CN114441677A - 一种同时检测三苯乙酸维兰特罗多种基因杂质的方法 - Google Patents

一种同时检测三苯乙酸维兰特罗多种基因杂质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测三苯乙酸维兰特罗中含有溴基己基的基因毒性杂质的方法，所述基因毒性杂质选自结构式I的VL02imp4、结构式II的VL02imp6和/或结构式III的VL02imp8。所述方法基于气相色谱‑火焰离子化检测器，色谱条件为：5％二苯基‑95％二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管色谱柱；初始温度35～45℃，以13～18℃/min升温至315～325℃，维持10～20min；载气为氮气，流速0.8～1.2ml/min，恒流模式，分流比8:1～12:1；进样温度250℃；进样量1μl；检测温度：315～325℃，氮气流速25ml/min，氢气流速40ml/min，空气流速400ml/min。

Description

一种同时检测三苯乙酸维兰特罗多种基因杂质的方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种同时检测三苯乙酸维兰特罗多种基因杂质的方法。
背景技术
三苯乙酸维兰特罗(Vilanterol trifenatate)，CAS#503070-58-4，结构式如1所示。
Figure BDA0003487463090000011
三苯乙酸维兰特罗是一种新型长效β2受体激动剂。与其它β2受体激动剂相比，该化合物具有起效更快，持续作用时间更长，选择性更高，在哮喘和COPD患者中的安全性和耐受性更好的优势。维兰特罗可与吸入糖皮质激素、抗胆碱能药物组成复方或三方制剂，用于哮喘或慢性阻塞性肺病(COPD)的维持治疗。已上市产品有乌美溴铵维兰特罗吸入粉雾剂(商品名：欧乐欣)、糠酸氟替卡松维兰特罗吸入粉雾剂(商品名：万瑞舒)、氟替美维吸入粉雾剂(商品名：全再乐)。
三苯乙酸维兰特罗原料药的生产过程中可能会生成包含溴基己基的VL02imp4(结构式如I所示)、VL02imp6(结构式如II所示)、VL02imp8(结构式如III所示)这三种具有基因毒性的杂质。
Figure BDA0003487463090000012
形成这三种杂质的反应步骤离终产物较远，虽然含量很低但仍有残留的可能，因此需在三苯乙酸维兰特罗原料药中进行检测和控制。正是由于其含量限度较低，对检测方法灵敏度要求高，实现定量检测较为困难。而且三种杂质极性较为接近，分离难度大。目前尚未有文献报道对这三种潜在基因毒性杂质同时进行定性定量检测的方法。
因此开发一种分离度好、专属性强、灵敏度高、有良好的线性关系等优点的同时检测三苯乙酸维兰特罗中多种基因毒性杂质的方法，实现对三苯乙酸维兰特罗杂质的有效控制，进一步保证三苯乙酸维兰特罗的产品质量和患者的用药安全，具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种同时检测三苯乙酸维兰特罗中多种含有溴基己基的基因毒性杂质的方法，从而能够对三苯乙酸维兰特罗中基因毒性杂质的有效控制，减少患者用药副反应的发生，保证用药安全性。
为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种检测三苯乙酸维兰特罗中含有溴基己基的基因毒性杂质的方法，所述基因毒性杂质选自结构式I的VL02imp4、结构式II的VL02imp6和结构式III的VL02imp8中的一种或多种，
Figure BDA0003487463090000021
所述方法基于气相色谱-火焰离子化检测器，包括色谱条件的建立：
色谱柱：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管色谱柱；
程序升温：初始温度为35～45℃，以13～18℃/min升温至315～325℃，维持10～20min；
载气：氮气；
载气流速：0.8～1.2ml/min；
控制模式：恒流模式；
分流比：8:1～12:1；
检测器：火焰离子化检测器(FID)；
检测温度：315～325℃。
优选地，所述基因毒性杂质选自结构式I、结构式II和结构式III的化合物的全部。
优选地，所述色谱柱为岛津GL Sciences Wonda CAP 5，规格0.25mm×30m，0.25μm。
优选地，所述程序升温模式为：初始温度40℃，以15℃/min升温至320℃，维持15min。
优选地，所述载气流速为1.0ml/min。
优选地，所述分流比为10:1。
优选地，色谱条件还包括：
进样温度：250℃；
进样量：1μl；
检测器氮气流速：25ml/min，氢气流速：40ml/min，空气流速：400ml/min。
优选地，所述方法还包括对照品溶液的制备，具体操作为：
称取VL02imp6对照品15mg于50ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml于20ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
优选地，所述方法还包括供试品溶液的制备，具体操作为：
称取待测样品300mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
优选地，所述方法还包括测定，具体操作为：
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪，记录色谱图。
作为一个优选的实施方案，本发明提供一种检测三苯乙酸维兰特罗中含有溴基己基的基因毒性杂质的方法，所述基因毒性杂质选自结构式I的VL02imp4、结构式II的VL02imp6和结构式III的VL02imp8中的一种或多种，
Figure BDA0003487463090000031
所述方法基于气相色谱-火焰离子化检测器，包括：
色谱条件的建立：
色谱柱：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管色谱柱，规格0.25mm×30m，0.25μm；
程序升温：初始温度为35～45℃，以13～18℃/min升温至315～325℃，维持10～20min；优选地，初始温度40℃，以15℃/min升温至320℃，维持15min；
载气：氮气；
载气流速：0.8～1.2ml/min；优选1.0ml/min；
控制模式：恒流模式；
分流比：8:1～12:1；优选10:1；
进样温度：250℃；
进样量：1μl；
检测器：火焰离子化检测器(FID)；
检测温度：315～325℃；
氮气流速：25ml/min；
氢气流速：40ml/min；
空气流速：400ml/min；
对照品溶液的制备：称取VL02imp6对照品15mg于50ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml于20ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备：称取待测样品300mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
测定：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪，记录色谱图；
定性检测：将供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图进行比较，以供试品溶液的色谱图中VL02imp6的色谱峰为基准，如果供试品溶液的色谱图出现相对保留时间为1.00的色谱峰，则供试品中存在VL02imp6；供试品溶液的色谱图中如果出现相对保留时间1.27±0.03的色谱峰，则供试品中存在VL02imp4；供试品溶液的色谱图中如果出现相对保留时间1.56±0.03的色谱峰，则供试品中存在VL02imp8；
定量检测：采用外标法计算供试品溶液中VL02imp6的含量；利用公式1计算供试品溶液中VL02imp4或VL02imp8的含量：
Figure BDA0003487463090000041
其中，
ASPL：供试品溶液中VL02imp4或VL02imp8的峰面积；
WSPL：供试品溶液中三苯乙酸维兰特罗的量，mg；
VSPL：供试品溶液的总体积，ml；
RF：对照品溶液中VL02imp6以峰面积计算的响应因子的平均值；
RRF：VL02imp4或VL02imp8相对VL02imp6的相对响应因子，其中VL02imp4的RRF＝0.70，VL02imp8的RRF＝1.40。
上述优选的实施方案中，优选同时检测三苯乙酸维兰特罗中三种基因毒性杂质VL02imp4、VL02imp6和VL02imp8。
本发明检测方法杂质VL02 imp4在浓度8.3633～55.7550μg/ml(相当于供试品主成分的0.03％～0.2％)范围内线性关系良好；线性方程为y＝0.6591x+0.1637，R＝0.9997；9份加标回收率RSD为0.7％，小于10.0％，精密度良好；定量限浓度为8.3633μg/ml(约相当于供试品主成分的0.028％)，6针的S/N均大于10，所测6份溶液中杂质峰面积的RSD为4.3％，小于10.0％；检测限浓度为4.1817μg/ml(约相当于供试品主成分的0.014％)；在30％、100％和200％浓度9份供试品的回收率均在80％～120％之间；同一水平回收率的RSD分别为0.5％、0.2％和0.5％，9份回收率的RSD为0.7％，均小于10.0％，方法准确度良好。
本发明检测方法杂质VL02 imp6在浓度8.5180～56.7864μg/ml(相当于供试品主成分的0.03％～0.2％)范围内线性关系良好；线性方程为y＝0.464x+0.3287，R＝0.9998；9份加标回收率RSD为0.9％，小于10.0％，精密度良好；定量限浓度为8.5180μg/ml(约相当于供试品主成分的0.028％)，6针的S/N均大于10，所测6份溶液中杂质峰面积的RSD为2.4％，小于10.0％；检测限浓度为4.2590μg/ml(约相当于供试品主成分的0.014％)；在30％、100％和200％浓度9份供试品的回收率均在80％～120％之间；同一水平回收率的RSD分别为0.8％、0.4％和0.3％，9份回收率的RSD为0.9％，均小于10.0％，方法准确度良好。
本发明检测方法杂质VL02 imp8在浓度8.4636～56.4242μg/ml(相当于供试品主成分的0.03％～0.2％)范围内线性关系良好；线性方程为y＝0.3322x+0.0314，R＝0.9996；9份加标回收率RSD为4.9％，小于10.0％，精密度良好；定量限浓度为8.4636μg/ml(约相当于供试品主成分的0.028％)，6针的S/N均大于10，所测6份溶液中杂质峰面积的RSD为2.4％，小于10.0％；检测限浓度为4.2318μg/ml(约相当于供试品主成分的0.014％)；在30％、100％和200％浓度9份供试品的回收率均在80％～120％之间；同一水平回收率的RSD分别为2.8％、0.9％和1.2％，9份回收率的RSD为4.9％，均小于10.0％，方法准确度良好。
本发明的有益效果如下：
本发明采用气相色谱的分析方法，建立了可以同时检测三苯乙酸维兰特罗中三种基因毒性杂质(VL02imp4、VL02imp6和VL02imp8)的检测方法。采用本检测方法，三种基因毒性杂质及相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，分离度好；空白在三种基因毒性杂质保留时间处没有干扰，专属性强，灵敏度溶液S/N均大于10，灵敏度高；线性相关系数均不小于0.995，有良好的线性关系，可实现对三苯乙酸维兰特罗中杂质的有效控制，进一步保证了三苯乙酸维兰特罗的产品质量和患者的用药安全。
附图说明
下面结合附图，对本发明做进一步说明。
图1为研究例1中色谱条件1测定得到的供试品溶液I的色谱图。图中，1：VL02imp4色谱峰，2：VL02imp6色谱峰，3：VL02imp8色谱峰，4：三苯乙酸色谱峰。
图2为研究例1中色谱条件1的色谱柱更换为DB-WAX(规格为0.32mm×30m，0.5μm)得到的供试品溶液II与VL02imp8定位溶液的叠加色谱图。其中，A：VL02imp8定位溶液的色谱图，B：供试品溶液II的色谱图。图中，1：VL02imp8色谱峰，2：三苯乙酸色谱峰。
图3为研究例1中色谱条件2测定得到的供试品溶液III的色谱图。图中，1：VL02imp4色谱峰，2：VL02imp6色谱峰，3：VL02imp8色谱峰，4：三苯乙酸色谱峰。
图4为实施例1中空白溶液的色谱图.
图5为实施例1中系统适用性溶液的色谱图。图中：1：VL02imp4色谱峰，2：VL02imp6色谱峰，3：VL02imp8色谱峰，4：三苯乙酸色谱峰，5：维兰特罗色谱峰。
图6为实施例1中供试品溶液的色谱图。
图7为实施例1中VL02imp4定位溶液的色谱图。
图8为实施例1中VL02 imp6定位溶液的色谱图。
图9为实施例1中VL02 imp8定位溶液的色谱图。
图10示出的是实施例1中VL02imp4的线性回归曲线。
图11示出的是实施例1中VL02imp6的线性回归曲线。
图12示出的是实施例1中VL02imp8的线性回归曲线。
图13示出的是实施例1中耐用性实验记录的色谱图，其中：
A是不同起始柱温下得到的色谱图，其中，A-1柱温45℃，A-2柱温35℃；
B是不同检测器温度下得到的色谱图，其中，B-1检测器温度325℃，B-2检测器温度315℃；
C是不同进样口温度得到的色谱图，其中，C-1进样口温度255℃，C-2进样口温度245℃；
D是不同升温速率下得到的色谱图，其中，D-1升温速率16℃/min，D-2升温速率14℃/min；
E是不同柱流量下得到的色谱图,其中，E-1柱流量1.1ml/min，E-2柱流量0.9ml/min。
图中，1：VL02imp4色谱峰，2：VL02imp6色谱峰，3：VL02imp8色谱峰。
图14为实施例2中VL1709901批次供试品溶液的色谱图。
图15为实施例2中VL1709902批次供试品溶液的色谱图。
图16为实施例2中VL1709903批次供试品溶液的色谱图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。此外应理解，在阅读本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
研究例1 本发明检测方法的色谱条件的建立
为了检测三苯乙酸维兰特罗中三种基因毒性杂质(VL02imp4、VL02imp6和VL02imp8)的含量，根据杂质VL02imp4、VL02imp6和VL02imp8的结构，初步选取适用于分析卤素化合物的5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管色谱柱，该色谱柱的最高使用温度为iso.325-prog.350℃，而三苯乙酸维兰特罗的沸点较高(646.7±55.0℃)，为了防止其残留于色谱柱中影响样品检测，同时兼顾色谱柱的使用寿命，将色谱柱升温程序中最高温度和检测器温度均定为320℃(即色谱柱最高耐受温度下限)。其他参数初步设定为：起始柱温为40℃，以15℃/min升至320℃，维持5min；载气为氮气，氮气流速为25ml/min；氢气流速为40ml/min；空气流速为400ml/min；柱流速为2ml/min；进样量为1μl；进样口温度为250℃。将上述色谱条件命名为色谱条件1。
供试品溶液I的制备：称取维兰特罗三苯乙酸盐原料药305.52mg，置10ml量瓶中，分别加入VL02imp4、VL02imp6、VL02imp8定位溶液60μl，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。(定位溶液配制：称取5.24mg VL02imp4，精密加入1ml甲醇溶解，即得VL02imp4定位溶液。同法配制VL02imp6、VL02imp8定位溶液，称样量分别为5.54mg、5.78mg。)
以所述色谱条件1测定供试品溶液I，记录色谱图，见图1。图1示出，VL02imp8与三苯乙酸色谱峰无法基线分离。
在色谱条件1基础上，进行了色谱柱的筛选研究。更换改善低沸点分析物的分离度效果较好的以聚乙二醇(PEG)为固定液的毛细管色谱柱(DB-WAX，规格为0.32mm×30m，0.5μm)，其余色谱条件同色谱条件1，测定VL02imp8定位溶液和供试品溶液II，记录色谱图，见图2。
供试品溶液II的制备：称取维兰特罗三苯乙酸盐原料药304.91mg，置10ml量瓶中，分别加入VL02imp4、VL02imp6、VL02imp8定位溶液60μl，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。(定位溶液配制：称取5.24mg VL02imp4，精密加入1ml甲醇溶解，即得VL02imp4定位溶液。同法配制VL02imp6、VL02imp8定位溶液，称样量分别为5.54mg、5.78mg。)
图2示出，供试品溶液II中的三种杂质都没有出峰。所以该聚乙二醇(PEG)为固定液的毛细管色谱柱(DB-WAX，规格为0.32mm×30m，0.5μm)不适用于对本发明所述三种杂质的检测。
在此基础上对色谱条件1中的参数进行如下优化：将柱流速由2.0ml/min改为1.0ml/min；升温程序改为：初始温度40℃，以15℃/min升温至320℃，维持15min；其余色谱条件与色谱条件1保持一致。该色谱条件命名为色谱条件2。
供试品溶液III：分别称取14.75mg VL02imp4、14.34mg VL02imp6、14.35mgVL02imp8，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1ml至装有维兰特罗三苯乙酸盐对照品302.40mg的10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
在所述色谱条件2测定供试品溶液III，记录色谱图，见图3。图3示出，供试品溶液III中杂质VL02imp4、VL02imp6、VL02imp8及三苯乙酸色谱峰之间的分离度均大于1.5。
通过上述研究，初步建立了本发明优选的色谱条件，即：
色谱柱：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管色谱柱，规格0.25mm×30m，0.25μm；
程序升温：初始温度40℃，以15℃/min升温至320℃，维持15min；
载气：氮气；
载气流速：1.0ml/min；
控制模式：恒流模式；
分流比：8:1～12:1；优选10:1；
进样温度：250℃；
进样量：1μl；
检测器：火焰离子化检测器(FID)；
检测温度：315～325℃；
氮气流速：25ml/min；
氢气流速：40ml/min；
空气流速：400ml/min。
实施例1 本发明建立的检测方法的方法学验证
1.1专属性和系统适应性
溶液的配制：
(1)空白溶液：取甲醇(色谱纯)，即得。
(2)供试品溶液：称取三苯乙酸维兰特罗(批号：VL1709903,来源：丽珠合成制药有限公司)30mg，精密称定，置进样小瓶中，加1ml甲醇溶解，摇匀，即得。
(3)混合对照品储备液：取VL02imp4、VL02imp6和VL02imp8对照品各15mg，精密称定，置同一个50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得。各杂质对照品的称样量见表1。
表1 三种杂质对照品的称样量
杂质对照品 VL02imp4 VL02imp6 VL02imp8
称样量(mg) 14.75 14.34 14.35
(4)定位溶液：称取VL02 imp4对照品6mg置20ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为VL02imp4储备液。移取VL02imp4储备液2ml置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得VL02imp4定位溶液。同法配制VL02imp6、VL02imp8定位溶液。
(5)系统适用性溶液：称取三苯乙酸维兰特罗约300mg置10ml量瓶中，移取上述混合对照品储备溶液1.0ml置同一量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。
测定：分别取空白溶液、各定位溶液、系统适用性溶液、供试品溶液各1μl进样测定，记录色谱图，其中空白溶液的色谱图见图4，系统适用性溶液的色谱图见图5，供试品溶液的色谱图见图6，VL02imp4定位溶液的色谱图见图7，VL02imp6定位溶液的色谱图见图8，VL02imp8定位溶液的色谱图见图9。由于气相色谱系统中残留的三苯乙酸维兰特罗，导致三种杂质定位溶液的色谱图中都出现了三苯乙酸和维兰特罗的色谱峰，但是其不影响三种杂质的定位。
结果：空白溶液在各已知杂质保留时间处没有干扰。各杂质及相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，符合规定，本法的系统适用性和专属性良好。
2.1定量限和检测限
溶液的配制：
(1)定量限(LQQ)溶液：精密量实施例1中混合对照品储备溶液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取3ml，置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
(2)检测限溶液：准确移取定量限(LOQ)溶液5.0ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：分别精密吸取定量限溶液、检测限溶液各1μl进样测定，重复测定6次，结果见表2～5。
表2 VL02imp6定量限(LOQ)测定结果
Figure BDA0003487463090000101
表3 VL02imp4定量限(LOQ)测定结果
Figure BDA0003487463090000102
表4 VL02imp8定量限(LOQ)测定结果
Figure BDA0003487463090000111
表5 检测限(LOQ)测定结果
名称 浓度(μg/ml) S/N
VL02 imp6 4.2590 25.9
VL02imp4 4.1817 34.3
VL02imp8 4.2318 16.1
2.3线性考察
系列混合对照品溶液的配制：
(1)L-0.2％：精密量取实施例1中混合对照品储备溶液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
(2)L-0.1％：精密量取实施例1中混合对照品储备溶液2ml，置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
(3)L-0.08％：精密量取实施例1中混合对照品储备溶液4ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
(4)L-0.06％：精密量取实施例1中混合对照品储备溶液3ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
(5)L-0.03％：精密量取L-0.2％溶液3ml，置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：分别吸取L-0.03％、L-0.06％、L-0.08％、L-0.1％、L-0.2％溶液各1μl进样测定，以浓度为X轴，峰面积为Y轴，做线性回归曲线。
结果：测定结果见表6～8，线性回归曲线图10～12。
表6 VL02 imp6线性测定结果
Figure BDA0003487463090000112
表7 VL02 imp4线性测定结果
Figure BDA0003487463090000121
表8 VL02 imp8线性测定结果
Figure BDA0003487463090000122
2.4准确度和精密度
溶液配制：
(1)混合对照品溶液：移取实施例1中混合对照品储备溶液2ml置20ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得，平行配制2份。
(2)回收率R-200％溶液：称取三苯乙酸维兰特罗对照品30mg，精密称定，置进样小瓶中，精密量取1ml实施例3中L-200％溶液，使溶解，摇匀，即得，平行配制3份。
(3)回收率R-100％溶液：称取三苯乙酸维兰特罗对照品30mg，精密称定，置进样小瓶中，精密量取1ml实施例3中L-100％溶液，使溶解，摇匀，即得，平行配制3份。
(4)回收率R-30％溶液：称取三苯乙酸维兰特罗盐对照品30mg，精密称定，置进样小瓶中，精密量取1ml实施例3中L-30％溶液，使溶解，摇匀，即得，平行配制3份。
(5)供试品溶液：称取三苯乙酸维兰特罗对照品30mg，精密称定，置进样小瓶中，精密量取1ml甲醇使溶解，摇匀，即得，平行配制2份。
测定：分别取混合对照品溶液、各回收率溶液和供试品溶液各1μl进样，记录各色谱峰峰面积，分别按外标法以峰面积计算含量，以供试品溶液中杂质含量为“本底”，计算回收率，结果见表9～11。
表9 VL02imp6准确度和回收率测定结果
Figure BDA0003487463090000131
表10 杂质VL02 imp4准确度和回收率测定结果
Figure BDA0003487463090000132
表11 杂质VL02 imp8准确度测定结果
Figure BDA0003487463090000133
结果表明：杂质VL02imp4、VL02imp6和VL02imp8在30％限度浓度、100％限度浓度、200％限度浓度时，回收率均在80.0％～120.0％之间，方法准确度良好；同一水平3份回收率及三个浓度水平9份回收率RSD均不大于10.0％，符合要求，方法精密度良好。
2.5耐用性
溶液配制：取2.4(3)项下第一份回收率R-100％溶液。
测定：在不同起始柱温±5℃(35℃、45℃)；不同进样口温度±5℃(245℃、255℃)；不同检测器温度±5℃(315℃、325℃)；不同柱流速±0.1ml/min(0.9ml/min、1.1ml/min)；不同升温速率：±1℃/min(14℃/min、16℃/min)条件下，分别取回收率R-100％溶液1μl进样测定，记录色谱图，见图13。
结果：图13示出，在上述色谱条件下，各杂质与相邻峰的分离度均大于1.5，方法耐用性良好，小范围内改变流速、初始柱温及检测器温度等色谱条件不会影响基因毒性杂质VL02imp4、VL02imp6和VL02imp8的检出。
实施例2 不同批次三苯乙酸维兰特罗中基因毒性杂质的测定
色谱条件：
供试品溶液的配制：称取三苯乙酸维兰特罗30mg，精密称定(具体称样量见表12)，置进样小瓶中，加1ml甲醇溶解，摇匀，即得。
表12 三苯乙酸维兰特罗称样量记录
批号 VL1709901 VL1709902 VL1709903
称样量(mg) 29.91 31.41 31.87
对照品溶液的配制：称取VL02imp6对照品14.34mg于50ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml于20ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪，记录色谱图，见图14～16。
测定结果：采用外标法计算供试品溶液中VL02imp6的含量；利用公式1计算供试品溶液中VL02imp6或VL02imp8的含量：
Figure BDA0003487463090000141
其中，
ASPL：供试品溶液中VL02imp4或VL02imp8的峰面积；
WSPL：供试品溶液中三苯乙酸维兰特罗的量，mg；
VSPL：供试品溶液的稀释体积，ml；
RF：对照品溶液中VL02imp6峰面积的响应因子的平均值；
RRF：VL02imp4和VL02imp8相对VL02imp6的校正因子，其中VL02imp4的RRF＝0.70，VL02imp8的RRF＝1.40。
测定结果见表13。
表13 三批三苯乙酸维兰特罗中基因毒性杂质的测定结果
有关物质Ⅲ VL1709901 VL1709902 VL1709903
VL02imp4 未检出 未检出 未检出
VL02imp6 未检出 未检出 未检出
VL02imp8 未检出 未检出 未检出
总之，本发明提供了一种同时测定三苯乙酸维兰特罗中可能存在的多种基因毒性杂质(选自VL02imp4、VL02imp6和VL02imp8中的一种或多种)的方法。该方法的分离度好、专属性强、灵敏度高，从而可以进一步检测三苯乙酸维兰特罗的产品质量，更好地保证患者的用药安全。

Claims (10)

1.一种检测三苯乙酸维兰特罗中含有溴基己基的基因毒性杂质的方法，所述基因毒性杂质选自结构式I的VL02imp4、结构式II的VL02imp6和结构式III的VL02imp8中的一种或多种，
Figure FDA0003487463080000011
所述方法基于气相色谱-火焰离子化检测器，包括色谱条件的建立：
色谱柱：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管色谱柱；
程序升温：初始温度为35～45℃，以13～18℃/min升温至315～325℃，维持10～20min；
载气：氮气；
载气流速：0.8～1.2ml/min；
控制模式：恒流模式；
分流比：8:1～12:1；
检测器：火焰离子化检测器；
检测温度：315～325℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因毒性杂质选自结构式I、结构式II和结构式III的化合物的全部。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为岛津GL Sciences WondaCAP 5，规格0.25mm×30m，0.25μm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述程序升温模式为：初始温度40℃，以15℃/min升温至320℃，维持15min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载气流速为1.0ml/min；
优选地，所述分流比为10:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：
进样温度：250℃；
进样量：1μl；
检测器氮气流速：25ml/min，氢气流速：40ml/min，空气流速：400ml/min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
(1)对照品溶液的制备，具体操作为：
称取VL02imp6对照品15mg于50ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml于20ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
(2)供试品溶液的制备，具体操作为：
称取待测样品300mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括测定，具体操作为：
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪，记录色谱图。
9.一种检测三苯乙酸维兰特罗中含有溴基己基的基因毒性杂质的方法，所述基因毒性杂质选自结构式I的VL02imp4、结构式II的VL02imp6和结构式III的VL02imp8中的一种或多种，
Figure FDA0003487463080000021
所述方法基于气相色谱-火焰离子化检测器，包括：
色谱条件的建立：
色谱柱：以5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管色谱柱，规格0.25mm×30m，0.25μm；
程序升温：初始温度为35～45℃，以13～18℃/min升温至315～325℃，维持10～20min；优选地，初始温度40℃，以15℃/min升温至320℃，维持15min；
载气：氮气；
载气流速：0.8～1.2ml/min；优选1.0ml/min；
控制模式：恒流模式；
分流比：8:1～12:1；优选10:1；
进样温度：250℃；
进样量：1μl；
检测器：火焰离子化检测器；
检测温度：315～325℃；
氮气流速：25ml/min；
氢气流速：40ml/min；
空气流速：400ml/min；
对照品溶液的制备：称取VL02imp6对照品15mg于50ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml于20ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液的制备：称取待测样品300mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
测定：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪，记录色谱图；
定性检测：将供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图进行比较，以供试品溶液的色谱图中VL02imp6的色谱峰为基准，如果供试品溶液的色谱图出现相对保留时间为1.00的色谱峰，则供试品中存在VL02imp6；供试品溶液的色谱图中如果出现相对保留时间1.27±0.03的色谱峰，则供试品中存在VL02imp4；供试品溶液的色谱图中如果出现相对保留时间1.56±0.03的色谱峰，则供试品中存在VL02imp8；
定量检测：采用外标法计算供试品溶液中VL02imp6的含量；利用公式1计算供试品溶液中VL02imp4或VL02imp8的含量：
Figure FDA0003487463080000031
其中，
ASPL：供试品溶液中VL02imp4或VL02imp8的峰面积；
WSPL：供试品溶液中三苯乙酸维兰特罗的量，mg；
VSPL：供试品溶液的总体积，ml；
RF：对照品溶液中VL02imp6以峰面积计算的响应因子的平均值；
RRF：VL02imp4或VL02imp8相对VL02imp6的相对响应因子，其中VL02imp4的RRF＝0.70，VL02imp8的RRF＝1.40。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法同时检测三苯乙酸维兰特罗中三种基因毒性杂质VL02imp4、VL02imp6和VL02imp8。
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