CN114441749A - 一种新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光afp中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光AFP中的应用。其中，多元适体分子通式为：Mag‑NH‑C(S)‑NH‑R1‑L1‑[C(O)‑NH‑Ap1]n，n为正整数且不小于4，Mag‑NH2为氨基磁珠，Ap1为适体分子。通过功能基团增加了适体分子Ap1的数量，通过链长L1增加了适体分子之间的间隔距离。AFP为甲胎蛋白，通过适体分子与检测物质AFP反应，捕获检测物质AFP；同时，通过检测物质AFP的双抗体夹心免疫反应，再次增加对检测物质AFP的信号放大作用，从而，提高检测物AFP的灵敏度。特别提供了新型多元适体分子AP6(n＝16)、检测物质AFP、多个抗体标记物等一起共同形成抗原抗体适体磁珠免疫复合物。该适体免疫复合物增加了对检测物质AFP的信号放大作用。

Description

一种新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光AFP中的应用
技术领域
本发明是关于生物检测技术，特别是关于一种新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光AFP中的应用。
背景技术
目前，抗原抗体免疫反应分为竞争法和夹心法两种。夹心法是双抗体与抗原反应，形成抗原抗体免疫复合物。其中，包被抗体与磁珠交联，形成磁珠包被抗体；标记抗体与标记物交联，形成抗体标记物。磁珠包被抗体，抗原，也就是检测物，与抗体标记物等，一起免疫反应，形成抗原抗体免疫复合物，经过磁分离过程，洗去未结合的抗体标记物，通过抗体标记物与底物的反应，产生光信号强度，其中，光信号强度与检测物T浓度成正比。作光信号强度与校准品浓度的校准曲线，通过检测物的校准曲线求出检测物的浓度。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光AFP中的应用，尤其适用于磁珠免疫化学发光AFP领域，获得了一种空间位阻和空间构象等得到显著优化的适体分子，从而极大地提高了免疫化学发光AFP的灵敏度。
为实现上述目的，本发明的实施例提供了一种新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光AFP中的应用，包括多元适体分子，其通式为：Mag-NH-C(S)-NH-R1-L1-[C(O)-NH-Ap1]n，n为正整数且不小于4，其中Mag-NH2为氨基磁珠，Ap1至少包括核酸单链序列或者核酸双链序列，L1选自长链基团，R1为不存在或者选自多元结构。优选的，L1选自至少提供多元氨基的C1-C100长链基团。
优选的新型多元适体分子的通式如下所示：
Figure BDA0003493380870000021
在本发明的一个或多个实施方式中，多元适体分子中R1的多元结构选自碳链或者杂链或者多元环结构。
在本发明的一个或多个实施方式中，氨基磁珠的粒径为0.01-1000μm。
在本发明的一个或多个实施方式中，还包括与所述新型多元适体分子配合的抗体标记物和检测物质AFP，形成免疫复合物，其通式如下所示：
Figure BDA0003493380870000022
其中，抗体标记物至少包括Ab1-X和Ab2-X，其中Ab1和Ab2为AFP的单克隆抗体或者多克隆抗体，X为标记物，m为正整数，且不小于1。X能与底物反应产生光信号，X产生的光信号强度与检测物质AFP浓度成正比。因此，新型多元适体分子免疫复合物产生的光信号强度，可以通过检测物质AFP的校准曲线求出检测物质AFP的浓度。
在本发明的一个或多个实施方式中，新型多元适体分子免疫复合物，抗体标记物中标记物X选自碱性磷酸酶。
在本发明的一个或多个实施方式中，新型多元适体分子免疫复合物，适体分子Ap1是针对检测物质AFP的特异性适体分子。
在本发明的一个或多个实施方式中，Ap1是一段单链DNA或双链DNA序列。Ap1优选为序列5’-AACCTTGACTGG-3’或5’-AACCTTGACTGGTTTAACCTATACGGGCACATTAAACCCGTA-3’或5’-CAATGGTACGGTACGGCCAAAGGGACCCTCATGTGCGCGC-3’或5’-CCCATGCTAAAGTGGGGGA-3’或5’-TTAACTTATTGCTAAATA-3’等。
在本发明的一个或多个实施方式中，上式a中n和m可以相等，也可以不等。
在本发明的一个或多个实施方式中，抗体标记物中Ab1和Ab2可以是AFP同一个位点的不同特异性抗体，也可以是AFP不同位点的不同特异性抗体。
在本发明的一个或多个实施方式中，药物组合物，包括如前述的新型多元适体分子或如前述的新型多元适体分子免疫复合物。
在本发明的一个或多个实施方式中，新型多元适体分子的合成路径可以参照如下：
Figure BDA0003493380870000031
此时，其中的一种可能的结构式如下，当n＝16：其中新型多元适体分子、检测物质AFP、多个抗体标记物等一起共同形成抗原抗体适体磁珠免疫复合物。该适体免疫复合物增加了对检测物质AFP的信号放大作用。
Figure BDA0003493380870000041
与现有技术相比，根据本发明实施方式的新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光AFP中应用时，具有提高灵敏度和增加信号强度的作用。主要通过优选合适的功能基团，同时结合链长L1等来优化新型多元适体分子的空间位阻、空间构象等方面的限制，从而获得了一种能提高灵敏度的多元适体分子。尤其该新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光AFP中，通过提供大量的适体分子Ap1与检测物质AFP反应，捕获检测物质AFP；同时，通过检测物质AFP的双抗体夹心免疫反应，再次增加对检测物质AFP的信号放大作用，从而提高检测物AFP的灵敏度。特别提供了新型多元适体分子AP6(n＝16)、检测物质AFP、多个抗体标记物等一起共同形成抗原抗体适体磁珠免疫复合物。该适体免疫复合物增加了对检测物质AFP的信号放大作用。
具体实施方式
下面结合本发明的具体实施方式，对本发明技术方案进行示例性的详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
本发明的目标产物的制备以及测试过程如下：
1、对硝基苯丙氨酸甲酯(化合物1)盐酸盐的制备
1L干燥烧瓶中加入800mL甲醇，搅拌下用冰盐浴冷却至-5℃～0℃，然后用恒压漏斗缓慢滴入120mL二氯亚砜(SOCl2)，滴完后再反应30min，然后加入42g(0.2mol)对硝基苯丙氨酸，室温下反应10h。TLC监测反应进程，待反应完全后，抽滤出白色固体，用乙醚洗三次，将滤液浓缩至混浊，再减压抽滤出白色固体，用乙醚洗三次，合并固体并烘干得产品。该反应产率为96.5％，产物的TLC：Rf＝0.65(展开剂：氯仿∶甲醇＝5∶1)。
2、对硝基苯丙氨酰胺(化合物2)的制备
250mL烧瓶中加入13g(50mmol)对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐，加入100mL浓氨水，冰浴下搅拌8h以上，TLC监测反应进程，待反应完全后，抽滤出白色固体，用冰水洗三次，干燥后即得到产品。该反应产率为85.5％，产物的TLC:Rf＝0.55(氯仿：甲醇＝5∶1)。
3、2-(4-硝基苄基)-乙二胺(化合物3)的制备
250mL三口烧瓶中加入4.2g(20mmol)对硝基苯丙氨酰胺和3.5g NaBH4，加入150mL无水THF，N2保护下搅拌，冰盐浴冷却至-10℃，缓慢滴加15mL BF3-乙醚溶液，滴完后再反应1h，然后升温至60℃回流，并在此温度下反应48h。TLC监测反应进程，待反应完全后，冰盐浴冷却至-10℃，滴加甲醇至不再有气体产生，用丙酮吸收尾气，待溶液中无气体逸出时，减压蒸去溶剂，加入100mL无水乙醇搅拌均匀，然后滤去不溶物，往滤液中通入干燥HCl气体至饱和，此时有固体产生，加热溶液并回流17h，冷却后滤出固体并用乙醚洗涤，烘干后用少量水溶解，然后用10mol/LNaOH溶液调节pH至14，并用氯仿萃取(10mL×8)，氯仿相用无水硫酸钠干燥过夜。滤出硫酸钠，减压蒸去溶剂即得产物。该反应产率为83.5％，产物的TLC:Rf＝0.25(展开剂：乙腈∶水＝5∶1)。
4、2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酸甲酯(化合物4)的制备
250mL烧瓶中加入1.95g(10mmol)2-(4-硝基苄基)-乙二胺，用80mL二氯甲烷溶解。再加入4g碳酸钾和少量碘化钾，氮气保护下室温搅拌1h；然后加入15.3g(9.4mL，100mmol)溴乙酸甲酯，氮气保护下升温至60℃回流48h。TLC监测反应进程，待反应完后，冷却后滤出沉淀，旋转蒸出溶剂，再减压蒸出过量的溴乙酸甲酯，残留物用二氯甲烷溶解，用水洗8～10次，有机相用无水硫酸钠干燥过夜。滤出硫酸钠，将滤液浓缩，经硅胶柱色谱分离(洗脱剂为：二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)。洗脱液中产物的TLC:Rf＝0.55(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，将含有纯产物的洗脱液蒸干即得黄色产物，产率80％。产物的TLC:Rf＝0.6(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)。
5、2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺(化合物5)的制备
250mL烧瓶中加入34mL(0.5mol)乙二胺，搅拌下用冰盐浴冷却至-5℃～0℃，然后用恒压漏斗缓慢滴入30mL二氯亚砜(SOCl2)，滴完后再反应30min，然后加入24.15g(0.05mol)2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酸甲酯，室温下反应10h。TLC监测反应进程，待反应完全后，抽滤出白色固体，用乙醚洗三次，将滤液浓缩至混浊，再减压抽滤出白色固体，用乙醚洗三次，合并固体并烘干得产品。该反应产率为82％，产物的TLC:Rf＝0.55(展开剂：氯仿∶甲醇＝5∶1)。
Figure BDA0003493380870000071
6、2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酸甲酯(化合物6)的制备
在氮气保护下，干燥的250mL三口烧瓶中，分别加入5.95g(10mmol)2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺和80mL甲醇，置于冰水浴中搅拌均匀。在磁力搅拌器上，用恒压滴液漏斗将9.1mL(100mmol)溴丙酸甲酯逐滴加入到三口烧瓶中，混合搅拌30分钟。升高水浴温度到30度，保持温度反应30h。反应完成后，保持温度40度，用旋转蒸发器减压蒸馏，除去溶剂甲醇和过量的溴丙酸甲酯，得产物。产率为97.6％，产物的TLC:Rf＝0.55(二氯甲烷∶甲醇＝14∶1)。
7、2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺(化合物7)的制备
250mL烧瓶中加入68mL(1.0mol)乙二胺，搅拌下用冰盐浴冷却至-5℃～0℃，然后用恒压漏斗缓慢滴入30mL二氯亚砜(SOCl2)，滴完后再反应30min，然后加入64.15g(0.05mol)2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酸甲酯，室温下反应10h。TLC监测反应进程，待反应完全后，抽滤出白色固体，用乙醚洗三次，将滤液浓缩至混浊，再减压抽滤出白色固体，用乙醚洗三次，合并固体并烘干得产品。该反应产率为81％，产物的TLC:Rf＝0.55(展开剂:氯仿∶甲醇＝5∶1)。
Figure BDA0003493380870000081
8、2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸叔丁酯的制备
250mL烧瓶中加入7.535g(5mmol)2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺，用80mL二氯甲烷溶解。再加入2g碳酸钾和少量碘化钾，氮气保护下室温搅拌1h；然后加入29.259g(24.3mL，150mmol)溴乙酸叔丁酯，氮气保护下升温至50℃回流48h。TLC监测反应进程，待反应完后，冷却后滤出沉淀，旋转蒸出溶剂，再减压蒸出过量的溴乙酸叔丁酯，残留物用二氯甲烷溶解，用水洗8～10次，有机相用无水硫酸钠干燥过夜。滤出硫酸钠，将滤液浓缩，经硅胶柱色谱分离(洗脱剂为：二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)。洗脱液中产物的TLC:Rf＝0.55(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，将含有纯产物的洗脱液蒸干即得黄色粘稠产物，产率75％。产物的TLC:Rf＝0.6(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)。
Figure BDA0003493380870000091
9、2-(4-氨基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸叔丁酯的制备
称取6.662g(2.0mmol)2-(4-硝基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸叔丁酯溶于50mL甲醇中，并加入到100mL三口瓶内，待固体溶解后加入0.1g 10％Pd/C，反应瓶用氢气置换10次并保持通氢气状态于室温搅拌24h，TLC检测反应完全后，将反应液过滤，滤饼用甲醇洗三次合并滤液，旋蒸干溶剂后用油泵抽干得产物，产率为92％。滤饼在湿润状态下回收至装有甲醇的广口瓶中。产物的TLC:Rf＝0.45(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)。
Figure BDA0003493380870000101
10、2-(4-氨基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸的制备
100mL烧瓶中加入4.952g(1.5mmol)2-(4-氨基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸叔丁酯，然后加入20mL TFA，室温下反应48h。TLC监测反应进程，待反应完后，旋转蒸出TFA，往残留物中加入冷乙醚，并用玻璃棒研磨，有灰白色固体析出，冷藏后过滤出固体，烘干即得产物，产率为91％。产物的TLC:Rf＝0.25(乙腈∶水＝3∶1)。
11、2-(4-异硫氰酸基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸的制备
100mL三口烧瓶中加入2.886g(1.2mmol)2-(4-氨基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸，用少量水溶解，剧烈搅拌下滴加5mL硫光气的氯仿溶液，室温下反应3h。待反应完后，静止分层，氯仿相用水洗3次，合并所有水相，减压浓缩至5mL左右时冻干，得产物，产率为88％。
到目前为止，阶段性产物p-SCN-R1-L1-(COOH)16的总产率为19.7％。
Figure BDA0003493380870000121
12、2-(4-磁珠-硫脲-苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸的制备
取10mg氨基磁珠(1mg/mL，10mL，磁珠的粒径为220μm)用双蒸水清洗三次，然后用10mL PBS-pH7.4的缓冲液溶解，放入50mL玻璃瓶，封闭后，振荡混匀，加入2.447mg(1.0μmol)2-(4-异硫氰酸基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸(用1.0mLDMF溶解)，再次振荡混匀，在摇床上室温反应2h。将磁珠反应液靠近磁铁后，用PBS清洗三次，收集上清液，余下的磁珠混合物为产物。测量上清液中化合物含量，计算产率。产率为86％。
本方案中的氨基磁珠，还可以选择0.01μm、50μm、100μm、300μm、500μm、800μm、880μm、1000μm以及0.01-1000μm范围内的其它任意值。
Figure BDA0003493380870000131
13、2-(4-磁珠-硫脲-苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸十六适体分子(新型多元适体分子Ap6，n＝16)的制备
取10mg上述氨基磁珠产物(1mg/mL，10mL)用双蒸水清洗三次，然后用10mLPBS-pH7.4的缓冲液溶解，放入50mL玻璃瓶，封闭后，振荡混匀，加入50mg EDC和50mg NHS，再次振荡混匀，在摇床上室温反应0.5h。将磁珠反应液靠近磁铁后，用PBS清洗三次。加入1.0μg适体分子(H2N-Ap1)，振荡混匀后，在4℃旋转反应过夜。取出磁珠适体反应液，靠近磁铁，清洗三次，收集上清液，余下的磁珠混合物为产物。测量上清液中适体分子含量，计算产率。产率为81％。
Figure BDA0003493380870000151
14、甲胎蛋白AFP浓度检测。
取10μL试剂1(新型多元适体分子溶液，Ap6)，50μL样本S或者校准品Calibrator或者质控品Control(AFP溶液)，50μL试剂2(Ab1-ALP，AFP抗体1碱性磷酸酶标记物)，50μL试剂3(Ab2-ALP，AFP抗体2碱性磷酸酶标记物)分别加入反应杯中，振荡混匀，37度反应10min。
将反应杯靠近磁铁，磁吸30秒，吸去反应杯内反应液。加入400μL清洗液，反应杯离开磁铁，振荡混匀后，反应杯靠近磁铁，磁吸30秒，吸去反应杯内反应液。如此重复清洗三次。
加入碱性磷酸酶底物100μL，通过光纤接收光信号，并转化为数字信号，得到信号强度。
通过下面数据，可以看出，与常规AFP磁珠免疫化学发光方法(对照)相比，信号强度提高了近15.4倍(18.5/1.2＝15.4)。
Figure BDA0003493380870000161
Figure BDA0003493380870000162
Figure BDA0003493380870000171
检测机理如上式所示。
上述实施例中的序列也可以选择性地为5’-AACCTTGACTGGTTTAACCTATACGGGCACATTAAACCCGTA-3’或5’-CAATGGTACGGTACGGCCAAAGGGACCCTCATGTGCGCGC-3’或5’-CCCATGCTAAAGTGGGGGA-3’或5’-TTAACTTATTGCTAAATA-3’，引入路线可以如前述方案或者等同方案，在甲胎蛋白AFP浓度检测时，检测信号强度提高近15倍，明显优于现有技术的产品。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (8)

1.一种新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光AFP中的应用，包括多元适体分子，其通式为：Mag-NH-C(S)-NH-R1-L1-[C(O)-NH-Ap1]n，n为正整数且不小于4，其中Mag-NH2为氨基磁珠，Ap1至少包括核酸单链序列或者核酸双链序列，L1选自长链基团，R1为不存在或者选自多元结构，所述多元适体分子的结构简式如下：
Figure FDA0003493380860000011
2.如权利要求1所述的新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光AFP中的应用，其特征在于，所述多元适体分子中R1的多元结构选自碳链或者杂链或者多元环结构。
3.如权利要求1所述的新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光AFP中的应用，其特征在于，所述氨基磁珠，其粒径为0.01-1000μm。
4.如权利要求1-3任一所述的新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光AFP中的应用，其特征在于，还包括与所述新型多元适体分子配合的抗体标记物和检测物质AFP，形成免疫复合物，其通式如下式所示：
Figure FDA0003493380860000012
其中，抗体标记物至少包括Ab1-X和Ab2-X，其中Ab1和Ab2为AFP的单克隆抗体或者多克隆抗体，X为标记物，m为正整数，且不小于1。
5.如权利要求4所述的新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光AFP中的应用，其特征在于，所述抗体标记物中标记物X选自碱性磷酸酶。
6.如权利要求4所述的新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光AFP中的应用，其特征在于，所述适体分子Ap1是针对检测物质AFP的特异性适体分子。
7.如权利要求6所述的新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光AFP中的应用，其特征在于，Ap1是一段单链DNA序列或一段双链DNA序列。
8.如权利要求4所述的新型多元适体分子在磁珠免疫化学发光AFP中的应用，其特征在于，所述免疫复合物的通式中n和m相等或不等。
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