CN114437107A

CN114437107A - 哌嗪类化合物及其应用

Info

Publication number: CN114437107A
Application number: CN202111303180.7A
Authority: CN
Inventors: 唐锋; 李桢; 周峰; 陈平; 唐任宏; 任晋生
Original assignee: Jiangsu Simcere Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Simcere Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-11-06
Filing date: 2021-11-05
Publication date: 2022-05-06

Abstract

本发明提供了一种式(I)所示的新型的哌嗪类化合物或其药学上可接受的盐，含有它们的药物组合物以及其在制备预防和/或治疗针对KRAS G12C突变肿瘤药物中的应用。

Description

哌嗪类化合物及其应用

本发明要求2020年11月06日向中国国家知识产权局提交的，专利申请号为202011232187.X，发明名称为“哌嗪类化合物及其应用”以及2021年02月05日向中国国家知识产权局提交的，专利申请号为202110160742.0，发明名称为“哌嗪类化合物及其应用”的在先申请的优先权。上述在先申请的全文通过引用的方式结合于本发明中。

技术领域

本发明涉及一种新型的哌嗪类化合物或其药学可接受的盐，含有它们的药物组合物以及作为KRAS G12C抑制剂在预防或治疗相关疾病中的用途。

背景技术

Ras是首个被发现的人类原癌基因，其有三个家族成员:Hras、Kras和Nras(Barbacid M,Annu Rev Biochem,1987；56:779-827)。RAS作为一类小G蛋白，具有GTP水解酶活性，定位于胞质膜内侧，通过与GTP/GDP的不同结合而调控其活性。当它与GTP结合时即被活化(开)，而当与GDP结合时则处于非活化状态(关)。RasGTP激酶在许多信号网络中是至关重要的，它们具有信号整合的作用并将信号传递至下游效应器，参与细胞运动、细胞骨架组装、囊泡以及核运输等生命活动，进而调控细胞增殖、分化、衰老和凋亡等生命过程(Fernandez-Medarde A,et al,Genes Cancer,2011；2(3):344-58)。因此，RAS蛋白被视为细胞信号传递中的重要分子开关蛋白。

原癌基因Ras被激活以后就变成有致癌活性的癌基因。Ras基因激活的方式有三种:点突变、过表达、插入激活。其中，Ras基因被激活最常见的方式就是点突变，并主要通过点突变的方式而起致癌作用。目前已发现，151种不同的Ras点突变，主要集中在12、13位甘氨酸以及61位谷氨酰胺的突变(Prior IA,et al,Cancer Res 2012；72(10):2457-67)。在上述突变中，G12点突变最为常见，G12突变在KRAS和Hras中占主导地位。在KRAS突变中，现已发现G12存在15种不同的点突变，包括G12A、G12D、G12F、G12K、G12N、G12S、G12V、G12Y、G12C、G12E、G12I、G12L、G12R、G12T和G12W。其中，G12D突变约占G12全部突变的41％，G12V约占28％，G12C约占14％(Hobbs GA,et al,Cancer Cell,2016；29(3):251-3)。

Ras突变是促进多种癌症发生的一个重要原因，常出现在肿瘤发生早期。这些突变激活的RAS蛋白不受控制的细胞生长及增殖。据统计，Ras突变频率最高的5种癌症分别是胰腺导管腺癌、结直肠癌、多发性骨髓瘤、肺癌和皮肤黑色素瘤，突变频率分别为97.7％、52.2％、42.6％、32.2％和29.1％(Albertini AF,et al,Bull Cancer,2017；104(7/8):662-74)。值得注意的是，在这些Ras突变中，KRAS的突变频率明显高于其他两种突变。例如，在胰腺导管腺癌中，KRAS的突变率高达97.7％，而Nras和Hras则全部为0；而在结直肠癌中，52.2％的Ras突变率中KRAS突变率高达44.7％。在对非小细胞肺癌的研究中发现，Ras突变多发生于密码子12上，最常见的是G12C点突变，其次是G12V和G12D(Yoon YK,et al,MolCarcinog 2010；49(4):353-62)。

KRAS基因的激活突变与人类恶性肿瘤的发生发展及肿瘤的复发密切相关。遗传和生物化学研究证明，KRAS依赖性信号传导在调节多种癌细胞生长、增殖、侵袭和转移中具有重要作用。在病人预后上,KRAS也被视为是一种标记物。在非小细胞肺癌患者中，KRAS突变患者相比KRAS野生型患者有更短的生存期，特别是含有G12C点突变的患者(Svaton M,etal,Anticancer Res,2016；36(3):1077-82)。因此，科学界一直致力于寻找能够与特定突变KRAS蛋白结合的小分子，并抑制KRAS蛋白的活化和功能，进而阻止其下游信号通路的转导，最终起到抑制肿瘤生长的作用。

2013年，霍华德·休斯医学研究所Shokat课题小组在Nature杂志上最先报道了KRAS G12C小分子抑制剂(Ostrem J M,et al,Nature,2013,503(7477):548-551)。这些抑制剂可以结合至KRAS蛋白分子开关Ⅱ区域下方的变构结合口袋，并与附近的Cys12形成共价结合，从而选择性抑制KRAS G12C的活化。基于上述研究，针对KRAS G12C分子开关Ⅱ区变构口袋，2016年Wellspring公司报道了一个新的KRAS G12C不可逆共价抑制剂ARS-853，可以将KRAS蛋白固定在非活性的GDP结合构象，并对多种KRAS G12C突变阳性的肿瘤细胞具有选择性抑制活性(Patricelli M P,et al,Cancer Discov,2016,6(3):316-329；Lito P,etal,Science,2016,351(6273):604-608)。

目前，已试图鉴定作为KRAS G12C共价抑制剂的杂环化合物包括苯并嘧啶酮类、吡啶并嘧啶酮类以及四氢吡啶并嘧啶类等(WO2017/201161、WO2018/119183、WO2018/217651、WO2018/206539、WO2018/143315、WO2017/087528、WO2020/081282、WO2020/178282)。上述化合物全部被描述为用于治疗肿瘤的KRAS抑制剂。鉴于庞大的肿瘤市场以及未被满足的市场需求，开发KRAS G12C抑制剂具有巨大的市场前景。

发明内容

本发明提供一种式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐：

其中，

R¹选自芳基或杂芳基，所述芳基或杂芳基被一个或多个氨基取代，所述芳基或杂芳基进一步任选被R^a取代；

每一个R^a独立地选自F、Cl、Br、I、CN、OH、NO₂或任选被R^b取代的以下基团：C₁-C₁₀烷基、C₃-C₁₀环烷基、3-10元杂环基、C₁-C₁₀烷氧基、C₃-C₁₀环烷基氧基、3-10元杂环基氧基；

R²、R³独立地选自H、F、Cl、Br、I、CN、OH、NO₂或任选被R^b取代的以下基团：NH₂、C₁-C₁₀烷基、C₃-C₁₀环烷基、3-10元杂环基、C₁-C₁₀烷氧基、C₃-C₁₀环烷基氧基、3-10元杂环基氧基、C₂-C₁₀烯基、C₂-C₁₀炔基；

R^4a、R^4b选自H，或者R^4a、R^4b共同形成＝O；

R⁵选自

Q选自C(＝O)、C(＝NR⁸)、NR⁹ C(＝O)、S(＝O)₂或NR⁹ S(＝O)₂；

R⁸、R⁹独立地选自H、C₁-C₁₀烷基、C₃-C₁₀环烷基、3-10元杂环基、C₆-C₁₀芳基或5-10元杂芳基；

当R⁵选自

时，R⁶、每一个R⁷各自独立地选自H、F、Cl、Br、I、CN、羧基或任选被R^c取代的以下基团：C₁-C₆烷基、C₃-C₁₀环烷基、3-10元杂环基，或者R⁶、R⁷和它们相连的碳原子共同形成部分饱和的C₅-C₁₀环烃基或5-10元杂环基，所述部分饱和的C₅-C₁₀环烃基或5-10元杂环基任选被R^c取代；

当R⁵选自

时，R⁷选自H或任选被R^c取代的以下基团：C₁-C₆烷基、C₃-C₁₀环烷基、3-10元杂环基；

每一个R^b、R^c独立地选自卤素、CN、OH、＝O或任选被R^d取代的下列基团：NH₂、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、3-6元杂环基、C₁-C₆烷氧基、C₃-C₆环烷基氧基或3-6元杂环基氧基；

每一个R^d独立选自卤素、OH、CN、＝O、NH₂、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基或3-6元杂环基。

在一些实施方案中，R¹选自苯基或5-10元杂芳基，所述苯基或5-10元杂芳基被一个或多个氨基取代，所述苯基或5-10元杂芳基进一步任选被R^a取代。

在一些实施方案中，R¹选自苯基、6元杂芳基或9元杂芳基，所述苯基、6元杂芳基或9元杂芳基被一个或多个氨基取代，所述苯基、6元杂芳基或9元杂芳基进一步任选被R^a取代。

在一些实施方案中，R¹选自苯基、吡啶基或苯并噻唑基，所述苯基、吡啶基或苯并噻唑基被一个或多个氨基取代，所述苯基、吡啶基或苯并噻唑基进一步任选被R^a取代。

在一些实施方案中，R¹选自苯基、

所述苯基、

被一个或多个氨基取代，所述苯基、

进一步任选被R^a取代。

在一些实施方案中，R^a选自F、Cl、Br、I、CN、OH、C₃-C₆环烷基或任选被卤素取代的C₁-C₃烷基。

在一些实施方案中，R^a选自F、Cl、Br、I或任选被F取代的C₁-C₃烷基。

在一些实施方案中，R^a选自F、Cl、甲基或三氟甲基。

在一些实施方案中，R¹选自

在一些实施方案中，R¹选自

在一些实施方案中，R²、R³独立地选自H、F、Cl、Br、I、CN、OH、NO₂或任选被R^b取代的以下基团：C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、3-6元杂环基、C₁-C₆烷氧基、C₃-C₆环烷基氧基、3-6元杂环基氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基。

在一些实施方案中，R²、R³独立地选自F、Cl、Br、I或任选被R^b取代的以下基团：C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆炔基。

在一些实施方案中，R²选自F、Cl、Br、I或任选被R^b取代的以下基团：环丙基、C₁-C₃烷氧基、C₂-C₃炔基。

在一些实施方案中，R³选自F、Cl、Br、I或任选被R^b取代的以下基团：C₁-C₃烷基、C₃-C₆环烷基。

在一些实施方案中，R^b选自卤素、CN、OH、＝O或C₁-C₆烷基。

在一些实施方案中，R^b选自卤素。

在一些实施方案中，R^b选自F。

在一些实施方案中，R²选自F、乙炔基、1-丙炔基、环丙基、三氟甲氧基或二氟甲氧基。

在一些实施方案中，R³选自F、Cl、Br、I、C₁-C₃烷基或C₃-C₆环烷基。

在一些实施方案中，R³选自Cl、F、甲基或环丙基。

在一些实施方案中，R⁵选自

在一些实施方案中，R⁵选自

在一些实施方案中，Q选自C(＝O)或S(＝O)₂。

在一些实施方案中，R⁶、R⁷各自独立地选自H、F、Cl、Br、I、CN或任选被R^c取代的以下基团：C₁-C₃烷基、C₃-C₆环烷基、3-6元杂环基。

在一些实施方案中，R^c选自卤素、CN、OH、＝O或C₁-C₆烷基。

在一些实施方案中，R⁶、每一个R⁷各自独立地选自H、F、Cl、Br、I、CN、C₁-C₃烷基。

在一些实施方案中，R⁶、每一个R⁷各自独立地选自H、F、Cl、Br、I。

在一些实施方案中，R⁶、每一个R⁷各自独立地选自H、F。

在一些实施方案中，两个R⁷中的至少一个选自H。

在一些实施方案中，两个R⁷中的其中一个选自H，另一个R⁷选自H、F、Cl、Br、I、CN或C₁-C₃烷基。

在一些实施方案中，R⁶、R⁷各自独立地选自H。

在一些实施方案中，R⁵选自

在一些实施方案中，所述式(I)所示的化合物或其药学可接受的盐，选自以下化合物或其药学可接受的盐：

本发明还提供药物组合物，其包含式(I)所示化合物或其药学可接受的盐和药学上可接受的辅料。

进一步，本发明涉及式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物在制备预防或者治疗KRAS G12C相关疾病的药物中的用途。

进一步，本发明涉及式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物在预防或者治疗KRAS G12C相关疾病中的用途。

进一步，本发明涉及预防或者治疗KRAS G12C相关疾病的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物。

本发明还涉及治疗KRAS G12C相关疾病的方法，该方法包括给以患者治疗上有效剂量的包含本发明所述的式(I)化合物或其药学上可接受的盐的药物制剂。

本发明的优选方案，其中所述的KRAS G12C相关疾病包括但不限于炎性疾病、自身免疫性疾病或癌症。术语定义和说明

除非另有说明，本发明说明书和权利要求书中记载的基团和术语定义，包括其作为实例的定义、示例性的定义、优选的定义、表格中记载的定义、实施例中具体化合物的定义等，可以彼此之间任意组合和结合。这样的组合和结合后的基团定义及化合物结构，应当属于本发明说明书记载的范围内。

术语“药学可接受的盐”是指药学上可接受的无毒酸或碱的盐，包括无机酸和碱、有机酸和碱的盐。

术语“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，包括顺反异构体、对映异构体和非对映异构体。

术语“对映异构体”是指互为实物与镜像而不可重叠的立体异构体，可以简称为对映体。

术语“外消旋体”是指一种具有旋光性的手性分子与其对映体的等摩尔混合物。

本发明的化合物可以具有不对称原子如碳原子、硫原子、氮原子、磷原子(光学中心)或不对称双键。外消旋体、对映异构体、非对映异构体、几何异构体都包括在本发明的范围之内。

本文中消旋体或者对映体纯的化合物的图示法来自Maehr，J.Chem.Ed.1985，62:114-120。除非另有说明，用楔形键和虚楔键

表示一个立体中心的绝对构型，用黑实键和虚键

表示脂环化合物的顺反构型。当本文所述化合物含有烯属双键或其它几何不对称中心，除非另有规定，它们包括E、Z几何异构体。同样地，所有的互变异构形式均包括在本发明的范围之内。

本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子、不对称硫原子、不对称氮原子或不对称磷原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。本申请的含有不对称原子的化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。

术语“互变异构体”是指因分子中某一原子在两个位置迅速移动而产生的官能团异构体。本发明化合物可表现出互变异构现象。互变异构的化合物可以存在两种或多种可相互转化的种类。互变异构体一般以平衡形式存在，尝试分离单一互变异构体时通常产生一种混合物，其理化性质与化合物的混合物是一致的。平衡的位置取决于分子内的化学特性。例如，在很多脂族醛和酮如乙醛中，酮型占优势；而在酚中，烯醇型占优势。本发明包含化合物的所有互变异构形式。

术语“药物组合物”表示一种或多种文本所述化合物或其生理学/药学上可接受的盐或前体药物与其它化学组分的混合物，其它组分例如生理学/药学上可接受的辅料。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。

术语“被取代”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为氧代(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代，氧代不会发生在芳香基上。

术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，乙基“任选”被卤素取代，指乙基可以是未被取代的(CH₂CH₃)、单取代的(如CH₂CH₂F)、多取代的(如CHFCH₂F、CH₂CHF₂等)或完全被取代的(CF₂CF₃)。本领域技术人员可理解，对于包含一个或多个取代基的任何基团，不会引入任何在空间上不可能存在和/或不能合成的取代或取代模式。

术语“卤”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘。

术语“C₅-C₁₀环烃基”应理解为饱和或部分饱和的非芳香族一价环烃基，其具有5、6、7、8、9或10个碳原子。

术语“C₁-C₁₀烷基”应理解为表示具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的直链或支链饱和一价烃基。所述烷基是例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1，2-二甲基丙基、新戊基、1，1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，1-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基或1，2-二甲基丁基等；优选地，“C₁-C₁₀烷基”可以包含“C₁-C₆烷基”或“C₁-C₃烷基”，“C₁-C₆烷基”应理解为表示具有1、2、3、4、5、6个碳原子的直链或支链饱和一价烃基，“C₁-C₃烷基”应理解为表示具有1、2、3个碳原子的直链或支链饱和一价烃基。

术语“C₁-C₁₀烷氧基”可理解为“C₁-C₁₀烷基氧基”或“C₁-C₁₀烷基-O-”，优选地，“C₁-C₁₀烷氧基”可以包含“C₁-C₆烷氧基”或“C₁-C₃烷氧基”。

术语“C₃-C₁₀环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，其具有3～10个碳原子。如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基或环癸基，或者是双环烃基如十氢化萘环。优选地，“C₃-C₁₀环烷基”可以包含“C₃-C₆环烷基”，术语“C₃-C₆环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，其具有3～6个碳原子。

术语“C₃-C₁₀环烷基氧基”可理解为“C₃-C₁₀环烷基-O-”，优选地，“C₃-C₁₀环烷基氧基”可以包含“C₃-C₆环烷基氧基”。

术语“3-10元杂环基”意指饱和的或部分饱和的一价单环、并环、螺环或桥环，其包含1-5个，优选1-3个选自N、O、B和S的杂原子。特别地，“3-10元杂环基”包括“5-10元杂环基”或“3-6元杂环基”，所述“3-10元杂环基”包括但不限于：4元环，如氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基；5元环，如四氢呋喃基、二氧杂环戊烯基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基、1,3,2-二氧杂硼戊烷基；或6元环，如四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、二噻烷基、硫代吗啉基、哌嗪基或三噻烷基；或部分饱和的6元环如四氢吡啶基。任选地，所述杂环基可以是苯并稠合的。所述杂环基可以是双环的，例如但不限于5,5元环，如六氢环戊并[c]吡咯-2(1H)-基环，或者5,6元双环，如六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-2(1H)-基环。含氮原子的环可以是部分不饱和的，即它可以包含一个或多个双键，例如但不限于2,5-二氢-1H-吡咯基、4H-[1,3,4]噻二嗪基、4,5-二氢噁唑基或4H-[1,4]噻嗪基，或者，它可以是苯并稠合的，例如但不限于二氢异喹啉基。任选地，所述3-10元杂环基可以是“3-10元杂环烷基”，意指饱和的含1-5个杂原子的一价单环、并环、螺环或桥环；优选地，“3-10元杂环烷基”包括3-6元杂环烷基，也包括5-6元杂环烷基等。

术语“3-10元杂环基氧基”可理解为“3-10元杂环基-O-”。优选地，“3-10元杂环基氧基”包括“3-6元杂环基氧基”。

术语“芳基”指环状芳族烃基。在一些方案中，所述芳基具有6至20个碳原子(C₆-C₂₀)。在另一些方案中，所述芳基包括C₆-C₁₀芳基。在另一些方案中，所述芳基是C₆芳基。“芳基”还包括芳族环与非芳族环或部分饱和的环稠合的二环基团。示例性的芳基包括但不限于，苯基、萘基、蒽基、茚基、茚满基、1，2-二氢萘基和1，2，3，4-四氢萘基。

术语“C₆-C₁₀芳基”应理解为优选表示具有6～10个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环。特别是具有6个碳原子的环(“C₆芳基”)，例如苯基；或者具有9个碳原子的环(“C₉芳基”)，例如茚满基或茚基，或者具有10个碳原子的环(“C₁₀芳基”)，例如四氢化萘基、二氢萘基或萘基。

术语“杂芳基”指一价单环、双环或三环芳族环系，其具有5～20个环原子且包含1-8个独立选自N、O和S的杂原子。杂芳基选自噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基等以及它们的苯并衍生物，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基等；或吡啶基、哌嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基等，以及它们的苯并衍生物，例如喹啉基、喹唑啉基、异喹啉基等。

术语“5-10元杂芳基”应理解为包括这样的一价单环、双环或三环芳族环系，其具有5～10个环原子且包含1-5个独立选自N、O和S的杂原子。“6元杂芳基”是指具有6个环原子，且其包含1-4个，优选1-3个独立选自N、O和S的杂原子。“9元杂芳基”是指具有9个环原子，且其包含1-6个，优选1-3个独立选自N、O和S的杂原子。

术语“C₂-C₁₀烯基”应理解为直链或支链的一价烃基，其包含一个或多个双键并且具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。所述烯基可分为“顺式”和“反式”取向(或者″E″和″Z″取向)。“C₂-C₆烯基”应理解为直链或支链的一价烃基，其包含一个或多个双键并且具有2、3、4、5或6个碳原子。“C₂-C₁₀烯基”的实例包括但不限于乙烯基(-CH＝CH₂)、丙-1-烯基(-CH＝CHCH₃)、丙-2-烯基(-CH₂CH＝CH₂)、2-甲基丙-1-烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、丁-1，3-二烯基、2-甲基-1，3-丁二烯基、己-1-烯基、己-2-烯基、己-3-烯基或己-4-烯基。

术语“C₂-C₁₀炔基”应理解为直链或支链的一价烃基，其包含一个或多个三键并且具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。“C₂-C₆炔基”应理解直链或支链的一价烃基，其包含一个或多个三键且具有2、3、4、5或6个碳原子。“C₂-C₁₀炔基”的实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)、丙-1-炔基(1-丙炔基、-C≡CCH₃)、丙-2-炔基(炔丙基)、丁-1-炔基、丁-2-炔基或丁-3-炔基。“C₂-C₃炔基”实例包括乙炔基(-C≡CH)、丙-1-炔基(1-丙炔基、-C≡CCH₃)、丙-2-炔基(炔丙基)。

特别地，术语“治疗”意为将本申请所述化合物或制剂进行给药以预防、改善或消除疾病或与所述疾病相关的一个或多个症状，且包括：

(i)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中出现，特别是当这类哺乳动物易患有该疾病状态，但尚未被诊断为已患有该疾病状态时；

(ii)抑制疾病或疾病状态，即遏制其发展；

(iii)缓解疾病或疾病状态，即使该疾病或疾病状态消退。

术语“治疗有效量”意指(i)治疗或预防特定疾病、病况或障碍，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文中所述的特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状发作的本发明化合物的用量。构成“治疗有效量”的本发明化合物的量取决于该化合物、疾病状态及其严重性、给药方式以及待被治疗的哺乳动物的年龄而改变，但可例行性地由本领域技术人员根据其自身的知识及本公开内容而确定。

术语“辅料”是指可药用惰性成分。术语“赋形剂”的种类实例非限制性地包括粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、填充剂和稀释剂等。赋形剂能增强药物制剂的操作特性，即通过增加流动性和/或粘着性使制剂更适于直接压缩。适用于上述制剂的典型的“药学上可接受的载体”的实例为：糖类，淀粉类，纤维素及其衍生物等在药物制剂中常用到的辅料。

术语“药学上可接受的辅料”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些辅料。合适的辅料是本领域技术人员熟知的，例如碳水化合物、蜡、水溶性和/或水可膨胀的聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水等。

词语“包括(comprise)”、“含有(comprise)”或“包含(comprise)”及其英文变体例如comprises或comprising应理解为开放的、非排他性的意义，即“包括但不限于”。

本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。

本申请还包括与本文中记载的那些相同的，但一个或多个原子被原子量或质量数不同于自然中通常发现的原子量或质量数的原子置换的同位素标记的本申请化合物。可结合到本申请化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如分别为²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F、¹²³I、¹²⁵I和³⁶Cl等。

某些同位素标记的本申请化合物(例如用³H及¹⁴C标记的那些)可用于化合物和/或底物组织分布分析中。氚化(即³H)和碳-14(即¹⁴C)同位素对于由于它们易于制备和可检测性是尤其优选的。正电子发射同位素，诸如¹⁵O、¹³N、¹¹C和¹⁸F可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以测定底物占有率。通常可以通过与公开于下文的方案和/或实施例中的那些类似的下列程序，通过同位素标记试剂取代未经同位素标记的试剂来制备同位素标记的本申请化合物。

此外，用较重同位素(诸如氘(即²H))取代可以提供某些由更高的代谢稳定性产生的治疗优点(例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求)，并且因此在某些情形下可能是优选的，其中氘取代可以是部分或完全的，部分氘取代是指至少一个氢被至少一个氘取代。

本申请的药物组合物可通过将本申请的化合物与适宜的药学上可接受的辅料组合而制备，例如可配制成固态、半固态、液态或气态制剂，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、悬浮剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球及气溶胶等。

给予本申请化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物的典型途径包括但不限于口服、直肠、局部、吸入、肠胃外、舌下、阴道内、鼻内、眼内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内给药。

本申请的药物组合物可以采用本领域众所周知的方法制造，如常规的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣药丸法、磨细法、乳化法、冷冻干燥法等。

在一些实施方案中，药物组合物是口服形式。对于口服给药，可以通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的辅料混合，来配制该药物组合物。这些辅料能使本申请的化合物被配制成片剂、丸剂、锭剂、糖衣剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、浆剂、悬浮剂等，用于对患者的口服给药。

可以通过常规的混合、填充或压片方法来制备固体口服组合物。例如，可通过下述方法获得：将所述的活性化合物与固体辅料混合，任选地碾磨所得的混合物，如果需要则加入其它合适的辅料，然后将该混合物加工成颗粒，得到了片剂或糖衣剂的核心。适合的辅料包括但不限于：粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、甜味剂或矫味剂等。

药物组合物还可适用于肠胃外给药，如合适的单位剂型的无菌溶液剂、混悬剂或冻干产品。

本文所述的通式Ⅰ化合物的所有施用方法中，每天给药的剂量为0.01到100mg/kg体重，优选为0.05到50mg/kg体重，更优选0.1到30mg/kg体重，以单独或分开剂量的形式。

本发明具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本发明的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本发明的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。

具体实施方式

以下实施例详细说明发明的技术方案，但本发明的保护范围包括但不限于此。

化合物的结构是通过核磁共振(NMR)和/或质谱(MS)来确定的。NMR位移的单位为10^-6(ppm)。NMR测定的溶剂为氘代二甲基亚砜、氘代氯仿、氘代甲醇等，内标为四甲基硅烷(TMS)；“IC₅₀”指半数抑制浓度，指达到最大抑制效果一半时的浓度。

实施例1

1-(9-(2-氨基-7-氟苯并[d]噻唑-4-基)-10-氯-8-氟-3,4,12,12a-四氢-6H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-2(1H)-基)丙-2-烯-1-酮(化合物1)

步骤1:9-(2-((叔丁氧羰基)氨基)-7-氟苯并[d]噻唑-4-基)-10-氯-8-氟-3,4,12,12a-四氢-6H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-2(1H)-甲酸叔丁酯(中间体1-3)的合成

将起始原料1-1(500mg,1.15mmol)和起始原料1-2(465.63mg,1.49mmol)溶于1,4-二氧六环和水中，加入RuPhos(53.55mg,114.75μmol),RuPhos Pd G3(95.98mg,114.75μmol)和碳酸钾(317.20mg,2.30mmol)。反应液于氮气保护下，100℃搅拌反应15小时。LC-MS监测目标产物形成。将反应液用乙酸乙酯萃取三次，饱和食盐水洗有机层，有机层减压浓缩至干，残余物柱层析纯化(二氧化硅,石油醚/四氢呋喃＝3/1)，得标题化合物(230mg)。

MS m/z(ESI):＝623.5[M+H]⁺。

步骤2:4-(10-氯-8-氟-1,2,3,4,12,12a-六氢-6H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)-7-氟苯并[d]噻唑-2-胺(中间体1-4)的合成

将中间体1-3(200mg,320.97μmol)溶于二氯甲烷中。在0℃下向反应液中加入三氟乙酸(3.08g,27.01mmol)，将反应液升至25℃，搅拌反应2小时。LC-MS监测原料已经全部反应完全，目标产物形成。反应液用饱和碳酸氢钠水溶液调pH值至8～9。二氯甲烷萃取三次，有机层减压浓缩至干，得标题化合物粗品(130mg)，不经纯化，直接用于下步反应。

MS m/z(ESI):＝423.0[M+H]⁺。

步骤3:1-(9-(2-氨基-7-氟苯并[d]噻唑-4-基)-10-氯-8-氟-3,4,12,12a-四氢-6H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-2(1H)-基)丙-2-烯-1-酮(化合物1)的合成

将中间体1-4(120mg,283.77μmol)溶于四氢呋喃和水中，加入磷酸钾(150.59mg,709.42μmol)。在0℃下，向反应液中加入丙烯酰氯(28.25mg,312.15μmol)的四氢呋喃溶液。反应液于氮气保护下，25℃搅拌反应1小时。LC-MS监测原料已经全部反应完全，目标产物形成。反应液用乙酸乙酯萃取三次，有机层减压浓缩至干，制备薄层色谱纯化(二氧化硅,石油醚/乙酸乙酯＝2/1)，得到两对外消旋体(结构中含有一个手性碳及一个手性轴，即存在四个异构体)；一对外消旋体(薄层色谱Rf值:0.54)依次经超临界流体色谱法纯化(柱子:DAICEL CHIRALPAK AD-H(250mm*30mm,5um)；流动相:[A：二氧化碳，B:含0.1％氨水的乙醇溶液]；B％：35％-35％)和高效液相色谱法纯化(柱子:YMC-Actus Triart C18 150*30mm*5um；流动相：[A:水(0.05％氨水v/v),B:乙腈]；B％:37％-57％，11分钟)，得化合物1异构体1(11.6mg,对映体过量值98.4％，RT:1.979min),得化合物1异构体2(5.5mg,对映体过量值99.6％，RT:1.795min)；另一对外消旋体(薄层色谱Rf值:0.40)依次经超临界流体色谱法纯化(柱子：DAICEL CHIRALCEL OJ-H(250mm*30mm,5um)；流动相:[A：二氧化碳，B:含0.1％氨水的乙醇溶液]；B％:35％-35％)和高效液相色谱法纯化(柱子:YMC-Actus TriartC18150*30mm*5um；流动相：[A:水(0.05％氨水v/v),B:乙腈]；B％:42％-62％,11min)，得化合物1异构体3(4.6mg，对映体过量值98.9％，RT:3.528min)；得化合物1异构体4(4.2mg,对映体过量值73.3％，RT:3.895min)。

化合物1异构体1 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.20-7.05(m,2H),6.96(t,J＝8.9Hz,1H),6.87-6.71(m,1H),6.25(d,J＝16.9Hz,1H),5.79(d,J＝10.4Hz,1H),4.43-4.31(m,1H),4.23-3.98(m,2H),3.96-3.84(m,1H),3.80-3.74(m,1H),3.73-3.63(m,1H),3.63-3.46(m,1H),3.25-3.07(m,1H),3.05-2.90(m,2H),2.62-2.47(m,1H).

MS m/z(ESI):＝477.1[M+H]⁺

化合物1异构体2 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.20-7.07(m,2H),6.96(t,J＝8.9Hz,1H),6.88-6.68(m,1H),6.25(d,J＝17.0Hz,1H),5.79(d,J＝10.3Hz,1H),4.45-4.31(m,1H),4.23-4.00(m,2H),3.93-3.85(m,1H),3.80-3.74(m,1H),3.73-3.65(m,1H),3.63-3.45(m,1H),3.26-3.08(m,1H),3.05-2.90(m,2H),2.65-2.44(m,1H)

MS m/z(ESI):＝477.1[M+H]⁺

化合物1异构体3 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.14-7.10(m,2H),6.95(t,J＝8.9Hz,1H),6.86-6.71(m,1H),6.24(d,J＝16.6Hz,1H),5.78(d,J＝10.6Hz,1H),4.40-4.26(m,1H),4.18-4.04(m,1H),4.00-3.73(m,4H),3.72-3.46(m,1H),3.44-3.34(m,1H),3.18-2.88(m,2H),2.64-2.45(m,1H)

MS m/z(ESI):＝477.1[M+H]⁺

化合物1异构体4 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.14-7.10(m,2H),6.95(t,J＝8.8Hz,1H),6.88-6.71(m,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),5.78(d,J＝10.5Hz,1H),4.39-4.26(m,1H),4.19-4.04(m,1H),4.01-3.73(m,4H),3.72-3.46(m,1H),3.44-3.35(m,1H),3.19-2.88(m,2H),2.64-2.45(m,1H)

MS m/z(ESI):＝477.1[M+H]⁺

实施例2、1-(9-(2-氨基苯并[d]噻唑-4-基)-10-氯-8-氟-3,4,12,12a-四氢-6H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-2(1H)-基)丙-2-烯-1-酮(化合物2)

步骤1:9-(2-((叔丁氧羰基)氨基)苯并[d]噻唑-4-基)-10-氯-8-氟-3,4,12,12a-四氢-6H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-2(1H)-甲酸叔丁酯(中间体2-2)的合成

将起始原料1-1(296.27mg,679.96μmol)和起始原料2-1(200mg,679.96μmol，可根据专利WO 2020081282第29页报道方法合成)溶于1,4-二氧六环和水中，加入RuPhos(31.73mg,68.00μmol),RuPhos Pd G3(56.87mg,68.00μmol)和碳酸钾(187.96mg,1.36mmol)。反应液于氮气保护下，80℃搅拌反应15小时。LC-MS监测目标产物形成。将反应液用乙酸乙酯萃取三次，饱和食盐水洗有机层，有机层减压浓缩至干，残余物用柱层析纯化(二氧化硅,石油醚/乙酸乙酯＝5/1到3/1)，得标题化合物(250mg)。

MS m/z(ESI):＝605.4[M+H]⁺。

步骤2:4-(10-氯-8-氟-1,2,3,4,12,12a-六氢-6H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)苯并[d]噻唑-2-胺(中间体2-3)的合成

将中间体2-2(280mg,462.72μmol)溶于二氯甲烷中，降温至0℃。在0℃下向反应液中加入三氟乙酸(7.70g,67.53mmol)，将反应液升至25℃，搅拌反应2小时。LC-MS监测原料已经全部反应完全，目标产物形成。反应液用饱和碳酸氢钠水溶液调pH值至8～9。乙酸乙酯萃取三次，有机层减压浓缩至干，得标题化合物粗品(160mg)，直接用于下步反应。

MS m/z(ESI):＝405.0[M+H]⁺。

步骤3:1-(9-(2-氨基苯并[d]噻唑-4-基)-10-氯-8-氟-3,4,12,12a-四氢-6H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-2(1H)-基)丙-2-烯-1-酮(化合物2)的合成

将中间体2-3(160mg,395.17μmol)溶于四氢呋喃和水中，加入磷酸钾(209.71mg,987.93μmol)，降温至0℃。在0℃下，向反应液中加入丙烯酰氯(39.34mg,434.69μmol)的四氢呋喃溶液。反应液于氮气保护下，25℃搅拌反应1h。LC-MS监测原料已经全部反应完全，目标产物形成。反应液用乙酸乙酯萃取三次，有机层减压浓缩至干，制备薄层色谱纯化(二氧化硅,乙酸乙酯/甲醇＝50/1)，得到两对外消旋体(结构中含有一个手性碳及一个手性轴，即存在四个异构体)；一对外消旋体(薄层色谱Rf值:0.47)经超临界流体色谱法纯化(柱子:DAICEL CHIRALCEL OD-H(250mm*30mm,5um)；流动相:[A：二氧化碳，B:含0.1％氨水的乙醇溶液]；B％:60％-60％)，得化合物2异构体1(19.2mg,对映体过量>99.9％，RT:1.419min),得化合物2异构体2(19.3mg,对映体过量>99.9％，RT:3.709min)；另一对外消旋体(薄层色谱Rf值:0.40)依次经超临界流体色谱法纯化(柱子：DAICEL CHIRALPAK AD(250mm*30mm,10um)；流动相:[A：二氧化碳，B:含0.1％氨水的乙醇溶液]；B％:45％-45％)和高效液相色谱法纯化(柱子:YMC-Actus Triart C18 150*30mm*5um；流动相:[A：水(0.05％氨水v/v)，B：乙腈]；B％:38％-58％,11分钟)，得化合物2异构体3(8mg,对映体过量99.9％，RT:2.608min)；得化合物2异构体4(9.8mg,对映体过量99.9％，RT:4.842min)。

化合物2异构体1 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.68(dd,J＝1.5,7.6Hz,1H),7.21-7.15(m,1H),7.14-7.08(m,2H),6.88-6.72(m,1H),6.27-6.22(m,1H),5.82-5.75(m,1H),4.44-4.31(m,1H),4.23-3.99(m,2H),3.94-3.91(m,1H),3.80-3.75(m,1H),3.73-3.65(m,1H),3.62-3.47(m,1H),3.24-3.07(m,1H),3.05-2.91(m,2H),2.64-2.47(m,1H)

MS m/z(ESI):＝459.1[M+H]⁺

化合物2异构体2 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.68(dd,J＝1.3,7.7Hz,1H),7.20-7.15(m,1H),7.15-7.09(m,2H),6.87-6.73(m,1H),6.27-6.22(m,1H),5.82-5.75(m,1H),4.44-4.31(m,1H),4.23-4.01(m,2H),3.94-3.91(m,1H),3.80-3.75(m,1H),3.74-3.66(m,1H),3.64-3.47(m,1H),3.22-3.08(m,1H),3.05-2.91(m,2H),2.64-2.48(m,1H)

MS m/z(ESI):＝459.2[M+H]⁺

化合物2异构体3 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.68(dd,J＝1.3,7.8Hz,1H),7.20-7.14(m,1H),7.13-7.04(m,2H),6.87-6.72(m,1H),6.24(d,J＝15.6Hz,1H),5.79-5.75(m,1H),4.40-4.26(m,1H),4.20-4.05(m,1H),3.98-3.74(m,4H),3.73-3.50(m,1H),3.48-3.35(m,1H),3.19-3.03(m,1H),2.98-2.92(m,1H),2.59-2.55(m,1H)

MS m/z(ESI):＝459.2[M+H]⁺

化合物2异构体4 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.68(dd,J＝1.3,7.8Hz,1H),7.22-7.14(m,1H),7.12-7.05(m,2H),6.87-6.69(m,1H),6.24(d,J＝15.6Hz,1H),5.79-5.75(m,1H),4.41-4.24(m,1H),4.20-4.04(m,1H),4.00-3.74(m,4H),3.73-3.48(m,1H),3.48-3.35(m,1H),3.18-3.02(m,1H),2.98-2.92(m,1H),2.59-2.55(m,1H)

MS m/z(ESI):＝459.2[M+H]⁺

实施例3、1-(9-(2-氨基-7-氟苯并[d]噻唑-4-基)-10-氯-8-(丙-1-炔-1-基)-3,4,12,12a-四氢-6H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-2(1H)-基)丙-2-烯-1-酮(化合物6)

步骤1:9-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-7-氟苯并[d]噻唑-4-基)-10-氯-8-(丙-1-炔-1-基)-3,4,12,12a-四氢-6H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-2(1H)-甲酸叔丁酯(中间体6-3)的合成

将中间体6-1(300mg,658.22μmol,可根据专利WO 2020178282报道方法合成)和中间体6-2(225.99mg,724.05μmol)溶于二氧六环(6mL)和水(1.5mL)，加入碳酸钾(272.91mg,1.97mmol),在氮气氛围下,加入(2-二环己基膦基-2,6-二异丙氧基-1,1-联苯基)(2-氨基-1,1-联苯-2-基)钯(II)甲磺酸盐(RuPhos Pd G3)(55.05mg,65.82μmol)和RuPhos(30.72mg,65.82μmol)，反应升温至90℃搅拌3小时。反应完毕，降温至25℃,加水(5mL),乙酸乙酯(5mL)萃取2次,合并有机相。有机相经减压浓缩(0.01MPa)除去溶剂。残留物经柱层析纯化(

4g

快速硅胶柱,洗脱剂10-35％乙酸乙酯/石油醚(即乙酸乙酯和石油醚的体积比是10:90～35:65)梯度，18mL/min).得标题化合物(240mg)。

MS m/z(ESI):＝665[M+Na]⁺

步骤2:4-(10-氯-8-(丙-1-炔-1-基)-1,2,3,4,12,12a-六氢-6H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)-7-氟苯并[d]噻唑-2-胺(中间体6-4)的合成

将中间体6-3(240mg,373.15μmol)溶于盐酸二氧六环溶液(4M,2.00mL),反应在25℃搅拌1小时。反应完毕，经减压浓缩(0.01MPa)除去溶剂，得标题化合物粗品(195.7mg)。.

MS m/z(ESI):＝442.8[M+H]⁺

步骤3:1-(9-(2-氨基-7-氟苯并[d]噻唑-4-基)-10-氯-8-(丙-1-炔-1-基)-3,4,12,12a-四氢-6H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-2(1H)-基)丙-2-烯-1-酮(化合物6)的合成

将中间体6-4(195mg,440.24μmol)溶于四氢呋喃(4mL)和水(1mL),降温至0℃，加入磷酸钾(351.73mg,1.32mmol)，搅拌5分钟,加入丙烯酰氯(41.84mg,462.25μmol)四氢呋喃(558uL)溶液，在0℃搅拌1小时。反应完毕乙酸乙酯(5mL)萃取两次,合并有机相,有机相经减压浓缩(0.01MPa)除去溶剂。残留物经制备HPLC纯化(甲酸条件,柱子:YMC-ActusTriart C18 150*30mm*5um；流动相:[A:水(0.225％甲酸)，B:乙腈]；B％:35％-55％,11分钟).得到两对外消旋体的混合物(结构中含有一个手性碳及一个手性轴，即存在四个异构体)。

四个异构体的混合物经过超临界流体色谱法纯化(柱子:DAICEL CHIRALCEL OD-H(250mm*30mm,5um)；流动相:[A：二氧化碳，B:含0.1％氨水的乙醇溶液]；B％:55％-55％)得化合物6异构体1和异构体2的混合物以及化合物6异构体3(4.1mg,对映体过量值92.38％，RT:1.801min)，化合物6异构体4(4.0mg,对映体过量值100％，RT:1.738min)；

化合物6异构体1和异构体2的混合物通过超临界流体色谱法纯化(柱子:DAICELCHIRALCEL OD-H(250mm*30mm,5um)；流动相:[A：二氧化碳，B:含0.1％氨水的乙醇溶液；B％:55％-55％)和超临界流体色谱法纯化(柱子:DAICEL CHIRALPAK AD(250mm*30mm,10um)；流动相:[A：二氧化碳，B:含0.1％氨水的异丙醇溶液]；B％:50％-50％)。得化合物6异构体1(2.2mg,对映体过量值100％，RT:1.952min),得化合物6异构体2(2.5mg,对映体过量值99.7％，RT:1.866min)；

MS m/z(ESI):＝497.2[M+H]⁺

化合物6异构体1 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.30(s,1H),7.06(dd,J＝5.6,8.4Hz,1H),6.98-6.88(m,1H),6.78(s,1H),6.25(d,J＝17.3Hz,1H),5.78(d,J＝9.3Hz,1H),4.41-4.28(m,1H),4.15-4.11(m,1H),4.11-4.00(m,1H),3.99-3.91(m,1H),3.90-3.81(m,2H),3.80-3.72(m,1H),3.71-3.57(m,1H),3.20-2.87(m,2H),2.54-2.40(m,1H),1.72(s,3H)

化合物6异构体2 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.28(s,1H),7.04(dd,J＝5.6,8.4Hz,1H),6.95-6.86(m,1H),6.84-6.66(m,1H),6.22(d,J＝16.8Hz,1H),5.76(d,J＝11.0Hz,1H),4.40-4.27(m,1H),4.13-3.97(m,2H),3.88-3.63(m,4H),3.54-3.41(m,1H),3.12-2.87(m,2H),2.50-2.40(m,1H),1.70(s,3H)

化合物6异构体3 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.33(s,1H),7.15-7.03(m,1H),6.98-6.88(m,1H),6.78(dd,J＝10.8,16.3Hz,1H),6.24(d,J＝17.0Hz,1H),5.78(d,J＝10.0Hz,1H),4.50-4.32(m,1H),4.27-4.05(m,1H),4.04-3.88(m,2H),3.81-3.64(m,2H),3.61-3.41(m,1H),3.31-3.07(m,1H),3.04-2.82(m,2H),2.64-2.44(m,1H),1.70(s,3H)

化合物6异构体4 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.31(s,1H),7.07(dd,J＝5.6,8.4Hz,1H),6.91(t,J＝8.9Hz,1H),6.84-6.68(m,1H),6.22(d,J＝16.6Hz,1H),5.77(d,J＝10.5Hz,1H),4.43-4.28(m,1H),4.25-4.03(m,1H),4.02-3.83(m,2H),3.78-3.62(m,2H),3.58-3.46(m,1H),3.27-3.09(m,1H),3.09-2.80(m,2H),2.63-2.43(m,1H),1.71(s,3H)

实施例4、1-(9-(6-氨基-4-甲基-3-(三氟甲基)吡啶-2-基)-10-氯-8-(丙-1-炔-1-基)-3,4,12,12a-四氢-1H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-2(1H)-基)丙-2-烯-1-酮(化合物7)

步骤1:10-氯-8-(丙-1-炔-1-基)-9-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼戊环-2-基)-3,4,12,12a-四氢-1H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-2(1H)-甲酸叔丁酯(中间体7-1)的合成

将反应物6-1(440mg,965.39μmol)溶于四氢呋喃中，在-78℃下加入正丁基锂(2.5M,579.24μL 1.45mmol),反应液在-78℃下搅拌反应30分钟后，向其中滴加2-异丙氧基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧环戊硼烷(359.23mg,1.93mmol)，反应液在-78℃下搅拌反应30分钟。LC-MS监测原料已经全部反应完全。在-10℃向反应液中加入饱和氯化铵水溶液,反应液用乙酸乙酯萃取三次，有机层减压浓缩至干，残余物经薄层色谱纯化(二氧化硅,石油醚/乙酸乙酯＝2/1)，得标题化合物(80mg)。

MS m/z(ESI):＝502.9[M+H]⁺。

步骤2:9-(6-(二(4-甲氧苄基)氨基)-4-甲基-3-(三氟甲基)吡啶-2-基)-10-氯-8-(丙-1-炔-1-基)-3,4,12,12a-四氢-1H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-2(1H)-甲酸叔丁酯(中间体7-3)的合成

将中间体7-1(120mg,238.65μmol)，中间体7-2(120mg,238.65μmol)溶于二氧六环/水中，加入碳酸钾(98.95mg,715.94μmol)，二环己基(2,6-二异丙氧基-[1,1-二联苯]-2-基)膦(Ruphos)(11.14mg,23.86μmol)，(2-二环己基膦-2,6-二异丙氧基-1,1-联苯基)(2-氨基-1,1-联苯-2-基)钯(II)甲磺酸盐(RuPhos Pd G3)(19.96mg,23.86μmol)。反应液于氮气保护下在100℃搅拌反应3小时。LC-MS监测原料已经全部反应完全。反应液用乙酸乙酯萃取三次，有机层减压浓缩至干，残余物经薄层色谱纯化(二氧化硅,石油醚/乙酸乙酯＝2/1)，得标题化合物粗品(110mg)。

MS m/z(ESI):＝791.3[M+H]⁺。

步骤3:6-(10-氯-8-(丙-1-炔-1-基)-1,2,3,4,12,12a-六氢-6H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-9-基)-4-甲基-5-(三氟甲基)吡啶-2-胺(中间体7-4)的合成

将中间体7-3(110mg,139.01μmol)溶于三氟乙酸中，反应液于50℃搅拌反应12小时。LC-MS监测原料已经全部反应完全，目标产物形成。将反应液减压浓缩至干，得标题化合物粗品(62mg)。

MS m/z(ESI):＝451.1[M+H]⁺

步骤4:1-(9-(6-氨基-4-甲基-3-(三氟甲基)吡啶-2-基)-10-氯-8-(丙-1-炔-1-基)-3,4,12,12a-四氢-6H-苯并[f]吡嗪并[2,1-c][1,4]氧氮杂卓-2(1H)-基)丙-2-烯-1-酮(化合物7)的合成

将中间体7-4(62mg,137.51μmol)溶于四氢呋喃中，加入三乙胺(27.83mg,275.02μmol)。在0℃下，向反应液中滴加丙烯酰氯(12.45mg,137.51μmol)。滴毕，反应液于0℃搅拌反应20分钟。LC-MS监测原料已经全部反应完全，目标产物形成。反应液减压浓缩至干，残余物经薄层色谱(二氧化硅，二氯甲烷/甲醇＝10/1)纯化，得到两对外消旋体(结构中含有一个手性碳及一个手性轴，即存在四个异构体)。一对外消旋体(薄层色谱Rf值:0.77,二氯甲烷：甲醇＝10:1)经超临界流体色谱法(柱子:DAICEL CHIRALPAK IC(250mm*30mm,10um)；流动相:[A：二氧化碳，B:含0.1％氨水的乙醇溶液]；B％:45％-45％)拆分后再经高效液相色谱(柱子：YMC-Actus Triart C18 150*30mm*5um；流动相:[A:水(0.05％氨水v/v)，B:乙腈]；B％:40％-60％,11分钟)纯化得化合物7异构体1(2.1mg,对映体过量值100％，RT:3.709min)；化合物7异构体2(1.5mg,对映体过量值100％，RT:4.575min)。另一对外消旋体(薄层色谱Rf值:0.66,二氯甲烷：甲醇＝10:1)经超临界流体色谱法纯化(柱子:DAICELCHIRALPAK IC(250mm*30mm,10um)；流动相:[A：二氧化碳，B:含0.1％氨水的乙醇溶液]；B％:35％-35％)后得化合物7异构体3(6.7mg,对映体过量值99.92％，RT:4.424min)，化合物7异构体4(7.0mg,对映体过量值98.77％，RT:5.028min)。

MS m/z(ESI):＝505.1[M+H]⁺

化合物7异构体1 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.29(s,1H),6.89-6.73(m,1H),6.55(s,1H),6.25(d,J＝17.9Hz,1H),5.79(d,J＝10.1Hz,1H),4.48-4.36(m,1H),4.31-4.12(m,1H),4.00-3.90(m,2H),3.77-3.64(m,2H),3.55-3.45(m,0.5H),3.25-3.15(m,0.5H),3.02-2.84(m,3H),2.60-2.50(m,1H),2.44(s,3H),1.80(s,3H)

化合物7异构体2 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.29(s,1H),6.91-6.72(m,1H),6.55(s,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),5.79(d,J＝10.8Hz,1H),4.50-4.42(m,1H),4.32-4.13(m,1H),4.00-3.95(m,2H),3.77-3.64(m,2H),3.51-3.49(m,0.5H),3.20-3.11(m,0.5H),3.05-2.83(m,3H),2.60-2.50(m,1H),2.44(s,3H),1.80(s,3H)

化合物7异构体3 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.28(s,1H),6.89-6.72(m,1H),6.55(s,1H),6.24(d,J＝16.9Hz,1H),5.78(d,J＝10.6Hz,1H),4.44-4.31(m,1H),4.10-4.06(m,1H),4.02-3.80(m,2H),3.78-3.68(m,2H),3.67-3.63(m,0.5H),3.62-3.56(m,0.5H),3.27-2.84(m,3H),2.60-2.50(m,1H),2.44(s,3H),1.80(s,3H).

化合物7异构体4 ¹H NMR(400MHz,METHANOL-d₄)δ7.16(s,1H),6.75-6.60(m,1H),6.43(s,1H),6.12(d,J＝17.0Hz,1H),5.66(d,J＝10.9Hz,1H),4.33-4.18(m,1H),4.10-3.90(m,1H),3.89-3.72(m,2H),3.66-3.57(m,2H),3.53-3.50(m,0.5H),3.15-3.11(m,0.5H),3.05-2.70(m,3H),2.50-2.42(m,1H),2.31(s,3H),1.68(s,3H).

试验例、人非小细胞肺癌H358细胞增殖抑制试验

试验原理简介:

KRAS突变是多种肿瘤细胞异常增殖的驱动因子，其中KRAS-G12C突变在非小细胞肺癌和胰腺癌发生较高。体外以携带KRAS-G12C突变的人非小细胞肺癌H358为细胞模型，检测KRAS-G12C抑制剂对细胞增殖的抑制活性。实验方法参考文献:Janes MR et al,Targeting KRAS Mutant Cancers with a Covalent G12C-Specific Inhibitor,Cell2018Jan 25；172(3):578-589。

实验材料和仪器:

NCI-H358细胞购自ATCC(USA)。

384孔板购自Corning(USA)。

RPMI-1640培养基购自Gibco(USA)。

DMEM培养基购自Gibco(USA))

FBS购自Gibco(USA)。

马血清(horse serum)购自Gibco(USA)。

Penicillin-streptomycin购自Invitrogen(USA)。

1640完全培养基:RPMI1640培养基+10％FBS+1％Penicillin-streptomycin。

DMEM完全培养基：DMEM+10％FBS+2.5％马血清+1％Penicillin-streptomycin。

Celltiter Glo assay kit(2D-CTG试剂)购自Promega(USA)。

Echo 550Liquid Handler(Labcyte,USA)。

读板仪器:Envision(PerkinElmer,USA)。

实验方法:

第一天收集H358细胞，计数，调整细胞密度，将细胞悬液以40μL接种至384孔板中(含800个细胞/孔)，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。第二天，化合物稀释和细胞处理。将化合物母液10mM,用DMSO稀释至200*终浓度(比如化合物终浓度是1μM，先将10mM稀释到200μM，取2μL到98μL DMSO中，混匀后取40μL200μM到source板中)，采用ECHO550梯度稀释程序，将化合物以梯度浓度变化加入到第一天接种的细胞培养板内(200nL/孔，各浓度待测化合物)。将细胞培养板置于37℃，5％CO₂培养箱内继续培养3天。第五天，取出细胞培养板加2D-CTG试剂20μL/孔，室温孵育20min。置于Envision读取Luminescence信号。

数据分析:

细胞增殖抑制率％＝(Average_DMSO-Sample)/(Average_DMSO-Ratio_PositiveControl)x 100％。100％抑制定义为1μM阳性化合物(2-((S)-1-丙烯酰-4-(7-(3-羟基萘-1-基)-2-(((S)-1-甲基吡咯烷-2-基)甲氧基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)哌嗪-2-基)乙腈)的处理下细胞的增殖抑制水平。采用XLfit进行数据分析处理。浓度-效应曲线采用非线性四参数曲线拟合,并计算化合物的IC₅₀:

Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC₅₀-X)*HillSlope))

X:Log of cpd concentration

Y:Percent inhibition(％inh)

试验结果:

在本试验条件下，受试化合物对带有KRAS G12C突变的人非小细胞肺癌H358细胞增殖具有显著的抑制活性。受试化合物与KRAS G12C蛋白的结合活性具体见表1。

表1