CN114414670A - 一种马蹄金指纹图谱的建立方法及其指纹图谱 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种马蹄金指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，属于中药质量鉴定技术领域。包括以下步骤：对照品溶液的制备：精密称定绿原酸、伞形花内酯、东莨菪内酯、芦丁对照品适量，加甲醇溶解，制备得到对照品溶液；供试品溶液的制备：精密称定马蹄金药材粉末，精密加入甲醇溶解，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜进行过滤，取续滤液，即得供试品溶液；HPLC检测：色谱条件为，流动相：A：甲醇，B：0.1％磷酸；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：340nm；进样量：10μL。本发明弥补了现有质量控制技术的不足，使马蹄金药材的质量控制更加完善和科学。

Description

一种马蹄金指纹图谱的建立方法及其指纹图谱
技术领域
本发明涉及中药质量鉴定技术领域，具体涉及一种马蹄金指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。
背景技术
中药作为我国传承几千年的国粹，它的疗效也令人瞩目。中药指纹图谱是目前能够为国内外广泛接受的一种中药质量评价模式。日本汉方药在20世纪80年代就采用高效液相指纹图谱控制中药和天然药的质量，欧共体也将指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制，美国食品药品管理局允许草药保健品申报资料时提供指纹图谱。近年来，我国对中药指纹图谱的研究也越来越活跃。2000年国家药品监督管理局颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，要求中药注射剂必须进行指纹图谱的研究，并建立其相关的标准。《中国药典》 2020年版提出依据中药整体成分发挥作用的特点对“毒性”、“生熟异治”等中药饮片进行指纹图谱和多成分含量测定研究，以提高饮片有效性的控制方法。
马蹄金为苗族民间常用的一种治疗肝炎的草药，苗族药名“窝比赊溜”，味苦、辛，性微寒，主人肺经和胃经，具有清热解毒，利水，活血的功效，是一味资源丰富的苗族民间药材，有很好的开发和利用价值。目前，人们马蹄金的质量控制还只限于对其诸多组分中某个有效成分或指标性成分进行定性、定量分析，缺乏全面反映枸杞质量的标准控制手段。
发明内容
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，本发明通过对马蹄金高效液相色谱指纹图谱的研究，提出了一种马蹄金指纹图谱的建立方法，弥补了现有质量控制技术的不足，使马蹄金药材的质量控制更加完善和科学。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种马蹄金指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称定绿原酸、伞形花内酯、东莨菪内酯、芦丁对照品适量，加甲醇溶解，制备得到对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密称定马蹄金药材粉末，精密加入甲醇溶解，称定重量，超声提取15～30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜进行过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
(3)HPLC检测：色谱条件为，色谱柱为Welch Ultimate AQ-C18，4.6×250mm，5μm；流动相：A：甲醇，B：0.1％磷酸；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：340nm；进样量：10μL；梯度洗脱程序见表1；
表1
时间(min) A(％) B(％)
0 95 5
10 80 20
25 75 25
33 64 36
36 60 40
45 60 40
55 50 50
60 70 30
65 80 20
70 95 5
75 95 5
分别精密吸取对照品储备液和供试品溶液，进样，用高效液相色谱仪测定，记录色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得到马蹄金的HPLC指纹图谱。
本发明中，优选地，所述对照品溶液中绿原酸、伞形花内酯、东莨菪内酯、芦丁的浓度分别为50ug/ml。
由于采用上述建立方法，所得的马蹄金指纹图谱共由20个指纹峰构成，其保留时间分别为峰1：14.977min；峰2：19.435min；峰3：21.539min；绿原酸峰4：23.077min；峰5：23.987min；峰6：25.461min；峰7：29.589min；伞形花内酯峰8：32.51min；峰9：33.688min；东莨菪内酯峰10：34.404min；峰11：35.639min；峰22：36.778min；峰12：41.291min；峰13：42.461min；芦丁峰14：45.609min；峰15:48.538min；峰16：49.782min；峰23： 54.487min；峰18：55.047min；峰19：55.887min；峰20：59.294min；这些共有特征峰构成了马蹄金药材的指纹特征，可作为马蹄金药材的标准指纹图谱。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(1)本发明的马蹄金药材指纹图谱构建方法对各供试品的前处理方法简单，特征性成分保留完整，且供试品溶液稳定；
(2)本发明中的高效液相色谱方法精密度较高、重现性良好，具有一定的专属性；
(3)本发明所建立的标准指纹图谱有24个共有峰，信息量较大，较完整的保留了供试品溶液中的化学成分；
(4)本发明确立了马蹄金指纹图谱的方法，通过该方法可获得马蹄金药材的标准指纹图谱，比较指纹图谱中共有峰的有无，能有效地监控马蹄金药材的质量，完善了马蹄金药材的质量评价体系，为马蹄金药材质量的全面、有效控制提供了理论和实践基础。
附图说明
图1是本发明中的对照品溶液的液相色谱图，其中峰1：绿原酸；峰2：伞形花内酯；峰 3：东莨菪内酯；峰4：芦丁。
图2是马蹄金的指纹图谱。
图3-8是提取溶剂分别为甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯、氯仿、石油醚时所得的液相色谱图。
图9是超声提取60min所得的液相色谱图。
图10是回流提取60min所得的液相色谱图。
图11-13是提取溶剂甲醇的浓度分别是99％、70％和50％时所得的液相色谱图。
具体实施方式
为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
1、仪器与材料
高效液相色谱仪(waters e2695，美国waters公司)，二极管阵列检测器；Sk8200HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；XS205DU电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；超纯水仪GWB-2E(北京普析通用仪器有限责任公司)。
绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号110753-202018，含量96.1％)；伞形花内酯对照品(中国食品药品检定研究院，批号111739-200501，含量100％)；东莨菪内酯对照品(中国食品药品检定研究院，批号110768-200504，含量100％)；芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号100080-201409，含量91.9％)；流动相所用甲醇为色谱纯(上海安谱实验科技股份有限公司)；水为自制超纯水；其余化学试剂均为分析纯。
2、提取方法
一种马蹄金指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称定绿原酸、伞形花内酯、东莨菪内酯、芦丁对照品适量，加体积浓度为70％的甲醇溶解，制备得到浓度分别为50ug/ml的对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密称定15批次的马蹄金药材粉末，每批次重量为0.25g，置具塞锥形瓶中，密塞，分别精密加入体积浓度为70％的甲醇溶解，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜进行过滤，取续滤液，即得浓度为10mg/ml的供试品溶液；
(3)HPLC检测：色谱条件为，色谱柱为Welch Ultimate AQ-C18，4.6×250mm，5μm；流动相：A：甲醇，B：0.1％磷酸；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：340nm；进样量：10μL；梯度洗脱程序见表1；
表1
时间(min) A(％) B(％)
0 95 5
10 80 20
25 75 25
33 64 36
36 60 40
45 60 40
55 50 50
60 70 30
65 80 20
70 95 5
75 95 5
分别精密吸取对照品储备液和供试品溶液，进样，用高效液相色谱仪测定，记录色谱图，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A软件对图谱进行处理，即得到对照品溶液的色图谱(见图1)和马蹄金的HPLC图谱。选择15批次马蹄金的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰，用平均值计算法生成1批次对照指纹图谱，得到的对照指纹图谱见图2，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，计算结果见表2。
表2
Figure RE-RE-GDA0003530288640000041
Figure RE-RE-GDA0003530288640000051
由于采用上述建立方法，所得的马蹄金指纹图谱共由21个指纹峰构成，这些共有特征峰构成了马蹄金药材的指纹特征，可作为马蹄金药材的标准指纹图谱。在测试具体马蹄金供试样品过程中，以上特征峰的保留时间可能会出现0.05～0.25min的标准偏差，不影响样品相似度的比对。
3、试验条件的选择
(1)提取溶剂的选择：
分别使用甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯、氯仿、石油醚作为溶剂，超声提取30分钟，其他条件与实施例1相同，所得的色谱图见图3-8，可以看出，6种溶剂中，甲醇和乙醇的峰型及峰个数，基本重合，但甲醇较乙醇峰响应值较高，提取效果最好，水提取效果一般，乙酸乙酯、氯仿、石油醚几乎没有提取出来。故决定选择甲醇作为提取溶剂。
(2)提取方式的选择：
分别采用超声提取60min和回流提取60min的提取方式进行马蹄金的提取，其他条件与实施例1相同，所得的色谱图见图9-10，可以看出，甲醇超声较回流提取效果好，故选择超声作为提取方式。
(3)甲醇浓度的选择
分别采用甲醇，70％甲醇和50％甲醇作为提取溶剂，采用超声提取30min的方式进行马蹄金的提取，其他其他条件与实施例1相同，所得的色谱图见图10-12，可以看出，70％甲醇提取效果较好，故选择70％甲醇作为提取溶剂。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (5)

1.一种马蹄金指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称定绿原酸、伞形花内酯、东莨菪内酯、芦丁对照品适量，加甲醇溶解，制备得到对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密称定马蹄金药材粉末，精密加入甲醇溶解，称定重量，提取15～60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜进行过滤，取滤液，即得供试品溶液；
(3)HPLC检测：色谱条件为，色谱柱为Welch Ultimate AQ-C18，4.6×250mm，5μm；流动相：A：甲醇，B：0.1％磷酸；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：340nm；进样量：10μL；梯度洗脱程序见表1；
表1
时间(min) A(％) B(％) 0 95 5 10 80 20 25 75 25 33 64 36 36 60 40 45 60 40 55 50 50 60 70 30 65 80 20 70 95 5 75 95 5
分别精密吸取对照品储备液和供试品溶液，进样，用高效液相色谱仪测定，记录色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得到马蹄金的HPLC指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的一种马蹄金指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述对照品溶液中绿原酸、伞形花内酯、东莨菪内酯、芦丁的浓度分别为50ug/ml。
3.根据权利要求1所述的一种马蹄金指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述步骤(2)中甲醇的体积浓度为50％-99％。
4.根据权利要求1所述的一种马蹄金指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述提取方式为超声提取或回流提取。
5.根据权利要求1-5中任一项的建立方法所得的马蹄金指纹图谱，其特征在于：所述指纹图谱共由20个指纹峰构成，其保留时间分别为峰1：14.977min；峰2：19.435min；峰3：21.539min；绿原酸峰4：23.077min；峰5：23.987min；峰6：25.461min；峰7：29.589min；伞形花内酯峰8：32.51min；峰9：33.688min；东莨菪内酯峰10：34.404min；峰11：35.639min；峰22：36.778min；峰12：41.291min；峰13：42.461min；芦丁峰14：45.609min；峰15:48.538min；峰16：49.782min；峰23：54.487min；峰18：55.047min；峰19：55.887min；峰20：59.294min；这些共有特征峰构成了马蹄金药材的指纹特征，可作为马蹄金药材的标准指纹图谱。
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