CN114441483A - 检测装置、芯片的制造方法及蛋白质类标志物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及芯片领域,提供一种检测装置、芯片的制造方法及蛋白质类标志物的检测方法用于检测蛋白质类标志物,包括芯片、第一盖板及第二盖板,芯片包括玻璃基体和设置在玻璃基体上的微孔阵列层,微孔阵列层与玻璃基体层叠设置,微孔阵列层包括多个微孔,第一盖板和第二盖板贴合并围成腔体,芯片设置在所腔体中,第一盖板上设置有进液孔和出液孔,进液孔和出液孔设置为通过进液孔进入的液体可以进入腔体,并流经微孔阵列层中的微孔,最终从出液孔排出。应用本申请,采用一具有微孔阵列层的芯片,可以对检测磁珠微粒进行单一分离,实现对蛋白质类标志物的更高精度的检测。
Description
技术领域
本发明涉及芯片技术领域,具体地,涉及一种检测装置、芯片的制造方法及蛋白质类标志物的检测方法。
背景技术
在当前的IVD(in vitro diagnostic products,体外诊断产品,指医疗器械、体外诊断试剂以及药品)领域,用于蛋白质类标志物的检测主要是ELISA(enzyme linkedimmune sorbent assay,酶联免疫吸附测定)法、荧光法和化学发光法。其中,化学发光技术是当前免疫诊断中灵敏度、精密度和准确度都较为领先的检测技术。但由于化学发光技术不可能实现单分子蛋白检测,在设备自动化技术已经发展到瓶颈的今天,现有的化学发光技术检测灵敏度已经接近于其理论上的检测极限水平。
因此,亟需一种用于蛋白质类标志物检测的检测装置和/或检测方法,以实现对蛋白质类标志物的更高精度的检测。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一,提出了一种检测装置、芯片的制造方法及蛋白质类标志物的检测方法,该检测装置采用一具有微孔阵列层的芯片,可以对检测磁珠微粒进行单一分离,实现对蛋白质类标志物的更高精度的检测。
为实现本申请的目的,第一方面提供一种检测装置,所述检测装置用于检测蛋白质类标志物,包括芯片、第一盖板及第二盖板,所述芯片包括玻璃基体和设置在所述玻璃基体上的微孔阵列层,所述微孔阵列层与所述玻璃基体层叠设置,所述微孔阵列层包括多个微孔,所述第一盖板和所述第二盖板贴合并围成腔体,所述芯片设置在所腔体中,所述第一盖板上设置有进液孔和出液孔,所述进液孔和所述出液孔设置为通过所述进液孔进入的液体可以进入所述腔体,并流经所述微孔阵列层中的微孔,最终从所述出液孔排出。
可选地,所述第二盖板上形成有所述腔体,所述第二盖板还包括环绕所述腔体设置的连接区,所述连接区与所述第一盖板贴合。
可选地,所述连接区和所述第一盖板之间均设置有粘结剂;或者
所述连接区和所述第一盖板贴合表面通过离子键键合。
可选地,所述微孔阵列层包括光刻胶层和钝化层,所述光刻胶层设置在所述玻璃基体上,并与所述玻璃基体层叠设置,所述光刻胶层上形成有初始微孔,所述钝化层覆盖所述光刻胶层,并覆盖所述初始微孔的底壁和侧壁,形成所述微孔。
可选地,所述检测装置还包括磁场组件,所述磁场组件设置在所述芯片的外周,用于至少在所述微孔阵列层形成磁场,所述磁场的方向沿所述微孔的延伸方向,并对落入所述微孔中的磁性体具有朝向所述微孔的底壁的作用力。
可选地,所述微孔阵列层的尺寸占所述玻璃基体同方向的尺寸的三分之一至二分之一。
可选地,所述微孔的直径在4μm至5μm之间,所述微孔的深度在3μm至5μm之间。
为实现本申请的目的,第二方面提供一种芯片的制造方法,所述芯片用于检测蛋白质类标志物的检测装置,所述制造方法包括:
提供玻璃基体;
在所述玻璃基体上形成微孔阵列层,所述微孔阵列层具有呈阵列排布的多个微孔。
可选地,所述在玻璃基体上形成微孔阵列层的步骤包括:
在所述基体层上涂覆一层光刻胶层;
对所述光刻胶层进行曝光显影,以在所述光刻胶层上形成阵列排布的初始微孔;
在曝光显影后的光刻胶层上形成所述钝化层,且所述钝化层覆盖所述初始微孔的底壁和侧壁,以形成阵列排布的所述微孔。
为实现本申请的目的,第三方面提供一种免疫检测方法,应用于含有蛋白质类标志物的待检测溶液,所述方法包括:
将偶联有所述蛋白质类标志物的抗体的磁珠微粒依次与所述待检测溶液和具有标记抗体的溶液进行反应,以得到具有标记物的所述磁珠微粒;
应用第二方面提供的芯片的制造方法制造芯片,并基于该芯片和第一盖板及第二盖板制作第一方面提供的检测装置;
将所有所述磁珠微粒从所述进液孔上样到所述检测装置上,使至少部分所述磁珠微粒落入到所述微孔中,通过检测所述微孔中所述磁珠微粒的总量和含有标记物的所述磁珠微粒的分总量,来确定所述待检测溶液中蛋白质类标志物的含量。
可选地,所述至少部分磁珠微粒落入到每个所述微孔中之后,还包括:
采用油相冲洗的方法去除未落入所述微孔中的所述磁珠微粒。
可选地,所述采用油相冲洗的方法去除未落入所述微孔中的所述磁珠微粒,包括:
采用40μL-60μL的电子氟化液在2μL/s-4μL/s的流速下对所述检测装置进行冲洗,以去除未落入所述微孔中的所述磁珠微粒。
附图说明
图1为本申请实施例提供的检测装置的芯片的结构示意图;
图2为本申请实施例提供的芯片的制作流程示意图;
图3为本申请实施例提供的染色后清洗不同次数下的荧光显微镜图像;
图4为本申请实施例提供的采用不同体积和流速的电子氟化液冲洗后的荧光显微镜图像;
图5为本申请实施例提供的采用不同浓度的待检测溶液所得的检测结果的荧光显微镜图像。
具体实施方式
下面详细描述本申请,本申请的实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的部件或具有相同或类似功能的部件。此外,如果已知技术的详细描述对于示出的本申请的特征是不必要的,则将其省略。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,仅用于解释本申请,而不能解释为对本申请的限制。
本技术领域技术人员可以理解,除非另外定义,这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语),具有与本申请所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是,诸如通用字典中定义的那些术语,应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义,并且除非像这里一样被特定定义,否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。
本技术领域技术人员可以理解,除非特意声明,这里使用的单数形式“一”、“一个”和“该”也可包括复数形式。应该理解,当我们称元件被“连接”或“耦接”到另一元件时,它可以直接连接或耦接到其他元件,或者也可以存在中间元件。此外,这里使用的“连接”或“耦接”可以包括无线连接或无线耦接。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的全部或任一单元和全部组合。
下面结合附图以具体的实施例对本申请的技术方案以及本申请的技术方案如何解决上述技术问题进行详细说明。
本实施例对使用磁珠微粒作为固相载体的蛋白质类标志物的检测技术进行了研究分析,发现:使用磁珠微粒作为固相载体的检测技术中,磁珠微粒虽然比二维平面具有更大的表面积,可以使其在检测过程中充分反应,但是磁珠微粒所在的缓冲液的PH值和其中的各种离子浓度会对带有电性的磁珠微粒产生影响(出现团聚现象等),因此,如果能将磁珠微粒单一、均匀分布,可以解决此问题,获得更加精确的信号,继而实现对蛋白质类标志物的更高精度的检测。例如,可以采用加热PDMS(聚二甲基硅氧烷)的方式使标记有抗体的磁珠微粒固定在PMDS阳模中,但是,此种方法需要对模具进行加热,极易造成蛋白变性,继而导致抗原抗体失活,致使检测精度大幅度下降;且使用PDMS作为微阵列材料,容易老化变性,使用寿命较低,成本较高等。
鉴于上述问题,本实施例提供一种检测装置,可用于检测蛋白质类标志物,如图1和图2所示,该检测装置包括芯片10、第一盖板及第二盖板,芯片10包括玻璃基体11和设置在玻璃基体11上的微孔阵列层12,玻璃基体11和微孔阵列层12可层叠设置,微孔阵列层12可包括多个微孔121。第一盖板和第二盖板贴合并围成腔体,芯片10设置在所腔体中,第一盖板上设置有进液孔和出液孔,进液孔和出液孔均位于第一盖板与芯片10贴合的区域,且与微孔阵列上的微孔121连通。进液孔和出液孔可被设置为通过进液孔进入的液体可以进入上述腔体,并流经微孔阵列层12中的微孔121,最终从出液孔排出。
本实施例提供的检测装置,包括具有微孔阵列层12和玻璃基体11的芯片10,还包括第一盖板和第二盖板,可以将芯片10组装到第一盖板和第二盖板贴合围成的腔体中,然后从第一盖板上的进液孔注入具有与待检测溶液进行反应的磁珠微粒的缓冲液,缓冲液在芯片10上流动,使磁珠微粒均匀落入微孔阵列的每个微孔121中,并可以通过设置磁珠微粒的尺寸与微孔121的尺寸匹配,使每个微孔121中能且仅能容纳一个磁珠微粒,则可以通过落入微孔121中的磁珠微粒的总量和发生反应的磁珠微粒的量,根据泊松比可精确计算出待检测溶液中蛋白质类标志物的含量,且采用玻璃基体11的芯片10,直接在其微孔阵列层12开设微孔121,无需进行加热,不会使蛋白质变性,可以保证蛋白质类标志物检测的精度,从而实现pg/mL(10-12)浓度级别的蛋白检测。再者,玻璃基的芯片10抗腐蚀能力强,不易老化变性,使用寿命较高,成本较低。
上述芯片10的微孔阵列层12可以包括光刻胶层14和钝化层13,光刻胶层14可设置在玻璃基体11上,并与玻璃基体11层叠设置,可在光刻胶层14上形成初始微孔141,钝化层13可覆盖光刻胶层14,并覆盖初始微孔141的底壁和侧壁,形成上述微孔121。其中,钝化层13为有机材料制作的亲水修饰层,其与蛋白之间的分子作用力较小,可以减少蛋白吸附,提高缓冲液及其中的磁珠微粒的流动性,可避免破坏反应后的磁珠微粒的结构,从而提高磁珠微粒的微孔填充率,提高采用该检测装置进行检测的精度。
具体地,形成微孔阵列层12的过程可以如下:1)在玻璃基体11上旋涂光刻胶层14(工艺参数例如:旋涂的速率为400rpm,时间为30s,可在110℃下烘烤150s,光刻胶层14的厚度可以为4微米);2)采用掩膜对光刻胶层14进行曝光显影(工艺参数例如:显影70s,曝光4500ms),以得到上述呈阵列排布的初始微孔141;3)采用PECVD(Plasma EnhancedChemical Vapor Deposition,等离子体增强化学的气相沉积)工艺蒸镀上述钝化层13。上述钝化层13的厚度可以大于等于且小于等于以实现钝化层13隔离缓冲液与玻璃基体11及光刻胶层14,减少蛋白吸附的作用。优选地,钝化层13的厚度可以为
需要说明的是,上述芯片10的结构只是本实施例的一种实施方式,本实施例并不以此为限,只要芯片10具有玻璃基体11和微孔阵列层12,并在微孔阵列层12上形成有呈阵列排布的微孔121即可。
上述第一盖板和第二盖板可以为透明的玻璃基板,以便于对磁珠微粒进行观察。具体将第一盖板、第二盖板及芯片10进行组装时,可以使第一盖板和第二盖板正对设置,也可以使第一盖板和第二盖板交错设置,只要能将芯片10封装在两个盖板之间即可,本实施例对此不作具体限定。需要说明的是,本实施例对盖板的具体材质不作限定,两者可以相同,也可以不同。优选地,可采用两种不同材质的第一盖板和第二盖板,针对位于芯片10的远离微孔121一侧的第二盖板,可不考虑缓冲液的流动性,采用容易与芯片10进行贴合固定的材质即可;而针对位于芯片10的靠近微孔121的一侧的第一盖板,需考虑缓冲液的流动性,即保证芯片10与第一盖板能够与芯片10进行贴合固定,又得保证缓冲液的流动性,所选材质不能阻碍缓冲液流动。
具体地,可以在第二盖板上形成有腔体,第二盖板还可以包括环绕腔体设置的连接区,连接区可用于与第一盖板贴合,如此,可将芯片10限定在侧面封闭的腔体内,以防在检测过程中芯片10的位置发生移动,继而导致检测结果的准确性降低等。
如图2所示,芯片10可以包括阵列区102和贴合区101,贴合区101环绕阵列区102设置,并与第一盖板贴合并连接,微孔阵列层12形成在阵列区102,如此,在阵列区102周围环绕设置贴合区101,以便于芯片10与第一盖板和第二盖板连接,可以保证对芯片10的压合作用,继而保证缓冲液可以均匀流过阵列区102,从而保证磁珠可以落入每个微孔121中。其中,阵列区102(微孔阵列层12)的尺寸可以占玻璃基体11同方向的尺寸的三分之一至二分之一,以保证有足够的贴合区101,使芯片10与两个盖板能够紧密贴合。例如,芯片10可以为10mm×10mm的玻璃片,其内部可含有4mm×4mm的阵列区102,阵列区102内可含有500×500个微孔121。
进一步地,可以在上述第二盖板的连接区和第一盖板之间设置有粘结剂,例如紫外胶,可以通过粘接剂将芯片10与两个盖板进行粘接贴合。或者,连接区和第一盖板贴合表面也可以通过等离子键合(通过高压放电电离空气产生等离子,通过气流吹出等离子,等离子体与被处理素材表面发生物理和化学变化使表面清洁、平整便于做进一步的加工处理)的方式进行贴合固定。其中,采用等离子键合的方式,芯片10的贴合区101(也可以是与盖板接触的整个表面)各个位置与盖板之间的作用力相当,可以使盖板与芯片10之间的结合更加均匀稳定。
需要说明的是,上述将芯片10封装在两个盖板之间的方式只是本实施例的两种可选的实施方式,本实施例并不以此为限,例如,也可以采用两个平板结构的盖板,可以使芯片10的上下两面分别与两个盖板贴合并粘接,可在芯片的贴合区101进行粘接,以免影响含有磁珠微粒的缓冲液的流动。
为了使缓冲液可以充分流经微孔阵列层12的每个微孔121,以使磁珠微粒可以落入每个微孔121,可以将进液孔和出液孔均设置于第一盖板与贴合区101贴合的位置,且使二者分别靠近芯片10的两个相对的顶角处,以使缓冲液从进液口进入上述腔体,从芯片10的一个角流经每个微孔121,多余的缓冲液对角处的出液口排出,从而保证几乎每个微孔121内均能落入磁珠微粒。
为了使微孔121内能且仅能落入一个磁珠微粒,可以设计磁珠微粒的尺寸与微孔121改的尺寸相匹配,使微孔121的直径的深度均大于磁珠微粒的直径,并小于磁珠微粒的直径的两倍。例如,考虑加工精度及便于观察性,微孔121的直径可大于等于4μm,且小于等于5μm,优选4.5μm;微孔121的深度可大于等于3μm,且小于等于5μm,优选4μm。则磁珠微粒的直径可以大于2.5μm,且小于3μm。
为了便于磁珠微粒进入微孔121内,该检测装置还可以包括磁场组件,磁场组件可以设置在芯片10的外周,用于至少在微孔阵列层12(阵列区102)形成磁场,磁场的方向沿微孔121的延伸方向,并对落入微孔121中的磁性体(如,磁珠微粒)具有朝向微孔121的底壁的作用力。
基于上述检测装置相同的构思,本实施例还提供一种芯片10的制造方法,用于制造上述芯片10,该芯片10可用于上述检测蛋白质类标志物的检测装置,可以包括以下步骤:
(1)提供一玻璃基体11,可以是以透明的玻璃基体11,以便于对磁珠微粒进行观察;
(2)在玻璃基体11上形成微孔阵列层12,微孔阵列层12具有呈阵列排布的多个微孔121,以用于在蛋白质类标志物检测过程中分离磁珠微粒。
如上,在玻璃基体11上形成微孔阵列层12的步骤可以包括:
(21)在基体层上涂覆一层光刻胶层14,光刻胶层14的厚度可用于形成阵列排布的微孔121;
(22)对光刻胶层14进行曝光显影,以在光刻胶层14上形成阵列排布的初始微孔141;
(23)在曝光显影后的光刻胶层14上形成钝化层13,且钝化层13覆盖初始微孔141的底壁和侧壁,形成阵列排布的微孔121。
本实施例提供的芯片10的制造方法,可制造出包括玻璃基体11和微孔阵列层12的芯片10,该芯片10可应用于上述检测装置,以便于分离磁珠微粒,提高检测精度等。
基于上述检测装置相同的构思,本实施例还提供一种蛋白质类标志物的检测方法,可应用于含有蛋白质类标志物的待检测溶液,该方法可以包括:
步骤S1,将偶联有蛋白质类标志物的抗体的磁珠微粒依次与待检测溶液和具有标记抗体的溶液进行反应,以得到具有标记物的磁珠微粒。
在检测过程中,将偶联有蛋白质类标志物的抗体的磁珠微粒加入待检测溶液中,使磁珠微粒偶联的抗体与待检测溶液中的蛋白类抗原结合,然后将所有磁珠微粒(包含有结合了抗原的磁珠微粒)进行清洗,之后再加入到具有标记抗体的溶液进行反应,使磁珠微粒结合的抗原与具有标记的抗体进行反应,从而得到具有标记物的磁珠微粒。
具体地,在使用磁珠微粒进行免疫反应之前,可以先对磁珠微粒进行染色,以得到荧光的磁珠微粒,以便于对磁珠微粒进行观察。染色后,可对染色的磁珠微粒进行清洗,使背景荧光降到最低,以避免染色液对后续检测造成影响。在使用之前可先将磁珠微粒置于保存液中保存,以保证其生物活性。进一步地,本实施例还对染色磁珠的清洗次数做了测试实验,以获得能够使背景荧光降到最低,且保证磁珠荧光效果的清洗次数,如图3所示,图中(A)、(B)、(C)分别是清洗三次、四次、五次后用荧光显微镜观察的图像,图中的亮点可表征荧光磁珠微粒。由图3可知,清洗五次后,可在保证磁珠荧光效果的前提下,能够使未落入孔中的磁珠微粒的背景荧光降到更低。
步骤S2,应用上述芯片10的制造方法制造芯片10,并基于该芯片10和第一盖板及第二盖板制作上述检测装置,具体可参考上述检测装置实施例和芯片10的制造方法实施例,在此不再赘述。
步骤S3,将所有磁珠微粒从进液孔上样到检测装置上,使至少部分磁珠微粒落入到微孔121中,通过检测微孔121中磁珠微粒的总量和含有标记物的磁珠微粒的分总量,来确定待检测溶液中蛋白质类标志物的含量。
上样过程可参照上述检测装置的使用过程,即从第一盖板的进液口注入含有磁珠微粒的缓冲液,并使多余的缓冲液和磁珠微粒从出液口排出,以使缓冲液流动过程中,磁珠微粒可落入每个微孔121中。
需要说明的是,本实施例对上述步骤S1和步骤S2的执行顺序不作具体限定,二者也可同时进行。
为了便于对磁珠微粒进行观察和数量检测,至少部分磁珠微粒落入到每个微孔121中之后,还可以包括:采用油相冲洗的方法去除未落入微孔121中的磁珠微粒,以避免未落入微孔121的磁珠微粒影响对落入微孔121的磁珠微粒的观察和检测(如,无法分辨磁珠微粒是否落入微孔121内)。
具体地,上述采用油相冲洗的方法去除未落入微孔121中的磁珠微粒,可以包括以下处理:采用40μL-60μL的电子氟化液在2μL/s-4μL/s的流速下对检测装置进行冲洗,以去除未落入微孔121中的磁珠微粒。本实施例在确定油相液的体积和流速之前对使用不同体积和流速的清洗效果做了对比试验,如图4所示,采用15μL含有500000个磁珠微粒的待测液通入具有200000个微孔121的芯片10后,在荧光显微镜下495nm激发光波长,10倍物镜,曝光时间700ms的荧光显微镜图像(图中亮点可表征磁珠微粒),图中(A)为加入磁珠微粒后未用油相冲洗的图像,(B)为采用30μL电子氟化液10μL/s流速冲洗的图像,(C)为采用50μL电子氟化液5μL/s冲洗的图像,(D)为采用50μL电子氟化液3u/s冲洗的图像。由图4可知,采用50μL电子氟化液使用3μL/s的流速加入对芯片10进行冲洗,能够最大化降低杂噪音的同时保留更多磁珠微粒在孔内。
下面结合具体实例对该免疫检测方法进行详细说明。
1、检测装置制作
可参照上述芯片10的制造方法和检测装置的结构,制作上述10mm×10mm的芯片10,并基于该芯片10制作检测装置,在此不再赘述。
2、试剂准备
由于数字化免疫检测需要将含有磁珠微粒的溶液施加到芯片10上,使单个磁珠微粒落入到阵列的每个微孔121中,以进行分离观测。磁珠微粒落入孔中的条件与磁珠微粒的溶液浓度和加入后的等待时间有关。例如,制作的芯片10上有250000个微孔,假设100个磁珠微粒被观察到有酶催化的荧光响应可以在可接受的泊松噪音之内(≤10%),并且有酶荧光响应的磁珠微粒占所有进入微孔121内磁珠比例的1%为检测下限,则可以根据泊松公式计算出磁珠微粒入孔效率最小值为4.6%,也就是经过免疫反应后磁珠微粒的浓度最小值应该在4000~7000个/μL。
具体可采用2.8um粒径的羧基磁珠微粒经过EDC(碳化二亚胺,活化剂)反应活化后,与SPRN-5捕获抗体(BSA牛血清蛋白的抗体)进行反应偶联。抗体偶联到磁珠微粒上后,需要对磁珠微粒进行染色,以用于后续计算,可直接定位全部入孔的磁珠微粒数量(包括连接和未连接到待测抗原的所有磁珠)。
磁珠染色所使用的染料的浓度可以为10mg/mL(1mg染料溶于100μL稀释液中),1000万个连接有捕获抗体的磁珠微粒悬浮于600μL NaHCO3溶液中(0.1M),加入4.4μL的pH8.5的染料。染色可在室温进行,持续震荡2个小时。染色后磁珠微粒可用PBST(0.1%吐温)清洗五次。最后染色后的抗体磁珠微粒可保存在磁珠保存液中,保存液成分可以包括50mM缓冲液,PH 7.8的150mMol的NaCl,10mMol的EDTA,,1%的BSA,1%的Triton-100,0.15%的Proclin-100等。
3、免疫特异性反应:
待测样本选取含有不同浓度PSA抗原的标准液100μL稀释液,成分为PBST(0.1%吐温)加入2.5%BSA溶液。单次反应需要的磁珠微粒数量为50万个,加入到待测样本稀释液中进行免疫反应,反应在室温下进行2小时,持续震荡。反应结束后,磁珠用洗涤液(PBST)清洗五次。洗涤后的磁珠加入1nM浓度的待标记抗体溶液50μL进行免疫反应,反应条件1小时,室温,持续震荡。反应结束后再用洗涤液清洗磁珠3次。加入40pM PBST和1mM MgCl2的酶标记物反应,反应条件为室温30分钟。反应结束后分离洗涤5次。最后将得到的磁珠微粒加入到15μL100uMol的底物后,通入到检测装置的芯片10上。
4、荧光磁珠微粒通入后的冲洗处理:
将含有磁珠微粒的溶液上样到芯片10上后,可以在芯片10外部施加磁场,使磁珠微粒沉降落入微孔121内。同时,大量未进入微孔121内的无序磁珠微粒会陈列在芯片10上,将会影响信号收集。为了解决此问题,可采用50μL电子氟化液使用3μL/s的流速对检测装置(芯片10的位置)进行冲洗,以在最大化降低杂噪音的同时保留更多磁珠微粒在微孔121内,以保证检测的准确性。
5、检测结果
分别使用不同浓度的待测抗原进行检测,浓度分别为:0pg/mL(阴性样本)、0.2pg/mL和1000pg/mL。采用荧光显微镜装载1000W像素摄像头对检测结果进行观察。首先在495nm激发光下获得520nm荧光发射光的图片,定位微孔121中所有磁珠微粒的位置,如图5中的(A)、(B)、(C);然后在577激发光下,得到620nm荧光发射光的图片,用于定位连接有抗原和标记抗体磁珠的荧光响应,如图5中的(D)、(E)、(F)。然后通过泊松公式计算出连有抗原的磁珠微粒占所有总体磁珠微粒的比例,从而实现对蛋白质类标记物的更高精度的数字化检测,也可以定性的观察检测技术对不同浓度待测物的响应。
综上,采用本实施例提供的免疫检测方法,可以以保证蛋白质类标志物检测的精度和准确性,从而实现pg/mL(10-12)浓度级别的蛋白检测。且检测方法简单易行,可实施性强。
本技术领域技术人员可以理解,本申请中已经讨论过的各种操作、方法、流程中的步骤、措施、方案可以被交替、更改、组合或删除。
在本申请的描述中,需要理解的是,术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于描述本申请和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本申请的限制。
以上仅是本申请的部分实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
Claims (13)
1.一种检测装置,所述检测装置用于检测蛋白质类标志物,其特征在于,包括芯片、第一盖板及第二盖板,所述芯片包括玻璃基体和设置在所述玻璃基体上的微孔阵列层,所述微孔阵列层与所述玻璃基体层叠设置,所述微孔阵列层包括多个微孔,所述第一盖板和所述第二盖板贴合并围成腔体,所述芯片设置在所腔体中,所述第一盖板上设置有进液孔和出液孔,所述进液孔和所述出液孔设置为通过所述进液孔进入的液体可以进入所述腔体,并流经所述微孔阵列层中的微孔,最终从所述出液孔排出。
2.根据权利要求1所述的检测装置,其特征在于,所述第二盖板上形成有所述腔体,所述第二盖板还包括环绕所述腔体设置的连接区,所述连接区与所述第一盖板贴合。
3.根据权利要求2所述的检测装置,其特征在于,所述连接区和所述第一盖板之间均设置有粘结剂;或者
所述连接区和所述第一盖板贴合表面通过离子键键合。
4.根据权利要求1所述的检测装置,其特征在于,所述微孔阵列层包括光刻胶层和钝化层,所述光刻胶层设置在所述玻璃基体上,并与所述玻璃基体层叠设置,所述光刻胶层上形成有初始微孔,所述钝化层覆盖所述光刻胶层,并覆盖所述初始微孔的底壁和侧壁,形成所述微孔。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的检测装置,其特征在于,所述检测装置还包括磁场组件,所述磁场组件设置在所述芯片的外周,用于至少在所述微孔阵列层形成磁场,所述磁场的方向沿所述微孔的延伸方向,并对落入所述微孔中的磁性体具有朝向所述微孔的底壁的作用力。
7.根据权利要求1至5中任意一项所述的检测装置,其特征在于,所述微孔阵列层的尺寸占所述玻璃基体同方向的尺寸的三分之一至二分之一。
8.根据权利要求1至5中任意一项所述的检测装置,其特征在于,所述微孔的直径在4μm至5μm之间,所述微孔的深度在3μm至5μm之间。
9.一种芯片的制造方法,所述芯片用于检测蛋白质类标志物的检测装置,其特征在于,所述制造方法包括:
提供玻璃基体;
在所述玻璃基体上形成微孔阵列层,所述微孔阵列层具有呈阵列排布的多个微孔。
10.根据权利要求9所述的芯片的制造方法,其特征在于,所述在玻璃基体上形成微孔阵列层的步骤包括:
在所述基体层上形成光刻胶层;
对所述光刻胶层进行曝光显影,以在所述光刻胶层上形成阵列排布的初始微孔;
在曝光显影后的光刻胶层上形成所述钝化层,且所述钝化层覆盖所述初始微孔的底壁和侧壁,以形成阵列排布的所述微孔。
11.一种蛋白质类标志物的检测方法,其特征在于,所述方法包括:
将偶联有所述蛋白质类标志物的抗体的磁珠微粒依次与所述待检测溶液和具有标记抗体的溶液进行反应,以得到具有标记物的所述磁珠微粒;
将所有所述磁珠微粒从所述进液孔上样到权利要求1至8中任意一项所述的检测装置上,使至少部分所述磁珠微粒落入到所述微孔中,通过检测所述微孔中所述磁珠微粒的总量和含有标记物的所述磁珠微粒的分总量,来确定所述待检测溶液中蛋白质类标志物的含量。
12.根据权利要求11所述的蛋白质类标志物的检测方法,其特征在于,所述至少部分磁珠微粒落入到每个所述微孔中之后,还包括:
采用油相冲洗的方法去除未落入所述微孔中的所述磁珠微粒。
13.根据权利要求12所述的蛋白质类标志物的检测方法,其特征在于,所述采用油相冲洗的方法去除未落入所述微孔中的所述磁珠微粒,包括:
采用40μL-60μL的电子氟化液在2μL/s-4μL/s的流速下对所述检测装置进行冲洗,以去除未落入所述微孔中的磁珠微粒。
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CN116879257A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-10-13 | 重庆工商大学 | 用于病原微生物定量检测的sers芯片及其制备方法和应用 |
CN117388227A (zh) * | 2023-10-18 | 2024-01-12 | 博瑞生物医药(苏州)股份有限公司 | 使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法、计算机可读介质和分析设备 |
CN117388227B (zh) * | 2023-10-18 | 2024-05-31 | 博瑞生物医药(苏州)股份有限公司 | 使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法、计算机可读介质和分析设备 |
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2020
- 2020-10-30 CN CN202011197985.3A patent/CN114441483A/zh active Pending
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2021
- 2021-05-27 US US17/332,812 patent/US20220137037A1/en active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN116879257A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-10-13 | 重庆工商大学 | 用于病原微生物定量检测的sers芯片及其制备方法和应用 |
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