CN114410633A - 反义寡核苷酸asoyap1在抑制多种yap1阳性癌症中的应用 - Google Patents

反义寡核苷酸asoyap1在抑制多种yap1阳性癌症中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了反义寡核苷酸ASOYAP1在抑制多种YAP1阳性癌症中的应用。用生物信息学在线工具分析YAP1蛋白转录组序列信息，筛选长度在20碱基的、能够结合的反义寡核苷酸位点，同时对反义寡核苷酸进行修饰，证明修饰后的反义寡核苷酸具有较高的抑制YAP1mRNA及其蛋白在细胞内的水平的能力。本发明为临床上治疗YAP1高表达且YAP1发挥重要作用的多种癌症细胞，提供了核酸药物治疗的新的手段。

Description

反义寡核苷酸ASOYAP1在抑制多种YAP1阳性癌症中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及反义寡核苷酸ASOYAP1在抑制多种YAP1阳性癌症细胞中的应用。
背景技术
2018年全球有高达18078957新增癌症病例，发病率236.9/10万，世界标准人口标化发病率197.9/10万；癌症死亡病例高达9555027例，死亡率125.2/10万，世界标准人口标化死亡率101.1/10万。全球185个国家中，有105个国家男性发病第1的癌症是前列腺癌；肺癌是37个国家男性发病的首位；肝癌和结直肠癌分别是13个和10个国家发病首位。肺癌在全球93个国家的男性中排死因第1位，46个国家的男性主要死于前列腺癌，20个国家是肝癌。此外膀胱癌的发病中，男性患者人数也四倍于女性患者。而女性死亡率分布更为复杂：103个国家乳腺癌是癌症死亡的首位，42个国家宫颈癌是首位，而男性最常见的死因—肺癌，在28个国家中的女性死因中也位居第一。由此可见，肺癌，肝癌，前列腺癌，乳腺癌，宫颈癌，膀胱癌等癌症，严重威胁着人类的生活质量与生命健康。
在上述几种肿瘤的发生发展中，一条信号通路发挥着至关重要的作用，即Hippo-YAP信号通路。Hippo-YAP信号通路发现于果蝇体内，主要包括Hpo、Wts、Sav、Mats、YkkSd，在哺乳动物体内其同系物为Mst2、Sav(WW45)、Lats2、Mobl、YAP、TAZ、TEAD4。Hippo-YAP信号通路作为调节器官大小和肿瘤发生的调节者，从生物进化角度上讲此通路高度保守。YAP(Yes-associated protein)即Yes相关蛋白是Hippo-YAP信号通路中关键因子，直接受到上游Lats2磷酸化调节，影响YAP的胞质定位和转录活性，磷酸化YAP后使Hippo-YAP信号通路抑制，一旦上游调节素乱，YAP将表达异常，引起细胞恶性增殖和转移。目前的研究表明YAP作为一个候选癌基因，能促进细胞增殖、诱导上皮间质转化、产生药物抵抗、影响细胞生存能力和促进肿瘤发生发展。其具体机制可能在于YAP/TAZ的持续激活促进异常细胞增殖。这种反应的机制突出了与YAP/TAZ下游细胞周期进展相关的广泛转录程序。该程序包括激活复制许可、DNA合成和修复、S期进入的细胞周期蛋白的控制和有丝分裂的完成。值得注意的是，YAP/TAZ可能通过诱导其他原癌性转录因子(如c-Myc)间接加强对细胞周期的控制。由此可见，在多种癌症之中，YAP蛋白分别以不同方式发挥着促癌基因的作用。
反义核酸药物从1978年发现并提出理论，到世纪之交第一种药物上市、推出2代反义技术，再到后来发展遇到低谷，药品退市，人们对其理解与运用的过程经历了一种螺旋式的上升。其研发伊始就承担着攻克普通药物无法治愈的疾病(如肿瘤)的希冀。随着近年来几种治疗癌症的反义核酸药物获批进入临床试验，此类药物重新回到了生物制药研究的舞台，再次展现了这种药物在基因治疗领域的广阔前景。
关于靶向YAP1反义寡核苷酸的研究还未见报道，且其抑制剂的研发尚不充分。本发明通过基础生物实验数据来研究能够下调YAP1转录物的反义寡核苷酸ASOYAP1，本发明的成果可以为YAP1阳性去势抵抗性前列腺癌治疗提供新的方法，也可用于治疗其他YAP1起到促癌作用的肿瘤之中。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一是提供针对YAP1的反义寡核苷酸。
本发明的目的之二是提供一种治疗YAP1阳性癌症的手段。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明第一方面提供了一种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸由15-30个核苷酸组成，所述反义寡核苷酸抑制YAP1的表达。
进一步，所述反义寡核苷酸由18-22个核苷酸组成。
进一步，所述反义寡核苷酸由20个核苷酸组成。
进一步，所述反义寡核苷酸是GAPMER寡核苷酸。
进一步，所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO.1-9任一项所示的序列。
进一步，所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO.1-3、SEQ ID NO.6-9任一项所示的序列。
进一步，所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO.1-3、SEQ ID NO.6-7任一项所述的序列。
进一步，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明第二方面提供了对本发明第一方面所述的反义寡核苷酸进行修饰的反义寡核苷酸。
进一步，所述修饰包括至少1个核苷间键修饰。
进一步，所述核苷间键修饰是硫代磷酸酯修饰。
进一步，所述修饰包括全链的核苷间键修饰。
进一步，所述修饰包括至少1个糖修饰。
进一步，所述糖修饰为2′-O-甲氧乙基修饰。
进一步，所述修饰包括至少6个糖修饰。
进一步，所述修饰包括10个糖修饰。
进一步，所述糖修饰位于反义寡核苷酸序列两侧。
进一步，所述两侧的糖修饰的数量为5。
进一步，所述反义寡核苷酸包括至少一个的核苷间键修饰和至少一个的糖修饰。
进一步，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少1个糖修饰。
进一步，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少6个糖修饰。
进一步，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和10个糖修饰。
进一步，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.23所示。
本发明第三方面提供了一种缀合物，包括本发明第一方面或本发明第二方面所述的反义寡核苷酸，以及至少一个共价连接到所述寡核苷酸的缀合物部分。
本发明第四方面提供了一种组合物，包括权本发明第一方面所述的反义寡核苷酸、本发明第二方面所述的反义寡核苷酸或本发明第三方面所述的缀合物，和药学上可接受的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。
本发明第五方面提供了一种体内或体外用于调节表达YAP1的靶细胞中YAP1表达的方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用本发明第一方面所述的反义寡核苷酸、本发明第二方面所述的反义寡核苷酸、本发明第三方面所述的缀合物或本发明第四方面所述的组合物。
本发明第六方面提供了本发明第一方面所述的反义寡核苷酸在制备治疗YAP1阳性癌症的药物组合物中的应用。
进一步，YAP1阳性癌症包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌、舌鳞癌、子宫内膜癌、胆管癌、前列腺癌。
进一步，所述YAP1阳性癌症选自前列腺癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌。
进一步，所述前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌。
本发明第七方面提供了本发明第二方面所述的反义寡核苷酸在制备治疗YAP1阳性癌症的药物组合物中的应用。
进一步，YAP1阳性癌症包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌、舌鳞癌、子宫内膜癌、胆管癌、前列腺癌。
进一步，所述YAP1阳性癌症选自前列腺癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌。
进一步，所述前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌。
本发明第八方面提供了本发明第三方面所述的缀合物在制备治疗YAP1阳性癌症的药物组合物中的应用。
进一步，YAP1阳性癌症包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌、舌鳞癌、子宫内膜癌、胆管癌、前列腺癌。
进一步，所述YAP1阳性癌症选自前列腺癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌。
进一步，所述前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌。
本发明第九方面提供了本发明第四方面所述的组合物在制备治疗YAP1阳性癌症的药物组合物中的应用。
进一步，YAP1阳性癌症包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌、舌鳞癌、子宫内膜癌、胆管癌、前列腺癌。
进一步，所述YAP1阳性癌症选自前列腺癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌。
进一步，所述前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了设计反义寡核苷酸以及进行反义寡核苷酸修饰的方法，使用该方法设计的反义寡核苷酸具有较高的敲除效率。
本发明首次设计合成了特异性结合并降解YAP1反义寡核苷酸ASOYAP1，为针对YAP1这一靶点的多种癌症的治疗提供了新的途径。
附图说明
图1不同反义寡核苷酸对YAP1的敲除效果图；
图2不同的反义寡核苷酸对YAP1的敲除效果图；其中，2A是YAP1蛋白水平检测结果图；2B是YAP1 mRNA水平的检测结果图；
图3是不同修饰的反义寡核苷酸的敲除效果图；其中，3A是不同修饰方式的反义寡核苷酸敲除效果图；3B是不同修饰位点数的反义寡核苷酸敲除效果图；
图4是甲氧乙基修饰的反义寡核苷酸对YAP1的敲除效果图，其中，4A是不同ASO转染浓度下的YAP1蛋白水平检测结果图；4B是不同转染时间下的YAP1蛋白的检测结果图；4C是不同ASO转染浓度下的YAP1mRNA水平检测结果图；4B是不同转染时间下的YAP1 mRNA的检测结果图；
图5是甲氧乙基修饰的反义寡核苷酸对不同癌细胞中YAP1的敲除效果图；其中，5A是YAP1蛋白水平检测结果图；5B是YAP1 mRNA水平的检测结果图；
图6是甲氧乙基修饰的反义寡核苷酸对不同癌细胞增殖的影响图，其中6A是C4-2细胞；6B是T24细胞；6C是Hela细胞；6D是MCF-7细胞；6E是Huh-6细胞；6F是A549细胞。
具体实施方式
生物医学领域一直需要在不负面影响靶RNA中靶腺苷的编辑效率的情况下，改善编辑RNA的反义寡核苷酸(ASO)的药代动力学特性。许多化学修饰存在于ASO的产生中，其特性并不总是与实现有效RNA编辑的愿望相一致。在寻求更好的药代动力学特性的过程中，设计并研究ASO的修饰对于改善ASO的稳定性以及对靶基因的编辑能力具有重要的意义。
在本发明中，术语YAP1(Gene ID:10413)包括野生型、突变型或其片段。本发明的YAP1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
寡核苷酸
如本文所用，术语“寡核苷酸”定义为如技术人员通常理解的包含两个或以上共价联接的核苷的分子。这样的共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常是在实验室中制作，先经固相化学合成后再加以纯化和分离。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如2'糖修饰的核苷。
靶序列
本文所用的术语“靶序列”意指存在于靶核酸中的核苷酸的序列，其包含与本发明的寡核苷酸为互补的核碱基序列。在一些实施例中，靶序列由靶核酸上具有与本发明寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的核碱基序列的区域组成。靶核酸的这一区域可以互换地称为靶标核苷酸序列、靶序列或靶标区域。在一些实施例中，所述靶序列比单一寡核苷酸的互补序列更长，并且可以例如代表所述靶核酸的被本发明的若干寡核苷酸所靶向的优选区域。
在一些实施例中，靶序列是选自人YAP1 mRNA的序列。
本发明的寡核苷酸包含与靶核酸诸如本文所述的靶序列互补或杂交的连续核苷酸序列。
GAPMER
本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以为gapmer。反义gapmer通常用于通过RNase H介导的降解来抑制靶核酸。gapmer寡核苷酸包含至少三个不同的结构区5′-侧翼、gap和3′-侧翼，5′->3′方向的F-G-F′。“gap”区(G)包含连续的DNA核苷酸延伸，使寡核苷酸能够募集RNase H。gap区的侧翼是5′侧翼区(F)，该区包含一个或多个糖修饰的核苷，有利的是高亲和力的糖修饰的核苷，以及3′侧翼区(F′)，其包含一个或多个糖修饰的核苷，有利的是高亲和力的糖修饰的核苷。F和F′区中一个或多个糖修饰的核苷增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即是增强亲和力的糖修饰的核苷)。在一些实施方案中，F和F′区的一个或多个糖修饰的核苷是2′糖修饰的核苷，例如高亲和力的2′糖修饰，例如独立地选自LNA和2′-MOE。
Gapmer的G区(gap区)是能够使寡核苷酸募集RNaseH，例如人RNase H1的核苷区，通常为DNA核苷。RNaseH是细胞酶，其可识别DNA与RNA之间的双链体，并且酶促切割RNA分子。适合地，gapmer可以具有至少5或6个连续DNA核苷，例如5-16个连续DNA核苷，例如6-15个连续DNA核苷，例如7-14个连续DNA核苷，例如8-12个连续DNA核苷酸，例如8-12个连续DNA核苷酸长度的gap区(G)。在一些实施方案中，gap G区可以由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续DNA核苷组成。在一些实施方案中，gap G区可以由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续硫代磷酸酯连接的DNA核苷组成。在一些实施方案中，gap中的全部核苷间键为硫代磷酸酯键。
反义寡核苷酸
如本文所用，术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因的表达的寡核苷酸。
作为一种优选地实施方式，反义寡核苷酸包含至少一个化学改性或者修饰。术语“经修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与同等的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。在优选的实施例中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。
糖修饰
与DNA和RNA中发现的核糖糖部分相比时本发明的寡聚物可包含一种或多种具有修饰的糖部分(即糖部分的修饰)的核苷。
已经制备了许多具有核糖部分的修饰的核苷，主要目的是改善寡核苷酸的某些性质，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。这样的修饰包括其中核糖环结构被修饰的那些修饰，例如，通过用己糖环(HNA)或双环替换核糖环结构来实现，其通常在核糖环(LNA)的C2和C4碳原子之间具有双基桥，或通常在C2和C3之间缺乏键的未连接核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸或三环核酸。经修饰的核苷还包括其中糖部分被替换为非糖部分的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基更改为氢以外的基团或天然存在于DNA和RNA核苷中的2'-OH基团所做出的修饰。例如，可以在2'、3'、4'或5'位置引入取代基。2'糖修饰的核苷是一种核苷，其在2'位置具有除H或-OH以外的取代基(2'取代的核苷)或包含能够在2'碳与核糖环中的第二个碳原子之间形成桥的2'连接双基，诸如LNA(2'-4'双基桥连)核苷。2'取代的修饰的核苷的包括但不限于2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为7-50核苷酸，优选为10-40核苷酸，更优选为15-30核苷酸，更优选为18-25核苷酸，更优选为20核苷酸。
在优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸由20个核苷酸组成。
在本发明的实施例中，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.1-9任一项所示。
在一些优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.1-3、SEQ IDNO.6-9任一项所示的序列。
在一些优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.1-3、SEQ IDNO.6-7任一项所示的序列。
作为更为优选的实施方案，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.3所示。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸的修饰包括至少一个核苷间键修饰。
作为一种进一步实施方案，反义寡核苷酸的修饰包括全链核苷间键修饰。
在一些实施方案中，核苷间键修饰是硫代磷酸酯修饰。
在具体实施方案中，所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO.10-18任一项所述的序列。
在进一步实施方案中，所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO.10-12、SEQ ID NO.15-18任一项所述的序列。
在进一步实施方案中，所述反义寡核苷酸为SEQ ID NO.12所述的序列。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸的修饰包括至少一个糖修饰。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸的修饰包括至少6个糖修饰。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸的修饰包括至少10个糖修饰。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸的糖修饰位于反义寡核苷酸序列两侧。
在一些实施方案中，两侧的糖修饰的数量为5。
作为进一步实施方案，所述糖修饰为2′-O-甲氧基修饰。
在进一步实施方案中，所述反义寡核苷酸包括至少一个的核苷间键修饰和至少一个的糖修饰。进一步，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少一个的糖修饰。更为进一步，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少6个的糖修饰。更为进一步，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和10个糖修饰。
在优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.22-25任一项所示。
在更为优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.23所示。
缀合物
如本文所用，术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价联接的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸与一个或多个非核苷酸部分的缀合可以改善该寡核苷酸的药理学，例如，通过影响寡核苷酸的活性、细胞分布、细胞吸收或稳定性实现。在一些实施例中，所述缀合物部分是通过改善寡核苷酸的细胞分布、生物利用度、新陈代谢、排泄、渗透性和/或细胞摄入来调整或增强寡核苷酸的药代动力学特性。特别地，缀合物可将寡核苷酸靶向特定的器官、组织或细胞类型，从而增强寡核苷酸在该器官、组织或细胞类型中的有效性。同时，缀合物可用于降低寡核苷酸在非靶细胞类型、组织或器官中的活性，例如脱靶活性或在非靶细胞类型、组织或器官中的活性。
在一个实施例中，非核苷酸部分(缀合物部分)选自由碳水化合物、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如衣壳)或其组合组成的组。
组合物
本发明提供了组合物，其包含任何前述反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物或其盐以及药学上可接受的稀释剂、载体、盐和/或佐剂。药用稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而药用盐包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施例中，药用稀释剂是无菌磷酸盐缓冲盐水。
根据本发明的化合物可以以其药学上可接受的盐的形式存在。术语“药学上可接受的盐”是指常规的酸加成盐或碱加成盐，其保留了本发明化合物的生物学效力和特性，并由合适的无毒有机或无机酸或有机或无机碱形成。酸加成盐包括例如那些源自无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸)的，以及那些来自有机酸(诸如对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸，等等)的盐。碱加成盐包括那些来自铵、钾、钠和季铵碱(例如氢氧化四甲铵)的盐。为了获得化合物的更好的物理和化学稳定性、吸湿性、流动性和可溶性，将药物化合物化学修饰为盐，是药物化学家公知的技术。
本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物可与药用活性或惰性物质混合，用以制备药物组合物或制剂。药物组合物的组成和配制方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或施用剂量。
这些组合物可以通过常规的灭菌技术进行灭菌，或者可以进行无菌过滤。所得的水溶液可以包装后直接使用或冻干，在施用前将冻干的制剂与无菌水性载体混合。制剂的pH通常为介于3至11之间，更优选地介于5和9之间或介于6和8之间，并且最优选地介于7和8之间，诸如7至7.5。可以将固体形式的所得组合物包装在多个单剂量单元中，每一个单元包含固定量的一种或多种上述试剂，诸如在片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的组合物也可以灵活的量包装在容器中，诸如在设计用于局部适用的乳膏或软膏的可挤压管中。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物是前药。特别地，对于寡核苷酸缀合物，一旦前药被递送至作用位点例如靶细胞，缀合物部分就从寡核苷酸上裂解下来。
方法
本发明提供了一种体内或体外用于调节表达YAP1的靶细胞中YAP1表达的方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用前述的反义寡核苷酸、缀合物或组合物。
如本文所用，术语“表达的调节”应理解为，与施用寡核苷酸之前的YAP1的量相比，寡核苷酸改变YAP1量的能力的总称。备选地，表达的调节可参照对照实验进行确定。如普遍所知，对照是以盐水组合物处理的单个或靶细胞，或是以非靶向寡核苷酸(模拟品)处理的单个或靶细胞。
一种调节类型是寡核苷酸抑制、下调、降低、抑制、去除、停止、阻断、阻止、减少、减低、避免或终止YAP1表达的能力，例如通过降解mRNA或阻止转录实现。本发明的反义寡核苷酸有利地能够抑制哺乳动物YAP1诸如人YAP1的表达。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸能够抑制YAP1靶核酸在表达靶核酸的细胞中的表达，从而使YAP1靶核酸(例如，mRNA)的水平相比于YAP1靶核酸(如mRNA)在细胞中的表达水平减少了，通过至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抑制。适当地，该细胞选自由人类细胞、猴子细胞、小鼠细胞和猪细胞组成的组。本发明可以使用本领域普通技术人员已知的多种核酸以及蛋白技术进行检测反义寡核苷酸抑制靶基因的能力，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。
核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。
核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。
核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。
蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。
治疗
本文中使用的术语“治疗”通常涉及治疗和理疗人或动物(例如，在兽医应用中)，其中实现一些期望的治疗效果，例如抑制疾病进展，并包括降低进展率、停止进展率、减轻疾病症状、改善疾病和治愈疾病。也包括作为预防性手段(即，预防)的治疗。例如，术语“治疗”也包括对尚未发生疾病但是有发生疾病的危险的病人的应用。
例如，治疗包括癌症的预防，降低癌症的发生率，降低癌症的严重度，减轻癌症的症状等。
本文中所用的术语“治疗有效量”涉及当根据期望的治疗方案给药时，对产生一些期望的治疗效果有效，与合理的收益/风险比率匹配的化合物或材料，包含化合物的组合物或剂型的量。
在一些实施方案中，对YAP1阳性的癌症患者进行治疗，所述YAP1阳性癌症包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌、舌鳞癌、子宫内膜癌、胆管癌、前列腺癌。
在一些实施方案中，本发明的组合物或者反义寡核苷酸用于治疗前列腺癌尤其是去势抵抗性前列腺癌。
在一些实施方案中，本发明的组合物或者反义寡核苷酸用于治疗乳腺癌。
在一些实施方案中，本发明的组合物或者反义寡核苷酸用于治疗肺癌。
在一些实施方案中，本发明的组合物或者反义寡核苷酸用于治疗宫颈癌。
在一些实施方案中，本发明的组合物或者反义寡核苷酸用于治疗膀胱癌。
在一些实施方案中，本发明的组合物或者反义寡核苷酸用于治疗肝癌。
本发明的寡核苷酸或药物组合物可经由胃肠外方式给药(诸如静脉注射、皮下、肌内、脑内、脑室内、眼内或鞘内给药)。
在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物或药物组合物是用以与另一治疗剂进行结合治疗。治疗剂可以例如是上述疾病或病症的常规治疗药物。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。因此，本发明的宽度和范围不应限于任何上述的实施方案。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 YAP1反义寡核苷酸的设计及检测
1、ASO序列的生物学鉴定以及修饰方案和位点的效果对比
使用NCBI中的BLAST生物串行信息一级结构在线比对工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对比分析YAP1 mRNA各个转录本的mRNA结构信息，并记录其共有序列。使用sfold RNA二级结构在线预测工具中的“soligo”页面(http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.pl)，输入YAP1各个转录本的共有序列，oligo长度选择为20nt，提交并记录筛选结果。
根据碱基互补配对的基本原则，我们设计了9条(参见表1)覆盖功能位点在内的20个核酸的反义寡核苷酸ASOYap1，并且使用硫代磷酸全链修饰作为基础修饰(表2)
表1 ASO序列
ASO序列 序列编号
TCAAGGGAGTTGGAGGGAAA SEQ ID NO.1
AGCAGGTTGGGAGATGGCAA SEQ ID NO.2
TCCTGGGACAAATGTGGACC SEQ ID NO.3
AATAGTGTGGTAGTGGAATG SEQ ID NO.4
GAGTATGTGTCTACAGGAGT SEQ ID NO.5
AAATGAGTGCTCAGGTGGAT SEQ ID NO.6
GACAACAACATGGCAGGACC SEQ ID NO.7
CTTGGAAGGAGTGCCTATAA SEQ ID NO.8
AATGAACACAGGGAAGTGAC SEQ ID NO.9
表2修饰的ASO序列
编号 ASO序列 序列编号
ASO-1 T*C*A*A*G*G*G*A*G*T*T*G*G*A*G*G*G*A*A*A SEQ ID NO.10
ASO-2 A*G*C*A*G*G*T*T*G*G*G*A*G*A*T*G*G*C*A*A SEQ ID NO.11
ASO-3 T*C*C*T*G*G*G*A*C*A*A*A*T*G*T*G*G*A*C*C SEQ ID NO.12
ASO-4 A*A*T*A*G*T*G*T*G*G*T*A*G*T*G*G*A*A*T*G SEQ ID NO.13
ASO-5 G*A*G*T*A*T*G*T*G*T*C*T*A*C*A*G*G*A*G*T SEQ ID NO.14
ASO-6 A*A*A*T*G*A*G*T*G*C*T*C*A*G*G*T*G*G*A*T SEQ ID NO.15
ASO-7 G*A*C*A*A*C*A*A*C*A*T*G*G*C*A*G*G*A*C*C SEQ ID NO.16
ASO-8 C*T*T*G*G*A*A*G*G*A*G*T*G*C*C*T*A*T*A*A SEQ ID NO.17
ASO-9 A*A*T*G*A*A*C*A*C*A*G*G*G*A*A*G*T*G*A*C SEQ ID NO.18
注：*代表硫代磷酸酯修饰。
2、western blot检测ASO的敲除效果
使用ASO与转染试剂混合转染前列腺癌细胞C4-2，转染200nM的最终浓度。48h后，将6孔板从细胞培养箱中取出，取适量RIPA溶液加入细胞中使用细胞刮将细胞与RIPA同时刮到一起，使用微量移液器将其收至标记好的EP管中，涡旋震荡后置于4℃摇床中摇匀30min，其中每10min涡旋震荡30秒。EP管中的细胞裂解液，移入4℃预冷的离心机中，设置为14000rpm，离心30min。吸取上清液移入新的EP管中，即获得细胞总蛋白。使用Bradford测量蛋白浓度，根据测得的蛋白浓度，吸取适量蛋白质至新EP管中，并且按照体积1:4加入5×Loading Buffer，震荡离心后，置于金属浴中95℃加热5min。
配置Western-blot所用的SDS-PAGE凝胶和所用三种缓冲液(电泳缓冲液，电转缓冲液，TBST缓冲液)清洗电泳槽与电泳架子，将两块凝胶以及玻璃板组装到电泳架上，将电泳架放入电泳槽中，加满1×电泳缓冲液。使用量程为10μL的微量移液器将蛋白样本加入泳道中，上样需要轻柔缓慢，防止配平好的蛋白样本因为上样不规范而损失，应当预留出泳道加入5-10μL蛋白Marker。随后盖上电泳槽的盖子。打开电源，调整电压至90V，运行90min左右。将电泳槽中电泳架取出，将其中电泳缓冲液倒出。另外取一个搪瓷方盆，在其中倒入适量的电转缓冲液，将电转夹子打开放入其中，依次放上湿润的海绵垫子、滤纸、以及从玻璃板中取出的凝胶，再将甲醇激活过的PVDF膜在电转液中浸润后，敷在凝胶之上，放上滤纸和海绵垫，将上述物品用电转夹子固定好，插入电转架子中。将电转架子放入电泳槽中，加满1×电转液。将电转槽放入装满冰水混合物的塑料盆中，正确地连上电源，设置电流恒定250mA，电转时间为2h。
电转完毕后，将PVDF膜从电转夹子中取出，放入装有TBST缓冲液的盒子中，使用TBST清洗PVDF膜。然后使用TBST配制的5％的封闭用脱脂奶粉孵育PVDF膜，室温摇床孵育1h。封闭结束后再次使用TBST将膜上附着的牛奶洗净。将膜放入提前配制好的一抗中，最后将抗体放置在4℃摇床上孵育过夜。第二天将膜从一抗中取出，并使用TBST将膜清洗三次，之后选取对应的鼠/兔二抗液，将PVDF膜浸润至二抗液中，室温摇床孵育1h，再使用TBST将膜清洗三次，然后将其放置在干净的玻璃板上，用滤纸适当吸去PVDF膜上的TBST液体，然后用提前1:1配置好的ECL化学发光显影液均匀地滴加到PVDF膜上，放入曝光机中曝光。
实验结果如图1所示，ASO-1、2、3、6、7具有较好效果。
3、western bolt检测ASO的敲除效果
降低浓度与时间(100nM，24h)进行western blot检测，具体操作步骤同上。
结果如图2A所示，ASO-3具有最佳的敲除效果。
4、RT-QPCR检测ASO的敲除效果
体外六孔板培养C4-2细胞，细胞铺板24h后转染细胞。首先将ASO与脂质体转染试剂混合均匀室温孵育20min，将混合物均匀加入培养基中。将混合物均匀加入培养基中。使得ASOYAP1在培养基中的终浓度分别为100nM。于24h后，去除细胞培养基，加入Trizol试剂，提取细胞总RNA。采用Thermo RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit将总RNA反转录为cDNA，采用CWBIO 2×Taq MasterMix、YAP1引物和Sangon Biotech GAPDH内参引物进行RT-QPCR反应，并计算其Ct值换算，得到mRNA的相对水平数值。
YAP1引物序列如下：
前引物序列：5′-CAACTCCAACCAGCAGCAACA-3′(SEQ ID NO.19)，
后引物序列：5′-GCAGCCTCTCCTTCTCCATCTG-3′(SEQ ID NO.20)；
结果如图2B所示，ASO-3组的YAP1具有最低的表达水平。
综合western blot检测以及RT-QPCR检测的实验结果，后续修饰与修饰位点的实验将使用ASO-3序列进行。
3、不同修饰方法的敲除效果检测
从公司(生工Sagon)合成以ASO-3序列为基础，不同修饰方法的序列，包括全链RNA，全链DNA，全链2MOE以及GAPMER-2MOE的不同修饰策略(表3)。经过转染-RNA抽提-RT-qPCR实验，计算其Ct值换算，得到mRNA的相对水平数值，具体操作步骤同上。
表3不同修饰的ASO
Figure BDA0003503637600000171
注：*代表硫代磷酸酯修饰；i2OMe代表2-甲氧乙基修饰
结果显示，GAPMER-2-MOE修饰的ASO在序列相同的条件下具有较强的敲除能力(图3A)。
由于GAPMER修饰策略两侧的2-MOE修饰数量并不固定。为了进一步优化敲低效率，对ASO两侧的修饰数量进行了进一步的对比(表3)并从公司(生工Sagon)合成，其中ASO-3-flank5和MOE修饰的GAPMER/GAPMER-2MOE相同，并同样进行了ASO转染-RNA抽提-RT-qPCR实验的流程，具体操作步骤同上。
结果显示，采用GAPMER-2MOE修饰时，两侧的2MOE修饰数量分别为5时能够获得最强的敲除效果(图3B)。
实施例2甲氧乙基修饰的反义寡核苷酸ASOYAP1敲除YAP1的作用模式
体外六孔板培养C4-2细胞，细胞铺板24h后转染细胞。首先将甲氧乙基修饰的反义寡核苷酸ASOYAP1 ASO-3-flank5与脂质体转染试剂混合均匀室温孵育20min，将混合物均匀加入培养基中。使得ASOYAP1在培养基中的终浓度分别为0nM，50nM，100nM，200nM，48h后去除细胞培养基，分别加入Trizol/RIPA试剂提取细胞总RNA与总蛋白。另铺一板，24h后转染细胞，以100nM终浓度使用脂质体转染ASO。分别于0，12h，24h和48h后，使用同样方法，提取细胞总RNA与总蛋白。采用Thermo RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit将总RNA反转录为cDNA，采用CWBIO 2×Taq MasterMix、YAP1引物和Sangon Biotech GAPDH内参引物进行PCR反应。采用Yap1抗体(ab205270)，GAPDH抗体，BioRad电泳槽套装以及索莱宝SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，进行WB实验，检测Yap1蛋白表达水平。
结果如图4所示，转染后12h，在C4-2细胞中可见到YAP1的RNA与蛋白水平都降低，且随着ASOYAP1浓度的增加，降低的更加明显；转染后48h，可以见到YAP1同样表达水平下降，且相对于转染后24h，YAP1蛋白水平降低更多。
实施例3检测ASOYAP1在多种癌细胞中对YAP1蛋白水平的敲除能力
使用ASO-3-flank5与脂质体转染试剂混合转染乳腺癌MCF-7细胞，肺癌细胞A549细胞，宫颈癌细胞Hela细胞，膀胱癌T24细胞，肝癌细胞HUH-6。使用western blot和RT-QPCR检测100nM ASO转染48h后YAP1蛋白和mRNA的表达水平。
结果如图5所示，在乳腺癌MCF-7细胞，肺癌细胞A549细胞，宫颈癌细胞Hela细胞，膀胱癌T24细胞，肝癌细胞HUH-6中，实验组YAP1 mRNA和蛋白的表达水平都显著下调。
实施例4 YAP1对细胞增殖的影响
1、MTT实验
将前列腺癌细胞C4-2、乳腺癌MCF-7，肺癌细胞A549，宫颈癌细胞Hela，膀胱癌T24，肝癌细胞HUH-6铺板于96孔板(n＝5)中，分别给予对照组ASO-Con和实验组ASO-3-flank5\。置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每隔24h取出一块96孔板。使用PBS溶液或是生理盐水做溶剂，配置四甲基偶氮唑(MTT)溶液，终浓度5mg/ml。于每一孔中加入10μlMTT溶液，再次放于37℃、5％CO2培养箱中孵育2h。2h后取出96孔板，轻轻倒扣在滤纸上，每孔中加入150μlDMSO溶液，避光于摇床上低速摇晃30min使甲臢结晶充分溶解。使用酶标仪在OD值490nm检测各孔吸光度，记录数值，之后每24h取出一个96孔板进行上述操作。
结果如图6所示，随着时间增加，不同细胞系中实验组细胞活力明显下降，细胞增殖能力受到抑制。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 天津市泌尿外科研究所
<120> 反义寡核苷酸ASOYAP1在抑制多种YAP1阳性癌症中的应用
<141> 2022-02-14
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
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<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(20)
<223> 甲氧乙基修饰
<400> 23
uccugggaca aatgtggacc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> 硫代磷酸酯修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 甲氧乙基修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(20)
<223> 甲氧乙基修饰
<400> 24
ucctgggaca aatgtggacc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> 硫代磷酸酯修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> 甲氧乙基修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(20)
<223> 甲氧乙基修饰
<400> 25
ucctgggaca aatgtggacc 20

Claims (10)

1.一种反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸由15-30个核苷酸组成，所述反义寡核苷酸抑制YAP1的表达；
优选的，所述反义寡核苷酸由18-22个核苷酸组成；
优选的，所述反义寡核苷酸由20个核苷酸组成；
优选的，所述反义寡核苷酸是GAPMER寡核苷酸；
优选的，所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO.1-9任一项所示的序列；
优选的，所述靶序列选自SEQ ID NO.1-3、SEQ ID NO.6-9任一项所示的序列；
优选的，所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO.1-3、SEQ ID NO.6-7任一项所述的序列；
优选的，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.对权利要求1所述的反义寡核苷酸进行修饰的反义寡核苷酸；
优选的，所述修饰包括至少1个核苷间键修饰；
优选的，所述核苷间键修饰是硫代磷酸酯修饰；
优选的，所述修饰包括全链的核苷间键修饰；
优选的，所述修饰包括至少1个糖修饰；
优选的，所述糖修饰为2′-O-甲氧乙基修饰；
优选的，所述修饰包括至少6个糖修饰；
优选的，所述修饰包括10个糖修饰；
优选的，所述糖修饰位于反义寡核苷酸序列两侧；
优选的，所述两侧的糖修饰的数量为5。
3.根据权利要求2所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸包括至少1个的核苷间键修饰和至少1个的糖修饰；
优选的，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少1个糖修饰；
优选的，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和至少6个糖修饰；
优选的，所述反义寡核苷酸包括全链的核苷间键修饰和10个糖修饰；
优选的，所述反义寡核苷酸包括全链的硫代磷酸酯修饰和2′-O-甲氧乙基修饰；
优选的，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.23所示。
4.一种缀合物，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的反义寡核苷酸，以及至少一个共价连接到所述寡核苷酸的缀合物部分。
5.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的反义寡核苷酸或权利要求4的缀合物和药学上可接受的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。
6.一种体内或体外用于调节表达YAP1的靶细胞中YAP1表达的方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用权利要求1-3中任一项所述的反义寡核苷酸、权利要求4的缀合物或权利要求5的组合物。
7.权利要求1所述的反义寡核苷酸在制备治疗YAP1阳性癌症的药物组合物中的应用；
优选的，YAP1阳性癌症包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌、舌鳞癌、子宫内膜癌、胆管癌、前列腺癌；
优选的，所述YAP1阳性癌症选自前列腺癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌；
优选的，所述前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌。
8.权利要求2或3所述的反义寡核苷酸在制备治疗YAP1阳性癌症的药物组合物中的应用；
优选的，YAP1阳性癌症包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌、舌鳞癌、子宫内膜癌、胆管癌、前列腺癌；
优选的，所述YAP1阳性癌症选自前列腺癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌；
优选的，所述前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌。
9.权利要求4所述的缀合物在制备治疗YAP1阳性癌症的药物组合物中的应用；
优选的，YAP1阳性癌症包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌、舌鳞癌、子宫内膜癌、胆管癌、前列腺癌；
优选的，所述YAP1阳性癌症选自前列腺癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌；
优选的，所述前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌。
10.权利要求5所述的组合物在制备治疗YAP1阳性癌症的药物组合物中的应用；
优选的，YAP1阳性癌症包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌、舌鳞癌、子宫内膜癌、胆管癌、前列腺癌；
优选的，所述YAP1阳性癌症选自前列腺癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌；
优选的，所述前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌。
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