CN114437190A - OsGLW12蛋白在调控植物种子粒型或千粒重中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了OsGLW12蛋白在调控植物种子粒型或千粒重中的应用，属于水稻基因工程技术领域，所述OsGLW12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明首次将OsGLW12蛋白用于调控种子粒型及千粒重，为培育高产经济作物提供了新的途径。本发明还提供了OsGLW12基因在调控植物种子粒型或千粒重中的应用。

Description

OsGLW12蛋白在调控植物种子粒型或千粒重中的应用

技术领域

本发明属于水稻基因工程技术领域，特别涉及OsGLW12蛋白在调控植物种子粒型或千 粒重中的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国最重要的粮食作物，水稻的栽培总面积约占主要粮食 作物种植面积的三分之一，同时我国更是水稻生产与消费的第一大国(郭兆武etal.，湖 南农业大学，2008)。但随着社会的发展，人口增长的加剧和耕地面积的减少对水稻的生 产造成了极大的压力。如何提高水稻产量一直是育种家和科学家们的关注重点。水稻产量 是极为复杂的数量性状，影响因素众多，其构成因素主要包括千粒重、有效穗和穗粒数。 而粒型是决定千粒重的一个重要的农艺性状(黄娟et al.，四川农业学报，2015)，粒型包括粒长、粒宽和粒厚三个指标，直接影响了水稻的产量，同时也对水稻的食用和加工品质有着一定程度的影响(孙忠明et al.，北京农业旬刊，2012)。种子大小是由粒长、粒 宽、粒厚和谷粒充实度共同决定的，是千粒重最主要的决定因素。种子大小也是构成水稻 理想株型的主要农艺性状之一，长期以来一直是很多作物育种改良的重要目标，对产量和 外观品质有很大的影响。近年来，伴随着分子生物学的快速发展，越来越多的农业科学家 开始使用分子生物学的方法研究农作物的育种问题，利用基因编辑的方法，将原本5至10 年的育种周期缩短到2至3年，大大加快了研究进度(Wen ZJ et al.,Rice，2013)，但 是在很长一段时间内，培育高产品种仍是水稻育种的主要研究方向(盛文涛.，南方农业学 报，2018)。我国是世界上水稻生产量和稻米消费量最大的国家,同时也是稻米的重要进出 口国,在国际贸易中占有重要位置.我国加入WTO,一方面给我国水稻的生产的贸易带来了机遇，另一方面如何提高水稻的产量和促进水稻生产，是我国目前亟待解决的科学问题(陈和午et al.,北京农业职业学院学报.,2004)。水稻作为单子叶植物中的模式植物，水稻基因组的研究也可以为其他植物的研究提供参考和借鉴。粒型是决定水稻产量和品质的一个关键性因素，寻找到新的粒型基因并引入实际应用对水稻遗传育种具有重要的意义。近年来，研究水稻粒型基因以及遗传分子机制、发掘优良的产量相关基因对提高水稻的产量以及稻米品质有着至关重要的作用，同时为培育水稻理想株型、研究水稻高产的分子机制提供理论依据。

水稻的粒型基因主要影响三个方面的性状：粒长、粒宽和粒厚，这三个性状与千粒重 呈正相关，并且受多个基因调控(Yong Z X et al.,plant jounal，2010)。目前已经发现的粒型QTL已经超过400个，在水稻的12条染色体中都有分布(如表1所示)，主要集 中在2、3、5、6号染色体上，9、10、11和12号染色体上相对较少。在这些粒型基因中， 调控粒长的有D11、PGL1、PGL2、SRS3等基因；调控粒宽的有GW2、GS2、GS5、GW5等基因； 调节千粒重的有RGA1、flo2、GW2、GS3、GL3.1、GW5、GW6、GW8等基因(杨树明et al.， 湖南农业大学学报，2012).

表1.已克隆的控制水稻粒型的基因

目前已知的粒型调控基因主要通过以下几种途径调控籽粒大小：MAPK信号通路、蛋白 酶体泛素化降解、激素响应调控、G蛋白信号传导调节、转录因子与基因表达水平调控， 以及其他调控途径(邓小书et al.,四川农业大学，2020)。通过对比研究表明，通过MAPK 途径、G蛋白偶联受体途径和E3泛素蛋白酶体途径的基因是影响细胞增殖进而调控粒型的； 而通过植物激素途径的基因是通过同时影响细胞的增殖和扩张来调控粒型的。有越来越多 的研究证实，不同的粒型调控基因之间存在着互相调控的关系(Huang RY et al.，PANS, 2013)。例如，Guo等通过EMS诱变发现一个大粒稀穗突变体gsn1，编码一种特异性磷酸酶， 通过细胞增殖调控籽粒大小。GSN1功能缺失形成大籽粒且穗粒数减少，而过表达GSN1导致 籽粒变小但穗粒数增加。进一步分析显示GSN1能与OsMPK6互作，通过去磷酸化OsMPK6使 其失活，进而调控籽粒大小以及穗粒数(Guo T et al.,plant cell，2018)。而异三聚体G 蛋白由3个亚基αβγ组成。在水稻中有1个Gα，1个Gβ和5个Gγ蛋白，其中， Gα、Gβ影响细胞增殖，正调控粒型(SUN S et.，Nature Communications，2018)。D1/RGA1 编码G蛋白的α亚基，该位点的隐性突变导致水稻矮化，穗型直立，着粒紧密，谷粒小 圆(ASHIKARI Met al.，PANS，1999)。dEP1编码蛋白的γ亚基，Gγ蛋白DEP1与Gα 亚基(RGA1)和Gβ亚基(RGB1)发生了互作(Huang X et al.，Nature Genetics,2014)， 导致RGA1活性降低，RGB1活性增高，从而抑制了氮反应。最新研究表明dEP1正调控粒 长，GS3-1负调控粒长，Gα是粒型变大的基础，Gβ影响植物生存和生长，Gγ是由几种Gγ 蛋白相互拮抗调控粒型。

目前，对于水稻种子粒型和千粒重的调控基因有待进一步挖掘，为粒型品种和高产水 稻品种的培育奠定基础，并提供更多的选择。

发明内容

为了解决水稻种子粒型控制的问题，本发明提供了OsGLW12蛋白在调控植物种子粒型 或千粒重中的应用，本发明首次将OsGLW12蛋白用于调控种子粒型及千粒重，为培育高产 经济作物提供了新的途径。

本发明还提供了OsGLW12基因在调控植物种子粒型或千粒重中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明提供OsGLW12蛋白在调控植物种子粒型或千粒重中的应用，所述OsGLW12蛋白 的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步的，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；

所述单子叶植物包括水稻、小麦、大麦、高粱和玉米中的任意一种；

所述双子叶植物包括拟南芥、番茄、烟草、大豆和土豆中的任意一种。

基于同一发明构思，本发明还提供OsGLW12基因在调控植物种子粒型或千粒重中的应 用，其特征在于，所述OsGLW12基因的CDS区包括a)或b)：

a)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA片段；

b)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA片段经过碱基的取代、缺失和添加中的至少 一种获得的基因，且基因编码的蛋白质具有OsGLW12蛋白的活性，所述OsGLW12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步的，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；

所述单子叶植物包括水稻、小麦、大麦、高粱和玉米中的任意一种；

所述双子叶植物包括拟南芥、番茄、烟草、大豆和土豆中的任意一种。

基于同一发明构思，本发明还提供OsGLW12蛋白和/或OsGLW12基因在选育植物粒型品 种或高产品种中的应用，所述OsGLW12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,所述OsGLW12 基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种调控植物种子粒型的方法，以OsGLW12基因为目的基因，所述OsGLW12基因的核 苷酸序列如SEQ ID No.2所示，采用CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建所述目的基因的敲除载体，转化入植物中，对植物进行培育；

采用单靶点敲除，敲除靶标序列如SEQ ID No.3所示，gRNA序列如SEQ ID No.4所示。

一种控制植物种子粒型和/或千粒重的OsGLW12-KO基因，所述OsGLW12-KO基因的核苷 酸序列如SEQ ID No.5所示。

基于同一发明构思，本发明还提供一种控制植物种子粒型和/或千粒重的OsGLW12-KO 基因在选育植物粒型品种或高产品种中的应用。

进一步的，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；

所述单子叶植物包括水稻、小麦、大麦、高粱和玉米中的任意一种；

所述双子叶植物包括拟南芥、番茄、烟草、大豆和土豆中的任意一种。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明OsGLW12蛋白在调控植物种子粒型或千粒重中的应用，本发明首次发现野生中 花11水稻OsGLW12基因和蛋白具有调控水稻粒型和千粒重的用途，为一个控制水稻产量的 新基因，其调控途径包括参与APG/PGL2的调控途径调控种子的粒型，调控颖壳细胞的形态 改变粒型，与其他蛋白互作形成异源二聚体或多聚体进行调控，可用于水稻高产品种的培 育，通过进一步试验发现OsGLW12基因在多个植物品种中具有极高的同源保守性，因此 OsGLW12基因可用于调控水稻、小麦、高梁、大麦等多种植物种子粒型及千粒重，用于多种 植物高产品种的培育。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的 附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领 域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附 图。

图1为OsGLW12蛋白氨基酸序列比对图：图中，INH31对应于OsGLW12蛋白，深色为该类 蛋白保守的Cys残基。

图2为OsGLW12蛋白氨基酸序列进行完全比对构建的系统发育进化树：图中，INH31对应 于OsGLW12蛋白。

图3为OsGLW12基因结构图及基因敲除靶位点设计图。

图4为野生中花11和敲除纯合突变体OsGLW12-KO的植株对比照片：其中WT为野生型中花 11，glw12-KO为基因敲除转基因株系单株。

图5为野生中花11和敲除纯合突变体glw12-KO的籽粒和颖果长度对比照片：其中A为籽 粒长度对比图，WT为野生型中花11，glw12-KO为基因敲除转基因株系单株的种子；其中B为 颖果长度对比图，WT为野生型中花11，glw12-KO为基因敲除转基因株系单株的种子。

图6为野生中花11和敲除纯合突变体glw12-KO的籽粒和颖果宽度对比照片：其中A为籽 粒宽度对比图，WT为野生型中花11，glw12-KO为基因敲除转基因株系单株的种子；其中B为 颖果宽度对比图，WT为野生型中花11，glw12-KO为基因敲除转基因株系单株的种子。

图7为野生中花11和敲除纯合突变体glw12-KO农艺性状统计图：其中包括株高、粒长、粒宽、分蘖数、穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、结束率、每穗实粒数、千粒重；其 中WT为野生型中花11，glw12-KO为基因敲除转基因株系单株。

图8为OsGLW12在植株不同组织及比不同时间段的基因表达谱图。

图9为粒型基因在WT与glw12-KO中的表达水平对比图：其中WT为野生型中花11，glw12-KO为基因敲除转基因株系单株。

图10为蔗糖转化酶ELISA酶活测定图：其中A为孕穗期蔗糖转化酶活性检测图，WT为 野生型中花11，glw12-KO为基因敲除转基因株系单株；B为抽穗期蔗糖转化酶活性检测图， WT为野生型中花11，glw12-KO为基因敲除转基因株系单株。

图11为蔗糖转化酶相关基因表达图：其中WT为野生型中花11，glw12-KO为基因敲除 转基因株系单株。

图12为糖份ELISA测定图：其中A为抽穗期碎布蔗糖含量测定图，WT为野生型中花11，glw12-KO为基因敲除转基因株系单株；B为成熟籽粒淀粉含量测定图，WT为野生型中 花11，glw12-KO为基因敲除转基因株系单株。

图13为蔗糖淀粉合成通路简图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由 此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发 明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使 用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域 技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市 场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

LOC_Os08g42890(OsGLW12)在国家水稻数据中心(https://www.ricedata.cn/)被注 释为：果胶甲酯酶抑制剂，其与许多序列存在相似性，虽然同源程度不是很高，但是形成两个二硫键的4个半胱氨酸残基的位置是严格保守的。果胶甲酯酶抑制剂有关联的序列分为两类：第一类为蔗糖酶抑制剂序列；第二类为果胶甲酯酶的前导序列。申请人通过氨基酸序列比对，发现OsGLW12与其它植物中的蔗糖转化酶抑制蛋白有相同的三个保守的Cys残基，这是植物蔗糖转化酶的标志，同时进行系统发育分析发现OsGLW12与玉米中的蔗糖转化酶抑制蛋白基因具有高度的同源性,暗示其极大可能参与了水稻种子发育的进程。

基于此，本发明提供OsGLW12蛋白在调控植物种子粒型或千粒重中的应用，为选育植 物粒型品种或高产品种提供新的途径。

下面将结合实施例及实验数据对本申请进行详细说明。

实施例1

(一)试验材料

供试的水稻品种为水稻粳稻品种中花11，即为水稻(Oryza sativa Japonica)。中花11 品种水稻于四川农业大学水稻研究所遗传研究室进行保存。每季新收的种子种植前先用质 量百分比浓度为1％得的过氧化氢消毒8h，在供氧的纯净水(内含1％H2O2)中于28℃环境 下置于摇床摇荡浸种8h，然后将种子放入30℃培养箱下进行发芽培养，每天换水两次，待 到露白后转入28℃下培养。待水稻芽长到5-7mm长的时候播种于幼苗培养盒中，并在水稻 营养液中培养到3叶期后，将水稻幼苗移入水稻栽培田进行管理，观察，性状统计。

(二)试验方法

2.1所用试剂和载体

质粒CRISPR/Cas9P35S-H；农杆菌(Agrobacterium)感受态EHA105购于昂羽生物技术 有限公司；大肠杆菌(EOsSGherichia coli)DH5α感受态购于北京全试金生物公司；质粒提取试剂盒购于诺唯赞(南京)公司

Plasmid Mini KitdC201，FastPureEndoFree Plasmid Maxi KitdC202；NAprep Pure植物总RNA提取试剂盒购于北京全试金生物公司；反 转录试剂盒购于诺唯赞(南京)公司HiOsSGript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)R223-01；qPCR试剂盒购于诺唯赞(南京)公司；AceQ qPCR SYBR GreenMaster Mix (without ROX)；重组酶

II One Step Cloning Kit购于南京诺唯赞生物科技 有限公司；

2.2OsGLW12生物信息学分析

前期通过本发明人其他几份粒型材料的转录组数据进行共表达分析，筛选到一个可能与种 子发育密切相关的被注释为：果胶甲酯酶抑制蛋白的编码基因LOC_Os08g42890(根据后续 突变体表型可命名为OsGLW12)，果胶甲酯酶抑制剂与许多序列存在相似性，虽然同源程度 不是很高，但是形成两个二硫键的4个半胱氨酸残基的位置是严格保守的。本发明人将与 果胶甲酯酶抑制剂有关联的序列分为两类：第一类为蔗糖酶抑制剂序列；第二类为果胶甲 酯酶的前导序列。通过氨基酸序列比对，发现OsGLW12与其它植物中的蔗糖转化酶抑制蛋 白有相同的三个保守的Cys残基(图1所示)，这是植物蔗糖转化酶的标志，同时进行系 统发育分析发现OsGLW12与玉米中的蔗糖转化酶抑制蛋白基因具有高度的同源性(图2所 示)。

2.2 OsGLW12敲除载体的构建

依据现有公开的在线设计网站，结合实验需求，设计、选取合适靶位点并设计相关引 物；

利用双重PCR构建靶标sgRNA表达盒。本实验采用单靶点敲除载体，构建了单靶点sgRNA 表达盒(U6a-目的基因编码区序列)；其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

靶标sgRNA表达盒克隆到表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S-H:BasI酶切载体pYLCRISPR/Cas9P35S-H，使用T4连接酶将构建完成的sgRNA表达盒连接到表达载体上，再经过大肠杆菌转化、单克隆菌落PCR鉴定和提取质粒后，测序验证重组敲除载体是否正确。

在OSGLW12编码区功能结构域上设计一个靶位点构建了OsGLW12的敲除载体，经农杆菌 转化法，以常规粳稻品种中花11为受体材料进行遗传转化。经过验证后筛选分类，获得1个 敲除转基因纯合株系。室内培养这1个敲除转基因纯合株系并选取叶片提取DNA，以靶位点 及附近序列为模板，设计PCR扩增引物，PCR扩增，电泳检测大小合适片段，测序验证，基 因序列比对。根据该敲除转基因株系靶位点突变方式的不同，分别将其命名为OsGLW12-KO (图3所示)其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

2.3农杆菌介导水稻遗传转化

消毒：挑选成熟饱满且胚完整的受体材料种子，脱壳，在75％酒精中浸泡1min，转到 0.15％HgCl2中继续浸泡20min，再用无菌水漂洗多次，直至将消毒液清洗干净，放入铺好 灭菌滤纸的培养皿中，置于超净工作台上吹10～15min至风干；

愈伤组织诱导：在每个配制好的诱导培养皿中接入15粒种子，27℃无光培养10～15d至 长出愈伤组织颗粒后，继续培养15d后继代，选择第三代胚性愈伤组织用于后续实验；

预培养：选取分散、鲜黄的2～3mm的颗粒状愈伤组织，转到预培养培养基中，置于27℃ 无光培养3d；

侵染：将预培养的愈伤组织置于三角瓶中，加入包含目的基因的农杆菌菌液浸泡30min， 干燥愈伤组织，并将其接种在共培养基上，19℃无光培养3d；

筛选：将愈伤组织转到筛选培养基，30℃持续光照培养15d，再转到新的筛选培养基上， 30℃培养至新的愈伤组织长出；

分化：将筛选后的愈伤组织转到分化培养基上，30℃光照培养至愈伤组织转绿并分化；

生根：将愈伤组织转移至生根培养基，30℃光照培养至生根；

移栽：已生根的植株用水洗净培养基后，移栽至土壤中。

2.4敲除转基因植株的验证

提取CRISPR/Cas9敲除转基因植株DNA，PCR扩增对应片段，电泳检测，测序验证，利用 DNA MAN软件进行序列比对，归纳各转基因株系的突变方式。

2.5农艺性状调查

大田培养中花11野生型及转基因敲除株系，在开花期随机选择21株发育正常、处于相 同花期的中花11野生型及转基因敲除植株，对其开花穗部做好标记后，分别在第3、5、7、 10、15、20、25d取小穗调查灌浆情况，拍照记录，并使用电子天平称量鲜重与干重。后期用Adobe Photoshop CC 2019图像处理软件排版处理，EXCEL软件整理数据，计算平均值并绘制折线图。

大田培养中花11野生型及转基因敲除株系，在成熟期随机选择10株发育正常的野生 型及转基因植株，分单株调查统计株高、分蘖数、粒长、粒宽及千粒重等农艺性状，三次生物学重复，拍照记录，利用考种仪测量并记录各项数据，利用EXCEL软件进行处理数据，计算3次生物学重复的标准误差，计算显著性差异，进行数据分析并绘制柱状图。

对T2代纯和敲除植株的表型进行观察，发现敲除株系glw12-KO籽粒要明显长于亲本 ZH11，但在粒宽上并无明显变化(图5-6所示)。同时我们也对敲除株系glw12-KO的农艺性状进行了测定，发现glw12-KO千粒重和二次枝梗数明显高于亲本ZH11；而结实率要显著低于亲本ZH11；其它农艺性状如分蘖、一次枝梗数和穗长等并无显著差异(图7所示)。

2.6CTAB提取DNA

取0.1g叶片置入1.5mL离心管中，倒入液氮，用研磨棒磨碎、磨细；

加入700μL预热到65℃的2％CTAB缓冲液，摇匀；

65℃水浴30min，期间多次摇匀；

加入400μL氯仿-异戊醇(体积比24:1)混合液，轻轻摇匀，室温放置10min；

室温，10000r/min，离心10min；

加入700μL-20℃预冷的无水乙醇至新离心管中，将上清液转至新离心管中，摇匀，-20℃静置10min(可长期保存)；

室温，10000r/min，离心10min，弃上清加入700μL 75％乙醇；

室温，10000r/min，离心10min，弃上清，室温阴干2～3h；

加入50～200μLddH2O，室温溶解30min；

核酸检测仪检测DNA浓度与质量，4℃保存。

2.7基因的qPCR分析

2.7.1RNA提取

在光照培养箱培养中花11植株，在其三叶期取整株于液氮保存；在大田培养中花11及 其转基因敲除株系，在其分蘖期分别取根、茎、叶于液氮保存，在其孕穗期取幼穗于液氮 保存。采用TRIZOL试剂提取法提取RNA，具体步骤如下：

①取新鲜水稻叶片50mg放入预冷的研钵中，加适量液氮后迅速研磨成粉末，将粉末迅 速转入1.5ml EP管中，加入1000ml Trizol，充分摇匀约1min，室温放置5min，使其充分 裂解。

②加入200ul氯仿，剧烈震荡30s，室温放置3min，4℃，12000r/min离心15min。

③吸取上清液于新的EP管中，加入500ul异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温放置20min， 4℃，12000r/min离心10min。

④弃上清液，RNA沉于管底，加入1000ul 75％乙醇(DEPC-H2O)配制，剧烈涡旋，4℃， 12000r/min离心5min。

⑤弃上清液，加入700ul无水乙醇，15℃，12000r/min离心10min，尽量弃上清液。

⑥室温晾干5-10min，待无水乙醇全部挥发，加入30uldEPC-H2O，室温溶解10-20min。

⑦用1％电泳检测，测其OD值。

2.7.2RNA的反转录：

检测后的RNA按照反转录试剂盒(Vazyme)操作步骤进行RNA的反转录，体系及步骤如下：

①基因组DNA的去除：

RNase freeddH2O to 8ul

4×gDNA wiper Mix 2ul

模板RNA 2ul

PCR 42℃反应2min。

②逆转录反应：上述反应液8ul，加入5×qRT Super MixⅡ2ul，混匀。

③反转录程序：25℃10min；50℃30min；85℃5min。将总RNA保存于-20℃。

RT-qPCR反应体系：

qRT-PCR反应程序：

2.7.3荧光定量PCR

利用primer premier 5软件根据每一个目的基因设计适合的qPCR引物，选用OsActin(Os03g0718100)为内参基因，以反转录的cDNA为模板，按照诺唯赞公司提供的

qPCR SYBR Green Master Mix(without ROX)试剂盒说明方法操作。qPCR反应体系为20μL：2×SYBR Green Master Mix加10μL，ddH2O加7.7μL，cDNA模板加1.5μL， 引物各加0.4μL。反应程序为95℃预变性5min；95℃变性15s；60℃退火延伸30s；40 个循环，每个样品均设有3个重复。反应结束后，采用仪器自带的qPCRsoft 3.2软件定义样 品并导出数据到EXCEL表格软件，利用EXCEL软件进行DDCT算法处理数据，计算3次生物学重 复的标准误差，计算显著性差异，进行数据分析并绘制柱状图。在不同组织部位的表达量 检测发现，OsGLW12呈组织特异性表达，其在颖壳以及受精5天的种子中高表达，在根、叶 以及受精三天的种子中也有表达，而在其它组织部位表达量较低(如图8所示)

同时通过实时荧光定量检测了一些已知调控粒型相关基因在亲本ZH11和敲除突变体 glw12-KO中的表达情况(图9所示)。发现PGL2和GW6的表达水平显著下调，而SRS5和OsGLW12的表达水平显著上调。而这四个基因都是通过调控细胞扩张进而调控粒型，因此我们推断glw12-KO通过颖壳细胞扩张来调控粒型，需要后续对颖壳进行扫描电镜观察，验证这一推断。

2.8蔗糖转化酶活性的测定

植物体内的INVs可分为三类，液泡蔗糖转化酶(Vacuolar Invertases,VINs)、细胞壁蔗糖转化酶(Cell Wall Invertases,CWINs)以及细胞质蔗糖转化酶(CytosolicInvertases,CINs)。而glw12-KO作为蔗糖转化酶抑制蛋白可能会影响这些蔗糖转化酶活性，因此我们对亲本ZH11和glw12-KO敲除株系的蔗糖转化酶活性进行ELISA检测，具体 方法如下：

分别吸取经研磨并萃取后的样品10ml于三支试管中，第一支加蒸馏水2.0ml，摇匀； 第二支置于沸水加热2min，取出冷却。于第二支与第三支试管中加入2.0ml蔗糖溶液，摇 匀。然后三支试管同时置于30℃，取出，立即用酶标仪进行测定，并代入公式进行计算。

结果显示，在孕穗期穗部液泡蔗糖转化酶和细胞质蔗糖转化酶活性并无显著差异，但 在抽穗期穗部glw12-KO敲除株系的液泡蔗糖转化酶和细胞质蔗糖转化酶活性要显著高于亲 本ZH11(图10所示)，证实INH31会在一定程度上抑制蔗糖转化酶的活性。

2.9蔗糖代谢相关基因表达

OsGLW12根据其蛋白结构可预测其为：蔗糖转化酶抑制蛋白，其可能会通过抑制或降低 蔗糖转化酶活性进而参与蔗糖的分解代谢，而蔗糖的分解代谢主要涉及到两大类酶：蔗糖 转化酶(INVs)和蔗糖合酶(SUSs)，因此我们利用实时荧光定量检测了glw12-KO敲除突 变体中蔗糖转化酶和蔗糖合酶基因的表达情况(如图11所示)。敲除突变体glw12-KO的蔗糖转化酶基因OsINV3和OsCIN3表达量显著上调；蔗糖合酶基因OsSUS2、OsSUS3、OsSUS4、OsSUS7表达量均显著上调。进一步证实glw12-KO会降低或抑制蔗糖转化酶活性进而参与蔗糖分解代谢，同时也有可能会影响淀粉的合成。

3.0蔗糖以及淀粉含量测定

因为glw12-KO会影响抽穗期穗部蔗糖转化酶活性，因此我们检测了抽穗期穗部蔗糖与 淀粉含量用购于北京索莱宝生物科技有限公司的ELISA试剂盒检测，具体步骤如下(如图 12A所示)：

蔗糖含量测定：

1、可见分光光度/酶标仪计预热30min以上，调节波长至480nm，蒸馏水调零。

2、样本测定(在1.5mL EP管中依次加入下表2的试剂)：

3、蔗糖含量计算：

1)按照样本蛋白浓度计算蔗糖含量(mg/mg prot)＝(C标准管 ×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(V1×Cpr)＝(A3-A1)÷(A2-A1)÷Cpr此法需要自行测定蛋 白浓度。

2)按照样本质量计算蔗糖含量(mg/g质量)＝(C标准管 ×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)＝(A3-A1)÷(A2-A1)÷W C

标准管：标准管浓度，1mg/mL；V1：加入样本体积，0.025mL；V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

淀粉含量测定：

一、样本处理

1、称取约0.1g样本于研钵中研碎，加入1mL试剂一，充分匀浆后转移到EP管中， 80℃水浴提取30min，3000g，常温离心5min，弃上清，留沉淀。

2、沉淀中加入0.5mL双蒸水，放入沸水浴中糊化15min(盖紧，以防止水分散失)。

3、冷却后，加入0.35mL试剂二，常温提取15min，振荡3-5次。

4、加入0.85mL双蒸水，混匀，3000g，常温离心10min，取上清液。

5、取上清液100μL加入700μL蒸馏水后即进行了八倍稀释测定。

二、测定步骤

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至620nm，蒸馏水调零。

2、调节水浴锅至95℃。

3、标准品的制备：将10mg/mL葡萄糖标准液进行稀释得到0.1、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01mg/mL标准溶液备用。

4、标准品测定：取0.2mL标准溶液(蒸馏水做空白)和1mL工作液至EP管中，95℃ 水浴10min(盖紧，防止水分散失)，自然冷却至室温，在620nm波长下测定吸光度值A 标准及A空白。计算ΔA＝A标准-A空白。

5、样本测定：取0.2mL样本和1mL工作液至EP管中，95℃水浴10min(盖紧，防止 水分散失)，自然冷却至室温，在620nm波长下测定吸光度值A测定。ΔA′＝A测定-A空白。

三、淀粉含量计算

1、标准曲线绘制：以0.1、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01mg/mL葡萄糖标准溶液为 横坐标，ΔA为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程y＝kx+b，将ΔA′代入方程得到x (mg/mL)。

2、淀粉含量计算：(1)按样本质量计算淀粉含量(mg/g质量)＝x×稀释倍数×V提取 ÷W÷1.11＝12.252x÷W V提取：提取后体积，1.7mL；W：样本质量，g；稀释倍数：8；1.11：是此法测得葡萄糖含量换算为淀粉含量的常数，即111μg葡萄糖用蒽酮试剂显色相当于100μg淀粉用蒽酮试剂显示的颜色。

测定结果显示glw12-KO敲除株系穗部蔗糖含量有所降低，但并不显著。后续还将进一 步重复实验结果，同时检测不同发育时期穗部蔗糖含量。淀粉主要来自蔗糖分解代谢产生 的己糖合成，是重要的能量来源。因此我们检测了成熟籽粒中淀粉含量(如图12B所示)， 发现glw12-KO敲除株系淀粉含量要显著高于亲本ZH11。说明glw12-KO通过蔗糖代谢进而 影响淀粉生成。基于以上结果，我们推测glw12-KO可能会通过抑制INVs的活性，进而使 植物体内蔗糖积累，己糖减少，不利于淀粉合成，进而负调控籽粒大小(如图13所示)。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而 且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固 有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概 念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选 实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和 范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内， 则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 四川农业大学

四川泰隆汇智生物科技有限公司

<120> OsGLW12蛋白在调控植物种子粒型或千粒重中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 180

<212> PRT

<213> 1(人工序列)

<400> 1

Met Ala Arg Pro Ala Ala Ala Val Thr Val Leu Leu Ala Val Val Val

1 5 10 15

Leu Val Ser Val Ala Ala Ser Leu Pro Ser Ala Val Val Gly Asp Ala

20 25 30

Arg Phe Val Ala Arg Thr Cys Lys Arg Thr Asn His Thr Glu Cys Val

35 40 45

Lys Met Leu Ser Ala Asp Arg Arg Ser Ala Arg Ala Thr Thr Val His

50 55 60

Gln Leu Ala Gly Ile Ala Val Asp Ile Ala Ala Ala Thr Val Lys Ser

65 70 75 80

Ser Ala Ala Ala Val Tyr Gly Lys Phe Leu Glu Asn His Gly Gln Val

85 90 95

Leu Glu Leu Thr Leu Leu Glu Cys Trp Trp Met Tyr Asp Leu Ala Ala

100 105 110

Gly Glu Ala Gln Ala Ala Val Asp Ala Tyr Ser Ser Gly Gly Ala Tyr

115 120 125

Leu Asp Val Val Arg His Gln Leu Ala Gly Tyr Tyr Ala Gly Ile Met

130 135 140

Cys Asp Asn Met Ile Val Arg Arg Ser Lys Val Ser Pro Val Ala Asp

145 150 155 160

Ile Asp Arg Thr Thr Ala Thr His Cys Asn Ile Ala Val Asp Leu Ile

165 170 175

Gly Leu Leu Tyr

180

<210> 2

<211> 543

<212> DNA

<213> 2(人工序列)

<400> 2

atggcgagac cagctgctgc cgtcaccgtc ctcctcgccg tcgtcgtcct cgtctccgtc 60

gccgcctccc tcccctccgc cgtcgtcggc gacgcccgct tcgtcgcccg cacgtgcaag 120

cgcaccaacc acaccgagtg cgtgaagatg ctcagcgccg accggcggag cgccagggcc 180

accaccgtgc accagctcgc cggcatcgcg gtcgacatcg ccgccgccac cgtgaagtcc 240

agcgccgccg ccgtgtacgg caagttcctg gagaatcacg gccaggtcct cgagctgacg 300

ctgctcgagt gctggtggat gtacgacctc gccgccggcg aggcccaggc ggcggtcgac 360

gcctacagct ccggcggcgc gtacctcgac gtggtcaggc accagctggc cggttactac 420

gccgggatca tgtgcgacaa catgatcgtc cgccgctcga aggtctctcc ggtggccgac 480

atcgacagga cgacggcgac gcactgtaac atcgccgtcg atctcatcgg gctgctttac 540

taa 543

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 3(人工序列)

<400> 3

gacgctgctc gagtgctgg 19

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 4(人工序列)

<400> 4

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 30

<210> 5

<211> 544

<212> DNA

<213> 5(人工序列)

<400> 5

atggcgagac cagctgctgc cgtcaccgtc ctcctcgccg tcgtcgtcct cgtctccgtc 60

gccgcctccc tcccctccgc cgtcgtcggc gacgcccgct tcgtcgcccg cacgtgcaag 120

cgcaccaacc acaccgagtg cgtgaagatg ctcagcgccg accggcggag cgccagggcc 180

accaccgtgc accagctcgc cggcatcgcg gtcgacatcg ccgccgccac cgtgaagtcc 240

agcgccgccg ccgtgtacgg caagttcctg gagaatcacg gccaggtcct cgagctgacg 300

ctgctcgagt gcatggtgga tgtacgacct cgccgccggc gaggcccagg cggcggtcga 360

cgcctacagc tccggcggcg cgtacctcga cgtggtcagg caccagctgg ccggttacta 420

cgccgggatc atgtgcgaca acatgatcgt ccgccgctcg aaggtctctc cggtggccga 480

catcgacagg acgacggcga cgcactgtaa catcgccgtc gatctcatcg ggctgcttta 540

ctaa 544

Claims (9)

1.OsGLW12蛋白在调控植物种子粒型或千粒重中的应用，其特征在于，所述OsGLW12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的OsGLW12蛋白在调控植物种子粒型或千粒重中的应用，其特征在于，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；

所述单子叶植物包括水稻、小麦、大麦、高粱和玉米中的任意一种；

所述双子叶植物包括拟南芥、番茄、烟草、大豆和土豆中的任意一种。

3.OsGLW12基因在调控植物种子粒型或千粒重中的应用，其特征在于，所述OsGLW12基因的CDS区包括a)或b)：

a)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA片段；

b)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA片段经过碱基的取代、缺失和添加中的至少一种获得的基因，且基因编码的蛋白质具有OsGLW12蛋白的活性，所述OsGLW12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.根据权利要求3所述的OsGLW12基因在调控植物种子粒型或千粒重中的应用，其特征在于，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；

所述单子叶植物包括水稻、小麦、大麦、高粱和玉米中的任意一种；

所述双子叶植物包括拟南芥、番茄、烟草、大豆和土豆中的任意一种。

5.OsGLW12蛋白和/或OsGLW12基因在选育植物粒型品种或高产品种中的应用,其特征在于，所述OsGLW12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,所述OsGLW12基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

6.一种调控植物种子粒型的方法，其特征在于，以OsGLW12基因为目的基因，所述OsGLW12基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，采用CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建所述目的基因的敲除载体，转化入植物中，对植物进行培育；

采用单靶点敲除，敲除靶标序列如SEQ ID No.3所示，gRNA序列如SEQ ID No.4所示。

7.一种控制植物种子粒型和/或千粒重的OsGLW12-KO基因，其特征在于，所述OsGLW12-KO基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

8.一种如权利要求7所述的控制植物种子粒型和/或千粒重的OsGLW12-KO基因在选育植物粒型品种或高产品种中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；

所述单子叶植物包括水稻、小麦、大麦、高粱和玉米中的任意一种；

所述双子叶植物包括拟南芥、番茄、烟草、大豆和土豆中的任意一种。

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