方法，所述方法包括向患者施用有效量的包含活化NK细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
在一些实施方案中，提供了用于增加有需要的患者中的免疫应答的方法，所述方法包括向患者施用有效量的包含活化NK细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
在一些实施方案中，提供了抑制患者中的HIV复制的方法，所述方法包括向具有HIV的受试者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
在一些实施方案中，提供了抑制患者中的肿瘤生长的方法，所述方法包括向具有肿瘤的患者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
在一些实施方案中，提供了抑制具有患有病毒或细菌感染的受试者中的病毒或细菌复制或繁殖的方法，所述方法包括向具有病毒或细菌感染的受试者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
在一些实施方案中，提供了活化NK细胞的方法，所述方法包括在体外使包含NK细胞的细胞组合物与至少一种细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)接触。
在一些实施方案中，提供了包含活化自然杀伤(NK)细胞的细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)活化的淋巴细胞性细胞组合物。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。
在一些实施方案中，提供了用于治疗具有HIV、癌症、病毒感染或细菌感染的患者的包含活化自然杀伤(NK)细胞的细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)活化的淋巴细胞性细胞组合物。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。
在一些实施方案中，提供了用于制备用于治疗具有HIV、癌症、病毒感染或细菌感染的患者的药剂的包含活化自然杀伤(NK)细胞的细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)活化的淋巴细胞性细胞组合物。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。
在某些实施方案中，所述细胞组合物进一步包含活化的γδT细胞(GDT细胞)。在一些实施方案中，所述细胞组合物进一步包含恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)。在一些实施方案中，所述细胞组合物进一步包含CD3 T细胞。
在一些实施方案中，在向患者施用之前，通过将细胞与至少一种细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)混合/孵育/接触来活化淋巴细胞性细胞组合物。
在一些实施方案中，细胞因子选自由IL-2、IL-15、IL-21、Flt3-L、干细胞因子(SCF)、IL-7、IL-12和IL18组成的组及其任何组合。
在一些实施方案中，将所述细胞因子与所述细胞组合物孵育/混合/接触约6-24小时。
在一些实施方案中，与细胞组合物一起孵育的细胞因子的量为约100-1000IU/ml。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过在施用淋巴细胞性细胞组合物之前施用至少一种淋巴抑制剂、化学治疗剂或免疫抑制剂3-5天，在施用活化NK细胞之前对患者进行预处理(pre-conditioning)。
仍然在另外的实施方案中，淋巴抑制剂或化学治疗剂包括多种剂(包括6TG、6-MMP)中的任何一种或其组合，以及一种或多种选自由氯法拉滨、氟达拉滨和阿糖胞苷组成的组的嘌呤类似物。
在一些实施方案中，淋巴抑制剂或化学治疗剂的剂量范围为约5mg/m2至约50mg/m2。
在一些实施方案中，化学治疗剂或免疫抑制剂包括环磷酰胺、利妥昔单抗和任选的类固醇中的任何一种或其组合。
在一些实施方案中，所述类固醇是糖皮质激素类固醇。
在一些实施方案中，所述类固醇是泼尼松。
在一些实施方案中，所述化学治疗剂或免疫抑制剂的剂量范围为约20mg/m2至约1000mg/m2(证实最低和最高可能剂量)。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在施用包含活化NK细胞的淋巴细胞性细胞组合物之前的两天和一天，以约1X106IU/m2/d至约10x106IU/m2/d的剂量向患者施用干扰素-α(IFN-α)或其生物等效物。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在向患者施用包含活化NK细胞的淋巴细胞性细胞组合物的同一天，但在施用之前至少约2-6小时，向患者施用一种或两种抗组胺药。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在施用包含活化NK细胞的淋巴细胞性细胞组合物的当天和在施用后的第一天向患者施用IL-2，并且在施用活化NK细胞后继续另外的3-14天，剂量为每剂量3-6X106IU。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在施用活化NK细胞的当天向患者施用COX-2抑制剂或非甾体抗炎药(NSAID)或其组合，并且在施用活化NK细胞后继续至少14至60天。
在一些实施方案中，COX-2抑制剂是塞来昔布或罗非昔布，并且非甾体抗炎药选自由阿司匹林、吲哚美辛(Indocin)、布洛芬(Advil，Motrin)、萘普生(Naprosyn)、吡罗昔康(Feldene)和萘丁美酮(Relafen)组成的组。
在一些实施方案中，所述NK细胞对患者而言是同种异体的。
在一些实施方案中，所述NK细胞与患者是非HLA匹配的。在一些实施方案中，所述NK细胞是经有意地HLA错配的，或KIR抑制性配体/HLA错配的。
在一些实施方案中，活化细胞的剂量范围为约3-50x106。
在一些实施方案中，所述病毒感染选自由下列病毒引起的病毒感染组成的组：逆转录病毒(例如，人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)I型和II型和人免疫缺陷病毒(HIV))、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒(HSV)I型和II型、EB病毒和巨细胞病毒)、沙粒病毒(例如，拉沙热病毒)、副粘病毒(例如，麻疹病毒属病毒、人呼吸道合胞病毒和肺炎病毒)、腺病毒、布尼亚病毒(例如，汉坦病毒)、冠状病毒、丝状病毒(例如，埃博拉病毒)、黄病毒(例如，丙型肝炎病毒(HCV)、黄热病毒和日本脑炎病毒)、嗜肝性DNA病毒(例如，乙型肝炎病毒(HBV))、正粘病毒(例如，仙台病毒和甲型、乙型和丙型流感病毒)、乳多空病毒(例如，乳头瘤病毒)、小核糖核酸病毒(例如，鼻病毒、肠道病毒和甲型肝炎病毒)、痘病毒、呼肠孤病毒(例如，轮状病毒)、披膜病毒(例如，风疹病毒)和弹状病毒(例如，狂犬病病毒)及其任何组合。在一些实施方案中，所述病毒感染是HIV。在一些实施方案中，所述病毒感染是HCV。在一些实施方案中，所述病毒感染是HBV。在一些实施方案中，所述病毒感染是冠状病毒。在一些实施方案中，所述病毒感染是COVID-19。
在一些实施方案中，癌症是血液学或血源性癌症，其选自由以下组成的组：急性白血病、急性髓系白血病、急性骨髓性白血病、成髓细胞性白血病、前髓细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞白血病、红细胞白血病、慢性白血病、慢性髓细胞(或粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓增生异常，以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，癌症是实体瘤，其选自由以下组成的组：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(比如胶质瘤(比如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、髓膜瘤(menangioma)、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移。
在一些实施方案中，所述细菌感染由以下致病细菌种之一引起：拟杆菌属、梭菌属、链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌属、军团菌属、分枝杆菌属、埃希菌属、沙门氏菌属、志贺菌属或李斯特菌属。
在一些实施方案中，患者中的移植物抗宿主病(GVHD)减少或消除，而移植物抗肿瘤(GVT)或移植物抗病毒(GVV)增加。
在一些实施方案中，当患者患有淋巴细胞性或淋巴母细胞性白血病或淋巴瘤时，IL-2的施用是反指示的，并且在施用包含活化NK细胞的淋巴细胞性细胞组合物后不予施用。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在施用包含活化NK细胞的淋巴细胞性细胞组合物后的4-14天的时间范围内，向患者施用免疫检查点抑制剂，包括两种检查点抑制剂中的任何一种或组合，包括PD-1或PD-L1(B7-H1)的抑制剂，比如抗PD-1抗体，包括纳武单抗(来自Bristol-Myers Squibb的纳武单抗)、派姆单抗/拉姆布罗力珠单抗，也称为MK-3475(来自Merck的Keytruda)、皮地利珠单抗(Cur etech)、AMP-224(Amplimmune)；或抗PD-L1抗体，包括MPDL3280A(Roche)、MDX-1105(Bristol Myer Squibb)、MEDI-4736(AstraZenec a)和MSB-0010718C(Merck)；CTLA-4的拮抗剂，比如抗CTLA-4抗体，包括抗CTLA4抗体YervoyTM(伊匹单抗，Bristol-Myers Squibb)、曲美木单抗(Pfizer)、替西木单抗(AstraZeneca)或AMGP-224(Glaxo S mith Kline)、或用于乳腺癌的肿瘤特异性抗体曲妥珠单抗(Herceptin)、用于淋巴瘤的利妥昔单抗(Rituxan)、或西妥昔单抗(Erbitux)。
在一些实施方案中，在从每月一次、到每两个月一次、到每3个月一次、到每4个月一次、到每5个月一次、到每6个月一次、或每7个月一次、或每8个月一次、或每9个月一次、或每10个月一次、或每11个月一次、或每年一次的时间范围内周期性地重复治疗或增加免疫应答作为维持治疗，只要患者表现出改善或病情稳定/无进展即可。
附图简述
图1是显示示例性治疗方案的表，所述治疗方案包括针对不同患者群体的治疗前处理、细胞输注治疗和细胞输注后治疗选项(“后处理(post-conditioning)”)。
图2A展示了非限制性治疗方案和来自根据本文所述方法治疗的HIV患者的HIV病毒载量计数。
图2B展示了非限制性治疗方案和来自根据本文所述方法治疗的HIV患者的HIV病毒载量计数。
图3A、图3B、图3C、图3D和图3E展示了总结患者数量和肿瘤类型(图3A)、治疗方案/协议(图3B)、NK细胞表征(图3C)、观察到的治疗毒性(图3D)和存活数据(图3E)的表格和示意图。
图4展示了质粒图谱，其显示了sFGFR1细胞外组分和表达载体的序列。
图5是显示癌症免疫周期的图解。
图6A、图6B、图6C和图6D是在不使用活化剂(图6A)、使用IL-2作为活化剂(图6B)、使用FGFR1作为活化剂(图6C)以及使用IL-2和FGFR1的组合作为活化剂(图6D)的72小时活化结束时NK细胞制剂的流式细胞术图像。
具体实施方式
NK细胞是先天免疫细胞，其形成抵抗病毒和肿瘤的第一道防线。虽然已经通过使用针对癌症抗原的抗体在癌症治疗方面取得显著进展，但是患者对此类抗体的反应性是可变的。对此类可变反应的研究通常集中于这些抗体对肿瘤细胞的直接抑制作用(例如生长因子受体的抑制和随后的凋亡诱导)，而这些抗体的体内作用可能更复杂，并且可能涉及宿主免疫系统。例如，此类抗癌抗体的作用机制可包括以下一种或多种：抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞因子/趋化因子产生和补体依赖性细胞毒性(CMC)。(参见，reviewVeluchamy,John等人，Front Immunol.2017；8:631)。
抗体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞因子/趋化因子产生主要是由淋巴细胞的专门亚群自然杀伤(NK)细胞介导的。NK细胞是组成第三大淋巴细胞群的效应细胞，并且对于针对肿瘤和病原体感染细胞的宿主免疫监视非常重要。
NK细胞及其活化和抑制受体
通常根据人NK细胞的CD56和CD16表达水平将其分类为两个亚群：CD56亮CD16暗和CD56暗CD16亮NK细胞。外周血和脾脏中的大多数NK细胞是CD56暗CD16亮的，并且对多种肿瘤细胞具有细胞毒性，而CD56亮CD16暗NK细胞在功能上是免疫调节的，并且在次级淋巴组织中占大多数，产生丰富的细胞因子，但是与CD56暗CD16亮NK细胞相比发挥弱的细胞毒性(参见，Cooper,M.A.等人Trends Immunol(2001)22(11):633–40)。NK细胞区分癌细胞和健康细胞的能力至少部分受到其活化受体和抑制受体之间的平衡的调节。NK活化受体，比如DNAM-1和NKG2D；天然细胞毒性受体(NCR)，比如NKp30、NKp44、NKp46、CD94/NKG2C、CD94/NKG2E和CD16a；以及活化杀伤细胞-免疫球蛋白样受体(KIR)促成NK细胞活化，从而触发NK细胞释放裂解癌细胞的细胞毒性颗粒和诸如干扰素γ(IFNγ)的促炎细胞因子。NK细胞活化受体NKG2D(CD314)识别MHC I类链相关蛋白A和B(MICA和MICB)以及ULBP，而DNAM-1与应激细胞、感染细胞和癌细胞上的CD112(连接蛋白-2)和CD155(脊髓灰质炎病毒受体)结合。在被病毒或被细胞内细菌感染的细胞上以及在肿瘤细胞上，NCR的配体广泛表达，但是它们的确切作用模式仍有待表征，以确定它们在NK细胞毒性中的作用。NKG2，也称为CD159(分化簇159)，是自然杀伤细胞的受体。有7种NKG2类型：A、B、C、D、E、F和H。NKG2D是NK细胞表面的活化受体。NKG2A与CD94二聚化，形成抑制受体(CD94/NKG2)。NKG2家族的异二聚体；CD94/NKG2C和CD94/NKG2E识别非经典MHC I类分子HLA-E，并与DAP-12分子缔合而触发NK活化信号(参见，Borrego,F.等人，J Exp Med(1998)187(5):813–8；和Pegram,H.J.等人，Immunol CellBiol(2011)89(2):216–24)。NK细胞的另一个重要活化机制是通过CD16a(FcγRIIIa，一种低亲和力的Fc受体)与IgG1抗体的Fc部分相互作用，从而形成免疫突触，所述免疫突触接合用于NK细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体调理靶标(Leibson,P.J.Immunity(1997)6(6):655–61)。除接合活化受体之外，NK细胞还利用肿瘤坏死因子α(TNF-α)、Fas配体和TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导靶细胞死亡。最突出的NK细胞抑制受体包括识别在健康组织上普遍表达的MHC I类(HLA-ABC)分子的抑制性KIR。类似地，CD94/NKG2A，一种来自NKG2家族的抑制受体，其与HLA-E结合，并通过活化细胞内免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)诱导NK细胞耐受。因此，认识到NK细胞功能是由一系列受体决定的，取决于与肿瘤细胞的不同配体相互作用，这些受体可以使活化或抑制信号增强，重要的是使治疗环境中的平衡朝向活化NK表型转移，以加速增强的NK肿瘤杀伤机制。
癌症中的NK细胞功能障碍
自然杀伤细胞可以控制循环肿瘤细胞，并且防止肿瘤转移的形成。然而，肿瘤采用不同的策略来逃避NK细胞的杀伤。抑制配体比如MHC I类分子(HLA-ABC、HLA-G和HLA-E)的上调与对NK细胞更强的抑制信号相关。此外，报道的在肾细胞癌中的抑制性NKG2A受体的表达增加导致肿瘤浸润性NK细胞的功能性降低。另一方面，NKG2D的NK活化配体比如MICA和MICB的下调以及肿瘤来源的可溶性MIC的脱落增加也损害了NKG2D介导的NK细胞肿瘤识别。最佳NK细胞功能的另一个重要特征是归巢和迁移到肿瘤部位的能力。一些研究已经将NK细胞向肿瘤组织归巢的增加与实体瘤治疗结果的改善相关联。然而，包含调节性T细胞(T-reg)、髓源性抑制细胞(MDSC)、M2巨噬细胞和未成熟树突细胞的免疫抑制性肿瘤间质严重限制了NK细胞的功能性及其进入实体瘤。在慢性疾病中，比如与人免疫缺陷病毒和巨细胞病毒感染相关的疾病，主要观察到伴随细胞因子产生减少和细胞溶解活性降低的耗尽的NK细胞。在针对乳腺癌患者的研究中，活化受体(NKG2D、DNAM、CD16和NKp30)的NK细胞表达水平降低，而抑制受体(NKG2A)的表达水平升高，并且发现NK细胞的这种明显功能障碍直接影响NK细胞的细胞毒性。类似地，来自头颈癌和乳腺癌患者的NK细胞的效应亚群(CD56暗CD16+)在体外测试时高度倾向于凋亡，因而意味着这些患者的NK细胞活性低。NK细胞功能性受损可能由肿瘤强加的抑制机制引起，并成为NK细胞靶向免疫疗法的主要障碍。因此，恢复或替代受损的NK细胞的细胞毒性的方法将用作增强调节宿主防御癌症以及细菌和病毒感染(比如HIV)的防御的有效疗法。
与自体NK细胞不同，同种异体NK细胞不受患者肿瘤的HLA表达的限制，这是增进抗肿瘤作用改善的附加优势。
活化后，NK细胞大量产生细胞因子和趋化因子，同时表现出强大的细胞溶解活性。这种NK细胞活化的优势在于，它不依赖主要组织相容性复合体(MHC)。NK细胞的活化可以通过NK细胞受体与靶细胞上的配体直接结合而发生，正如直接的肿瘤细胞杀伤所见，或可以通过经由与结合到抗原携带细胞上的抗体的Fc部分结合的Fc受体(CD16；FcγRIII)的交联而发生。这种CD16接合(CD16交联)通过细胞内信号而启动NK细胞应答，所述细胞内信号是通过CD16相关衔接链FcRγ或CD3ζ中的一者或两者产生的。触发CD16导致γ链或ζ链磷酸化，进而募集酪氨酸激酶、syk和ZAP-70，从而启动信号转导级联，导致快速且有效的效应功能。最广为人知的效应功能是释放携带毒性蛋白的细胞质颗粒，从而通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)过程杀伤附近的靶细胞。CD16交联还导致细胞因子和趋化因子产生，进而激活和协调一系列免疫应答。
细胞因子和趋化因子的这种释放很可能在活化NK细胞的体内抗癌活性中发挥作用。NK细胞在其细胞质中还具有含穿孔素和蛋白酶(颗粒酶)的小颗粒。穿孔素从活化NK细胞释放后，在靶细胞的细胞膜上形成孔，颗粒酶和相关分子可以通过这些孔进入，从而诱导细胞凋亡。活化NK细胞诱导凋亡而不是靶细胞坏死的事实很重要--病毒感染细胞的坏死会释放病毒粒子，而凋亡导致细胞内病毒的破坏。
几种NK细胞活化受体的表达和信号转导活性需要物理相关的衔接子，这些衔接子通过免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)转导信号。在这些衔接子中，FcRγ链和CD3ζ链可以与CD16和天然细胞毒性受体(NCR)缔合作为二硫键连接的同二聚体或异二聚体，并且这些链被认为由所有成熟NK细胞表达。
因而，虽然不希望受理论的束缚，本发明的方面涉及以结合特定的预处理和细胞输注后处理步骤的方案(参见图1)向患者提供一种淋巴细胞性细胞组合物，其包含有效量的活化NK细胞，或活化NK细胞与有效量的任何下列细胞的组合：活化γδT细胞(GDT细胞)；活化GDT细胞和iNKT细胞；或CD3 T细胞，从而向患者提供针对癌症或感染性疾病(包括对HIV)的改善的免疫应答。本文所述的方法和组合物与以前的方法相比具有许多优势，包括没有对饲养细胞的共培养，能够减轻不需要的T细胞调节作用，以及使细胞组合物污染的风险降低至最低限度，制备活化的细胞组合物并将其递送给患者的容易性和速度，以及来自细胞组合物的非常小的副作用，这些副作用通常仅为1级或更小的副作用，参见图3D)。这些方法还用于提供“疫苗效应”，其训练宿主、患者免疫细胞类似地识别和杀伤癌症、细菌或病毒靶标。
缩写：
抗体依赖性细胞毒性：ADCC
分化簇3：CD3
移植物抗肿瘤效应：GVT
移植物抗宿主病：GVHD
移植物抗病毒：GVV
γδT细胞：GDT细胞，也称为γδT细胞。
人免疫缺陷病毒(HIV)：一种引起获得性免疫缺陷综合征的慢病毒。
恒定自然杀伤T细胞：iNKT细胞，也称为I型或经典NK T细胞，是一个独特的T细胞群体，其表达恒定的aβT细胞受体(TCR)和许多与自然杀伤(NK)细胞共同的细胞表面分子。
自然杀伤细胞：NK细胞
为了可以更容易地理解本发明，在下文具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文件中另外特别定义，本文中使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
如本文所用且除非另有说明，术语“约”旨在表示它修饰的值的±5％。因而，约100表示95至105。另外，术语“约”修饰一系列术语中的一个术语，例如“约1、2、3、4或5”，应当理解，术语“约”修饰清单中的每个成员，使得“约1、2、3、4或5”可被理解为表示“约1、约2、约3、约4或约5”。对于被术语“至少”或其他量化修饰语修饰的清单也是如此，所述其他量化修饰语例如但不限于“小于”、“大于”等。
如本文中和所附权利要求中使用的，除非上下文另外明确指示，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
如本文所用的，术语“包含”、“具有”、“有”和“包括”及其同根词，如本文所用，意指“包括但不限于”。虽然以“包括”各种组分或步骤(解释为意为“包括但不限于”)来描述各种组合物和方法，但组合物、方法和装置也可以“基本上由各种组分和步骤组成”或“由其组成”，并且此类术语应被解释为定义基本上封闭的成员组。
如本文所用的，术语“可溶性FGFR1”是指脊椎动物成纤维细胞生长因子受体1，特别是来自智人的蛋白质，(UNIPROTKB:P11362-7,完整信息可以在万维网上以下网址找到：genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝FGFR1)。脊椎动物成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族是一组重要的蛋白质，其参与胚胎发育和成体细胞的生长和增殖。FGFR蛋白的突变可导致包括骨骼或肢体缺陷和各种形式的癌症在内的病理。FGFR蛋白是受体酪氨酸激酶，在配体结合后，它们二聚化并通过MAPK和PLCγ途径发信号。FGFR1是这个蛋白家族中充分表征的成员，由细胞外区、单次跨膜结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域组成。细胞外区含有负责与细胞外基质相互作用的肝素结合结构域，而细胞内结构域在受体二聚化后与下游效应子相互作用以传播信号(Int.J.Dev.Biol.2002；46(4):393-400)。FGFR1存在于许多可变剪接的同工型中，包括缺乏跨膜和激酶结构域的可溶性分泌型同工型。虽然它们的功能尚不清楚，但可溶性FGFR1同工型可在发育过程中结合并调节FGF配体的活性(Int.J.Dev.Biol.2002；46(4):393-400)。典型的FGFR1信号传导发生在配体结合、受体二聚化和下游效应蛋白磷酸化之后。然而，最近的研究表明内化的FGFR1被转运到细胞核，它在细胞核调节癌细胞中的靶基因表达和细胞增殖(J.Cell Biol.2012Jun 11；197(6):801-17)。(还参见，例如：Breast Cancer Res.2012年8月3日；14(4):R115)。
虽然如本文所述，对于人FGFR1有许多来源可用于活化或预处理NK细胞，特别是GDT细胞，但一个选项是使用如图4所示的表达构建体从质粒表达人FGFR1的细胞外部分并纯化。这是一个非限制性实例，并且可以使用FGFR1的任何来源。
术语“共同施用”等预期包括将选择的治疗剂施用于单个患者，并且旨在包括其中通过相同或不同施用途径或者在相同或不同的时间施用剂的治疗方案。
如本文所用的，术语“激动剂”是指这样一种化合物，其存在导致蛋白质的生物活性与存在天然存在的蛋白质配体所致的生物活性相同。
如本文所用的，术语“部分激动剂”是指这样一种化合物，其存在导致蛋白质的生物活性与存在天然存在的蛋白质配体所致的生物活性的类型相同，但数量级较低。
如本文所用的，术语“拮抗剂”是指这样一种化合物，其存在导致蛋白质生物活性的数量级降低。在某些实施方案中，拮抗剂的存在导致蛋白质生物活性的完全抑制。在某些实施方案中，拮抗剂是抑制剂。
当与治疗组合物(例如活化NK细胞或活化细胞的组合)结合使用时，“施用”是指将治疗剂直接施用到靶组织中或靶组织上，或向患者施用治疗剂，由此，治疗剂对其靶向的组织产生积极影响。
CD3蛋白由三对二聚体(εγ、εδ、ζζ)组成，它们负责由免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)(总共十个)的磷酸化引发的细胞内信号传导。CD3最初在前胸腺细胞的细胞质中表达，前胸腺细胞是在胸腺中产生T细胞的干细胞。前胸腺细胞分化为普通胸腺细胞，然后分化为髓样胸腺细胞，并且在这个后面的阶段CD3抗原开始向细胞膜迁移。发现该抗原与所有成熟T细胞的细胞膜结合，并且在其他细胞类型中实际上没有，尽管它在Purkinje细胞中以少量存在。这种高特异性，加上CD3在T细胞发育所有阶段的存在，使其成为组织切片中的T细胞的有用免疫组织化学标志物。该抗原保持存在于几乎所有的T细胞淋巴瘤和白血病中，因此可用于将它们与表面相似的B细胞和髓样肿瘤区分开来。
如本文所用的术语“受试者”或“患者”包括但不限于人和非人脊椎动物，例如野生、家养和农场动物。这些术语可以互换使用。在某些实施方案中，本文所述的受试者或患者是动物。在某些实施方案中，受试者或患者是哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，受试者或患者是非人动物。在某些实施方案中，受试者或患者是非人哺乳动物。在某些实施方案中，受试者或患者是驯养动物，例如狗、猫、牛、猪、马、绵羊或山羊。在某些实施方案中，受试者或患者是伴侣动物，例如狗或猫。在某些实施方案中，受试者或患者是家畜动物，例如牛、猪、马、绵羊或山羊。在某些实施方案中，受试者或患者是动物园动物。在另一个实施方案中，受试者或患者是研究动物，例如啮齿动物、狗或非人灵长类动物。在某些实施方案中，受试者或患者是非人转基因动物，例如转基因小鼠或转基因猪。
术语“抑制”包括施用本文实施方案的治疗剂以防止症状的发作、减轻症状或消除疾病、病症或疾患。
关于“药学上可接受的”，它表示载体、稀释剂或赋形剂必须与治疗剂的其他成分相容，并且对其接受者无害。
如本文所用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treated)”或“治疗(treating)”是指治疗性治疗和预防的或预防性措施，其中目的是抑制、预防或减缓(减轻)不希望的生理状况、疾患或疾病，或改善、抑制或以其他方式获得有益或期望的临床结果。出于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的改善或减轻；病症、疾患或疾病程度的消减；病症、疾患或疾病状态的稳定(即，不恶化)；病症、疾患或疾病的发病延迟或进展减缓；病症、疾患或疾病状态的好转；以及病症、疾患或疾病的可检测或检测不到的缓解(部分或全部)、或改进或改善。治疗包括引发临床显著反应，而没有过量水平的副作用。治疗还包括相比于在没有接受治疗的情况下的预期生存期的生存期延长。
如本文所用的，“活化NK细胞”，是指将NK细胞充分刺激为被看作是细胞毒性细胞而不是调节细胞的状态。活化也可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应功能相关。术语“活化NK细胞”尤其是指CD56暗CD16+、CD56int/低CD16-、CD56+CD16+细胞毒性细胞和/或ADCC的NK细胞。在一些实施方案中，NK细胞如本文提供是活化的。
化疗剂或淋巴抑制剂和免疫抑制剂
如本文在预处理步骤中使用的淋巴抑制剂(lymphosuppressant)或淋巴抑制剂(lymphosuppressive agent)可包括类固醇或其他免疫抑制剂，例如泼尼松或针对CD20的单克隆抗体，例如利妥昔单抗。对于表1-5中概述的期望预处理时间范围，免疫抑制剂的典型剂量在25-1000mg/m2之间。
预处理剂还可包括有效量(通常是低剂量)的化学治疗剂或抗肿瘤剂，例如硫鸟嘌呤(6TG)、6-巯基嘌呤(6-MP)和嘌呤类似物，比如氯法拉滨、氟达拉滨、阿糖胞苷中的任何一种或其组合。这些剂的典型剂量在25-1000mg/m2之间，期望时间范围在施用活化的细胞组合物前3天、4天或5天。
在某些实施方案中，可以用淋巴抑制剂或化学治疗剂比如环磷酰胺对患者进行预处理，同时给予或不给予氟达拉滨。这种预处理治疗的实例可以在例如美国专利第9,855,298号中找到。非限制性实例是施用氟达拉滨(每天静脉内施用30mg/m2，持续4天)和环磷酰胺(每天静脉内施用500mg/m2，持续2天，从第一剂氟达拉滨开始)。施用后，可在氟达拉滨完成后2至5天(即，在预处理治疗后)施用活化淋巴细胞性组合物。在某些实施方案中，以约500至约600mg/m2的剂量施用环磷酰胺2-3天。
适合于活化NK细胞以及GDT细胞和iNK细胞的活化细胞因子
适合的NK活化细胞因子可包括有效量的下列一种或多种：IL-2、IL-15、IL-21、Flt3-L、SCF、IL-7、IL-12和IL18以及它们的任何组合。这些活化细胞因子作为单一剂也是有效的，或组合用于活化NK细胞、iNKT细胞和GDT细胞。
用于输注后、处理后剂的非甾体抗炎药(NSAID)
NSAID通过减少前列腺素的产生来发挥作用，前列腺素是促进炎症、疼痛和发热的化学物质。在本文所述方法中用于控制免疫应答的消极方面的适合NSAID包括特异性COX-2抑制剂比如塞来昔布(Celebrex)以及非特异性抑制剂比如阿司匹林，以及非特异性COX-2抑制剂，比如：吲哚美辛(Indocin)、布洛芬(Advil，Motrin)、萘普生(Naprosyn)、吡罗昔康(Feldene)和萘丁美酮(Relafen)。
前列腺素通过两种不同的酶产生，环氧合酶-1(COX-1)和环氧合酶-2(COX-2)。通过这两种不同的酶产生的前列腺素对身体的影响略有不同。前列腺素E2(PGE2)是环氧合酶(COX)途径的末端前列腺素。PGE2产生的抑制可以减轻炎性症状，比如发热、关节炎和炎性疼痛。COX-2抑制剂是选择性阻断COX-2酶而不是COX-1酶的NSAID的一个亚类。阻断这种酶阻碍通过COX-2产生前列腺素，而产生前列腺素通常是炎症的疼痛和肿胀和其他疼痛病症的原因。因为它们选择性地阻断COX-2酶，而不阻断COX-1，这些药物与传统的NSAID截然不同，后者通常阻断COX-1和COX-2酶两者。COX-1是通常存在于身体的各种组织中(包括炎症部位和胃)的酶。通过COX-1产生的一些前列腺素保护胃的内膜。
常见的NSAID比如阿司匹林可以阻断COX-1和COX-2两者。当COX-1酶被阻断时，炎症减轻，但对胃内膜的保护也丧失。这可引起胃部不适以及胃甚至肠的溃疡形成和出血。
COX-2酶特别地位于通常涉及炎症的身体区域中，但不在胃中。当COX-2酶被阻断时，炎症减轻；然而，由于COX-2酶在保护胃或肠方面不起作用，因此COX-2特异性NSAID没有同样的损害胃或肠的风险。
较老的NSAID(例如，阿司匹林、布洛芬、萘普生等)都是通过阻断COX-1和COX-2酶两者的作用发挥作用。COX-2抑制剂选择性地阻断COX-2酶，并且因此具有较低的引起胃或肠溃疡的风险。
如本文所用的，术语“抗体”是指与抗原特异性地结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是源于天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体可以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用的，术语“抗原”定义为激发免疫应答的分子。这种免疫应答可以涉及抗体的产生或特定免疫活性细胞的活化，或两者兼而有之。技术人员将理解的是，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽在内，都可以用作抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。技术人员将理解的是，包含编码诱发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所用术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解的是，抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，实施方案包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以诱发期望的免疫应答。而且，技术人员将理解的是，抗原根本不必由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或可以源自生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
如本文所用的术语“癌症”被定义为其特征在于异常细胞快速且不受控制地生长的疾病。癌细胞可以局部扩散，或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
可以治疗的癌症包括未血管化或尚未显著血管化的肿瘤以及血管化肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(例如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可以包括实体瘤。将要用本文所述的活化NK细胞治疗的癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症也包括在内。
血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(比如急性淋巴细胞性白血病、急性髓系白血病、急性骨髓性白血病以及成髓细胞、早幼粒细胞、粒单核细胞、单核细胞白血病和红细胞白血病)、慢性白血病(比如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓增生异常。
实体瘤是通常不含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。将不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型加以命名(比如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤的实例，例如肉瘤和癌，包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(比如胶质瘤(比如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、髓膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
如本文所用的术语“抗肿瘤作用”是指可表现为肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加或与癌症状况相关的各种生理症状的改善的生物学作用。“抗肿瘤作用”还可以表现为肽、多核苷酸、细胞和抗体首先阻止肿瘤发生的能力。
术语“自身抗原”是指被免疫系统错误地识别为是外来的任何自身抗原。自身抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
如本文所用的，术语“自体的”意指源自同一个体的任何材料，其随后被重新引入到所述个体中。
“同种异体的”是指源自同一物种的不同动物的移植物。出于目前治疗的目的，活化NK细胞是完全HLA不匹配的，这与肾和骨髓移植中匹配HLA-A、HLA-B和HLA-DR有利于移植物存活的情况不同。在目前治疗癌症、感染性病症(包括HIV)的方法中，活化NK细胞靶向癌细胞并与之结合和杀伤它们，从而释放肿瘤细胞抗原。同种异体的活化NK细胞使这个循环自身重复，直到它们在约4-7天内(并且可能在4-15天的延长范围内)被宿主细胞免疫应答杀伤为止。因而，由于同种异体细胞寿命如此短，GVHD没有风险。然而，在跨越约4-7天的识别和杀伤肿瘤细胞并释放抗原的过程中，同种异体细胞可用于接种宿主NK和其他免疫细胞来识别和杀伤肿瘤细胞。另见评论文章Cancer Sci.2019Jan；110(1):16-22。图5是显示癌症免疫周期的图解。癌症-免疫周期。抗肿瘤免疫的诱导是一个循环过程，其可以是自传播的。它可以放大和扩展T细胞对癌细胞的应答。当靶细胞(癌细胞)被根除时，它还含有几种抑制因子本身来停止所述周期。所述周期可分为7个步骤，如图5所示，以从癌细胞释放癌抗原开始，以杀伤癌细胞结束。APC，抗原呈递细胞：DC，树突细胞。
“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
本发明涉及一种用于治疗癌症和感染性病症(包括HIV)的方法，所述方法包括施用活化淋巴细胞性细胞，包括在细胞因子以及任选的可溶性FGFR1存在下活化的基本上纯的活化自然杀伤细胞。
因此，根据本发明的一个方面，提供了在细胞因子存在的情况下，结合本文所述的预处理和后处理方案，活化从各种来源分离的自然杀伤细胞(包括外周血单核细胞)的方法。
“外周血单核细胞”、“PBMC”或“单核细胞”是指从外周血分离的单核细胞，通常用于抗癌免疫疗法。可以从使用已知方法比如Ficoll-Hypaque密度梯度法采集的人血中获得外周血单核细胞。
根据本发明的一个示例性实施方案，可以从任何适合的人获得“外周血单核细胞”。供体淋巴细胞性细胞的来源，包括诸如本文所用的外周血单核细胞等来源，需要与接受者患者同种异体，以便分离期望的淋巴细胞性细胞，包括：NK细胞、γδT细胞、iNKT细胞和CD3T细胞，用于根据本发明的抗癌、抗病毒和/或抗细菌免疫治疗方法。因而，供体抑制配体与患者(例如宿主)HLA不匹配。
示例性活化细胞因子和淋巴细胞性细胞以及NK活化
在本发明中，术语“细胞因子”是指一种免疫活化细胞因子，其可用于活化本文所述的用于本方法的任何治疗性淋巴细胞性细胞，包括基本上纯的NK细胞，并且包括从外周血单个核细胞分离的那些。根据本发明的一个示例性实施方案，IL-2、IL-15、IL-21、Flt3-L、SCF、IL-7、IL-12或IL18可以单独地或组合用作这样的细胞因子。特别地，由于已知IL-2、IL-15或IL-21为在外周血单核细胞向NK细胞的分化和NK细胞的增殖中具有优异作用的细胞因子，因此期望使用这些细胞因子的一种或多种的组合。根据本发明的一个示例性实施方案，使用IL-2，但本发明不限于此。本方法的实施方案中另外包括IL-2激动剂、IL-2同源物或其他合成的、优化的IL-2组合物。(参见美国专利第6,921,530号，其描述了用于增强免疫的低剂量IL-2)。
IL-15在分化为NK细胞中起作用。这是从这样的事实中发现的：在产生IL-15所需的转录因子干扰素(IFN)-调节因子1缺乏的小鼠中，缺乏NK细胞(Kouetsu等人，Nature391,700-703,1998)，并且在缺乏IL-15或IL-15Ra的小鼠中，没有发现NK细胞。结果，据报道，IL-15通过在NK细胞中表达的IL-15受体直接促进NK细胞的生长和分化(MrozekE等人，Blood 87,2632-2640,1996)。
IL-21是由活化CD4+T细胞分泌的细胞因子(Nature,5:688-697,2005)，并且IL-21受体(IL-21R)在淋巴细胞比如树突细胞、NK细胞、T细胞和B细胞中表达(Rayna Takaki等人，J.Immonol 175:2167-2173,2005)。IL-21在结构上与IL-2和IL-15高度相似，并且IL-21R与IL-2R、IL-15、IL-7R和IL-4R共享一条链(Asao等人，J.Immunol,167:1-5,2001)。据报道，IL-21诱导来自骨髓的NK细胞前体的成熟(Parrish-Novak等人，Nature,408:57-63,2000)，特别是促进效应功能，比如NK细胞产生细胞因子和杀伤细胞的能力(M.Strengell等人，JImmunol,170,5464-5469,2003；J.Brady等人，J Immunol,172,2048-2058,2004)，并通过增强CD8+T细胞的效应功能促进先天和适应性免疫系统的抗癌反应(Rayna Takaki等人，J Immunol 175,2167-2173,2005；A.Moroz等人，J Immunol,173,900-909,2004)。并且，据报道，IL-21使分离自人外周血的NK细胞活化(Parrish-Novak等人，Nature,408,57,2000)，并从分离自脐带血的造血干细胞诱导成熟的NK细胞(J.Brady等人，J Immunol,172,2048,2004)。
本发明的实施方案包括使用浓度为50U/ml至1000U/ml，例如200U/ml至800U/ml，或400U/ml至600U/ml的一种或多种这些“活化细胞因子”来活化本文所述的用于本发明免疫调节方法的任何淋巴细胞性细胞，比如NK细胞、γδT细胞或iNKT细胞。
“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持稳态，并且其中如果疾病没有改善，则动物的健康继续恶化。相反，受试者中的“疾患”是这样的健康状态，其中受试者能够维持稳态，但受试者的健康状态不如没有所述疾患时良好。如果不治疗，疾患不一定引起受试者的健康状态进一步下降。
如本文所用的“有效量”，意指提供治疗或预防益处的量。
“编码”是指多核苷酸中的特定核苷酸序列(例如基因、cDNA或mRNA)的固有特性，所述特定核苷酸序列用作模板，用于在生物过程中合成具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性的其他聚合物和大分子。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生一种蛋白质，则所述基因编码所述蛋白质。两条编码链(与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的核苷酸序列)以及用作基因或cDNA的转录模板的非编码链都可以称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。
如本文所用的“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统内部的或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。
如本文所用的，术语“外源”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入的或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。
如本文所用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列的由其启动子驱动的的转录和/或翻译。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与要表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件；其他用于表达的元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括掺入了重组多核苷酸的本领域中所有已知的载体，例如粘粒、质粒(例如裸质粒或包含在脂质体中的质粒)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列两者中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单位占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一者的一个位置被腺嘌呤占据，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置数除以比较的位置数X100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中有6个匹配或同源，那么所述两个序列60％同源。举例来说，ATTGCC和TATGGC的DNA序列共享50％的同源性。通常，当将两个序列比对时进行比较，以给出最大同源性。
如本文所用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为一类起抗体作用的蛋白质。由B细胞表达的抗体有时称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。这类蛋白质包括的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。
“分离的”表示从天然状态改变或从其移出。例如，天然存在于活的动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是从其天然状态的共存物质部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。“分离的”生物成分(比如核酸、蛋白质或细胞)已与其他生物成分(比如细胞碎片、其他蛋白质、核酸或细胞类型)基本上分离或纯化出来。已经“分离的”生物成分包括通过标准纯化方法纯化的那些成分。
预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的全面发展。“治疗”是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征或症状的治疗干预。“改善”是指降低疾病的体征或症状的数量或严重性。
化学疗法包括用化学剂(比如细胞毒剂)进行治疗，所述化学剂具有治疗以异常细胞生长为特征的疾病(比如肿瘤、赘生物、癌症和银屑病)的治疗效用。
如本文所用的，重组通常是指下列情况：重组核酸或蛋白质是具有非天然存在的序列或具有通过将两个原本分开的序列区段人工组合而产生的序列的核酸或蛋白质。经常通过化学合成，或通过对分离的核酸区段的人工操作(例如通过遗传工程技术)来完成该人工组合。
如本文所用的，对于普遍存在的核酸碱基使用以下缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。
如本文所用的术语“白细胞”或“白血球”是指任何免疫细胞，包括单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞。如本文所用的，术语“淋巴细胞”是指淋巴中常见的细胞，并且包括自然杀伤细胞(NK细胞)、T细胞和B细胞。本领域技术人员将理解的是，上面列出的免疫细胞类型可进一步分成亚群。
如本文所用的术语“肿瘤浸润性白细胞”是指存在于实体瘤中的白细胞。
如本文所用的术语“血液样品”是指由血液制备的任何样品，比如血浆、从血液分离的血细胞等。
如本文所用的术语“纯化样品”是指其中一个或多个细胞亚群被富集的任何样品。可以通过基于诸如大小、蛋白质表达等特征移出或分离细胞来纯化样品。
药学上可接受的媒介物：可用于本公开的药学上可接受的载体(媒介物)是常规的。Remington's Pharmaceutical Sciences(作者E.W.Martin，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，第15版(1975))描述了适合于一种或多种治疗组合物和其他药剂的药物递送的组合物和制剂。
一般而言，用于递送的适合载体或媒介物的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体，比如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等作为媒介物。对于固体组合物(例如，散剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可包括例如医药级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体之外，将要施用的药物组合物可含有少量无毒辅助物质，比如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或失水山梨糖醇单月桂酸酯。
在一些实施方案中，组合物，无论它们是溶液、悬浮液或其他类似形式，可包含以下一种或多种：DMSO；无菌稀释剂比如注射用水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠；固定油，比如合成甘油单酯或甘油二酯，可用作溶剂或悬浮介质；聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂，比如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，比如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，比如乙二胺四乙酸；缓冲液，比如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及张力调节剂，比如氯化钠或右旋糖。
本文所述的组合物和方法可治疗的疾病包括微生物感染，比如病毒感染、酵母菌感染、真菌感染、原生动物感染和/或细菌感染。
示例性细菌感染包括由以下一种或多种致病细菌种引起的那些：拟杆菌属、梭菌属、链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌属、军团菌属、分枝杆菌属、埃希菌属、沙门菌属、志贺菌属或李斯特菌属。
关于“病毒感染”，意指由体内病毒的存在引起的感染。病毒感染包括慢性或持续性病毒感染，这些病毒感染能够感染宿主并在证明致命之前的延长时间段内(通常为数周、数月或数年)在宿主细胞内繁殖。引起可根据本发明治疗的慢性感染的病毒包括例如人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒和其他疱疹病毒、乙型和丙型肝炎病毒以及其他肝炎病毒、人免疫缺陷病毒和麻疹病毒，所有这些都可以引起重大临床疾病。长期感染可最终导致诱发疾病，例如在丙型肝炎病毒肝癌的情况下，这对患者可能是致命的。可根据本发明治疗的其他慢性病毒感染包括EB病毒(EBV)，以及其他病毒，例如可能与肿瘤相关的病毒。
可用本文所述的活化NK细胞组合物和方法治疗或预防的病毒感染的实例包括但不限于由以下病毒引起的病毒感染：逆转录病毒(例如，人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)I型和II型和人免疫缺陷病毒(HIV))、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒(HSV)I型和II型、EB病毒和巨细胞病毒)、沙粒病毒(例如，拉沙热病毒)、副粘病毒(例如，麻疹病毒属病毒、人呼吸道合胞病毒和肺炎病毒)、腺病毒、布尼亚病毒(例如，汉坦病毒)、冠状病毒、丝状病毒(例如，埃博拉病毒)、黄病毒(例如，丙型肝炎病毒(HCV)、黄热病毒和日本脑炎病毒)、嗜肝性DNA病毒(例如，乙型肝炎病毒(HBV))、正粘病毒(例如，仙台病毒和甲型、乙型和丙型流感病毒)、乳多空病毒(例如，乳头瘤病毒)、小核糖核酸病毒(例如鼻病毒、肠道病毒和甲型肝炎病毒)、痘病毒、呼肠孤病毒(例如，轮状病毒)、披膜病毒(例如，风疹病毒)和弹状病毒(例如，狂犬病病毒)。病毒感染的治疗和/或预防包括但不限于减轻与所述感染相关的一种或多种症状；病毒复制和/或病毒载量的抑制、降低或阻抑；和/或免疫应答的增强。
如本文所用的，免疫缺陷意指免疫系统的至少一种基本功能的缺乏。如本文所用的，“免疫缺陷”受试者(比如人)是这样的受试者：其缺乏免疫系统的特定成分或缺乏免疫系统的特定成分(例如，B细胞、T细胞、NK细胞或巨噬细胞)的功能。在一些情况下，免疫缺陷受试者包含一种或多种阻止或抑制功能性免疫细胞(比如B细胞、T细胞或NK细胞)发育的遗传改变。在一些实例中，遗传改变位于IL17或IL17受体中。
如本文所用的，免疫抑制是指免疫系统的活性或功能降低。受试者可以是免疫抑制的，例如，由于用免疫抑制剂化合物治疗或由于疾病或疾患(例如，由HIV感染或由于遗传缺陷引起的免疫抑制)。在一些情况下，免疫抑制是由于基因突变而发生的，所述基因突变阻止或抑制了功能性免疫细胞(比如T细胞)的发育。
如本文所用的，白细胞介素8(IL8)是CXC趋化因子家族的成员，是炎症反应的主要介质。IL8由几种细胞类型分泌，并作为化学引诱物和强效的血管生成因子发挥作用。人IL8是小鼠CXCL1和CXCL2的功能等同物。IL8的核苷酸和氨基酸序列是公开可用的。例如，人IL8序列可以根据NCBI Gene ID 3576找到。
如本文所用的，白细胞介素17A(IL17A)是由活化T细胞产生的促炎细胞因子。IL17A的核苷酸和氨基酸序列是公开可用的。例如，人和小鼠IL17A序列可以分别根据NCBIGene ID 3605和Gene ID 16171找到。
在本发明的一些实施方案中，“治疗有效量”是相对于未施用本发明组合物的动物或动物组(例如，两只、三只、五只、十只或更多动物)中的病毒滴度或微生物滴度，在施用活化细胞组合物并且用本文所述的相关方法治疗的受试者/患者/动物中导致病毒滴度或微生物滴度降低至少2.5％、至少5％、至少10％、至少15％、至少25％、至少35％、至少45％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的本文所述的活化细胞组合物的量。
可用有效量的活化淋巴细胞性细胞组合物和本文所述的相关方法治疗的癌症和增殖性疾患的类型的实例包括但不限于白血病(例如，成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、粒单核细胞白血病、单核细胞白血病、红细胞白血病、慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、尤因氏瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、维尔姆斯瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮细胞癌、胶质瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、发育不良和增生。癌症的治疗和/或预防包括但不限于减轻与癌症相关的一种或多种症状、抑制或降低癌症的进展、促进癌症的消退和/或促进免疫免疫应答。
在某些其他实施方案中，“治疗有效量”是相对于未施用本发明组合物的患者(或动物)或一组患者(或动物)中癌症的生长或扩散，在施用本文所述组合物的患者或动物中导致癌症的生长或扩散降低至少2.5％、至少5％、至少10％、至少15％、至少25％、至少35％、至少45％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的活化淋巴细胞性细胞组合物的量。
在一些实施方案中，活化淋巴细胞性细胞组合物用于治疗酵母菌或细菌感染的方法中。例如，本文所述的组合物和方法可以治疗与下列微生物相关的感染：酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoe a)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、白喉棒状杆菌(Coryneba cterium diphtheriae)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoni ae)、臭鼻克雷伯菌(Klebsiella ozaenae)、鼻硬结克雷伯菌(Klebsiella rhinoscleromotis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、铜绿假单胞菌(Pseudo monas aeruginosa)、(胎儿弯曲杆菌(弧菌属))、空肠弯曲杆菌(Campyl obacter jejuni)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、痢疾志贺菌(Shigella dys enteriae)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、宋氏志贺菌(Shigella sonne i)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、苍白密螺旋体(Treponem a pallidum)、细弱密螺旋体(Treponemapertenue)、斑点病密螺旋体(T reponema carateneum)、奋森氏疏螺旋体(Borreliavincentii)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、出血黄疸型钩端螺旋体(Leptospiraicte rohemorrhagiae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、流产布鲁菌(Brucella aborts)、猪布鲁菌(Brucella suis)、马尔他布鲁菌(Brucella melitensis)、支原体属种(Mycoplasma spp.)、普氏立克次体(Rickettsiaprowazeki)、恙虫病立克次体(Rickettsia tsutsugumushi)、衣原体属种(Chlamydia spp.)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)或其任何组合。
在某些实施方案中，可以将活化淋巴细胞性细胞组合物与抗微生物剂、抗病毒剂和其他治疗剂同时施用。可替代地，可以在施用抗微生物剂、抗病毒剂和其他治疗剂之前的选定时间施用活化淋巴细胞性细胞组合物。
在一些实施方案中，提供了治疗具有HIV、癌症、病毒感染或细菌感染的患者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。在一些实施方案中，患者具有HIV。在一些实施方案中，患者患有癌症。在一些实施方案中，患者具有病毒感染。在一些实施方案中，患者具有细菌感染。本文提供了癌症、病毒感染和细菌感染的非限制性实例。
在一些实施方案中，提供了用于增加有需要的患者中的免疫应答的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患者施用有效量的包含活化NK细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
在一些实施方案中，提供了抑制患者中的HIV复制或繁殖的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向具有HIV的受试者患者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。如本文所用的，术语“抑制HIV复制或繁殖”可以指病毒不能在受试者中复制或繁殖而维持可检测的病毒载量。在一些实施方案中，所述方法包括降低感染HIV的受试者的HIV病毒载量，包括向所述具有HIV的受试者患者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。病毒载量可降低至检测不到的水平或与治疗前水平相比降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96％、97％、98％或99％。
在一些实施方案中，提供了抑制患者中的肿瘤生长的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向具有肿瘤的患者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。可以使肿瘤生长减缓或消除。在一些实施方案中，使肿瘤消退，因为它不再是可检测的。在一些实施方案中，肿瘤转移受到抑制。
在一些实施方案中，提供了抑制具有病毒或细菌感染的受试者中病毒或细菌复制或繁殖的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向具有病毒或细菌感染的受试者患者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。在一些实施方案中，患者中的病毒或细菌载量降低或检测不到。病毒或细菌载量可降低至检测不到的水平或与治疗前水平相比降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96％、97％、98％或99％。
如本文所提供，在一些实施方案中，细胞组合物还可包含活化的γδT细胞(GDT细胞)。还可以通过与NK细胞分开的组合物来施用GDT细胞。
如本文所提供，在一些实施方案中，所述细胞组合物还可包含恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)。还可以通过与NK细胞和/或GDT细胞分开的组合物施用iNKT细胞。
如本文所提供，在一些实施方案中，所述细胞组合物还可包含恒定CD3+T细胞。还可以通过与NK细胞、GDT细胞和/或iNKT细胞分开的组合物施用CD3+T细胞。
在一些实施方案中，通过将细胞与至少一种细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)混合/孵育/接触来活化所述细胞。可以在患者体外或外部(也可以称为离体)进行这种混合/孵育/接触。在一些实施方案中，所述细胞未活化，或通过向受试者施用活化剂初步活化。在一些实施方案中，在向受试者施用所述活化细胞之后，可以通过向受试者外源性施用细胞因子来维持或增强细胞的活化。在一些实施方案中，细胞因子选自由IL-2、IL-15、IL-21、Flt3-L、干细胞因子(SCF)、IL-7、IL-12和IL-18组成的组及其任何组合。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，细胞因子是IL-15。在一些实施方案中，细胞因子是IL-21。在一些实施方案中，细胞因子是Flt3-L。在一些实施方案中，细胞因子是干细胞因子(SCF)。在一些实施方案中，细胞因子是IL-7。在一些实施方案中，细胞因子是IL-12。在一些实施方案中，细胞因子是IL-18。在一些实施方案中，将所述细胞因子与所述细胞组合物离体孵育/混合/接触约6-24小时。在一些实施方案中，与所述细胞组合物离体孵育/混合/接触的细胞因子的量为约100-1000IU/ml。
在一些实施方案中，在向试者施用淋巴细胞性细胞组合物之前，对受试者进行预处理。不受任何特定理论的束缚，在一些实施方案中，预处理使受试者自身的免疫细胞经受淋巴细胞清除，并为新的免疫细胞创造了余地或空间，然后，这些新的免疫细胞随后将被施用于患者。在一些实施方案中，预处理包括在施用淋巴细胞性细胞组合物之前施用至少一种淋巴抑制剂、化学治疗剂或免疫抑制剂持续约1天至约10天、3天至约7天、约1天至约2天。在一些实施方案中，预处理包括施用氟达拉滨、环磷酰胺和/或干扰素α。根据权利要求13所述的方法，其中所述淋巴抑制剂或化学治疗剂包括6TG、6-MMP中的任何一种、一种或多种选自由氯法拉滨、氟达拉滨和阿糖胞苷组成的组的嘌呤类似物，或其任何组合。在一些实施方案中，淋巴抑制剂或化学治疗剂的剂量范围为约5mg/m2至约50mg/m2。在一些实施方案中，化学治疗剂或免疫抑制剂包括环磷酰胺、利妥昔单抗、类固醇中的任何一种或其任何组合。在一些实施方案中，所述类固醇是糖皮质激素类固醇。在一些实施方案中，所述类固醇是泼尼松。在一些实施方案中，预处理包括从第-7天至第-3天施用氟达拉滨。在一些实施方案中，氟达拉滨以约15mg/m2/d的剂量施用。在一些实施方案中，预处理包括在第-2天和第-1天施用环磷酰胺。在一些实施方案中，环磷酰胺的剂量如本文提供。在一些实施方案中，预处理包括在第-2天和第-1天施用干扰素α。在一些实施方案中，干扰素α的剂量为约3x106IU/m2/d。如本文所用的，术语“第-1天”是指施用活化细胞组合物之前的日期。例如，第0天被认为是向受试者施用包含NK细胞的细胞组合物的那一天。因此，“第-1天”是指在施用之前一天。“第-2天”是指在施用之前两天，以此类推。在一些实施方案中，所述方法包括在第0天施用活化NK细胞，其可以是细胞组合物的一部分。在一些实施方案中，还施用活化GDT细胞。它们可以作为同一组合物的一部分施用，也可以分开施用。另外，在一些实施方案中，还在第0天向患者施用IL-2。可以例如静脉内或皮下施用IL-2。在一些实施方案中，在施用活化细胞组合物之后施用IL-2持续1天至约5天，例如在第+1天、第+2天、第+3天、第+4天和第+5天。也可以施用IL-2更长的时间。术语“第+1天”等是指施用活化细胞组合物之后的日期。在一些实施方案中，以约6x106IU/m2的剂量施用IL-2。在一些实施方案中，在第0天之后不向受试者施用IL-2。
在一些实施方案中，向受试者施用抗炎药，比如非甾体抗炎药(NSAID)。这些可以在第0天之后约1天至约60天给予。在一些实施方案中，NSAID是Cox-2抑制剂，比如本文提供的那些。在一些实施方案中，NSAID是塞来昔布。在一些实施方案中，NSAID是布洛芬或萘普生。在一些实施方案中，在施用淋巴细胞性细胞组合物后，施用NSAID约14天至约60天。
本文还提供了活化NK细胞的方法，所述方法包括在体外使包含NK细胞的细胞组合物与至少一种细胞因子和/或可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)接触。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，细胞因子选自由IL-2、IL-15、IL-21、Flt3-L、干细胞因子(SCF)、IL-7、IL-12和IL18组成的组及其任何组合。在一些实施方案中，使所述细胞因子与所述细胞组合物接触约6小时至约24小时。在一些实施方案中，与细胞组合物接触的细胞因子的量为约100IU/ml至约1000IU/ml。在一些实施方案中，组合物还可以包含γδT细胞(GDT细胞)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)和/或CD3+T细胞。可以从任何来源分离所述细胞。例如，在一些实施方案中，从外周血中分离NK细胞、γδT细胞(GDT细胞)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)和/或CD3+T细胞。可以通过例如白细胞除去术将它们分离。
本文还提供了细胞因子和/或可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)活化淋巴细胞性细胞组合物，其包含活化自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述活化组合物是IL-2活化的组合物。在一些实施方案中，所述细胞因子活化的组合物是IL-2、IL-15、IL-21、Flt3-L、干细胞因子(SCF)、IL-7、IL-12和IL18及其任何组合活化的组合物。在一些实施方案中，所述活化组合物包含γδT细胞(GDT细胞)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)和/或CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述NK细胞是外周血NK细胞。在一些实施方案中，所述γδT细胞(GDT细胞)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)、CD3+T细胞是外周血γδT细胞(GDT细胞)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)和CD3+T细胞。
与抗体的组合
例如，可以将活化淋巴细胞性细胞组合物与对选定癌症类型特异的抗体同时施用。可替代地，可以在施用对选定癌症类型特异的抗体之前的选定时间施用所述活化淋巴细胞性细胞组合物。对选定癌症类型特异的抗体包括任何被批准用于治疗癌症的抗体。实例包括用于乳腺癌的曲妥珠单抗(Herceptin)、用于淋巴瘤的利妥昔单抗(Rituxan)和用于头颈部鳞状细胞癌的西妥昔单抗(Erbitux)。
这样的抗体剂的其他实例包括PD-1或PD-L1(B7-H1)的抑制剂，比如抗PD-1抗体，包括纳武单抗(来自Bristol-Myers Squibb的纳武单抗)和派姆单抗/拉姆布罗力珠单抗，也称为MK-3475(来自Merck的Keytruda)、皮地利珠单抗(Curetech)、AMP-224(Amplimmune)，以及抗PD-L1抗体，包括MPDL3280A(Roche)、MDX-1105(Bristol MyerSquibb)、MEDI-4736(AstraZeneca)和MSB-0010718C(Merck)。其他检查点抑制剂包括CTLA-4的拮抗剂，比如抗CTLA-4抗体。示例性抗CTLA4抗体是YervoyTM(伊匹单抗)，其由Bristol-Myers Squibb销售。其他示例性的CTLA-4抗体包括曲美木单抗(Pfizer)、替西木单抗(AstraZeneca)和AMGP-224(Glaxo Smith Kline)。在实施例3中可以找到使用免疫治疗抗体的示例性治疗方案。在某些情况下还可以指示与这些抗体中的任何两种组合。如图1所述的预处理和后处理方案以及不同的细胞输注选项可以应用于这种抗体治疗(即，在细胞输注后的某一时间，在输注后4-14天，优选输注后4-6天，施用所述抗体)。
用于治疗性淋巴细胞性组合物的同种异体NK细胞的来源
常用的同种异体NK细胞是采集自单倍体相同的和无关的供体PBMC的血液成分单采术产品(Koepsell等人，Transfusion(2013)53(2):404–10)。
另一个来源是脐带血(UCB)，其中NK细胞是从CD34+祖细胞生成的，使用细胞因子和生长因子使所述祖细胞扩增和分化，从而成熟为细胞溶解性NK细胞(Spanholtz J.等人，PLoS One(2011)6(6):e20740；和Arai S.等人，Cytotherapy(2008)10(6):625–32.)
CD3细胞
表述“CD3”是指作为多分子T细胞受体(TCR)的一部分在T细胞上表达的抗原，其由四个不同的链组成：CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ和CD3-γ。在哺乳动物中，该复合物含有一条CD3γ链、一条CD3δ链和两条CD3ε链。这些链与T细胞受体(TCR)和ζ链(zeta-链)缔合，在T淋巴细胞中生成活化信号。TCR、ζ链和CD3分子一起构成TCR复合物。人CD3-ε(hCD 3ε)包含UniProtKB/Swiss-Prot:P07766.2中列出的氨基酸序列。人CD3-δ(hCD 3δ)包含UniProtKB/Swiss-Prot:P04234.1中列出的氨基酸序列。CD3 T细胞共受体有助于活化细胞毒性T细胞(CD8+初始T细胞)以及还有辅助性T细胞(CD4+初始T细胞)两者。
CD3γ、CD3δ和CD3ε链是含有单个细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3链的跨膜区带负电荷，因为它含有天冬氨酸残基，这个特性使这些链能够与带正电荷的TCR链缔合。
CD3分子的胞内尾部含有单个保守基序，称为免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，这对TCR的信号传导能力至关重要。ζ链的胞内尾含有3个ITAM基序。
癌症和NK细胞、同种异体NK细胞的活化
虽然不希望受理论的束缚，但本文所述的多管齐下的方法和治疗方案被认为克服了调节性T细胞诱导的免疫抑制作用，并且在某些实施方案中，与活化淋巴细胞性细胞(例如活化NK细胞)组合、与某些其他免疫应答性细胞组合，被认为提供了增强的治疗效果，如下文进一步描述的。注意的是，通过活化淋巴细胞性细胞(例如活化NK细胞)进行的活化和免疫训练在患者中—体内进行，并且不需要体外培养。
γδT细胞和活化γδT细胞
γδT细胞(γδT细胞)代表在其表面上具有独特的T细胞受体(TCR)的一个小的T细胞亚群。大多数T细胞具有由被称为α(α)和β(β)-TCR链的两条糖蛋白链组成的TCR。然而，在γδT细胞中，TCR由一条γ链和一条δ链构成。这组T细胞比αβT细胞少得多(占总T细胞的5％)，但在肠粘膜中以其最高的丰度存在于被称为上皮内淋巴细胞(IEL)的淋巴细胞群中。活化γδT细胞的抗原分子仍然广为未知。然而γδT细胞不受MHC限制，并且似乎能够识别全蛋白，而不需要通过抗原呈递细胞上的MHC分子呈递肽。不过，某些识别MHC IB类分子。构成外周血中主要γδT细胞群的人V.γ.9/V.δ.2T细胞是独特的，因为它们对小的非肽微生物代谢物HMB-PP(一种异戊烯基焦磷酸盐前体)作出特异性和快速的反应。
激活γδT细胞的方法已经描述于例如Deniger等人，Clin Cancer Res.2014年11月15日；20(22):5708–5719。本文所述的方法都不利用饲养细胞系统，而是依赖细胞因子和/或细胞的珠粒活化，这在降低污染风险、易于活化和提高活化细胞向患者递送的速度方面提供了优势。
用于活化γδT细胞的活化混合物的实例包括以下项：
500IU/ml IL-2
20ng/ml HM-BPP
CD3/CD28 T细胞活化珠粒(1:2的珠粒与细胞比)
24小时孵育。
细胞来源
通过样品的Ficoll-Hypaque密度梯度离心可以分离外周血单核细胞(PBMC)，所述样品从废弃的、去鉴定的(de-identified)白细胞减少过滤器(美国红十字会)或从知情同意的健康志愿者的血液捐献获得。细胞群、来源和选择或富集期望的细胞类型的方法的描述可以在例如美国专利第9,347,044号中找到。用于本文所述的治疗哺乳动物的方法中的细胞群必须是物种匹配的，比如人细胞。可以从动物例如人患者获得所述细胞。如果细胞是从动物获得的，它们可能已经首先在培养物中例如通过转化而被建立；或者更优选地，可能已经使它们经受初步纯化方法。例如，可以通过以下方式对细胞群进行操作：基于细胞表面标志物表达的阳性或阴性选择；用一种或多种抗原进行体外或体内刺激；用一种或多种生物调节剂进行体外或体内处理；或者这些项的任何或全部的组合。在一个说明性实施方案中，对细胞群进行阴性选择，以耗竭非T细胞和/或特定的T细胞亚群。可以在多种分子的细胞表面表达的基础上进行阴性选择，所述分子包括B细胞标志物，比如CD19和CD20；单核细胞标志物CD14；NK细胞标志物CD56。可替代地，可以对细胞群进行阴性选择，以耗竭非CD34+造血细胞和/或特定的造血细胞亚群。可以基于多种分子的细胞表面表达来进行阴性选择，所述分子例如抗体的混合物(例如，CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123和CD235a)，例如通过MACS或柱分离，可以将其用于分离其他细胞类型。
细胞群包括外周血单核细胞(PBMC)、全血或其含有混合群的部分、脾细胞、骨髓细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、通过白细胞去除术获得的细胞、活检组织、淋巴结，例如从肿瘤移出的淋巴结。适合的供体包括免疫的供体、未免疫的(首次用于实验的)供体、治疗的或未治疗的供体。“治疗的”供体是已经暴露于一种或多种生物调节剂的供体。“未治疗的”供体尚未暴露于一种或多种生物调节剂。
获得包含T细胞的细胞群的方法在本领域是公知的。例如，可以根据本领域已知的方法所述获得外周血单核细胞(PBMC)。这样的方法的实例在实施例中进行阐述，并且Kim等人(1992)；Biswas等人(1990)；Biswas等人(1991)已有论述。
还可能从受试者获得细胞样品，然后针对期望的细胞类型对其进行富集。例如，可以如本文所述从血液分离PBMC。可以采用逆流离心(淘洗)从PBMC富集T细胞。还可以使用各种技术从其他细胞中分离细胞，例如用与期望细胞类型的细胞表面上的表位结合的抗体进行分离和/或活化，例如，一些T细胞分离试剂盒利用抗体缀合珠粒来活化细胞，并且然后用相同的珠粒进行柱分离。可以使用的另一种方法包括使用针对细胞表面标志物的抗体进行阴性选择，以选择性地富集特定细胞类型，而不通过受体接合活化细胞。
可以从髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或其他骨髓腔获得骨髓细胞。可以从患者取出骨髓，并通过各种分离和清洗程序进行分离。一种已知的分离骨髓细胞的方法包括以下步骤：a)将骨髓悬浮液离心分离成三个级分，并收集中间部分或血沉棕黄层；b)将来自步骤(a)的血沉棕黄层级分在分离液中再离心一次，分离液通常为Ficoll(Pharmacia FineChemicals AB的商标)，并收集含有骨髓细胞的中间级分；和c)洗涤来自步骤(b)的收集级分，用于回收可再输注的骨髓细胞。
如果希望使用富含T细胞的细胞群，可以通过白细胞去除术和使用连续流细胞分离器的机械分离从混合细胞群获得这样的细胞群。例如，可以通过任何已知的方法从血沉棕黄层分离T细胞，所述方法包括通过Ficoll-HypaqueTM梯度分离、通过Percoll梯度分离或淘洗。
NK细胞的表型分析。可以将PBMC染色，用于使用荧光染料缀合的抗体进行流式细胞术分析，如先前Kim等人所述(Proc Natl Aca d Sci USA 105(8):3053-3058(2008))。可以利用抗体来检测来自Bec kman Coulter的下列蛋白质：(CD56(N901)、NKG2A(Z199)、NKp44(Z231))、BD Biosciences(CD3ζ(UCHT1)、CD16(3G8)、KIR2DL2/3(C H-L)、KIR3DL1(DX9)、NKp46(9E2)、NKp30(p30-15)、CD11a(G43-25B)、CD11b(ICRF44)、CD11c(B-ly6)、NKG2D(1D11)、CD161(DX12)、DNAM-1(DX11)、CD57(NK-1)、CD25(M-A251)、IFN-.γ.(B27)、TNF-.α.(Mab11)、CD107a(H4A3)、颗粒酶A(CB9)、颗粒酶B(GB11))、Biolegend(CD14(HCD14)、CD19(HIB19)、CD2(RPA-2.10)、2B4(C1.7)、NTB-A(NT-7)、CRACC(162.1)、CD69(FN50))、eBioscience s(KIR2DL1(HP-MA4)、穿孔素(dG9))和R&D(NKG2C(134591))。
在一些实施方案中，提供了以下实施方案：
1.一种治疗具有HIV、癌症、病毒感染或细菌感染的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
2.一种用于增加有需要的患者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含活化NK细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
3.一种抑制患者中的HIV复制的方法，所述方法包括向具有HIV的受试者患者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
4.一种抑制患者中的肿瘤生长的方法，所述方法包括向具有肿瘤的患者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
5.一种抑制具有病毒或细菌感染的受试者中的病毒或细菌复制或繁殖的方法，所述方法包括向具有病毒或细菌感染的受试者患者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物进一步包含活化的γδT细胞(GDT细胞)。
7.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物进一步包含恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)。
8.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物进一步包含CD3+T细胞。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中在向患者施用之前，通过将所述细胞与至少一种细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)混合/孵育/接触来活化所述淋巴细胞性细胞组合物。
10.根据实施方案9所述的方法，其中所述细胞因子选自由IL-2、IL-15、IL-21、Flt3-L、干细胞因子(SCF)、IL-7、IL-12和IL18组成的组及其任何组合。
11.根据实施方案10所述的方法，其中将所述细胞因子与所述细胞组合物孵育/混合/接触约6-24小时。
12.根据实施方案10所述的方法，其中与所述细胞组合物一起孵育的细胞因子的量为约100-1000IU/ml。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过在施用所述淋巴细胞性细胞组合物之前施用至少一种淋巴抑制剂、化学治疗剂或免疫抑制剂3-5天，在施用所述淋巴细胞性细胞组合物之前对所述患者进行预处理。
14.根据实施方案13所述的方法，其中所述淋巴抑制剂或化学治疗剂包括6TG、6-MMP中的任何一种、一种或多种选自由氯法拉滨、氟达拉滨和阿糖胞苷组成的组的嘌呤类似物，或其任何组合。
15.根据实施方案14所述的方法，其中所述淋巴抑制剂或化学治疗剂的剂量范围为约5mg/m2至约50mg/m2。
16.根据实施方案13所述的方法，其中所述化学治疗剂或免疫抑制剂包括环磷酰胺、利妥昔单抗、类固醇中的任何一种或其任何组合。
17.根据实施方案16所述的方法，其中所述类固醇是糖皮质激素类固醇。
18.根据实施方案17所述的方法，其中所述类固醇是泼尼松。
19.根据实施方案16所述的方法，其中所述化学治疗剂或免疫抑制剂的剂量范围为约20mg/m2至约1000mg/m2。
20.根据实施方案13所述的方法，其中所述方法进一步包括在施用所述淋巴细胞性细胞组合物之前的两天和/或1天，以约1x106IU/m2/d至约10x106IU/m2/d的剂量向所述患者施用干扰素-α(IFN-α)或其生物等效物。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在施用所述淋巴细胞性细胞组合物的当天和在施用所述淋巴细胞性细胞组合物后的第一天向所述患者施用IL-2，并且任选地在施用所述淋巴细胞性组合物后继续施用另外3-14天，剂量为每剂量约3-6x106IU/m2。
22.根据实施方案1-21中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在施用所述淋巴细胞性细胞组合物的当天向患者施用COX-2抑制剂或非甾体抗炎药(NSAID)或其组合，并且在施用所述淋巴细胞性细胞组合物后继续施用至少14至60天。
23.根据实施方案22所述的方法，其中所述COX-2抑制剂是塞来昔布或罗非昔布，并且所述非甾体抗炎药选自由阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬、萘普生、吡罗昔康和萘丁美酮组成的组。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述活化NK细胞对于所述患者是同种异体的。
25.根据实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述NK细胞与所述患者是非HLA匹配的。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中活化细胞的剂量范围为约3-50x106。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述病毒感染选自由下列病毒引起的病毒感染组成的组：逆转录病毒(例如，人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)I型和II型和人免疫缺陷病毒(HIV))、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒(HSV)I型和II型、EB病毒和巨细胞病毒)、沙粒病毒(例如，拉沙热病毒)、副粘病毒(例如，麻疹病毒属病毒、人呼吸道合胞病毒和肺炎病毒)、腺病毒、布尼亚病毒(例如，汉坦病毒)、冠状病毒、丝状病毒(例如，埃博拉病毒)、黄病毒(例如，丙型肝炎病毒(HCV)、黄热病毒和日本脑炎病毒)、嗜肝性DNA病毒(例如，乙型肝炎病毒(HBV))、正粘病毒(例如，仙台病毒和甲型、乙型和丙型流感病毒)、乳多空病毒(例如，乳头瘤病毒)、小核糖核酸病毒(例如，鼻病毒、肠道病毒和甲型肝炎病毒)、痘病毒、呼肠孤病毒(例如，轮状病毒)、披膜病毒(例如，风疹病毒)和弹状病毒(例如，狂犬病病毒)及其任何组合。
28.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液学或血源性癌症，其选自由以下组成的组：急性白血病、急性髓系白血病、急性骨髓性白血病、成髓细胞性白血病、前髓细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞白血病、红细胞白血病、慢性白血病、慢性髓细胞(或粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓增生异常，以及它们的任何组合。
29.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤，其选自由以下组成的组：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(比如胶质瘤(比如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、髓膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移。
30.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述细菌感染由以下致病细菌种之一引起：拟杆菌属、梭菌属、链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌属、军团菌属、分枝杆菌属、埃希菌属、沙门氏菌属、志贺菌属或李斯特菌属。
31.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述患者中的移植物抗宿主病(GVHD)减少或消除，而移植物抗肿瘤(GVT)或移植物抗病毒(GVV)增加。
32.根据实施方案1-20所述的方法，其中当所述患者患有淋巴细胞性或淋巴母细胞性白血病或淋巴瘤时，IL-2的施用是反指示的，并且在施用包含活化NK细胞的所述淋巴细胞性细胞组合物后不予施用。
33.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中在施用包含活化NK细胞的所述淋巴细胞性细胞组合物后的4-14天的时间范围内，向所述患者进一步施用免疫检查点抑制剂，包括两种检查点抑制剂中的任何一种或组合，包括PD-1或PD-L1(B7-H1)的抑制剂，比如抗P D-1抗体，包括纳武单抗(来自Bristol-Myers Squibb的纳武单抗)、派姆单抗/拉姆布罗力珠单抗，也称为MK-3475(来自Merck的Keytrud a)、皮地利珠单抗(Curetech)、AMP-224(Amplimmune)；或抗PD-L1抗体，包括MPDL3280A(Roche)、MDX-1105(Bristol MyerSquibb)、MEDI-4736(AstraZeneca)和MSB-0010718C(Merck)；CTLA-4的拮抗剂，比如抗CTLA-4抗体，包括抗CTLA4抗体YervoyTM(伊匹单抗，Bristol-Myers Squibb)、曲美木单抗(Pfizer)、替西木单抗(AstraZeneca)或AMGP-224(Glaxo Smith Kline)、或用于乳腺癌的肿瘤特异性抗体曲妥珠单抗(Herceptin)、用于淋巴瘤的利妥昔单抗(Rituxan)、或西妥昔单抗(Erbitux)。
34.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中在从每月一次、到每两个月一次、到每3个月一次、到每4个月一次、到每5个月一次、到每6个月一次、或每7个月一次、或每8个月一次、或每9个月一次、或每10个月一次、或每11个月一次、或每年一次的时间范围内周期性地重复治疗或增加免疫应答作为维持治疗，只要患者表现出改善或病情稳定/无进展即可。
35.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在向所述患者施用包含活化NK细胞的所述淋巴细胞性细胞组合物的同一天，但在施用之前至少约2-6小时，向患者施用一种或两种抗组胺药。
36.一种活化NK细胞的方法，所述方法包括在体外使包含所述NK细胞的细胞组合物与至少一种细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)接触。
37.根据实施方案36所述的方法，其中所述细胞因子选自由IL-2、IL-15、IL-21、Flt3-L、干细胞因子(SCF)、IL-7、IL-12和IL18组成的组及其任何组合。
38.根据实施方案36所述的方法，其中使所述细胞因子与所述细胞组合物接触约6小时至约24小时。
39.根据实施方案36所述的方法，其中与所述细胞组合物接触的细胞因子的量为约100IU/ml至约1000IU/ml。
40.根据实施方案36-39中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包含γδT细胞(GDT细胞)。
41.根据实施方案36-40中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物进一步包含恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)。
42.根据实施方案36-41中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物进一步包含CD3+T细胞。
43.根据实施方案36-42中任一项所述的方法，其中所述NK细胞、γδT细胞(GDT细胞)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)和/或CD3+T细胞是从外周血中分离的。
44.一种细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)活化的淋巴细胞性细胞组合物，其包含活化自然杀伤(NK)细胞。
45.根据实施方案44所述的组合物，其中所述细胞因子活化的组合物是IL-2、IL-15、IL-21、Flt3-L、干细胞因子(SCF)、IL-7、IL-12和IL18及其任何组合活化的组合物。
46.根据实施方案44和45所述的组合物，其中所述组合物物进一步包含γδT细胞(GDT细胞)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)和/或CD3+T细胞。
47.根据实施方案44-46中任一项所述的组合物，其中所述NK细胞是外周血NK细胞。
48.根据实施方案44-47中任一项所述的组合物，其中所述γδT细胞(GDT细胞)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)、CD3+T细胞是外周血γδT细胞(GDT细胞)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)和CD3+T细胞。
49.一种包含活化自然杀伤(NK)细胞的细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)活化的淋巴细胞性细胞组合物，其用于治疗具有HIV、癌症、病毒感染或细菌感染的患者。
50.一种包含活化自然杀伤(NK)细胞的细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)活化的淋巴细胞性细胞组合物，其用于制备用于治疗具有HIV、癌症、病毒感染或细菌感染的患者的药剂。
以下实施例是对本文所述的化合物、组合物和方法的说明，而不是限制性的。本领域技术人员已知的其他适合的修改和改编也在本文提供的实施方案的范围内。
实施例1
治疗癌症患者以及包括HIV在内的病毒感染的选项
作为第一步，从任何适合的商业来源获得或纯化NK细胞—并且所述细胞是同种异体的，如本文和以上章节所述。
如本文所述，有四种不同的输注选项用于向患者施用治疗性细胞组合物。这些治疗性细胞组合物包括以下细胞组分：
活化NK细胞；或
活化NK细胞+活化GDT细胞；或
活化NK细胞+活化GDT细胞+iNKT细胞；或
活化NK细胞+CD3 T细胞。
第1阶段：患者预处理选项
取决于患者的病情和疾病阶段，如图1所述，使用表1-5中列出的以下预处理方案之一对患者进行预治疗。第0天参考是输注日(例如，活化的淋巴细胞性细胞组合物的输注)。
表1
第-7天到第-3天 氟达拉滨25mg/m<sup>2</sup>/天IV
第-4天 环磷酰胺1000mg/m<sup>2</sup>IV
表2
第-5天到第-1天 氟达拉滨15mg/m<sup>2</sup>/天IV
第-2天 环磷酰胺1000mg/m<sup>2</sup>IV
表3
第-3天和第-2天 环磷酰胺1000mg/m<sup>2</sup>IV
表4
第-5天到第-2天 氟达拉滨25mg/m<sup>2</sup>/天IV
表5
第-5天到第-1天 环磷酰胺200mg/d PO
在某些实施方案中，在表1-5中任一项的治疗前方案后，然后在第-2天和第-1天通过皮下(SC)注射用干扰素α(IFN-α)3x106 IU/m2/d治疗患者。IFN-α通过SC注射的量可以在约1x106至约5x106IU/m2/d的范围。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在向患者施用包含活化NK细胞的淋巴细胞性细胞组合物的同一天，但在施用之前至少约2-6小时，向患者施用一种或两种抗组胺药(标准剂量，比如25mg异丙嗪和25mg苯海拉明)。
淋巴细胞性治疗细胞的体外活化
在某些实施方案中，活化混合物可以单独或以任何组合包括IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。活化过程通常为整夜，最少12小时，通常不超过24小时。
在某些实施方案中，可溶性FGF1受体用作活化剂(FGFR1，具体为FGF1受体的细胞外结构域，从图4所示的构建体中纯化)，其示例性浓度为33.33纳摩尔/升(或33.33皮摩尔/ml)。淋巴细胞性细胞暴露于FGF1受体的细胞外结构域起到活化CD56+NK细胞群的作用，并驱使它们成为几乎纯的细胞毒性NK细胞组合物(例如至少80％的细胞毒性NK细胞)(与细胞毒性和调节性NK细胞的混合群相反)。可以简单地将活化混合物添加到其中保存分离后的细胞的缓冲液(或培养基)中。在某些实施方案中，来自新鲜白细胞去除术材料的新鲜分离的细胞用作NK细胞的来源。然而，在某些实施方案中，其他细胞收集/分离/和/或保存方案可以用作细胞来源。例如，可以在活化步骤之前或更优选地在活化步骤之后冷冻保存所述细胞。利用FGF1受体的细胞外结构域的活化可用于活化本文所述的任何淋巴细胞性细胞，包括NK细胞、GDT细胞和iNK细胞。
利用新鲜细胞物质的示例性方法：
○处理新动员的白细胞去除术材料，用于分离“靶细胞群”(任何上述4个选项)。
○将分离的细胞悬浮在具有活化混合物的缓冲溶液或培养基中。具有5-20％HSA(人血清白蛋白)的PBS是典型的缓冲溶液，但也可以使用其他相似的选项。
○在12+小时后洗涤细胞，并再次悬浮在注射液中。典型地，这种缓冲溶液是具有5-20％HSA的PBS，但可以是任何适合的溶液。在某些实施方案中，患者自身的血清或血浆可以用作输注介质。
○在表1-5中描述的预处理过程之后，将细胞输注到患者体内，伴随任选的第-2天和第-1天干扰素α治疗。
注意的是，一旦用IL-2或任何其他包括IL-2的组合混合物将淋巴细胞(NK或其他)在体外活化，它们的细胞毒性效力变得依赖于IL-2。这意味着在患者血液中没有一定水平的IL-2，活化淋巴细胞(NK细胞或其他)开始失去其效力。因此，在体外活化混合物中利用IL-2的情况下，应当在细胞输注当天向患者注射IL-2，并在细胞输注后继续至少4天(最多14天)。作为皮下注射，典型的IL-2剂量为每天约300万-600万IU/m2。
另外，在患有淋巴细胞性或淋巴母细胞性白血病或淋巴瘤的患者中，没有利用IL-2活化来活化NK细胞或其他治疗组合物(参见图1，淋巴母细胞性白血病或淋巴瘤患者的选项)。在这些淋巴细胞性或淋巴母细胞性白血病或淋巴瘤患者中，对于治疗性细胞组合物不使用IL-2活化的这种不同过程避免了使这些癌症驱使过度，并且包括所述治疗性细胞组合物的效力。因而，如图1所示，对这些患者将不利用IL-2活化。
第2阶段：取决于疾病阶段或病情，淋巴细胞性细胞群输注到患者中的选项。
如图1所示，有四种不同的细胞群或“细胞混合物”，其取决于疾病和阶段，作为“活化的淋巴细胞性组合物”用于输注。这些组合物和变化的各种组成描述如下。
另外，这些活化的淋巴细胞性组合物的某些组分或实施方案可以提供在试剂盒中。例如，四种淋巴细胞性组合物中的任何一种都可为以作冷冻组合物提供，并作为试剂盒单独包装，或者与来自预处理或后处理步骤的任何其它剂的单独容器以及任选的使用说明书一起包装。
一些实施方案还涉及试剂盒中的任何上述细胞组合物。在一些实施方案中，试剂盒可包括安瓿、一次性注射器、胶囊、小瓶、管等。在一些实施方案中，试剂盒可包括包含本文实施方案的局部制剂的单剂量容器或多剂量容器。在一些实施方案中，每个剂量容器可容纳一个或多个单位剂量。在一些实施方案中，试剂盒可包括涂药器。在一些实施方案中，试剂盒包括3个处理/治疗阶段所需的所有组分。在一些实施方案中，细胞组合物可含有防腐剂或不含防腐剂(例如，在一次性容器中)。
淋巴细胞性细胞输注
对于淋巴细胞性细胞输注，例如对于NK细胞，在第0天，向患者施用体外活化的同种异体NK细胞输注(1-50x106个细胞/kg)。细胞剂量可以在每kg约1-5000万个细胞的范围内广泛变化。如下所述，淋巴细胞性细胞输注混合物可以包含以下任何组合：
活化NK细胞；或
活化NK细胞+活化GDT细胞；或
活化NK细胞+活化GDT细胞+iNKT细胞；或
活化NK细胞+CD3 T细胞。
1.“基本上”纯的NK细胞的细胞群
在某些实施方案中，基本上纯的NK细胞群(“供体同种异体NK细胞”范围从至少约75％NK细胞到约98％NK细胞)用于治疗某些癌症患者中的最小残留疾病。通过CD16+CD56+NK细胞的阴性或阳性选择，可以手动或使用cliniMACS进行基本上纯的NK细胞的分离。因为NK细胞通常不能增殖(或者它们不如其他淋巴细胞增殖得多)，所以它们的作用是有限的，它们的寿命也非常有限。这些活化NK同种异体细胞在宿主/接受者体内任何地方存活约5-15天。这提供了减轻与肿瘤死亡相关的不良反应如肿瘤溶解综合征、肿瘤肿胀/炎症等的水平的能力。重要的是，消除了移植物抗宿主病(GVHD)的并发症，原因在于NK细胞的抗原独立性加上它们不能生长且寿命短。
通过CD16+CD56+NK细胞的阴性或阳性选择，并且如上所述和本文所述，基本上纯的NK细胞的分离可以手动或使用cliniMACS完成(还参见Slavin,S.等人，CancerImmunol.Immunther.(2010)59:1511-1519)。
2.一种淋巴细胞性细胞组合物，其包含纯NK细胞和GDT细胞的混合物(优选地，两种细胞类型一起或分别被活化)。
由于供体γδt细胞(γδT细胞或GDT细胞)在与MHC无关并通过靶细胞的应激信号进行杀伤方面基本上与供体NK细胞功能相似，因此它们也可以与基本上纯的供体NK细胞联合用于治疗某些患者。供体NK细胞和供体GDT细胞的区别在于供体GDT细胞在体内扩增。)。输注的NK细胞不能增殖。因为GDT细胞可以表现得像T细胞，并且因为它们可以扩增，所以它们在患者中的寿命比供体NK细胞长得多。在期望短暂供体微嵌合体的情况下，使用供体GDT细胞是有益的，这使得移植物抗肿瘤(GVT)(或移植物抗白血病或移植物抗病毒)效果更强效且更持久。通过将NK和GDT细胞从白细胞去除术材料中分离，可以制备细胞“产品”混合物。可替代地，可以将它们单独分离和单独活化，然后以期望的比率混合在一起以达到在个案基础上控制每个群的剂量的目的。
3.NK+GDT+iNKT细胞组合物混合物(优选地，NK和GDT细胞类型两者都被活化，或者一起活化，或者单独活化)。
包含NK+GDT+iNKT细胞的组合物与包含NK和GDT细胞的组合物相似，因为iNKT群在PBMC中所占百分比非常小。然而，分离过程略有不同。因而，在某些实施方案中，分离这种NK+GDT+iNKT细胞混合物的过程是通过耗竭中性粒细胞、单核细胞、AB T细胞和B细胞，并收集剩余成分完成的。例如，使白细胞去除术材料经受CD14、CD15、CD19、CD4和CD8的联合耗竭。剩余细胞是NK+GDT+iNKT细胞的混合物。这种分离过程非常实用，但它不允许单独控制细胞类型的每个群的剂量。
注意的是，iNKT细胞是表达转录因子PLZF的CD1d限制性脂质感应先天T细胞。(NatImmunol.2015年1月；16(1):85–95)。iNKT细胞具有半恒定αβTCR，并识别CD1d呈递的脂质抗原。与适应性MHC限制性T细胞不同，它们在稳定状态下显示出效应和记忆表型，这使得它们为立即效应功能做好准备。由于它们的快速反应和NK受体的基础表达，它们被认为是“先天”的T细胞。iNKT细胞特征性地表达高水平的由Zbtb16编码的BTB-POZ转录因子PLZF，这种转录因子被提出来定义iNKT细胞谱系。PLZF也由人MAIT细胞(半恒定T细胞的另一个群)以及γδT细胞的先天亚群表达。因而，PLZF表达与TCR多样性有限的T细胞相关，并且被认为是这些细胞的先天表型和快速细胞因子反应的原因。(参见，Anticancer Res.2018年7月；38(7):4233-4239)。
4.NK+CD3细胞组合物混合物(活化NK细胞与CD3细胞组合)
先前在同种异体移植中使用同种异体淋巴细胞的治疗引起这些患者中的GVHD。因而，从业者对使用CD3混合物一直是谨慎的。在这种治疗方案中，通过有效地暂时抑制患者的免疫系统(例如大约5-7天的淋巴抑制)的预处理步骤，减轻了GVHD的可能性。虽然不希望受理论的束缚，但认为只要输注的CD3细胞的数量不足以在的5-7天淋巴抑制期(为预处理步骤的结果)结束时克服宿主免疫系统，患者就没有GVHD的危险。没有GVHD危险的另一个原因是因为GVT(移植物抗肿瘤)(或GVL或GVV(移植物抗病毒))总是排在GVHD之前。这意味着，只要患者对作为CD3同种异体细胞的靶标的肿瘤抗原有一些肿瘤负荷，就没有产生“GVHD的时间”，因为同种异体细胞将忙于攻击入侵者细胞，例如癌症/病毒/细菌细胞。如果有可能在一次单一治疗中完全消灭目标癌症或病毒或细菌感染的细胞，则发生GVHD的风险非常小。例如，如果患者具有最小残留病，并且用NK+CD3细胞的组合进行治疗，并且在患者的免疫系统从预处理的效应恢复之前的最初几天内，同种异体细胞杀死所有癌细胞。人们认为，由于CD3细胞寿命更长，且它们扩增，并且它们攻击任何外来物，所以预计当没有癌细胞要攻击时，它们将开始攻击健康的宿主细胞，并且它们将保持增殖。这可以导致急性的、可能是低级别的GVHD。然而，需要避免的情况是最初输注较高剂量的CD3细胞，当预处理逐渐磨耗时，它们已经扩增到宿主免疫系统无法再排斥它们的程度，那么可能会导致更严重的GHVD。因此，活化NK细胞和CD3细胞治疗的这种组合仅用于肿瘤负荷非常重的患者，如转移性实体瘤患者和晚期或转移性血液癌患者(参见图1)。向治疗中加入CD3细胞实际上产生了更持久的供体微嵌合体和更好的同种异体细胞的肿瘤浸润。同种异体细胞的同种异体反应性间接帮助宿主免疫系统，使其更容易浸润到肿瘤微环境中。这个程序诱导了强得多的宿主抗肿瘤免疫原性。
第3阶段：输注后选项。如图1所示，对于输注后治疗(或输注后处理)，有三个选项 可用。输注后方案的作用是防止或减弱患者的免疫衰竭和/或免疫耐受。
1.输注后体内IL-2活化。
在某些患者中，通过在输注活化NK细胞后的第0天(细胞输注日)至约输注后第5天向患者施用IL-2，将实现体内IL-2活化。输注后，仅当用包含IL-2的混合物在体外活化NK细胞时才指示体内IL-2施用。IL-2的量可以变化，但通常以SC注射为约6x106 IU/m2/天。向患者施用IL-2的量可以在约1x106 IU/m2/天至约6x106 IU/m2/天之间变化，并且通常经皮下(SC)施用。对于不推荐给患者注射IL-2的癌症，比如淋巴细胞性或淋巴母细胞性白血病或淋巴瘤患者，不施用这个输注后步骤。对于这些患者，输注后不予体内施用IL-2。预计输注后向患者体内施用IL-2的最长时间为7天。
2.COX-2抑制剂的输注后施用
虽然不希望受理论的束缚，但与向患者施用COX-2抑制剂(特异性或非特异性)相关的输注后治疗选项用于阻断PGE2和FOXP3途径，从而阻碍Treg的分化和产生，以避免免疫衰竭和免疫耐受，免疫衰竭和免疫耐受是与许多基于细胞的疗法相关的两个复杂因素，尤其是与IL-2活化相关的疗法。另外，输注后治疗有助于控制输注相关发热和与活化的淋巴细胞性细胞输注相关的疼痛。在输注后或后处理方案中这些特异性或非特异性COX-2抑制剂可以口服施用，时间段范围为从第0天(细胞输注日)到约3-4周的任何时间段，量为约200-400mg/天，持续3-4周的时间范围。
3.PGE2抑制剂的输注后施用
类似地，根据图1，其他PGE2抑制剂，包括非特异性COX-2抑制剂，比如阿司匹林、吲哚美辛(Indocin)、布洛芬(Advil，Motrin)、萘普生(Naprosyn)、吡罗昔康(Feldene)和萘丁美酮(Relafen)也可以在活化淋巴细胞性细胞输注后施用于患者。这些化合物具有与COX-2抑制剂相似的作用。在输注后或后处理方案中这些剂可以口服施用，时间段范围为从第0天(细胞输注日)到约3-4周的任何时间段，量为约80-300mg/天。
另外，在某些患者中，预计这种治疗方案将周期性地重复，以增强免疫系统对肿瘤或传染因子的应答。这样的周期性治疗可以变化，从每月一次、到每两个月一次、到每3个月一次、到每4个月一次、到每5个月一次、到每6个月一次、或每7个月一次、或每8个月一次、或每9个月一次、或每10个月一次、或每11个月一次、或每年一次，作为维持治疗，只要患者需要即可。
实施例2
活化淋巴细胞治疗后施用的免疫检查点抑制剂
在某些实施方案中，用本文所述的活化淋巴细胞方案之一治疗患者，然后在施用活化淋巴细胞组合物后4-14天的时间范围内进一步施用免疫检查点抑制剂。虽然不希望受理论的束缚，但人们认为由于供体活化淋巴细胞性细胞在接受者患者中的寿命约为4/5-15天，当它们开始死亡时，它们起到呈递肿瘤抗原的作用，并在患者中起到疫苗的作用。此时(在施用活化淋巴细胞性细胞后约4-14天)，可以向患者施用免疫细胞检查点抑制剂中的任一种或两种的组合，例如向免疫系统发送抑制信号的分子。在施用免疫细胞检查点抑制剂后，将遵循本文所述的后处理治疗选项。免疫细胞检查点抑制剂的剂量将是标准剂量。另外，在某些患者中，预计这种治疗将周期性地重复，以增强免疫系统对肿瘤的应答。这样的周期性治疗可以变化，从每月一次、到每两个月一次、到每3个月一次、到每4个月一次、到每5个月一次、到每6个月一次、或每7个月一次、或每8个月一次、或每9个月一次、或每10个月一次、或每11个月一次、或每年一次，作为维持治疗，只要患者需要即可。
这样的剂的实例包括PD-1或PD-L1(B7-H1)的抑制剂，比如抗PD-1抗体，包括纳武单抗(来自Bristol-Myers Squibb的纳武单抗)和派姆单抗/拉姆布罗力珠单抗，也称为MK-3475(来自Merck的Keytruda)、皮地利珠单抗(Curetech)、AMP-224(Amplimmune)，以及抗PD-L1抗体，包括MPDL3280A(Roche)、MDX-1105(Bristol Myer Squibb)、MEDI-4736(AstraZeneca)和MSB-0010718C(Merck)。其他检查点抑制剂包括CTLA-4的拮抗剂，比如抗CTLA-4抗体。示例性抗CTLA4抗体是YervoyTM(伊匹单抗)，其由Bristol-Myers Squibb销售。其他示例性的CTLA-4抗体包括曲美木单抗(Pfizer)、替西木单抗(AstraZeneca)和AMGP-224(Glaxo Smith Kline)。
用活化NK细胞，然后用纳武单抗治疗转移性乳腺癌患者
用本文所述的活化淋巴细胞细胞方案治疗转移性乳腺癌患者，然后在施用活化淋巴细胞性细胞组合物后约8天的时间范围内进一步施用免疫检查点抑制剂(检查点抑制剂的施用时间可以是施用活化淋巴细胞细胞组合物后约4-15天的任何时间)。治疗耐受性良好，仅经历1级副作用。另外，初步结果显示，所有转移缩小到几乎检测不到的水平。图3A-E显示了该数据的总结以及其他结果和方案。
实施例3HIV治疗选项
按照规定采取其药物-抗逆转录病毒疗法(ART)并保持检测不到的病毒载量的HIV个体可以活得更长、更健康，并且实际上对伴侣没有性传播HIV的风险。然而，由于联合治疗前的次最佳疗法和/或依从性差，证明相当大的HIV患者亚群有耐药性。在美国的主要城市加利福尼亚、纽约、伊利诺伊、佛罗里达，和某些国家例如巴西和泰国，这是一个特别的问题，在这些国家，在1980年代和1990年代，单一疗法和双重疗法被广泛使用]。由于各种原因，包括不良副作用、毒性、耐药性、药物滥用、精神障碍、社会经济地位、文化程度和社会污名，大量HIV患者无法坚持治疗[4]。这样的患者有持续的病毒复制，通常伴有显著水平的血浆病毒血症，因此，免疫系统严重受损，选择有限，不可阻挡的显著发病率，并最终死亡。
尽管做出了重大努力，但在改善具有未抑制的血浆病毒血症的患者方面进展甚微。
目前，HIV疾病进展的临床前和临床模型表明，与HIV相关的胃肠道破坏导致微生物穿过受损的肠屏障移位，并随后导致慢性免疫活化、疾病进展和HIV疾病死亡率增加。γδ(γδ)T细胞是一种“先天”T细胞类型，其表达半恒定T细胞受体(TCR)。在重排的TCR中，Vδ1或Vδ2基因的不同使用区分了人γδT细胞的两个主要亚群[7]。微生物产物和应激宿主细胞的识别使γδT细胞在针对一般感染和特别地病毒感染的免疫应答中发挥重要作用[8-10]。虽然Vδ2+细胞主要在血液中循环，但Vδ1+细胞主要作为上皮内淋巴细胞(IEL)定位在肠粘膜内，并有助于维持上皮功能[9]。γδT细胞具有先天免疫细胞和适应性免疫细胞两者的组合特性，使它们有吸引力用于潜在的免疫治疗方法[11-13]。它们可以产生炎性细胞因子，直接裂解感染细胞或恶性细胞，并在再次暴露后建立记忆应答来攻击病原体。γδT细胞由T细胞受体(TCR)链的γ和δ异二聚体(TCRγ/TCRδ)的表达来定义，所述异二聚体通过相关的CD3/TCR复合物引导细胞内信号传导[14]。γδT细胞谱系(占循环T细胞的1-5％)可以与外周血中更普遍的αβT细胞谱系(约90％)形成对比，后者表达TCRα/TCRβ异二聚体，并且也通过相关的CD3/TCR复合物发出信号[15,16]。αβT细胞上的CD4和CD8共受体有助于TCRαβ链与主要组织相容性复合物(MHC)结合，从而呈递在形成的CD3/TCR复合物上呈递的各种肽[17-19]。相反，TCRγδ直接与抗原的超结构结合，而不依赖于MHC/肽复合物，因此，CD4和CD8在γδT细胞上并不常见[20,21]。鉴于抗原识别是在MHC/肽限制之外实现的，γδT细胞具有通过其TCR介导的可预测的免疫效应功能，并具有作为通用同种异体过继细胞疗法的潜在用途[22]。
已经证明，γδT细胞不引起显著的同种异体反应性，因此不诱导严重的移植物抗宿主病。
自然杀伤(NK)细胞是先天淋巴样细胞，其在缺乏抗原识别的情况下，提供对肿瘤转化细胞或病毒感染细胞的长期监视。它们是先天免疫的重要效应子，在病毒感染的根除和清除中发挥关键作用。而且，NK细胞被认为是天然和适应性免疫系统细胞之间的桥梁。近年来，一些研究表明，HIV-1病理性地改变NK细胞的稳态，并阻碍其抗病毒效应功能。此外，高水平的慢性HIV-1病毒血症显著损害了正常调节先天免疫应答和适应性免疫应答之间的串扰的那些NK细胞调节特征。据报道，NK细胞受体的特异性单倍型的存在以及NK细胞抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的衔接控制了HIV-1感染。
NK细胞上遗传编码的抑制性受体，包括杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)在内，极大地影响NK细胞活化，这是由活化和抑制信号之间的平衡决定的。KIR与其同源HLA配体之间的相互作用为NK细胞的细胞毒活性设定了阈值。而且，已证明它严重影响病毒感染过程，与丙型肝炎感染的消退相关[30]。在HIV中，HLA/KIR组合与疾病进展的速度[31,32]以及防止疾病获得相关[33,34]。赋予这种保护的机制可包括通过抑制性配体活化的NK细胞教育或“许可”[35]以及KIR与HLA分子上呈递的HIV-1衍生肽基序的直接相互作用。特异性病毒蛋白/KIR组合与体外NK细胞病毒抑制的差异相关[36]并且HLA/KIR组合赋予了HIV控制的差异[37]。将由特异性HIV衍生肽导向的HLA/KIR相互作用进一步与体外NK细胞功能的测量值和群体研究中的病毒逃逸模式联系起来[38,39]。这表明，部分地由抑制性受体配体的遗传变体决定的NK细胞活化阈值，以及可用于呈递在宿主HLA结构上的病毒相关肽，限定了NK细胞的细胞毒性活性的保护效力。
目前提出的方法至少部分地基于利用这些机制，以便利用同种异体NK细胞和γδT细胞的HIV特异性细胞毒性功能，基于源自HIV感染细胞的应激信号的存在和宿主HLA/供体KIR谱的不匹配，将所述功能鉴定为移植物抗病毒效应，而没有显著的移植物抗宿主反应的风险。
示例性的整体治疗流程是(可以根据需要重复)：
●从第-7天到第-1天的预处理
●第0天的细胞输注
●从第1天到第30天的后处理
HIV患者的示例性治疗概述如下：
预处理
第-7天到第-4天
氟达拉滨25mg/m2/d IV 30分钟
第-3天和第-2天
环磷酰胺300mg/m2/d IV 30分钟
第-2天和第-1天
干扰素3x106 IU/m2/d SC
过继细胞疗法
第0天
用药前：异丙嗪25mg和苯海拉明25mg IV 30分钟
NK细胞20-25x106/kg和γδT细胞5-10x106/kg IV 60分钟
白细胞介素-2 6x106IU/m2SC
后处理
第1-4天
白细胞介素-2 6x106IU/m2/d SC
第1-30天
塞来昔布200mg/d PO
阿司匹林120-300mg/d PO(除非反指示)
实施例3A
在HIV患者中使用活化NK细胞活化淋巴细胞方案诱发HIV患者中的免疫应答
如图2A-B所示，对病毒血症未得到控制且由于耐受性和/或毒性问题而不再采用抗逆转录病毒疗法(ART)药物的患者，使用活化NK细胞方案进行如下治疗：
预处理方案：
氟达拉滨15mg/m2/d，从第-7天到第-3天
环磷酰胺500mg/m2/d，第-2天和第-1天
干扰素α3x106IU/m2/d，第-2天和第-1天
第0天(活化NK输注日)：
20x106个细胞/kg活化NK细胞
5x106个细胞/kg活化GDT细胞
6x106IU/m2IL-2SC注射
第1天到第5天：
6x106IU/m2IL-2SC注射
第1天到第40天：
200mg/d塞来昔布PO
患者经历自限性发热、寒战和关节痛，在第3天到第6天，通过塞来昔布得到缓解。未观察到其他不良反应。在活化NK细胞治疗后的第49天，确定HIV病毒载量为<20个HIV RNA拷贝/ml，这几乎检测不到(参见图2A和图2B)。
患者的HLA谱与NK+GDT供体细胞的HLA谱不匹配。
本文提供的这些实施例证明了活化细胞组合物治疗HIV和/或癌症患者的令人惊讶和出乎意料的能力。
虽然不希望受理论的束缚，但人们认为由于病毒感染的细胞本质上类似于癌细胞(即不受控制地分裂或复制的外来细胞)，用如本文所述的活化淋巴细胞组合物和方法治疗患者将导致杀伤HIV感染的细胞，然后继续诱发具有活化淋巴细胞的“疫苗效应”的免疫应答，在这种情况下，活化NK细胞加上活化γδT细胞治疗，并通过活化NK细胞的吞噬能力继续控制病毒血症。当HIV病毒粒子在患者的外周血中循环时，预计NK细胞将破坏/消除它们。
如图2所示，在治疗之后，HIV病毒载量大幅降低，并且患者的CD4和CD8细胞计数以及患者的总淋巴细胞计数反弹。还在输注日向这位患者施用COX-2抑制剂的输注后治疗，并在输注后的40天内每天施用。
另外，预计这种治疗将周期性地重复，以增强免疫系统对任何剩余病毒/病毒粒子的应答。这样的周期性治疗可以变化，从每月一次、到每两个月一次、到每3个月一次、到每4个月一次、到每5个月一次、到每6个月一次、或每7个月一次、或每8个月一次、或每9个月一次、或每10个月一次、或每11个月一次、或每年一次，作为维持治疗，只要患者需要即可。
实施例3B
消除HIV储存库
鉴于图2和实施例2A中描述的HIV病毒载量的急剧降低，本发明的同种异体的活化淋巴细胞性治疗被认为也将有效消除潜伏的HIV储存库，所述储存库通过标准ART是基本上不能触及的。在感染HIV之后，由于“不完全ART”，存在着可以被刺激的潜伏储存库，从而变得对活化淋巴细胞性细胞(“同种异体细胞”)“可见”。没有一个活化潜伏HIV储存库的大事件—相反，储存库中的HIV以某一缓慢的速度自然复制，如果同时用“不完全ART”治疗，它们将无法融合或感染新的T细胞，所述治疗包括抗HIV mAb或任何其他干扰感染过程的抗逆转录的融合或进入抑制剂(这些提供不完全治疗，并且必须与另一种剂组合，而不是阻止病毒表达和产生的剂)。这样的小分子HIV融合或进入抑制剂的实例包括：贝韦立马(DSB；PA-457)；维立韦罗(Vicriviroc)、马拉韦罗(Maraviroc)(一种趋化因子受体拮抗剂或“CCR5抑制剂”)、T-20(恩夫韦地，Fuzeon，由Roche和Trimeris开发)、TRI-1144和TRI-999(参见，Qian,K等人，Med Res Rev.2009Mar；29(2):369–393，以及Haggani和Tilton,AntiviralRes.2013May；98(2):158-70)。类似地，抗HIV mAb的实例包括针对CCR5和CD4的那些，具体来说：依巴珠单抗(商品名Trogarzo)是一种结合CD4的非免疫抑制人源化单克隆抗体；PRO140是靶向针对CCR5的人源化单克隆抗体。在病毒爆发之后和融合到宿主CD4 T细胞之前的短暂时期，活化淋巴细胞性细胞(“同种异体细胞”)，如本治疗方法中所述(包括各种预处理和后处理选项)，将起到杀伤HIV病毒并防止其感染新细胞的作用。如本文所述，使用这种活化淋巴细胞性细胞治疗和方案，结合“不完全ART”方案，将允许潜伏感染的细胞表达病毒，从而使所述病毒然后可以暴露于被活化淋巴细胞性细胞杀伤。结果将是用活化淋巴细胞性细胞主动杀伤所有产生病毒的细胞，同时保护新的T细胞免受感染，因为存在如上所述的“不完全ART”mAb或小分子抑制剂。
另外，在某些患者中，预计这种治疗将周期性地重复，以增强免疫系统对任何剩余病毒/病毒粒子的应答。这样的周期性治疗可以变化，从每月一次、到每两个月一次、到每3个月一次、到每4个月一次、到每5个月一次、到每6个月一次、或每7个月一次、或每8个月一次、或每9个月一次、或每10个月一次、或每11个月一次、或每年一次，作为维持治疗，只要患者需要即可。
方法
A.用新收获的NK细胞活化/分化
●使用Miltenyi NK分离试剂盒(阴性选择)从健康供体白细胞去除术材料中分离健康供体来源的静息外周血NK细胞
●以106/ml细胞浓度接种细胞
●12孔板，3x106个细胞/孔
●基础培养基：Miltenyi GMP级NK培养基
●实验条件：
1.基础培养基
2.基础培养基+IL-2(500IU/ml)
3.基础培养基+FGFR1(33nM)
4.基础培养基+IL-2(500IU/ml)+FGFR1(33nM)
●每种情况一式三份测试。
●第0天(接种)细胞计数：106个总活细胞/ml
表6：24小时细胞计数结果(每组3个的平均值)：
总细胞计数/ml 活力％ 活细胞计数/ml
1 9.98x10<sup>5</sup> 97 9.68x10<sup>5</sup>
2 9.01x10<sup>5</sup> 98.5 8.88x10<sup>5</sup>
3 1.02x10<sup>6</sup> 98.9 10<sup>6</sup>
4 9.26x10<sup>5</sup> 97.2 9x10<sup>5</sup>
表7：48小时细胞计数结果(每组3个的平均值)：
总细胞计数/ml 活力％ 活细胞计数/ml
1 9.27x10<sup>5</sup> 95 8.8x10<sup>5</sup>
2 8.99x10<sup>5</sup> 97.2 8.73x10<sup>5</sup>
3 1.04x10<sup>6</sup> 98.4 1.02x10<sup>6</sup>
4 9.19x10<sup>5</sup> 95.9 8.81x10<sup>5</sup>
表8：72小时细胞计数结果(每组3个的平均值)：
总细胞计数/ml 活力％ 活细胞计数/ml
1 8.13x10<sup>5</sup> 91 7.39x10<sup>5</sup>
2 8.98x10<sup>5</sup> 97.0 8.71x10<sup>5</sup>
3 1.19x10<sup>5</sup> 98.1 1.16x10<sup>6</sup>
4 9.42x10<sup>5</sup> 94.9 8.93x10<sup>5</sup>
这些数据说明了新鲜收获的NK细胞作为用于本文方法中所述的治疗组合物和应用的细胞的来源(商业上可扩展)的稳定性和活力。
如图6C所示，当评价72小时过程中的活力和总细胞数时，FGFR1活化优于单独的IL-2。如上表6-8所示，FGFR1组中的细胞略有扩增(参见第3行的结果)。向FGFR1加入IL-2减弱了单独的FGFR1的增殖作用。这进一步反映在图6A-D中，图中比较了活化72小时结束时细胞毒性细胞数量与调节性/非细胞毒性NK细胞分布。在此分析中，有三个主要群被设门：
CD16-CD56+NK群，为调节亚群；
CD16-CD56暗NK群，为调节性/静息亚群；
活化的CD16+NK群/细胞毒性亚群。
因而，比较“细胞毒性与非细胞毒性/调节群”，流式细胞术数据说明FGFR1活化亚群(图6C)显示出细胞毒性NK细胞(CD16+，或者还有CD16+CD56暗或CD16-CD56暗)增加最多，而调节性NK细胞最少。在仅有IL-2的活化亚群(图6B)中，调节性NK细胞(CD16-CD56+)的数量要多得多，这可能促成过继细胞疗法环境中的免疫耐受或免疫衰竭。因而，FGFR1或组合IL-2+FGFR1活化的NK群对于本方法是最理想的。
B冷冻保存的NK细胞的活化/分化
●使用Miltenyi NK分离试剂盒(阴性选择，Miltenyi Biotec Inc.)从健康供体白细胞去除术材料中分离健康供体来源的静息外周血NK细胞。
●实验前将所述细胞在-80C下储存14天。将它们以5x106/ml的浓度储存在1.8ml冻存管中的Cryostor CS10冷冻保存溶液中。
●将细胞在37℃水浴中解冻并立即接种在培养板中。
●以106/ml细胞浓度将细胞接种在12孔板中，3x106个细胞/孔。
●基础培养基：Miltenyi GMP级NK培养基
●实验条件：
1.基础培养基
2.基础培养基+IL-2(500IU/ml)
3.基础培养基+FGFR1(33nM)
4.基础培养基+IL-2(500IU/ml)+FGFR1(33nM)
●每种情况一式三份测试。
●第0天(接种)细胞计数：106个总活细胞/ml
表9：24小时细胞计数结果(每组3个的平均值)：
总细胞计数/ml 活力％ 活细胞计数/ml
1 8.71x10<sup>5</sup> 91 7.92x10<sup>5</sup>
2 8.16x10<sup>5</sup> 90.5 7.38x10<sup>5</sup>
3 8.11x10<sup>5</sup> 93 7.54x10<sup>5</sup>
4 8.44x10<sup>5</sup> 92.7 7.82x10<sup>5</sup>
表10：48小时细胞计数结果(每组3个的平均值)：
总细胞计数/ml 活力％ 活细胞计数/ml
1 8.10x10<sup>5</sup> 92 7.45x10<sup>5</sup>
2 7.99x10<sup>5</sup> 94.2 7.52x10<sup>5</sup>
3 8.01x10<sup>5</sup> 94.4 7.56x10<sup>5</sup>
4 7.91x10<sup>5</sup> 94 7.43x10<sup>5</sup>
表11：72小时细胞计数结果(每组3个的平均值)：
总细胞计数/ml 活力％ 活细胞计数/ml
1 6.73x10<sup>5</sup> 91 6.13x10<sup>5</sup>
2 7.87x10<sup>5</sup> 90.5 7.12x10<sup>5</sup>
3 8.97x10<sup>5</sup> 92.3 8.27x10<sup>5</sup>
4 9.51x10<sup>5</sup> 93.7 8.91x10<sup>5</sup>
这些数据说明了冷冻保存的NK细胞作为用于本文方法中所述的治疗组合物和应用的细胞的另一个来源(商业上可扩展)的稳定性和活力。
不良事件表征
将使用《不良事件通用术语标准》(Common Terminology Criteria for AdverseEvents(CTCAE))v5.0第1级至第5级评估AE的严重性。如果事件没有经CTCAE分类，研究者将根据下面的等级对事件的严重性进行分级，以估计严重性。
Figure BDA0003481215030000681
标准方法
分子生物学的标准方法描述于Sambrook、Fritsch和Maniatis(1982和1989年第2版，2001年第3版)Molecular Cloning,A Labor atory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring H arbor,NY；Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA，第217卷，Academic Press,San Diego,CA)。标准方法也见于Ausbel等人，(2001)Current Protocols in Mo lecular Biology，第1-4卷，John Wileyand Sons,Inc.New York,NY，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。
蛋白质纯化的方法已有描述，包括免疫沉淀、色谱法、电泳、离心和结晶(Coligan等人，(2000)Current Protocols in Protein Science，第1卷，John Wiley and Sons,Inc.,New York)。化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化已有描述(参见，例如，Coligan等人，(2000)Current Protocols in Protein Science，第2卷，John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel等人，(2001)Current Protocols inMolecular Biology，第3卷，John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY，第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；第45-89页；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.，第384-391页)。多克隆和单克隆抗体的生产、纯化和片段化已有描述(Coligan等人，(2001)CurrentProtocols in Immunology，第1卷，John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow和Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；Harlow和Lane,上文)。可获得用于表征配体/受体相互作用的标准技术(参见，例如，Coligan等人，(2001)Current Protocols in Immunology，第4卷，John Wiley,Inc.,New York)。
将本文引用的所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物、数据库条目(例如，Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利具体地并且单独地被指明通过引用并入一样。根据37C.F.R.§1.57(b)(1)，申请人希望通过引用并入本声明，从而涉及各个和每个单独的出版物、数据库条目(例如，Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，每一者都根据37C.F.R.§1.57(b)(2)被明确标识，即使这样的引证未与通过引用并入的专用声明紧邻也是如此。在说明书中包含通过引用并入的专用声明(如果有的话)并不会以任何方式削弱通过引用并入的一般声明。本文参考文献的引用并不意味着承认所述参考文献是相关的现有技术，也不构成关于这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。
本发明实施方案并不限于本文所述的具体实施方案的范围。事实上，根据前述说明书和附图，除了本文所述的那些之外，所述实施方案的各种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。这样的修改预期落入所述实施方案和所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> S·居姆吕克曲(GUMRUKCU, Serhat)
<120> 活化淋巴细胞性细胞和使用其治疗癌症和感染性病症的方法
<130> 147144.00102
<150> US 62/861,487
<151> 2019-06-14
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7133
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 1
taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt 60
tgtttaactt taagaaggag atataccatg catcaccatc accatcactc ccctatacta 120
ggttattgga aaattaaggg ccttgtgcaa cccactcgac ttcttttgga atatcttgaa 180
gaaaaatatg aggagcattt gtatgagcgc gatgaaggtg ataaatggcg aaacaaaaag 240
tttgaattgg gtttggagtt tcccaatctt ccttattata ttgatggtga tgttaaatta 300
acacagtcta tggccatcat acgttatata gctgacaagc acaacatgtt gggtggttgt 360
ccaaaagagc gtgcagagat ttcaatgctt gaaggagcgg ttttggatat tagatacggt 420
gtttcgagaa ttgcatatag taaagacttt gaaactctca aagttgattt tcttagcaag 480
ctacctgaaa tgctgaaaat gttcgaagat cgtttatgtc ataaaacata tttaaatggt 540
gatcatgtaa cccatcctga cttcatgttg tatgacgctc ttgatgttgt tttatacatg 600
gacccaatgt gcctggatgc gttcccaaaa ttagtttgtt ttaaaaaacg tattgaagct 660
atcccacaaa ttgataagta cttgaaatcc agcaagtata tagcatggcc tttgcagggc 720
tggcaagcca cgtttggtgg tggcgaccat cctccaaaat cggatgaaaa cctgtatttt 780
cagggcatga ggccgtcccc gaccttgcct gaacaagatg ctctcccctc ctcggaggat 840
gatgatgatg atgatgactc ctcttcagag gagaaagaaa cagataacac caaaccaaac 900
cccgtagctc catattggac atccccagaa aagatggaaa agaaattgca tgcagtgccg 960
gctgccaaga cagtgaagtt caaatgccct tccagtggga ccccaaaccc cacactgcgc 1020
tggttgaaaa atggcaaaga attcaaacct gaccacagaa ttggaggcta caaggtccgt 1080
tatgccacct ggagcatcat aatggactct gtggtgccct ctgacaaggg caactacacc 1140
tgcattgtgg agaatgagta cggcagcatc aaccacacat accagctgga tgtcgtggag 1200
cggtcccctc accggcccat cctgcaagca gggttgcccg ccaacaaaac agtggccctg 1260
ggtagcaacg tggagttcat gtgtaaggtg tacagtgacc cgcagccgca catccagtgg 1320
ctaaagcaca tcgaggtgaa tgggagcaag attggcccag acaacctgcc ttatgtccag 1380
atcttgaaga ctgctggagt taataccacc gacaaagaga tggaggtgct tcacttaaga 1440
aatgtctcct ttgaggacgc aggggagtat acgtgcttgg cgggtaactc tatcggactc 1500
tcccatcact ctgcatggtt gaccgttctg gaagccctgg aagagaggcc ggcagtgatg 1560
acctcgcccc tgtacctgga gtaaggatcc gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag 1620
ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc 1680
ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggat atcccgcaag aggcccggca 1740
gtaccggcat aaccaagcct atgcctacag catccagggt gacggtgccg aggatgacga 1800
tgagcgcatt gttagatttc atacacggtg cctgactgcg ttagcaattt aactgtgata 1860
aactaccgca ttaaagctta tcgatgataa gctgtcaaac atgagaattc ttgaagacga 1920
aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 1980
acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 2040
atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 2100
tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 2160
gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 2220
gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 2280
gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 2340
ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 2400
tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 2460
acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta 2520
cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 2580
catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 2640
cgtgacacca cgatgcctgc agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa 2700
ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca 2760
ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc 2820
ggtgagcgtg ggtcacgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt 2880
atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc 2940
gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat 3000
atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 3060
tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 3120
cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 3180
ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 3240
actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta 3300
gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 3360
ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 3420
gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 3480
acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta 3540
tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 3600
gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 3660
cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 3720
cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 3780
ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc 3840
gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg 3900
agcgaggaag cggaagggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt 3960
tcacaccgca atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt 4020
atacactccg ctatcgctac gtgactgggt catggctgcg ccccgacacc cgccaacacc 4080
cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac 4140
cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgaggca 4200
gctgcggtaa agctcatcag cgtggtcgtg aagcgattca cagatgtctg cctgttcatc 4260
cgcgtccagc tcgttgagtt tctccagaag cgttaatgtc tggcttctga taaagcgggc 4320
catgttaagg gcggtttttt cctgtttggt cactgatgcc tccgtgtaag ggggatttct 4380
gttcatgggg gtaatgatac cgatgaaacg agagaggatg ctcacgatac gggttactga 4440
tgatgaacat gcccggttac tggaacgttg tgagggtaaa caactggcgg tatggatgcg 4500
gcgggaccag agaaaaatca ctcagggtca atgccagcgc ttcgttaata cagatgtagg 4560
tgttccacag ggtagccagc agcatcctgc gatgcagatc cggaacataa tggtgcaggg 4620
cgctgacttc cgcgtttcca gactttacga aacacggaaa ccgaagacca ttcatgttgt 4680
tgctcaggtc gcagacgttt tgcagcagca gtcgcttcac gttcgctcgc gtatcggtga 4740
ttcattctgc taaccagtaa ggcaaccccg ccagcctagc cgggtcctca acgacaggag 4800
cacgatcatg cgcacccgtg gccaggaccc aacgctgccc gagatgcgcc gcgtgcggct 4860
gctggagatg gcggacgcga tggatatgtt ctgccaaggg ttggtttgcg cattcacagt 4920
tctccgcaag aattgattgg ctccaattct tggagtggtg aatccgttag cgaggtgccg 4980
ccggcttcca ttcaggtcga ggtggcccgg ctccatgcac cgcgacgcaa cgcggggagg 5040
cagacaaggt atagggcggc gcctacaatc catgccaacc cgttccatgt gctcgccgag 5100
gcggcataaa tcgccgtgac gatcagcggt ccaatgatcg aagttaggct ggtaagagcc 5160
gcgagcgatc cttgaagctg tccctgatgg tcgtcatcta cctgcctgga cagcatggcc 5220
tgcaacgcgg gcatcccgat gccgccggaa gcgagaagaa tcataatggg gaaggccatc 5280
cagcctcgcg tcgcgaacgc cagcaagacg tagcccagcg cgtcggccgc catgccggcg 5340
ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa ggcttgagcg 5400
agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc gctccagcga 5460
aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac gagttgcatg 5520
ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca ccggaaggag 5580
ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta atgagtgagc 5640
taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 5700
cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgccag 5760
ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca ccgcctggcc 5820
ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa aatcctgttt 5880
gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt atcccactac 5940
cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg cgcccagcgc 6000
catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca gcatttgcat 6060
ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta tcggctgaat 6120
ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg agacagaact 6180
taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat gctccacgcc 6240
cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct ggtcagagac 6300
atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg catcctggtc 6360
atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat tgtgcaccgc 6420
cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc tggcacccag 6480
ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca gggccagact 6540
ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg ccacgcggtt 6600
gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt tcgcagaaac 6660
gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg catactctgc 6720
gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct cttccgggcg 6780
ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga tctcgacgct 6840
ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg ccgttgagca 6900
ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc ccggccacgg 6960
ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg cgagcccgat 7020
cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga 7080
tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga aat 7133

Claims (50)

1.一种治疗具有HIV、癌症、病毒感染或细菌感染的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
2.一种用于增加有需要的患者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含活化NK细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
3.一种抑制患者中的HIV复制的方法，所述方法包括向具有HIV的受试者患者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
4.一种抑制患者中的肿瘤生长的方法，所述方法包括向具有肿瘤的患者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
5.一种抑制具有病毒或细菌感染的受试者中的病毒或细菌复制或繁殖的方法，所述方法包括向具有病毒或细菌感染的受试者患者施用有效量的包含活化自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞性细胞组合物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物进一步包含活化的γδT细胞(GDT细胞)。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物进一步包含恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)。
8.根据权利要求书1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物进一步包含CD3+T细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在向所述患者施用之前，通过将所述细胞与至少一种细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)混合/孵育/接触来活化所述淋巴细胞性细胞组合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞因子选自由IL-2、IL-15、IL-21、Flt3-L、干细胞因子(SCF)、IL-7、IL-12和IL18组成的组及其任何组合。
11.根据权利要求10所述的方法，其中将所述细胞因子与所述细胞组合物孵育/混合/接触约6-24小时。
12.根据权利要求10所述的方法，其中与所述细胞组合物一起孵育的细胞因子的量为约100-1000IU/ml。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过在施用所述淋巴细胞性细胞组合物之前施用至少一种淋巴抑制剂、化学治疗剂或免疫抑制剂3-5天，在施用所述淋巴细胞性细胞组合物之前对所述患者进行预处理。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述淋巴抑制剂或化学治疗剂包括6TG、6-MMP中的任何一种、一种或多种选自由氯法拉滨、氟达拉滨和阿糖胞苷组成的组的嘌呤类似物，或其任何组合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述淋巴抑制剂或化学治疗剂的剂量范围为约5mg/m2至约50mg/m2。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述化学治疗剂或免疫抑制剂包括环磷酰胺、利妥昔单抗、类固醇中的任何一种或其任何组合。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述类固醇是糖皮质激素类固醇。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述类固醇是泼尼松。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述化学治疗剂或免疫抑制剂的剂量范围为约20mg/m2至约1000mg/m2。
20.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法进一步包括在施用所述淋巴细胞性细胞组合物之前的两天和/或1天，以约1x 106IU/m2/d至约10x 106IU/m2/d的剂量向所述患者施用干扰素-α(IFN-α)或其生物等效物。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在施用所述淋巴细胞性细胞组合物的当天和在施用所述淋巴细胞性细胞组合物后的第一天向所述患者施用IL-2，并且任选地在施用所述淋巴细胞性组合物后另外继续施用3-14天，剂量为每剂量约3-6x 106IU/m2。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在施用所述淋巴细胞性细胞组合物的当天向所述患者施用COX-2抑制剂或非甾体抗炎药(NSAID)或其组合，并且在施用所述淋巴细胞性细胞组合物后继续施用至少14至60天。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述COX-2抑制剂是塞来昔布或罗非昔布，并且所述非甾体抗炎药选自由阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬、萘普生、吡罗昔康和萘丁美酮组成的组。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述活化NK细胞对于所述患者是同种异体的。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述NK细胞与所述患者是非HLA匹配的。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中活化细胞的剂量范围为约3-50x 106。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述病毒感染选自由下列病毒引起的病毒感染组成的组：逆转录病毒(例如，人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)I型和II型和人免疫缺陷病毒(HIV))、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒(HSV)I型和II型、EB病毒和巨细胞病毒)、沙粒病毒(例如，拉沙热病毒)、副粘病毒(例如，麻疹病毒属病毒、人呼吸道合胞病毒和肺炎病毒)、腺病毒、布尼亚病毒(例如，汉坦病毒)、冠状病毒、丝状病毒(例如，埃博拉病毒)、黄病毒(例如，丙型肝炎病毒(HCV)、黄热病毒和日本脑炎病毒)、嗜肝性DNA病毒(例如，乙型肝炎病毒(HBV))、正粘病毒(例如，仙台病毒和甲型、乙型和丙型流感病毒)、乳多空病毒(例如，乳头瘤病毒)、小核糖核酸病毒(例如，鼻病毒、肠道病毒和甲型肝炎病毒)、痘病毒、呼肠孤病毒(例如，轮状病毒)、披膜病毒(例如，风疹病毒)和弹状病毒(例如，狂犬病病毒)及其任何组合。
28.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液学或血源性癌症，其选自由以下组成的组：急性白血病、急性髓系白血病、急性骨髓性白血病、成髓细胞性白血病、前髓细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞白血病、红细胞白血病、慢性白血病、慢性髓细胞(或粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓增生异常，以及它们的任何组合。
29.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤，其选自由以下组成的组：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(比如胶质瘤(比如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、髓膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移。
30.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述细菌感染由以下致病细菌种之一引起：拟杆菌属、梭菌属、链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌属、军团菌属、分枝杆菌属、埃希菌属、沙门氏菌属、志贺菌属或李斯特菌属。
31.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述患者中的移植物抗宿主病(GVHD)减少或消除，而移植物抗肿瘤(GVT)或移植物抗病毒(GVV)增加。
32.根据权利要求1-20所述的方法，其中当所述患者患有淋巴细胞性或淋巴母细胞性白血病或淋巴瘤时，IL-2的施用是反指示的，并且在施用包含活化NK细胞的所述淋巴细胞性细胞组合物后不予施用。
33.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中在施用包含活化NK细胞的所述淋巴细胞性细胞组合物后的4-14天的时间范围内，向所述患者进一步施用免疫检查点抑制剂，包括两种检查点抑制剂中的任何一种或组合，包括PD-1或PD-L1(B7-H1)的抑制剂，比如抗PD-1抗体，包括纳武单抗(来自Bristol-Myers Squibb的纳武单抗)、派姆单抗/拉姆布罗力珠单抗，也称为MK-3475(来自Merck的Keytrud a)、皮地利珠单抗(Curetech)、AMP-224(Amplimmune)；或抗PD-L1抗体，包括MPDL3280A(Roche)、MDX-1105(Bristol MyerSquibb)、MEDI-4736(AstraZeneca)和MSB-0010718C(Merck)；CTLA-4的拮抗剂，比如抗CTLA-4抗体，包括抗CTLA4抗体YervoyTM(伊匹单抗，Bristol-Myers Squibb)、曲美木单抗(Pfizer)、替西木单抗(AstraZeneca)或AMGP-224(Glaxo Smith Kline)、或用于乳腺癌的肿瘤特异性抗体曲妥珠单抗(Herceptin)、用于淋巴瘤的利妥昔单抗(Rituxan)、或西妥昔单抗(Erbitux)。
34.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中在从每月一次、到每两个月一次、到每3个月一次、到每4个月一次、到每5个月一次、到每6个月一次、或每7个月一次、或每8个月一次、或每9个月一次、或每10个月一次、或每11个月一次、或每年一次的时间范围周期性地重复治疗或增加免疫应答作为维持治疗，只要所述患者表现出改善或病情稳定/无进展即可。
35.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在向所述患者施用包含活化NK细胞的所述淋巴细胞性细胞组合物的同一天，但在施用之前至少约2-6小时，向所述患者施用一种或两种抗组胺药。
36.一种活化NK细胞的方法，所述方法包括在体外使包含所述NK细胞的细胞组合物与至少一种细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)接触。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述细胞因子选自由IL-2、IL-15、IL-21、Flt3-L、干细胞因子(SCF)、IL-7、IL-12和IL18组成的组及其任何组合。
38.根据权利要求36所述的方法，其中使所述细胞因子与所述细胞组合物接触约6小时至约24小时。
39.根据权利要求36所述的方法，其中与所述细胞组合物接触的细胞因子的量为约100IU/ml至约1000IU/ml。
40.根据权利要求36-39中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包含γδT细胞(GDT细胞)。
41.根据权利要求36-40中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物进一步包含恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)。
42.根据权利要求36-41中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物进一步包含CD3+T细胞。
43.根据权利要求36-42中任一项所述的方法，其中所述NK细胞、γδT细胞(GDT细胞)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)和/或CD3+T细胞是从外周血中分离的。
44.一种细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)活化的淋巴细胞性细胞组合物，其包含活化自然杀伤(NK)细胞。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述细胞因子活化的组合物是IL-2、IL-15、IL-21、Flt3-L、干细胞因子(SCF)、IL-7、IL-12和IL18及其任何组合活化的组合物。
46.根据权利要求44和45所述的组合物，其中所述组合物物进一步包含γδT细胞(GDT细胞)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)和/或CD3+T细胞。
47.根据权利要求44-46中任一项所述的组合物，其中所述NK细胞是外周血NK细胞。
48.根据权利要求44-47中任一项所述的组合物，其中所述γδT细胞(GDT细胞)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)、CD3+T细胞是外周血γδT细胞(GDT细胞)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT细胞)和CD3+T细胞。
49.一种包含活化自然杀伤(NK)细胞的细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)活化的淋巴细胞性细胞组合物，其用于治疗具有HIV、癌症、病毒感染或细菌感染的患者。
50.一种包含活化自然杀伤(NK)细胞的细胞因子和任选的可溶性成纤维细胞生长因子受体1(sFGFR1)活化的淋巴细胞性细胞组合物，其用于制备用于治疗具有HIV、癌症、病毒感染或细菌感染的患者的药剂。
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