CN114410724B

CN114410724B - 一种具有抑制酪氨酸酶活性的丹凤牡丹花肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114410724B
Application number: CN202210198465.7A
Authority: CN
Inventors: 黄君阳; 徐梅; 曹秀娟; 李满园
Original assignee: Xiamen Yuanzhidao Biotech Co ltd
Current assignee: Xiamen Yuanzhidao Biotech Co ltd
Priority date: 2022-03-02
Filing date: 2022-03-02
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2042-03-02
Also published as: CN114410724A

Abstract

本发明涉及牡丹花加工领域，特别涉及一种具有抑制酪氨酸酶活性的丹凤牡丹花肽及其制备方法和应用。其中，具有抑制酪氨酸酶活性的丹凤牡丹花肽的制备方法为先将干制的丹凤牡丹花与水混合经研磨均质处理形成浆液；所述浆液依次经复合酶水解、灭酶、沉淀和离心过滤得到丹凤牡丹花肽原液；所述丹凤牡丹花肽原液经膜过滤截留分子量为1000～10000Da的多肽滤液并浓缩即得所述丹凤牡丹花肽；所述复合酶由酸性蛋白酶、果胶酶及纤维素酶组成。该方法采用由酸性蛋白酶、果胶酶及纤维素酶组成的复合酶对丹凤牡丹花浆液作进行一步水解，其得到的丹凤牡丹花肽不仅具有高抑制酪氨酸酶活性，而且无苦味，口感好，有利于其在食品中的应用。

Description

一种具有抑制酪氨酸酶活性的丹凤牡丹花肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及牡丹花加工领域，特别涉及一种具有抑制酪氨酸酶活性的丹凤牡丹花肽及其制备方法和应用。

背景技术

丹凤牡丹花作为新食品原料，营养丰富，不仅含有丰富的蛋白质、脂肪、氨基酸、微量元素、微生素等对人体有益的营养成分，还含有能降低血压、镇咳及抗肿瘤的紫云英苷、芍药花苷、没食子酸、丹皮酚等活性成分。牡丹花蕊被称为“微型营养库”，具有多种保健等功效，其蛋白质含量丰富，有“天然蛋白质之冠”的美誉。

目前对于牡丹花中功效成分研究主要集中于牡丹花黄酮类、多酚类活性物质的开发，如公告为CN106074747B，公告日为2019年08月27日的专利文件公开了一种从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法，该方法以牡丹花瓣为原料，通过加热回流提取牡丹花瓣中含有酪氨酸酶抑制物的有效组分，萃取、大孔树脂柱层析除去脂溶性和水溶性的杂质，浓度为90％的乙醇洗脱液浓缩干燥后得到酪氨酸酶抑制物。使用该方法能够得到提取率较高的酪氨酸酶抑制物，提取率可达6％以上。在酪氨酸酶抑制物提取的过程中，所使用的药品均为常见药品，生产成本低；乙醇和层析柱中的大孔树脂均可重复使用，不污染环境，进一步降低生产成本。

也有针对于牡丹花中蛋白质资源的开发，如公告号为CN104152521B，公告日为2019年3月12日的专利文件公开了一种牡丹花粉蛋白多肽是牡丹花粉蛋白或者牡花粉多肽，以干燥的牡丹花粉为原料，经过花粉破壁、粗蛋白提取、真空干燥，得到牡丹花粉蛋白；将牡丹花粉蛋白经过蛋白酶解、脱苦脱色、离心或过滤，得到牡丹花粉多肽，该制品可以是粉剂、颗粒、片剂、胶囊、口服液等形式，该牡丹蛋白多肽具有降低胆固醇、降血压和促进脂肪代谢、抗疲劳、增强人体免疫力、调节人体生理机能等功效优势。

但上述牡丹花粉多肽的功能较为宽泛，对牡丹花为原料开发特定功能的活性肽(如具有抑制酪氨酸酶活性)则具有重要意义。

发明内容

为解决上述背景技术中提到的问题，本发明提供一种具有抑制酪氨酸酶活性的丹凤牡丹花肽的制备方法，

先将干制的丹凤牡丹花与水混合经研磨均质处理形成浆液；所述浆液依次经复合酶水解、灭酶、沉淀和离心过滤得到丹凤牡丹花肽原液；

所述丹凤牡丹花肽原液经膜过滤截留分子量为1000～10000Da的多肽滤液并浓缩即得所述丹凤牡丹花肽；

所述复合酶由酸性蛋白酶、果胶酶及纤维素酶组成。

在一实施例中，按浆液中的蛋白质量加入5000～10000u/g的酸性蛋白酶。

在一实施例中，所述果胶酶和纤维素酶的总添加量为所述浆液质量的0.04％～0.2％,所述果胶酶和纤维素酶的质量比为1～2：1～2。

在一实施例中，所述浆液中丹凤牡丹花的质量百分比为10％～15％。

在一些实施方式中，所述浆液的制备方法如下：

将干制的丹凤牡丹花与水混合在50℃～60℃泡发1～2小时，先研磨得到大于200目的丹凤牡丹花混合液，再经高速剪切均质处理20～30min即得到所述浆液，优选地，采用胶体磨进行研磨。

优选地，所述浆液在经复合酶水解之前还通过酸化剂调节pH至3.0～4.5，所述酸化剂为硫酸和柠檬酸中的一种或两种。

在一实施例中，所述复合酶水解的条件为在50～60℃下水解3.0～5.0h。

在一实施例中，所述灭酶的条件为在80～90℃下恒温15～20min。

在一实施例中，所述沉淀为向经灭酶处理后的水解液添加食品级氢氧化钙粉末调节pH至6.5～7.5以使水解液中的絮状物絮凝沉淀，即利用氢氧化钙中和硫酸根、柠檬酸根产生沉淀，无需再通过纳滤膜脱盐，节约能耗。

在一实施例中，经过沉淀后的水解液输送至装有旋转转盘的碟片式离心机进行离心处理，通过离心与湍流双重作用对水解液进行错流过滤，即得丹凤牡丹花肽原液。

优选地，所述丹凤牡丹花肽原液在经膜过滤之前还通过活性炭进行吸附脱色脱味处理。

在一些实施方式中，所述吸附脱色脱味处理的操作具体如下：

先调节丹凤牡丹花肽原液温度至50±2℃，加入活性炭，在搅拌条件下动态吸附处理1h；

然后将丹凤牡丹花肽原液通过气泵装置输送至板框过滤机中，以脱除活性炭。

在一些实施方式中，所述膜过滤依次包括陶瓷膜分离和超滤膜截留两个环节。其中，陶瓷膜分离用于去除丹凤牡丹花肽原液中未酶解的蛋白和多糖，优选地，陶瓷膜孔径规格为20nm；

超滤膜截留则是采用10000Da和1000Da的卷式膜对丹凤牡丹花肽原液分别截留其中成分FA(>10000Da)、FB(1000～10000Da)、FC(＜1000Da)的丹凤牡丹花肽成分；10000Da的卷式膜主要分离去除大部分糖肽及大分子蛋白肽FA(>10000Da)，1000Da卷式膜主要分离去除部分寡糖及游离氨基酸FC(＜1000Da)，及主要保留1000～10000Da卷式膜丹凤牡丹花肽的活性成分FB(1000～10000Da)。

在一实施例中，所述多肽滤液经反渗透膜浓缩至固形物含量≥20％即得所述丹凤牡丹花肽。

在一实施例中，所述浓缩后的丹凤牡丹花肽还进行UHT杀菌。

在一实施例中，将经UHT杀菌后的丹凤牡丹花肽再喷雾干燥即得丹凤牡丹花肽粉。

第二方面，本发明还提供一种具有抑制酪氨酸酶活性的丹凤牡丹花肽，采用如上任意所述的具有抑制酪氨酸酶活性的丹凤牡丹花肽的制备方法制得。

第三方面，本发明还提供一种如上所述的具有抑制酪氨酸酶活性的丹凤牡丹花肽在食品中的应用。

基于上述，与现有技术相比，本发明提供的一种具有抑制酪氨酸酶活性的丹凤牡丹花肽的制备方法具备如下有益效果：

1、丹凤牡丹花与水混合后，经过研磨和均质处理，提高了其水解多肽得率；

2、采用由酸性蛋白酶、果胶酶及纤维素酶组成的复合酶对丹凤牡丹花浆液作进行一步水解，其得到的丹凤牡丹花肽不仅具有高抑制酪氨酸酶活性，而且无苦味，口感好，有利于其在食品中的应用。

本发明的其它特征和有益效果将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他有益效果可通过在说明书、权利要求书中所指出的结构和/或组分来实现和获得。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；下面所描述的本发明不同实施方式中所设计的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，本发明所使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义，不能理解为对本发明的限制；应进一步理解，本发明所使用的术语应被理解为具有与这些术语在本说明书的上下文和相关领域中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的意义来理解，除本发明中明确如此定义之外。

本发明提供如下实施例

实施例1

S1、调浆及剪切均质：向泡发罐内加入纯化水9kg，干制丹凤牡丹花1kg，55℃搅拌泡制60min，搅拌速度500r/min；泡制完成后，通过胶体磨研磨至大于200目的丹凤牡丹花混合液,再经高速剪切均质处理20～30min得到浆液；

S2、酶解：向上述浆液中滴加配制好的酸化剂调节体系pH至3.5，采用537酸性蛋白酶、果胶酶及纤维素酶复合酶酶解，按浆液中的蛋白质量加入8000u/g的537酸性蛋白酶，果胶酶3克，纤维素酶3克，通过控制体系pH维持在3.5～4.5，酶解温度55℃，酶解4小时，之后在90℃下灭酶15min；

其中，酸化剂为质量分数10％的硫酸和质量分数10％的柠檬酸按质量比3：1配制成。

S3、过滤分离：将上述经灭酶后的水解液降温至50℃加入氢氧化钙粉末调节pH至6.5，以使酶解液中硫酸根、柠檬酸根与钙离子络合生成钙沉淀，让分散型的不溶物富集絮凝沉淀；再通过夹套快速降温至常温，利用碟式离心机分离5000r/min，分离出固体渣和酶解清液即丹凤牡丹花肽原液；

S4、吸附脱色脱味：先向丹凤牡丹花肽原液中加入100目HPM～05型活性炭15g在温度50℃下进行时间长达1h的脱色脱味，之后向板框填充白色和红色硅藻土分别各加入15克，填充均匀；

再将经过吸附脱色脱味的丹凤牡丹花肽原液通过气泵装

置输送至板框过滤机中，脱除活性炭；

S5、膜过滤：利用陶瓷膜20nm，过滤粗蛋白及多糖，再经过10000Da和1000Da的卷式膜过滤分离，过程需再添加5kg纯水，平均分2次补水脱除氨基酸和寡糖，截留得到FA、FB和FC三种组分；

S6、浓缩：采用反渗透膜对上述FA、FB和FC三种组分至固形物含量≥20％；

S7、UHT杀菌：送料至全自动UHT杀菌设备，杀菌参数为：121℃，15s，出料温度70～75℃；

S8、喷雾干燥：灭菌后的物料输送至喷雾干燥塔，其中，FA干燥参数为：螺杆泵5Hz，进风温度165～170℃，出风温度80～85℃，得到水分为4.5％，FA丹凤牡丹花肽粉末62克；

FB干燥参数为：螺杆泵5Hz，进风温度175～180℃，出风温度85～90℃，得到水分为4.2％，FB丹凤牡丹花肽粉末86克；

FC干燥参数为：螺杆泵5Hz，进风温度175～180℃，出风温度85～90℃；得到水分为4.0％，FC丹凤牡丹花肽粉末52克。

实施例2

与实施例1的区别在于酸化剂仅为质量分数为10％的硫酸，其余均与实施例1保持一致。

实施例3

与实施例1的区别在于酸化剂仅为质量分数为10％的柠檬酸，其余均与实施例1保持一致。

实施例4

S2、酶解：向上述浆液中滴加配制好的酸化剂调节体系pH至4.0，采用537酸性蛋白酶、果胶酶及纤维素酶复合酶酶解，按浆液中的蛋白质量加入8000u/g的宇佐美曲霉产的酸性蛋白酶，果胶酶2.4克，纤维素酶2.4克，通过控制体系pH维持在3.5～4.5，酶解温度55℃，酶解5小时，90℃高温灭酶15min；

其中,酸化剂为质量分数10％的硫酸和质量分数10％的柠檬酸按质量比3：1配制成。

S4、吸附脱色脱味：先向丹凤牡丹花肽原液中加入100目HPM-05型活性炭15g在温度50℃下进行1h的脱色脱味，之后向板框填充白色和红色硅藻土分别各加入15克，填充均匀；

再将经过吸附脱色脱味的丹凤牡丹花肽原液通过气泵装置输送至板框过滤机中，脱除活性炭；

S5、膜过滤：利用陶瓷膜20nm，过滤粗蛋白及多糖，再经过10000Da和1000Da的卷式膜过滤分离，过程需再添加5kg纯水，平均分2次补水脱除氨基酸和寡糖，截留得到3种组分FA、FB和FC三种组分；

S7、UHT杀菌：送料至全自动UHT杀菌设备，杀菌参数为：121℃，15s，出料温度70℃；

S8、喷雾干燥：灭菌后的物料输送至喷雾干燥塔，其中，FA干燥参数为：螺杆泵5Hz，进风温度165℃，出风温度85℃，得到水分为4.6％，FA丹凤牡丹花肽粉末78克；

FB干燥参数为：螺杆泵5Hz，进风温度175℃，出风温度90℃，得到水分为4.0％，FB丹凤牡丹花肽粉末56克；

FC干燥参数为：螺杆泵5Hz，进风温度175℃，出风温度90℃，得到水分为4.0％，FC丹凤牡丹花肽粉末54克。

实施例5

将实施例1中的537酸性蛋白酶等质量替换成黑曲霉产的酸性蛋白酶3.350，其余与实施例1保持一致。

对上述实施例最终制得的FA、FB和FC三种组分测试其水分、平均分子量、多肽得率和酪氨酸酶抑制率；

其中，酪氨酸酶抑制率的测定方法为将丹凤牡丹花肽粉末配制成多肽浓度为20mg/mL的溶液，并采用T/SHRH 015～2018化妆品～酪氨酸酶活性抑制测试。

表1不同组分的丹凤牡丹花肽的成分情况表及酪氨酶抑制率

本发明还提供如下对比例：

对比例1

除去实施例1中纤维素酶，其余与实施例1保持一致。

对比例2

除去实施例1中果胶酶，其余与实施例1保持一致。

对比例3

除去实施例1中的纤维素酶和果胶酶，其余与实施例1保持一致。

对比例4

将实施例1中的537酸性蛋白酶等质量替换成诺维信碱性蛋白酶，其余与实施例1保持一致。

对上述对比例最终制得的FA、FB和FC三种组分测试其多肽得率和酪氨酶酶抑制率，并与实施例1的相应结果比较，结果如表2和表3所示：

表2丹凤牡丹花肽得率测试表

序号

实施例1

实施例4

实施例5

对比例1

对比例2

对比例3

对比例4

FA

6.2％

7.8％

6.5％

6.8％

4.8％

7.0％

3.8％

FB

8.6％

5.6％

6.8％

5.8％

5.2％

6.2％

3.6％

FC

5.2％

5.4％

5.2％

6.0％

5.5％

5.2％

4.5％

表3丹凤牡丹花肽的酪氨酸酶抑制率测试表

序号

实施例1

实施例4

实施例5

对比例1

对比例2

对比例3

对比例4

FA

28.31％

23.50％

20.12％

15.40％

18.57％

12.89％

8.99％

FB

83.44％

78.21％

72.65％

60.52％

64.11％

45.44％

29.67％

FC

35.60％

33.44％

29.31％

21.13％

24.65％

16.70％

13.83％

本发明还对实施例1以及对比例1～4制得的丹凤牡丹花肽口感进行评价，具体评价方法为：取2g试样置于洁净的烧杯中，用200mL温开水配制成1％溶液，闻其气味，用温开水漱口，品其滋味。

表4实施例丹凤牡丹花肽的口感评价表

由表1可知，采用本发明提供的制备方法其制得的丹凤牡丹花肽的分子量在1000～10000Da区间内，具有很强的酪氨酸酶抑制活性；且多肽得率较高，大大提高了丹凤牡丹花的利用率。

由表2和表3可知，采用537酸性蛋白酶、果胶酶和纤维素酶的复合酶解对最终制得的丹凤牡丹花肽的酪氨酸酶抑制活性高低及多肽得率具有至关重要的影响，从对比例4可以看出，采用酸性蛋白酶制备的丹凤牡丹花肽具有比碱性蛋白酶制备的丹凤牡丹花肽更强的酪氨酸酶抑制活性。

由表4可知，实施例1、实施例4中口感最好，且无苦涩味、无咸味，实施例5口感其次，而对比例1至对比例4的口感则表现较为逊色，说明采用537酸性蛋白酶/宇佐美曲霉产的酸性蛋白酶、果胶酶和纤维素酶的复合酶解对最终制得的丹凤牡丹花肽的口感有显著的影响。

考虑到实际生产应用需求，本发明提供的丹凤牡丹花肽往往也需要以液态的形式进行贮存，为此，本发明还将上述实施例1至实施例5中经S7步骤中的UHT杀菌后制得的液态丹凤牡丹花肽取部分进行灌装密封；并在25℃条件下储存1个月后对其进行酪氨酸酶抑制活性保持测试，其中，酪氨酸酶抑制率的测定方法为将液态丹凤牡丹花肽配制成多肽浓度为20mg/mL的溶液，并采用T/SHRH 015～2018化妆品～酪氨酸酶活性抑制测试,如表5

表5

从表5可以看出，在同等多肽浓度下，液态丹凤牡丹花肽的酪氨酸酶抑制活性与粉末状的丹凤牡丹花肽相差无几，说明本发明提供的制备方法中的喷雾干燥环节对其丹凤牡丹花肽的酪氨酸酶抑制活性影响不大。此外，发明人还意外发现，实施例1、实施例4和实施例5的液态丹凤牡丹花肽的酪氨酸酶抑制活性保持优于实施例2和实施例3，说明酸化剂的组成会影响液态丹凤牡丹花肽的酪氨酸酶抑制活性保持；为此，本发明还提供如下对比例：

对比例5

采用醋酸代替实施例1中的硫酸和柠檬酸作为酸化剂，其余与实施例1保持一致。

对比例6

采用乳酸代替实施例1中的硫酸和柠檬酸作为酸化剂，其余与实施例1保持一致。

对比例7

采用苹果酸代替实施例1中的硫酸和柠檬酸作为酸化剂，其余与实施例1保持一致。

同样的，将上述对比例5至对比例7中经S7步骤中的UHT杀菌后制得的液态丹凤牡丹花肽取部分进行灌装密封；并在25℃条件下储存1个月时间后对其进行酪氨酸酶抑制活性保持测试，测试结果如表6

表6

从上述结果可知，酸化剂的组成对液态丹凤牡丹花肽的酪氨酸酶抑制活性保持具有显著影响，采用本发明提供的硫酸和柠檬酸组合而成的酸化剂，不仅可用于酶解前浆液的pH值的调节，还可提高后续制得的液态丹凤牡丹花肽的酪氨酸酶抑制活性的稳定性，使得其在长时间的储存下，减缓其酪氨酸酶抑制活性的降低，这可能是因为硫酸和柠檬酸的组合，相比其他有机酸更有利于与后续的氢氧化钙中和产生沉淀，丹凤牡丹花肽的纯度更高，其酪氨酸酶抑制活性也更高且稳定性好，由此可见，本发明采用特定组成的酸化剂，有利于使得液态丹凤牡丹花肽在常规储存条件下更好的保持酪氨酸酶抑制活性。

另外，本领域技术人员应当理解，尽管现有技术中存在许多问题，但是，本发明的每个实施例或技术方案可以仅在一个或几个方面进行改进，而不必同时解决现有技术中或者背景技术中列出的全部技术问题。本领域技术人员应当理解，对于一个权利要求中没有提到的内容不应当作为对于该权利要求的限制。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种具有抑制酪氨酸酶活性的丹凤牡丹花肽的制备方法，其特征在于：

先将干制的丹凤牡丹花与水混合经研磨均质处理形成浆液；

所述浆液在经复合酶水解之前还通过酸化剂调节pH至3.5，所述酸化剂为10%硫酸和10%柠檬酸；

所述浆液依次经复合酶水解、灭酶、沉淀和离心过滤得到丹凤牡丹花肽原液；

复合酶水解过程中，所述复合酶由537酸性蛋白酶、果胶酶及纤维素酶组成；所述复合酶水解的条件为在55℃下水解4h；其中，按浆液中的蛋白质量加入8000u/g的酸性蛋白酶，干制的丹凤牡丹花与果胶酶、纤维素酶的比例为1kg:3g:3g;

沉淀和离心过滤过程中，将经灭酶后的水解液加入氢氧化钙粉末调节pH至6.5，以使酶解液中硫酸根、柠檬酸根与钙离子络合生成钙沉淀，让分散型的不溶物富集絮凝沉淀；再通过离心分离以分离出固体渣和酶解清液，所述酶解清液即为丹凤牡丹花肽原液；

所述丹凤牡丹花肽原液进行吸附脱色脱味处理：先向丹凤牡丹花肽原液中加入活性炭进行脱色脱味，之后向板框均匀填充白色和红色硅藻土；再将经过吸附脱色脱味的丹凤牡丹花肽原液输送至板框过滤机中脱除活性炭；

所述吸附脱色脱味后的丹凤牡丹花肽原液经膜过滤截留分子量为1000～10000Da的多肽滤液：利用陶瓷膜20nm，过滤粗蛋白及多糖，再经过10000Da和1000Da的卷式膜过滤分离，过滤过程添加纯水以脱除氨基酸和寡糖，即得多肽滤液；

所述多肽滤液经浓缩得所述丹凤牡丹花肽。

2.根据权利要求1所述的具有抑制酪氨酸酶活性的丹凤牡丹花肽的制备方法，其特征在于：所述浆液中丹凤牡丹花的质量百分比为10%～15%。

3.根据权利要求1所述的具有抑制酪氨酸酶活性的丹凤牡丹花肽的制备方法，其特征在于：所述多肽滤液经反渗透膜浓缩至固形物含量≥20%即得所述丹凤牡丹花肽。

4.一种具有抑制酪氨酸酶活性的丹凤牡丹花肽，其特征在于：采用权利要求1～3任一项所述的具有抑制酪氨酸酶活性的丹凤牡丹花肽的制备方法制得。