CN114426933A - 一种提高亚硝酸细菌细胞产率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高亚硝酸细菌细胞产率的方法。该方法包括：将富含硝化细菌的活性污泥接种到具有搅拌和曝气功能的反应器内，采取批次补料并逐步提高补料中氨氮浓度的操作方式进行亚硝酸细菌的富集培养，结束培养的条件为：亚硝化率达90%以上，结束培养，收获菌体；其中，在亚硝酸细菌培养过程中，每一批次补料的同时均加入羟胺类物质和辅酶，当氨氮去除率达95%以上，结束当前批次，补料进入下一批次培养；当前批次的亚硝化率达30%以上时，从下一批次起向培养体系内通入NO和/或NO2气体。本发明方法能够实现亚硝酸细菌的快速繁殖。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高亚硝酸细菌细胞产率的方法。
背景技术
硝化细菌属于化能营养型微生物。生物细胞只能利用以ATP等形态保存的能量，不能直接利用化学反应所释放的自由能。在好氧代谢中，ATP主要通过呼吸链的氧化磷酸化作用合成。氨氧化磷酸化效率很低，所能产生的ATP非常有限，这些能量主要用于电子跃迁到较高能级，这使得硝化细菌生长很缓慢。硝化细菌又分为氨氧化细菌（亚硝酸细菌）和亚硝酸盐氧化细菌（硝酸细菌），近年来发展的新型生物脱氮技术如短程硝化-反硝化及短程硝化-厌氧氨氧化都需要将硝化反应进行到亚硝酸阶段而终止，希望氨氮被亚硝酸细菌转化为亚硝酸盐氮后不再继续被氧化而直接进行反硝化脱氮。因此亚硝酸细菌的生长繁殖非常关键。
CN201110315549.6公开了一种短程硝化反硝化颗粒污泥的培养方法，其中定期投加5-15mg/L羟胺；CN201010168453.7公开了一种快速启动缺氧氨氧化生物滤池的方法，其中投加羟胺，诱导接种污泥向缺氧氨氧化生物膜转变。上述方法主要是利用羟胺对硝酸细菌的抑制作用，促进短程硝化作用，但是对生长缓慢的亚硝酸细菌自身生长没有促进作用。
CN201410585640.3公开了一种硝化细菌富集培养方法，所使用的生长促进剂中含有羟胺，CN201410585421.5公开了一种氨氧化细菌生长促进剂及其制备方法和应用，所用的生长促进剂是使用无机酸羟胺和Na2SO3配合加入，羟胺的作用不仅作为底物直接参与氨氧化细菌的代谢过程，缩短酶促反应进程，而且可以作为羟胺氧还酶的激活剂加速细胞生长，提高氨氧化细菌的生长速率。上述方法主要是通过提高将羟胺转化为亚硝酸盐的酶的活性来加速酶促反应的进行、促进细胞生长。
发明内容
发明人经研究发现，在亚硝酸细菌培养过程中，亚硝酸细菌细胞的快速繁殖受限于细胞分裂与蛋白质合成的不匹配，由此，发明人创造性地在亚硝酸细菌培养过程中，在补料的同时加入羟胺类物质和辅酶，并控制NO和/或NO2气体的加入方式，使细胞分裂和蛋白质合成能够同步进行，从而解决了上述技术问题，实现亚硝酸细菌细胞快速繁殖的目的，从而获得本发明。
本发明提供了一种提高亚硝酸细菌细胞产率的方法。本发明方法能够实现亚硝酸细菌的快速繁殖。
本发明提供了一种提高亚硝酸细菌细胞产率的方法，包括：
将富含硝化细菌的活性污泥接种到具有搅拌和曝气功能的反应器内，采取批次补料并逐步提高补料中氨氮浓度的操作方式进行亚硝酸细菌的富集培养，结束培养的条件为：亚硝化率达90%以上，结束菌体培养过程，收获菌体；
其中，在亚硝酸细菌培养过程中，每一批次补料的同时均加入羟胺类物质和辅酶，当氨氮去除率达95%以上，结束当前批次，补料进入下一批次培养；
在亚硝酸细菌培养过程中，当前批次的亚硝化率达30%以上，优选50%-60%时，从下一批次起向培养体系内通入NO和/或NO2气体。
上述技术方案中，所述的富含硝化细菌的活性污泥按照污泥浓度为2000-5000mg/L进行接种。活性污泥可以取自任何含有氨氮污染物的污水处理场。
上述技术方案中，所述具有搅拌和曝气功能的反应器，其中，亚硝酸细菌培养过程是在搅拌条件下进行的，曝气是用于维持培养体系内的溶氧量。
上述技术方案中，所述的辅酶包括选自辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ中的至少一种和辅酶Q10，其中辅酶Ⅰ为NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），辅酶Ⅱ为NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）。其中，选自辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ中的至少一种与辅酶Q10的质量比为8：1-1：8，优选为5：1-1：5。
上述技术方案中，所述的补料是指补加培养液，批次补料是指补加培养液的方式是每批加一次。本发明所使用的培养液是本领域技术人员所熟知的，其中的基质是氨氮，可以是硫酸铵、尿素等一切含氨氮的物质；培养液中还含有金属盐。所述的金属盐可以是钙盐、亚铁盐和铜盐等，所述钙盐可以为CaSO4或者CaCl2；亚铁盐为FeSO4或者FeCl2，优选FeSO4；铜盐为CuSO4或者CuCl2。所述的金属盐可以按照Ca2+、Fe2+和Cu2+的摩尔比为（8-12）:（2-6）:（1-4）进行配制，使用浓度为0.01-1.0mg/L。
上述技术方案中，所述的逐步提高补料中氨氮浓度的操作方式如下：初始氨氮浓度为20-100mg/L，每次提高氨氮浓度的幅度为10-50mg/L，提高氨氮浓度的条件如下：对于同一氨氮浓度的补料，连续3-5批次使氨氮去除率均达到95%以上且每一批次所用时间与这几批次平均所用时间相差在10%以内，优选5%以内，即可提高下一批次补加料液的氨氮浓度。
上述技术方案中，所述羟胺类物质为羟胺、盐酸羟胺、硫酸羟胺或者磷酸羟胺中的至少一种，优选为磷酸羟胺。
上述技术方案中，羟胺类物质按照加入后在培养体系内的浓度为1-5mg/L进行投加，辅酶按照加入后在培养体系内的浓度为0.001-0.01mg/L进行投加。
上述技术方案中，NO和/或NO2气体的加入量占所通入气体总体积的0.001%-0.01%。在亚硝酸细菌培养过程中，所通入气体常规为空气，用于维持体系中的溶解氧量。
上述技术方案中，亚硝酸细菌的富集培养条件如下：温度为18-40℃，溶解氧为0.1-3.0mg/L，pH值为7.0-9.0，优选如下：温度为25-35℃，溶解氧为0.5-2.0mg/L，pH值为7.5-8.5。
上述技术方案中，结束培养的条件优选为：连续3-5批次亚硝化率均达90%以上，结束菌体培养过程，收获菌体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
发明人经研究发现，在亚硝酸细菌培养过程中，亚硝酸细菌细胞的快速繁殖受限于细胞分裂和生长与蛋白质合成的不匹配。对于亚硝酸细菌这种自养型微生物来说，需要从氨氮氧化中获得能量和还原力，才能同化CO2最终合成细胞物质，在常规培养过程中常常存在能量过大、还原力不足等问题而影响蛋白质合成，抑制细胞生长，从而出现细胞分裂和蛋白质合成不能同步的问题。由此，发明人创造性地在亚硝酸细菌培养过程中，在补料的同时加入羟胺类物质和辅酶，并控制NO和/或NO2气体的加入方式，可以调控细胞分裂和蛋白质合成速率，使细胞分裂和蛋白质合成能够同步进行，从而实现亚硝酸细菌的快速繁殖，提高亚硝酸细菌细胞的产率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可从生化试剂商店购买得到。
本发明实施例中，氨氮浓度采用GB7478-87《水质-铵的测定-蒸镏和滴定法》测定；硝酸盐氮浓度采用GB 7480-1987《水质 硝酸盐氮的测定 酚二磺酸分光光度法》测定；亚硝酸盐氮浓度采用GB 7493-1987《水质 亚硝酸盐氮的测定 分光光度法》测定。
本发明实施例中，氨氮去除率是指原料水中氨氮浓度与排出水中氨氮浓度的浓度差占原料水中氨氮浓度的百分数，氨氮去除率（%）=（原料水中氨氮浓度-排出水氨氮浓度）/原料水氨氮浓度×100%。亚硝化率是指氨氮被氧化为亚硝酸盐氮浓度占总的硝化产物浓度的百分数，亚硝化率（%）=排出水中亚硝酸盐氮浓度/（排出水中亚硝酸盐氮浓度+排出水中硝酸盐氮浓度）×100%。
实施例1
实验室准备5L具有搅拌和曝气功能的有机玻璃反应器，按照污泥浓度为2000mg/L接种富含硝化细菌的活性污泥。采取批次补料的方式进行亚硝酸细菌的富集培养。
所使用的培养液中含有氨氮和金属盐，氨氮为硫酸铵，金属盐为CaCl2、FeSO4和CuSO4，其中Ca2+、Fe2+和Cu2+按照摩尔比为8:2:1进行配制，使用浓度为0.1mg/L；培养液的初始氨氮浓度为30mg/L。
亚硝酸细菌的富集培养条件：温度为28℃，溶解氧为2.0mg/L，pH值8.0。
在亚硝酸细菌培养过程中，当氨氮去除率达95%以上，结束当前批次，补料进入下一批次培养，每一批次补料的同时均按照1mg/L的浓度加入磷酸羟胺并按照0.001mg/L的浓度加入辅酶ⅠNADH和辅酶Q10（质量比为1：1）。培养过程中连续3个批次使氨氮去除率均达95%以上时所用时间基本相同，下一个批次氨氮浓度提高30mg/L。培养到第10个批次亚硝化率达56.9%，第11个批次起按照占所通入气体总体积的0.01%通入NO气体，继续培养到20个批次，此时基质氨氮浓度为180mg/L，亚硝化率达95.2%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程，收获菌体A。
采用菌体A处理氨氮浓度为200mg/L的废水，24h后，氨氮去除率达94.5%，亚硝化率为94.0%。
实施例2
实验室准备5L具有搅拌和曝气功能的有机玻璃反应器，按照污泥浓度为2000mg/L接种富含硝化细菌的活性污泥。采取批次补料的方式进行亚硝酸细菌的富集培养。
所使用的培养液中含有氨氮和金属盐，氨氮为硫酸铵，金属盐为CaCl2、FeSO4和CuSO4 ，其中Ca2+、Fe2+和Cu2+按照摩尔比为8:2:1进行配制，使用浓度为0.1mg/L；培养液的初始氨氮浓度为30mg/L。
亚硝酸细菌的富集培养条件：温度为28℃，溶解氧为2.0mg/L，pH值8.0。
在亚硝酸细菌培养过程中，当氨氮去除率达95%以上，结束当前批次，补料进入下一批次培养，每一批次补料的同时均按照1mg/L的浓度加入羟胺并按照0.001mg/L的浓度加入辅酶ⅠNADH和辅酶Q10（质量比为2：1）。培养过程中连续3个批次使氨氮去除率均达95%以上时所用时间基本相同，下一个批次氨氮浓度提高30mg/L。培养到第10个批次亚硝化率达55.4%，从第11个批次起按照占所通入气体总体积的0.01%通入NO气体，继续培养到20个批次，此时基质氨氮浓度为180mg/L，亚硝化率达93.9%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程，收获菌体B。
采用菌体B处理氨氮浓度为200mg/L的废水，24h后，氨氮去除率达94.1%，亚硝化率为93.3%。
实施例3
所使用的反应器和培养过程及条件均同实施例1，所不同的是当培养到第11个批次起按照占所通入气体总体积的0.005%通入NO2气体，继续培养到20个批次，此时基质氨氮浓度为150mg/L，亚硝化率达92.7%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程，收获菌体C。
采用菌体C处理氨氮浓度为200mg/L的废水，24h后，氨氮去除率达93.4%，亚硝化率为91.9%。
实施例4
实验室准备5L具有搅拌和曝气功能的有机玻璃反应器，按照污泥浓度为3000mg/L接种富含硝化细菌的活性污泥。采取批次补料的方式进行亚硝酸细菌的富集培养。
所使用的培养液中含有氨氮和金属盐，氨氮为硫酸铵，金属盐为CaCl2、FeSO4和CuSO4，其中Ca2+、Fe2+和Cu2+按照摩尔比为5:1:1进行配制，使用浓度为0.1mg/L；培养液的初始氨氮浓度为50mg/L。
亚硝酸细菌的富集培养条件：温度为30℃，溶解氧为1.0mg/L，pH值7.8。
在亚硝酸细菌培养过程中，当氨氮去除率达95%以上，结束当前批次，补料进入下一批次培养，每一批次补料的同时均按照2.5mg/L的浓度加入磷酸羟胺并按照0.01mg/L的浓度加入辅酶ⅡNADPH和辅酶Q10（质量比为5：1）），培养过程中连续3个批次使氨氮去除率均达95%以上时所用时间基本相同，下一个批次氨氮浓度提高30mg/L；培养到第10个批次亚硝化率达50%，从第11个批次起按照占所通入气体总体积的0.001%通入NO气体，继续培养到20个批次，此时基质氨氮浓度为170mg/L，亚硝化率达92.1%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程，收获菌体D。
采用菌体D处理氨氮浓度为200mg/L的废水，24h后，氨氮去除率达93.6%，亚硝化率为91.0%。
实施例5
实验室准备5L具有搅拌和曝气功能的有机玻璃反应器，按照污泥浓度为4000mg/L接种富含硝化细菌的活性污泥。采取批次补料的方式进行亚硝酸细菌的富集培养。
所使用的培养液中含有氨氮和金属盐，氨氮为硫酸铵，金属盐为CaCl2、FeSO4和CuSO4 ，其中Ca2+、Fe2+和Cu2+按照摩尔比为4:1:1进行配制，使用浓度为0.1mg/L；培养液的初始氨氮浓度为70mg/L。
亚硝酸细菌的富集培养条件：温度为25℃，溶解氧为3.0mg/L，pH值7.7。
在亚硝酸细菌培养过程中，当氨氮去除率达95%以上，结束当前批次，补料进入下一批次培养，每一批次补料的同时均按照5mg/L的浓度加入盐酸羟胺并按照0.05mg/L的浓度加入辅酶ⅠNADH和辅酶Q10（质量比为1：5），培养过程中连续3个批次使氨氮去除率均达95%以上时所用时间基本相同，下一个批次氨氮浓度提高30mg/L；培养到第10个批次亚硝化率达50%，从第11个批次起按照占所通入气体总体积的0.005%通入NO气体，继续培养到20个批次，此时基质氨氮浓度为190mg/L，亚硝化率达90%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程，收获菌体E。
采用菌体E处理氨氮浓度为200mg/L的废水，24h后，氨氮去除率达94.5%，亚硝化率为91.2%。
对比例1
与实施例1相比，所不同的是每一批次补料的同时没有加辅酶Q10，培养过程中连续3个批次使氨氮去除率均达95%以上时所用时间基本相同，下一个批次氨氮浓度提高30mg/L；培养到第12个批次亚硝化率达51%，从第13个批次起按照占所通入气体总体积的0.01%通入NO气体，继续培养到23个批次，此时基质氨氮浓度为180mg/L，亚硝化率达92.2%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程，收获菌体DA。
采用收获的菌体DA处理氨氮浓度为200mg/L的废水，24h后，氨氮去除率达90.5%，亚硝化率为82.1%。
对比例2
与实施例1相比，所不同的是每一批次补料的同时没有加磷酸羟胺，培养过程中连续3个批次使氨氮去除率均达95%以上时所用时间基本相同，下一个批次氨氮浓度提高30mg/L；培养到14个批次后亚硝化率才达52%，此时按照占所通入气体总体积的0.01%通入NO气体，继续培养到28个批次，此时基质氨氮浓度为180mg/L，亚硝化率达90.3%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程，收获菌体DB。
采用收获的菌体DB处理氨氮浓度为200mg/L的废水，24h后，氨氮去除率达87.5%，亚硝化率为73.4%。
对比例3
与实施例1相比，所不同的是培养到第10个批次亚硝化率达55.2%后，体系内并没有通入NO气体，继续培养到20个批次，此时基质氨氮浓度为150mg/L，亚硝化率只有70%，继续培养三个批次亚硝化率仍然只有72%，结束菌体培养过程，收获菌体DC。
采用收获的菌体DC处理氨氮浓度为200mg/L的废水，24h后，氨氮去除率达83.1%，亚硝化率只有68.3%。
对比例4
与实施例1相比，所不同的是每一批次补料的同时不加辅酶Ⅰ，培养过程中连续3个批次使氨氮去除率均达95%以上时所用时间基本相同，下一个批次氨氮浓度提高30mg/L；培养到第16个批次亚硝化率才达50.7%，从第17个批次起按照占所通入气体总体积的0.01%通入NO气体，继续培养到30个批次，此时基质氨氮浓度为150mg/L，亚硝化率达90%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程，收获菌体DD。
采用收获的菌体DD处理氨氮浓度为200mg/L的废水，24h后，氨氮去除率达77.1%，亚硝化率只有65.2%。
对比例5
与实施例1相比，所不同的是每一批次补料的同时不加辅酶I和辅酶Q10，培养过程中连续3个批次使氨氮去除率均达95%以上时所用时间基本相同，下一个批次氨氮浓度提高30mg/L；培养到第18个批次亚硝化率才达51.6%，从第19个批次起按照占所通入气体总体积的0.01%通入NO气体，继续培养到30个批次，此时基质氨氮浓度为150 mg/L，亚硝化率达91.1%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程，收获菌体DE。
采用收获的菌体DE处理氨氮浓度为200mg/L的废水，24h后，氨氮去除率达70.4%，亚硝化率只有62.6%。
Claims (10)
1.一种提高亚硝酸细菌细胞产率的方法，包括：
将富含硝化细菌的活性污泥接种到具有搅拌和曝气功能的反应器内，采取批次补料并逐步提高补料中氨氮浓度的操作方式进行亚硝酸细菌的富集培养，结束培养的条件为：亚硝化率达90%以上，结束菌体培养过程，收获菌体；
其中，在亚硝酸细菌培养过程中，每一批次补料的同时均加入羟胺类物质和辅酶，当氨氮去除率达95%以上，结束当前批次，补料进入下一批次培养；
在亚硝酸细菌培养过程中，当前批次的亚硝化率达30%以上，优选50%-60%时，从下一批次起向培养体系内通入NO和/或NO2气体。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的富含硝化细菌的活性污泥按照污泥浓度为2000-5000mg/L进行接种。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的辅酶包括选自辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ中的至少一种和辅酶Q10，其中辅酶Ⅰ为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶Ⅱ为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；优选地，选自辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ中的至少一种与辅酶Q10的质量比为8：1-1：8，优选5：1-1：5。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的补料是补加培养液，所使用的培养液中，基质是氨氮，还含有金属盐，所述的金属盐是钙盐、亚铁盐和铜盐，其中Ca2+、Fe2+和Cu2 +的摩尔比为（8-12）:（2-6）:（1-4），使用浓度为0.01-1.0mg/L。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的逐步提高补料中氨氮浓度的操作方式如下：初始氨氮浓度为20-100mg/L，每次提高氨氮浓度的幅度为10-50mg/L，提高氨氮浓度的条件如下：对于同一氨氮浓度的补料，连续3-5批次使氨氮去除率均达到95%以上且每一批次所用时间与这几批次平均所用时间相差在10%以内，优选5%以内，即提高下一批次补料的氨氮浓度。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述羟胺类物质为羟胺、盐酸羟胺、硫酸羟胺或者磷酸羟胺中的至少一种，优选为磷酸羟胺。
7.按照权利要求1、3或6所述的方法，其特征在于：羟胺类物质按照加入后在培养体系内的浓度为1-5mg/L进行投加，辅酶按照加入后在培养体系内的浓度为0.001-0.01mg/L进行投加。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：NO和/或NO2气体的加入量占所通入气体总体积的0.001%-0.01%。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：亚硝酸细菌的富集培养条件如下：温度为18-40℃，溶解氧为0.1-3.0mg/L，pH值为7.0-9.0；优选地，温度为25-35℃，溶解氧为0.5-2.0mg/L，pH值为7.5-8.5。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：结束培养的条件为：连续3-5批次亚硝化率均达90%以上，结束菌体培养过程，收获菌体。
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| 周娟,李君文,郑金来: "亚硝酸细菌研究进展", 环境科学与技术, no. 2 * |
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