CN114409757B - 一种蛇毒神经毒素及应用 - Google Patents

一种蛇毒神经毒素及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114409757B
CN114409757B CN202210094328.9A CN202210094328A CN114409757B CN 114409757 B CN114409757 B CN 114409757B CN 202210094328 A CN202210094328 A CN 202210094328A CN 114409757 B CN114409757 B CN 114409757B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cobra
mobile phase
snake venom
peptide
venom neurotoxin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210094328.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114409757A (zh
Inventor
窦雅琪
李泽京
杨涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yunnan Nanzhao Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Yunnan Nanzhao Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yunnan Nanzhao Pharmaceutical Co ltd filed Critical Yunnan Nanzhao Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202210094328.9A priority Critical patent/CN114409757B/zh
Publication of CN114409757A publication Critical patent/CN114409757A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114409757B publication Critical patent/CN114409757B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种蛇毒神经毒素及应用。本发明利用反向HPLC分离收集科博肽中的其他组分，分析鉴定后得到了新的蛇毒神经毒素，其蛋白氨基酸序列为：LECHNQQSSQTPTTTGCSGGETNCYKKRWRDHRGYRTERGCGCPSVKDGIEINCCTTDRCNN，其中第48位的D为非异构天冬氨酸。本发明得到的蛇毒神经毒素具有良好的镇痛作用，适宜作为镇痛药物，其毒性相较科博肽有了极大降低，安全性更高，也具有良好的镇痛作用，更有适合作为临床低毒性镇痛药物，在使用时也更容易进行剂量控制。

Description

一种蛇毒神经毒素及应用
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种蛇毒神经毒素及应用。
背景技术
疼痛是机体受到损伤时发生的一种不愉快的感觉和情绪性的体验，是一组复杂的病理、生理改变的临床表现，疼痛可以是局部的，也可以是全身性疾病的反映，人们把具有以上“疼痛”为主要症状的疾病总称为“痛症”。目前阿片类镇痛药与非甾体类抗炎药都是经典临床镇痛药，用于疼痛治疗的历史悠久。但其临床应用也存在了许多的缺陷和不足，不良反应也是令人生畏。如一些临床用于术后、创伤、癌症等所产生的重度疼痛的强阿片类镇痛药，在临床应用中容易产生依赖性，并且会产生一定程度的耐受性，一旦出现精神依赖性又将给临床用药带来新的更大的问题。
神经毒素(neurotoxin，NT)是蛇毒中一类重要的活性组分，主要分布在眼镜蛇科和海蛇科及蝰科的响尾蛇蛇毒中。纯化的微量眼镜蛇毒神经毒素具有类似吗啡的中枢镇痛作用，用于顽固性疼痛、恶性肿瘤疼痛和关节痛的镇痛治疗。NT的镇痛作用有别于阿片类药物，表现为效价高、持续时间长、无耐受性和成瘾性，是一种很有潜力的新型镇痛药。研究表明，NT的含量以眼镜蛇毒中含量较高，从眼镜蛇毒中分离出的NT具有长短链两种，其中以短链NT镇痛效果更好。
科博肽是从眼镜蛇蛇毒中分离提纯的低分子多肽，其化学名为蛇毒神经毒素。眼镜蛇毒神经毒素与N型乙酰胆碱受体有高度亲和力，能阻止神经肌肉接头神经冲动信号的传递。影响脑内乙酰胆碱的代谢，并能提高人、鼠脑内脑啡肽含量，产生镇痛作用。科博肽在临床上主要用于晚期癌症疼痛、慢性关节痛、坐骨神经痛、三叉神经痛、麻风反应神经痛等慢性疼痛的治疗，长期临床使用表明，科博肽具有良好的镇痛效果，具有无成瘾性、无耐受性，镇痛作用持久，对停药或禁戒海洛因后出现的各种生理和精神依赖症状均有一定疗效，应用范围广，尤其适用于慢性、顽固性、持续性疼痛治疗，出现疗效后可减量维持。但以科博肽为代表的蛇毒神经毒素，具有一定的毒性，在使用时需要严格控制剂量来控制毒性。
因此，寻找一毒性较低，使用时较为容易控制剂量的蛇毒神经毒素类镇痛药物是当务之急。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供蛇毒神经毒素及应用，具体是通过以下技术方案得以实现的：
一种蛇毒神经毒素，所述其蛋白氨基酸序列为：
LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYKKRWR DHRGYRTERG CGCPSVKDGI EINCCTTDRC NN。
进一步的，所述蛋白氨基酸序列LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYKKRWRDHRGYRTERG CGCPSVKDGI EINCCTTDRC NN，其中第48位的D为非异构天冬氨酸。
进一步的，所述蛋白的分子量为6945.9678Da。
进一步的，所述蛇毒神经毒素，是眼镜蛇毒神经毒素。
所述的蛇毒神经毒素的制备方法，是取科博肽原料采用色谱法进行分离纯化。
进一步的，所述制备方法是取科博肽原料采用制备色谱仪进行分离纯化，以Symmetry shield RP18为色谱柱，以含0.1％体积量的三氟乙酸水溶液为流动相A，以含0.1％体积量的三氟乙酸的50％乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，以214nm为检测波长，分别收集主峰后的第3个色谱峰，冷冻干燥即为蛋白氨基酸序列：LECHNQQSSQ TPTTTGCSGGETNCYKKRWR DHRGYRTERG CGCPSVKDGI EINCCTTDRC NN的蛇毒神经毒素，所述梯度流脱条件为：
0-4min，流动相A 92％，流动相B 8％；
4-34min，流动相A 92→60％，流动相B 8→40％；
34-88min，流动相A 60％，流动相B 40％；
38-45min，流动相A 60→92％，流动相B 40→8％。
所述的蛇毒神经毒素在制备镇痛药物方面的应用。
进一步的，所述镇痛药物，是毒性较低的镇痛药物。
所述的蛇毒神经毒素在科博肽杂质分离、成分分析方面的应用。
进一步的，所述在科博肽杂质分离、成分分析方面的应用，是作为科博肽杂质分离、成分分析的标准品或对照品。
随着现代医药工业的发展，出现了大量的蛋白质和多肽类药物分子。蛋白制品在生产和储存过程中会发生复杂的翻译后修饰，如糖基化、N末端的焦谷氨酸化、C末端的赖氨酸截除、氧化、脱酰胺等等，理论上这些异质性的组合可使蛋白分子产生约108种异构体。这些异构体的组合形成了大小异质性、电荷异质性和糖基化修饰的异质性等。由于未经鉴定、可能存在毒性的杂质对健康有害，为提高药物治疗的安全性，应当通过适当方法分离鉴定杂质。本实验经反向HPLC分离收集科博肽中的杂质，通过测定其高分辨分子量、二硫键和翻译后修饰等方法最终鉴定杂质。最终得到了蛋白氨基酸序列为：
LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYKKRWR DHRGYRTERG CGCPSVKDGI EINCCTTDRC NN的成分。
本申请的蛇毒神经毒素分离及鉴定实验：
供试品
供试品名称 供试品批号 供试品状态
科博肽 20191101 固体
科博肽注射液 20190801 液体
实验仪器
1)高分辨质谱仪：Xevo G2-XS QTof(Waters)
2)超高效液相色谱：UPLC(Acquity UPLC I-Class)(Waters)
3)高效液相色谱：LC-20AD，(SHIMADZU)
4)高分辨质谱仪：Q-Exactive Plus，(Thermo Fisher)
5)超高效液相色谱：Vanquish Duo，(Thermo Fisher)
材料和试剂
1)乙腈(Thermo Fisher)
2)水(Thermo Fisher)
3)三氟乙酸(Sigma)
4)色谱柱:Symmetry ShieldTM RP18 5μm(Waters)
5)色谱柱:ACQUITY Peptide BEH C18，1.7μm 2.1mm*150mm(Waters)
6)Trypsin(Promega)
7)Glu-C(Wako)
8)Lys-C(Wako)
实验方法
1)分离收峰
流动相A：0.1％TFA in H2O；流动相B：0.1％TFA in 50％ACN H2O；
样品制备：
称取适量的科博肽粉末，用水配置成20mg/mL。供试品首先采用高效液相色谱系统(LC-20AD，SHIMADZU)进行分离。供试品进样量40uL，经色谱柱分离，流速为1.5ml/min，紫外检测波长214nm，柱温45℃。相关液相色谱梯度设置见下表1。
表1色谱梯度设置
时间/min 流速mL/min 流动相A％ 流动相B％
0.0 1.5 92 8
4.0 1.5 92 8
34.0 1.5 60 40
38.0 1.5 60 40
38.1 1.5 92 8
45 1.5 92 8
供试品经HPLC分离后，根据不同出峰时间进行收集杂质。收集完成后统一冻干，使用水复溶后置于-80℃备用。
2)酶解方法
还原酶解：取各馏分、科博肽和科博肽注射液适量，加入150mM Tris-HCl pH 7.8调整至弱碱性(0.5μg/μL)，加入适量DTT使终浓度为10mM，37℃处理约3h，完成后20mM IAA避光孵育3h，结束后稀释五倍(约0.1μg/μL)，加入适量LysC 37℃酶解过夜。非还原酶解：取各馏分、科博肽和科博肽注射液适量，加入150mM Tris-HCl pH 7.8调整至弱碱性(0.15μg/μL)，加入适量Trypsin 37℃处理过夜，完成后一分为二，一份加入适量Glu-C 37℃酶解6h；另一份继续加入Trypsin 37℃酶解6h。
3)液质联用
a)UPLC-QTOF
高分辨分子量：
采用UPLC液相系统进行分离。流动相A为0.1％FA水溶液，B为0.1％FA乙腈溶液。样品由自动进样器上样，再经色谱柱分离，流速为0.3ml/min，紫外检测波长280nm，柱温80℃，分析时长15min。
样品用XevoG2-XS QTof质谱仪(Waters)进行质谱分析。检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-2000m/z。采用UNIFI(1.8.2，Waters)处理数据，参数见表2。
b)UPLC-QE+
表2 UNIFI参数设置
酶解样品采用UPLC液相系统(Vanquish Duo)进行分离。A液为0.1％FA水溶液，B液为0.1％FA乙腈溶液。酶解肽段经毛细管高效液相色谱分离后使用质谱仪(Q-ExactivePlus)进行质谱检测分析。分析时长：80min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-2000m/z，一级质谱分辨率：70，000at m/z 200，二级质谱分辨率：17，500at m/z 200。原始数据(.raw)文件用Biopharma Finder V1.0(Thermo)软件进行数据检索分析查库参数见表3。
实验结果
表3 Biopharma Finder查库参数
1)供试品分离收峰
供试品科博肽(批号：20191101)HPLC分离UV(紫外214nm)图与Blank对比见附图1，该条件下供试品可以得到较充分分离(分离度接近1.5，详见附图2)。
根据以上液质检测图谱，供试品科博肽(批号：20191101)被分离成3个主要色谱峰P1、P2和P3，含量分别占比约58.6％、11.8％和28.6％(见附图2积分结果)。具体收集过程需要避免高含量成分污染，这里P2与P3同时收集(见附图3)，P1另收集(见附图4)。馏分P1、P2和P3经冻干浓缩复溶之后纯度验证见附图5-附图7，详细对比见表4。
表4供试品科博肽(批号20191101)主要成分P1、P2和P3纯化前后纯度对比
2)高分辨分子量分析
供试品科博肽(批号：20191101)馏分P1、P2和P3经UPLC-QTOF检测，相关鉴定结果见附图8-附图10，分子量对比见表5。
表5供试品科博肽(批号:20191101)馏分P1、P2和P3高分辨分子量信息表
3)二硫键分析
供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101)及其馏分(P1，P2，P3)经非还原Trypsin/Glu-C酶解，酶解产物经液质两用TIC对比见附图11，检测数据经软件分析，二硫键相关肽段的质谱鉴定图谱见附图12-附图16，均鉴定到与理论二硫键配对方式相符的4对二硫键(见表6)。
表6供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101)及其馏分P1、P2和P3二硫键鉴定表
4)翻译后修饰分析
供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101)及其馏分(P1，P2，P3)经还原Lys-C酶解，酶解产物经液质两用TIC对比见图17。
鉴定到P2P3肽段NGIEINCCTTDRCNN的N48位具有较高比例的脱酰胺修饰，具体比例见表7。
表7供试品脱酰胺修饰位点分析
鉴定图谱见附图18-附图20。
P2、P3具有相同的分子量以及相同的脱酰胺位点N48，但是P2、P3蛋白的出峰时间，P2(27.97min)早于P3(28.72min)见图2，脱酰胺肽段NGI EINCCTTDRC NN出峰时间P2(25.07min)也早于P3(25.18min)，可以确认P2峰蛋白为N48位天冬酰胺脱酰胺后形成的天冬氨酸异构体蛋白，P3峰蛋白为N48位天冬酰胺脱酰胺后形成的天冬氨酸蛋白。
本次试验采用液相色谱分离及液质联用检测的方法对供试品进行杂质分析，可以得到如下结论：
1)供试品科博肽(批号：20191101)进行液相色谱分离分析主要检测到P1、P2和P3共计3个色谱峰，经收集后各馏分P1、P2和P3纯度均高于90％，详见表4。
2)高分辨分子量分析：对供试品科博肽(批号：20191101)馏分P1、P2和P3进行高分辨分子量分析，发现P1与科博肽理论分子量一致，为6944.9925Da，杂质P2和P3为科博肽脱酰胺后产物，分子量分别为6945.9770Da、6945.9678Da。
3)二硫键分析：经过二硫键检测分析，馏分P1、P2、P3与供试品科博肽(批号：20191101)及科博肽注射液(批号：20190801)均检测到了与理论一致的四对二硫键(表6)，二硫键无差异，都是Cys3-Cys24、Cys17-Cys41、Cys43-Cys54、Cys55-Cys60。
4)翻译后修饰分析：通过翻译后修饰分析及液相色谱出峰时间的前后可以确定，杂质P2和P3脱酰胺均发生在第48位天冬酰胺上，且P2保留时间在P3之前。脱酰胺肽段形成的天冬氨酸有两种异构形式，异构天冬氨酸出峰时间在非异构天冬氨酸之前，确定杂质P2的第48位脱酰胺主要为异构天冬氨酸。
5)综合可得：
蛋白P1氨基酸序列为：LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYKKRWR DHRGYRTERGCGCPSVKNGI EINCCTTDRC NN.
蛋白P2氨基酸序列为：LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYKKRWR DHRGYRTERGCGCPSVKD(ISO)GI EINCCTTDRC NN.
蛋白P3氨基酸序列为：LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYKKRWR DHRGYRTERGCGCPSVKDGI EINCCTTDRC NN.
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
(1)本发明利用反向HPLC分离收集科博肽中的其他组分，分析鉴定后得到了新的蛇毒神经毒素。
(2)经过分析发现，本发明得到的蛇毒神经毒素具有良好的镇痛作用，适宜作为镇痛药物。
(3)本发明得到的蛇毒神经毒素，其毒性相较科博肽有了极大降低，安全性更高，也具有良好的镇痛作用，更有适合作为临床低毒性镇痛药物，在使用时也更容易进行剂量控制。
(4)本发明得到的蛇毒神经毒素，在给药后1h明显起效，4h后镇痛作用最强，6h后仍具有良好的镇痛作用，适宜作为长效镇痛药。
附图说明
图1是供试品科博肽(批号：20191101)(上)和Blank(下)UV对比图谱。
图2是供试品科博肽(批号：20191101)UV图谱(上、中)和积分表格(下)。
图3是供试品科博肽(批号：20191101)馏分P2与P3收集UV保留时间示意图。
图4是供试品科博肽(批号：20191101)馏分P1收集UV保留时间示意图。
图5是供试品科博肽(批号：20191101)馏分P1纯度验证结果图。
图6是供试品科博肽(批号：20191101)馏分P2纯度验证结果图。
图7是供试品科博肽(批号：20191101)馏分P3纯度验证结果图。
图8是供试品科博肽(批号：20191101)馏分P1高分辨分子量鉴定图谱(上：UV鉴定图谱，中：一级质谱图谱，下：单同位素相对分子量([M+H]+))。
图9是供试品科博肽(批号：20191101)馏分P2高分辨分子量鉴定图谱(上：UV鉴定图谱，中：一级质谱图谱，下：单同位素相对分子量([M+H]+))。
图10是供试品科博肽(批号：20191101)馏分P3高分辨分子量鉴定图谱(上：UV鉴定图谱，中：一级质谱图谱，下：单同位素相对分子量([M+H]+))。
图11是供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101)及其馏分(P1，P2，P3)非还原Trypsin/Glu-C酶解产物TIC对比图。
图12是供试品科博肽(批号：20191101)二硫键鉴定图谱。
图13是供试品科博肽注射液(批号：20190801)二硫键鉴定图谱。
图14是供试品科博肽(批号：20191101)馏分P1二硫键鉴定图谱。
图15是供试品科博肽(批号：20191101)馏分P2二硫键鉴定图谱。
图16是供试品科博肽(批号：20191101)馏分P3二硫键鉴定图谱。
图17是供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101)及其馏分(P1，P2，P3)还原Lys-C酶解产物TIC对比图。
图18是供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101)及其馏分(P1，P2，P3)肽段LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYK鉴定XIC对比图。
图19是供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101)及其馏分(P1，P2，P3)肽段RWR DHRGYRTERG CGCPSVK鉴定XIC对比图。
图20是供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101)及其馏分(P1，P2，P3)肽段NGI EINCCTTDRC NN鉴定XIC对比图。
图21是各组小鼠不同时间痛阀值变化曲线图。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例
将分离得到的蛋白P1、P2、P3进行镇痛作用研究实验。
实验材料
受试样品：
P1、P2、P3，均为无色澄清液体。
样品情况如下：
蛋白P1氨基酸序列为：LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYKKRWR DHRGYRTERGCGCPSVKNGI EINCCTTDRC NN.
蛋白P2氨基酸序列为：LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYKKRWR DHRGYRTERGCGCPSVKD(ISO)GI EINCCTTDRC NN.
蛋白P3氨基酸序列为：LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYKKRWR DHRGYRTERGCGCPSVKDGI EINCCTTDRC NN.
受试动物：
昆明种小鼠，雌性，体重18-22g。由贵州医科大学实验动物中心提供。动物合格证号:SCXK(黔)2018-0001。小鼠每笼6只，由专人饲养管理。动物室光照充足，通风和空调设备良好，室温18～25C，相对湿度50～70％，实验室和洁净动物饲养柜均按常规定期消毒。动物于该环境饲养3天，用于实验。
主要仪器及其他试剂
智能热板仪，YLS-6B型，安徽耀坤生物科技有限公司。单道可调移液器，100-1000μL型，德国Eppendorf公司。单道可调移液器，10-100μL型，德国Eppendorf公司。电子天平，AB104-S型，METTLERTOLEDO公司。盐酸吗啡，国营东北第六制药厂，批号:610902。0.9％氯化钠注射液(生理盐水)，贵州科伦药业有限公司，批号:E120091503。
试剂样品配制
盐酸吗啡溶液的配制:精密称取盐酸吗啡粉末3mg，溶解于1.5mL生理盐水中即得。P1高剂量组所用P1溶液的配制:用移液器精准量取P1样品15μL，加入4985μL生理盐水混匀，得到P1母液5000μL；再取P1母液3000μL，加入1000μL生理盐水混匀，即得P1高剂量组所用P1溶液。P1低剂量组所用P1溶液的配制:取P1母液1500μL，加入1500μL生理盐水混匀，即得P1低剂量组所用P1溶液。P2溶液的配制:用移液器精准量取P2样品24μL，加入4976μL生理盐水混匀，即得P2组所用P2溶液。P3溶液的配制:用移液器精准量取P3样品17μL，加入4983μL生理盐水混匀，即得P3组所用P3溶液。以上溶液均需现配现用。
实验方法
筛选
取雌性昆明种小鼠若干，逐一放置于热板仪.上检测小鼠的痛阙值。具体方法为:热板仪温度调至55℃，待仪器预热后将小鼠逐一放置于热板仪上，在小鼠足底接触到热板仪台面的同时开始计时，接着观察小鼠出现添后足的表现，在小鼠出现添后足的瞬间停止计时,记录到的时间即为小鼠的痛阈值。根据测试结果，筛选出5s<痛阈值<30s的小鼠，并剔除在热板仪上容易出现跳跃反应的小鼠，即为合格小鼠。
分组
取筛选合格的小鼠72只，按体重随机分成6个组，分别为:对照组、阳性组(吗啡组)、P1高剂量组、P1低剂量组、P2组和P3组，每组12只小鼠。
给药
对照组给生理盐水，吗啡组给吗啡10mg/kg,P1高剂量组给P117.475ug/kg，P1低剂量组给P111.65ug/kg，P2组给P223.3ug/kg，P3组给P323.3ug/kg。给药途径为肌肉注射，给药容积均为5mL/kg。
指标检测
各组动物给药前(给药0h)先测1次痛阈值作对照,即记录将小鼠置于55％C热板仪上出现舔后足的时间。再于给药后0.5h、1h、2h、4h、6h分别测定各组小鼠痛阈值。若小鼠在60s内仍未出现添后足反应，则应取出小鼠，其痛阈值计为60s。根据结果绘制各组小鼠给药前及给药后不同时间痛阈值变化曲线(药效-时间曲线)，并按下列公式计算痛阈提高百分率。
统计学分析
实验数据用SPSS 26.0统计软件进行统计与分析，所有数据均为计量资料,以均值士标准差(x+s)表示，当数据符合正态分布和方差齐性时，组间对照采用t检验，不满足正态分布采用非参数检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
实验结果
各组小鼠给药前及给药后不同时间痛阀值如表8所示,给药后不同时间痛阀提高百分率如表9所示，各组小鼠不同时间痛阀值变化曲线如附图21所示。
表8
注：(1)VS各自给药前，(1)表示P＜0.01；(2)VS对照组，(2)表示P＜0.05，(3)表示P＜0.01；(3)VSP1高剂量组，(4)表示P＜0.05，(5)表示P＜0.01；(4)VS P1低剂量组，(6)表示P＜0.05。
表9
通过与自身给前对照，发现:P1高、低剂量组小鼠给药后1h～6h的痛阈值较自身给药前明显延长(P<0.01)，P2组、P3组小鼠给药后2h～6h的痛阈值较自身给药前明显延长(P<0.01)。考虑到，在热板法镇痛实验中需要多次进行小鼠痛阈值测:量,可能存在随着测量次数的增多而使小鼠对热刺激所致的疼痛敏感性降低，本研究还设置了注射生理盐水的对照组。通过与对照组的比较，发现:P1高剂量组小鼠给药后2h、4h、6h时的痛阈值较对照组明显延长(P<0.05,P<0.01)P1低剂量组、P2组和P3组小鼠给药后4h、6h时的痛阙值较对照组明显延长(P<0.05,P<0.01)。以上结果提示，P1、P2和P3均具有明确的镇痛作用，其中高剂量P1在给药后2h左右表现出明显镇痛活性，P2和P3在给药后4h左右表现出明显镇痛活性，三者均在持续到给药后6h依然具有镇痛活性。
通过对P1高剂量组、P1低剂量组、P2组和P3组小鼠不同时间痛阈值变化曲线分析发现，4条曲线变化趋势一致,均为在给药后0.5h～4h段随给药时间的推移曲线逐渐上升，到给药后4h时升至最高点，给药后4h～6h段有所下降；其中，P1高剂量组曲线上升最为明显，在2h～6h段高于其他3组的曲线:4个组的曲线均在给药后1h～6h段高于对照组曲线。提示P1、P2和P3在给药后4h左右镇痛作用最强，在给药后6h左右仍具有明显的镇痛作用。
并且本申请研究过程中，给药剂量依据科博肽注射液的临床给药剂量进行设计。科博肽注射液的临床给药剂量为140ug/次，成人体重按60kg计，成人每次给药.公斤体重剂量为140ug/60kg-2.33ug/kg,折算成小鼠等效剂量约为23.3ug/kg，原计划设计P1、P2、P3给药剂量均为23.3ug/kg，实验中，按23.3ug/kg剂量分别.给小鼠肌肉注射P1、P2和P3后，注射P1的10只小鼠全部死亡，注射P2和P3的所有小鼠均未出现死亡及其他异常。
综上所述，科博肽注射液主要成分P1、P2和P3均具有明确的镇痛作用，其中p1的镇痛作用最强，但P1的毒性也明显大于P2和P3；P2与P3的镇痛作用差异不明显。同时，P1、P2、P3三种成分的镇痛作用均在给药后4h左右最强，持续到给药后6h左右依然能表现出镇痛活性。将成分P3用于制备镇痛药物，可以得到毒性低，副作用小，并且仍然具有良好镇痛效果的新型镇痛药物。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 云南南诏药业有限公司
<120> 一种蛇毒神经毒素及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 62
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Leu Glu Cys His Asn Gln Gln Ser Ser Gln Thr Pro Thr Thr Thr Gly
1 5 10 15
Cys Ser Gly Gly Glu Thr Asn Cys Tyr Lys Lys Arg Trp Arg Asp His
20 25 30
Arg Gly Tyr Arg Thr Glu Arg Gly Cys Gly Cys Pro Ser Val Lys Asn
35 40 45
Gly Ile Glu Ile Asn Cys Cys Thr Thr Asp Arg Cys Asn Asn
50 55 60
<210> 2
<211> 62
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Leu Glu Cys His Asn Gln Gln Ser Ser Gln Thr Pro Thr Thr Thr Gly
1 5 10 15
Cys Ser Gly Gly Glu Thr Asn Cys Tyr Lys Lys Arg Trp Arg Asp His
20 25 30
Arg Gly Tyr Arg Thr Glu Arg Gly Cys Gly Cys Pro Ser Val Lys Asp
35 40 45
Gly Ile Glu Ile Asn Cys Cys Thr Thr Asp Arg Cys Asn Asn
50 55 60
<210> 3
<211> 62
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Leu Glu Cys His Asn Gln Gln Ser Ser Gln Thr Pro Thr Thr Thr Gly
1 5 10 15
Cys Ser Gly Gly Glu Thr Asn Cys Tyr Lys Lys Arg Trp Arg Asp His
20 25 30
Arg Gly Tyr Arg Thr Glu Arg Gly Cys Gly Cys Pro Ser Val Lys Asp
35 40 45
Gly Ile Glu Ile Asn Cys Cys Thr Thr Asp Arg Cys Asn Asn
50 55 60

Claims (8)

1.一种蛇毒神经毒素，其特征在于，所述其蛋白氨基酸序列为：
LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYKKRWR DHRGYRTERG CGCPSVKDGI EINCCTTDRC NN。
2.如权利要求1所述的蛇毒神经毒素，其特征在于，所述蛋白的分子量为6945.9678Da。
3.如权利要求1所述的蛇毒神经毒素，其特征在于，所述蛇毒神经毒素，是眼镜蛇毒神经毒素。
4.权利要求1所述的蛇毒神经毒素的制备方法，其特征在于，是取科博肽原料采用制备色谱仪进行分离纯化，以Symmetry shield RP18为色谱柱，以含0.1％体积量的三氟乙酸水溶液为流动相A，以含0.1％体积量的三氟乙酸的50％乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，以214nm为检测波长，分别收集主峰后的第3个色谱峰，冷冻干燥即为蛋白氨基酸序列：LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYKKRWR DHRGYRTERG CGCPSVKDGI EINCCTTDRC NN的蛇毒神经毒素，所述梯度流脱条件为：
0-4min，流动相A92％，流动相B 8％；
4-34min，流动相A92→60％，流动相B 8→40％；
34-88min，流动相A60％，流动相B 40％；
38-45min，流动相A60→92％，流动相B 40→8％。
5.权利要求1所述的蛇毒神经毒素在制备镇痛药物方面的应用。
6.如权利要求5所述的蛇毒神经毒素在制备镇痛药物方面的应用，其特征在于，所述镇痛药物，是毒性较低的镇痛药物。
7.权利要求1所述的蛇毒神经毒素在科博肽杂质分离、成分分析方面的应用。
8.如权利要求7所述的蛇毒神经毒素在科博肽杂质分离、成分分析方面的应用，其特征在于，所述在科博肽杂质分离、成分分析方面的应用，是作为科博肽杂质分离、成分分析的标准品或对照品。
CN202210094328.9A 2022-01-26 2022-01-26 一种蛇毒神经毒素及应用 Active CN114409757B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210094328.9A CN114409757B (zh) 2022-01-26 2022-01-26 一种蛇毒神经毒素及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210094328.9A CN114409757B (zh) 2022-01-26 2022-01-26 一种蛇毒神经毒素及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114409757A CN114409757A (zh) 2022-04-29
CN114409757B true CN114409757B (zh) 2023-07-18

Family

ID=81277122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210094328.9A Active CN114409757B (zh) 2022-01-26 2022-01-26 一种蛇毒神经毒素及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114409757B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9815875B2 (en) * 2008-02-19 2017-11-14 Myocept Inc. Postsynaptically targeted chemodenervation agents and their methods of use

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000017356A2 (en) * 1998-09-18 2000-03-30 The Rockefeller University Lynx, a novel family of receptor ligands in the central nervous system, corresponding nucleic acids and proteins and uses therof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9815875B2 (en) * 2008-02-19 2017-11-14 Myocept Inc. Postsynaptically targeted chemodenervation agents and their methods of use

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Neurotoxin from Naja naja atra venom inhibits skin allograft rejection in rats;Yin-Li Xu et al.;International Immunopharmacology;全文 *
neurotoxin, NTX [Naja naja=Formosan cobra, ssp. atra, venom, Peptide, 62 aa];Chiou,S.H. et al.;GenBank: AAB25735.1;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114409757A (zh) 2022-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rjeibi et al. Purification, synthesis and characterization of AaCtx, the first chlorotoxin-like peptide from Androctonus australis scorpion venom
DE3688333T2 (de) Antikörper gegen Polypeptide, die gegen Peptide oder Proteine mit mindestens teilweise bekannter Aminosäure oder kodierender Nukleotidsequenz komplementär sind und diesbezügliches Aufbauverfahren.
NZ502480A (en) Pharmaceutical peptide formulations for treatment of dust mite allergy
US20160251403A1 (en) Peptide combinations and uses thereof in treating dust mite allergy
CN114409757B (zh) 一种蛇毒神经毒素及应用
CN114349837B (zh) 一种蛇毒神经毒素及应用
CN114470157B (zh) 一种镇痛药物及其应用
AU717187B2 (en) Pharmaceutical peptide formulations for treatment of dust mite allergy
WO2016049881A1 (zh) 芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104、其制备方法及应用
CN107001416B (zh) 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl04、其制备方法及应用
ES2543198T3 (es) Mutantes de FSH
CN109988228B (zh) 一种蒙古黄芪病程相关蛋白及其晶体、生长方法和用途
CN112851758B (zh) 一种罗非鱼鳞促骨形成肽及其应用
CN101314617B (zh) 一种新的蛇毒多肽及其制备方法和应用
Dibiase et al. The design of analytical methods for use in topical epidermal growth factor product development
WO2016049864A1 (zh) 芋螺毒素多肽κ-CPTx-btl01、其制备方法及应用
CN107001433B (zh) 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl03、其制备方法及应用
CN112194730A (zh) 一种多肽ti-16及其用途
WO2016101275A1 (zh) 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl02、其制备方法及应用
CN107949567B (zh) 三种芋螺毒素肽、其制备方法及应用
CN107531756B (zh) 两种芋螺毒素肽、其制备方法及应用
WO2016049869A1 (zh) 芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt102、其制备方法及应用
CN107108695B (zh) 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl01、其制备方法及应用
CN100569797C (zh) 一种十一肽及其用途
Brooks et al. Preparative purification of phosphorylated and nonphosphorylated bovine prolactins

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant