CN114404446B

CN114404446B - 一种抗病毒感染的复合物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN114404446B
Application number: CN202210006365.XA
Authority: CN
Inventors: 刘杰; 曹婷; 牟军; 顾芯瑕
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2022-01-04
Filing date: 2022-01-04
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2042-01-04
Also published as: CN114404446A

Abstract

本发明提供了一种抗病毒感染的复合物，它是以聚氨基葡萄糖(Chitosan,C)1摩尔份、N‑乙酰神经氨酸(Sialic acid,S)400～500摩尔份、丙三醇(Glycerol,G)4000～5000摩尔份和药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的液体制剂(GSC)。上述复合物与粘膜组织相容性好，无明显不良反应，可附着于鼻粘膜表面，形成透气性佳、附着力强、结构稳定的纳米孔状凝胶膜结构，可有效阻断呼吸道病毒对鼻粘膜上皮细胞的感染，并以物理阻挡的形式阻止呼吸道病毒感染诱发的呼吸道炎症，从而预防呼吸道病毒引起的疾病；同时可润泽鼻粘膜，避免干燥带来的鼻粘膜损伤，具有很好的推广应用价值。

Description

一种抗病毒感染的复合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗病毒感染的复合物及其制备方法和用途。

背景技术

呼吸道传染性疾病，特别是病毒感染性疾病，具有病原种类多、易扩散、传播快、传播途径多、发病率和死亡率高等特点，对公共卫生和人类健康带来严重的威胁。2015年的呼吸道合胞病毒(RSV)流行，在全球范围内导致3310万人感染，320万人住院治疗，59600例5岁以下儿童死亡，给全世界经济和社会的发展带来了巨大的负担。除此外，多种类型的腺病毒、鼻病毒、偏肺病毒等时刻威胁着人类的健康和生命。因此，发展有效的预防和治疗措施是维持健康和生命，提高公共卫生水平的当务之急。

目前针对呼吸道病毒感染的药物少，主要以流感和RSV为主，且有效性和安全性均有待提高；预防呼吸道病毒感染的疫苗也有限，除紧急授权使用的新型冠状病毒疫苗外，正式上市的仅有流感病毒疫苗。而现有流感病毒疫苗的有效性、针对性、免疫力的持续性等因流行株的变化存在不确定性。其它众多的呼吸道病毒如SARS-CoV、MERS-CoV、RSV类、腺病毒类、鼻病毒、偏肺病毒等感染均无有效疫苗预防。创新发展防御方式，发展新的预防手段既可弥补目前疫苗和药物的不足，也可在将来作为疫苗和药物的辅助和替代措施。

呼吸道病毒传播以空气和气溶胶为主，以上呼吸道，特别是鼻粘膜上皮细胞为主要入侵靶细胞。针对这一特点，从保护鼻粘膜出发，以物理屏蔽和配体消耗的方式阻断呼吸道病毒与上皮细胞的受体结合，将有助于达到有效控制病毒的感染和疾病的传播的目的。然而，目前用以阻断病毒通过鼻粘膜入侵的鼻粘膜保护剂还鲜有报道，部分用于鼻粘膜清洁消毒和保护的制剂或是含有蛋白类、多肽类物质，存在诱发过敏的风险，副作用大，安全性差，应用范围有限；或是由于消毒杀菌剂的刺激性大，使用者的接受性差，难以推广。发明专利CN100494368C公开了一种可用于阻止流感病毒血凝抗原蛋白与受体结合的唾液酸寡聚糖-壳聚糖复合体，验证了其对禽流感病毒的血凝抑制作用。但其对于呼吸道病毒的阻断效果，以及对于鼻粘膜的刺激性和保护效果尚未可知。而且唾液寡聚糖为多糖，结合位点、结合量不确定，难以控制质量和标准化，难以达到稳定的功效。

因此，进一步探索能阻断呼吸道病毒通过鼻粘膜入侵，并且对鼻粘膜起到湿润、保护作用的鼻粘膜保护剂，将为多种呼吸道病毒疾病的防治提供新的有效手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种为鼻粘膜提供湿润保护，同时具有阻断呼吸道病毒入侵的鼻粘膜保护剂。

本发明提供了一种抗病毒感染的组合物，它由如下摩尔份数的原料组成：聚氨基葡萄糖1份、N-乙酰神经氨酸400～500份、丙三醇4000～5000份。

进一步地，上述聚氨基葡萄糖的分子量为317000-370000Dalton，优选地，脱乙酰度≥75％。

本发明还提供了一种抗病毒感染的复合物，它是上述的组合物与药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

进一步地，上述制剂为液体制剂，所述液体制剂组合物的浓度不低于1.5mg/ml。

更进一步地，上述液体制剂pH为2～5.4。

本发明还提供了上述的复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)聚氨基葡萄糖加入含有1～3％的酸的水中，溶解均匀后，加碱调节pH至2～5.4，得聚氨基葡萄糖溶液；

(2)加入N-乙酰神经氨酸，混合均匀，得N-乙酰神经氨酸-聚氨基葡萄糖复合物溶液；

(3)加入丙三醇，混合均匀，即得。

进一步地，步骤(1)还包括如下步骤：将聚氨基葡萄糖溶液通过0.4～0.5μm的过滤器过滤。

本发明还提供了上述组合物或者复合物在抗病毒感染的药物中的用途。

进一步地，上述药物是阻断呼吸道病毒感染鼻粘膜上皮细胞，和/或阻挡呼吸道病毒诱发呼吸道炎症的药物。

更进一步地，上述呼吸道病毒包括流行性感冒病毒、呼吸道合胞病毒、SARS病毒、MERS病毒、腺病毒、鼻病毒或偏肺病毒。

本发明的有益效果：

1、本发明的复合物(鼻粘膜保护剂)可有效阻断呼吸道病毒对鼻粘膜上皮细胞的感染，同时可以以物理阻挡的形式防止呼吸道病毒诱发的呼吸道炎症，从而可以预防呼吸道病毒引起的疾病，具有很好的推广应用价值。

2、本发明的复合物(鼻粘膜保护剂)可附着于鼻粘膜表面，形成透气性佳、附着力强、结构稳定的纳米孔状凝胶膜结构，不影响正常呼吸的同时，可润泽鼻粘膜，避免干燥带来的鼻粘膜损伤。

3、本发明复合物(鼻粘膜保护剂)的原料生物相容性好，刺激性和副作用小。

本发明“聚氨基葡萄糖”的CAS号为9012-76-4。“呼吸道合胞病毒”为Respiratorysyncytial virus，简称RSV。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为筛选聚氨基葡萄糖与N-乙酰神经氨酸的比例，构建优化的本发明复合物GSC的实验结果。

图2为本发明复合物GSC阻断流感病毒APR8对MDCK上皮细胞感染的实验结果，及其与聚氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸混合物(SC)或丙三醇(G)单独作用效果的比较。

图3为本发明复合物GSC与对比例1“唾液酸寡糖-壳聚糖”复合物阻断流感病毒APR8对MDCK上皮细胞感染的效果比较。

图4为GSC保护BALB/c小鼠免受流感病毒APR8感染实验中肺组织的病毒载量检测。

图5为GSC保护BALB/c小鼠免受流感病毒APR8感染实验中小鼠的体重变化。

图6为GSC保护BALB/c小鼠免受流感病毒APR8感染实验中肺组织HE染色的病理学观察结果。

图7为GSC阻断呼吸道合胞病毒(RSV)感染BALB/c小鼠实验中肺组织的病毒载量。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例1、制备本发明复合物的方法

(1)称取25mg聚氨基葡萄糖(Sigma,美国，分子量317000-370000 Dalton，脱乙酰度≥75％)加入8mL 2％冰乙酸(KESHI,成都市科隆化学品有限公司)溶液，在25℃震荡混匀，待混匀后，用2M的NaOH(KESHI,成都市科隆化学品有限公司)溶液调节pH至5.4，定容到10mL，即配成2.5mg/mL的聚氨基葡萄糖溶液。用0.45μm的过滤器过滤聚氨基葡萄糖溶液。

(2)按照5：2的浓度比例加入N-乙酰神经氨酸(Sigma,美国)，配制N-乙酰神经氨酸-聚氨基葡萄糖复合物(下文简称SC)溶液，聚氨基葡萄糖终浓度为2.5mg/mL，N-乙酰神经氨酸终浓度为1mg/mL。

(3)按照体积比0.233％加入丙三醇(G)混匀，即得本发明复合物，下文简称GSC。

对比例1、唾液酸寡糖-壳聚糖复合物

按照发明专利CN100494368C的说明书实施例1公开的方法制备。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、本发明组分、比例的筛选

1、聚氨基葡萄糖与N-乙酰神经氨酸的比例

1.1实验方法

首先按照实施例1的制备方法分别制备了聚氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸的摩尔比为1:400～500(GSC1)、1:800～1000(GSC2)和1:1600～2000(GSC3)的GSC复合物，其中丙三醇的体积比均为0.233％。在小鼠APR8流感模型中，比较不同比例的GSC复合物的阻挡病毒感染肺组织的能力。

1.1.1动物实验设计

(1)实验组：在感染病毒前1天和前30分钟，鼻腔分别给予不同比例的GSC(GSC1，GSC2和GSC3，GSC1、GSC2、GCS3的浓度分别是2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL，保证N-乙酰神经氨酸的浓度均为1mg/mL)50μL/只小鼠，各实验小组5只小鼠；对照组(NS)：鼻腔给予生理盐水50μL/只小鼠，共5只小鼠；空白组：不感染病毒，鼻腔给予GSC1 50μL/只小鼠，共5只小鼠。

(2)流感病毒感染。实验组和对照组均通过鼻腔给予200TCID₅₀/mL的APR8，25μL/只小鼠；空白组：鼻腔给予生理盐水25μL/只小鼠。

(3)每天记录小鼠体重。

(4)在感染第4天，安乐死处理小鼠。组织称重匀浆，用于检测肺组织中的病毒载量。

1.1.2测定肺组织中的APR8病毒载量

(1)将肺组织加入M型组织匀浆管(gentleMACS^TM,Miltenyi)，加入500μL冷的无菌PBS，用组织处理机gentleMACS^TM Octo Dissociator(gentleMACS^TM,Miltenyi)匀浆，选用程序“RNA_02_01(Duration：83s)”。

(2)4℃，500g，5min离心处理组织匀浆。在生物安全柜中，将上清液分装于无菌冻存管，200μL/管，共2管，置于-80℃保存。

(3)取组织匀浆样品，用病毒RNA提取试剂盒(Qiagen，德国)提取RNA。

(4)用逆转录试剂盒(TaKaRa，日本)将步骤3)的RNA逆转录成cDNA。

(5)用合成的HA质粒作为标准曲线的模版，使用步骤(4)的cDNA作为待测样本模版，进行绝对定量qPCR。引物序列为：

正向引物(SEQ ID NO.1)：TGGAGCCATTGCCGGTTTTA；

反向引物(SEQ ID NO.2)：CTGCATAGCCTGATCCCTGT；

所述HA的基因序列(SEQ ID NO.3)为：

AGTGCCCAAAATACGTCAGGAGTGCCAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACATTCCGTCCATTCAATCCAGAGGTCTATTTGGAGCCATTGCCGGTTTTATTGAAGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGGATGGTACGGTTATCATCATCAGAATGAACAGGGATCAGGCTATGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGGGATTACAAACAAGGTGAACTCTGTTATCGAGAAAAT，质粒载体为PUC57。

qPCR反应体系

1.2实验结果

实验结果(图1)显示，聚氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸的摩尔比为1:400～500组(GSC1)的病毒载量显著低于对照组、聚氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸的摩尔比为1:800～1000组(GSC2)和1:1600～2000组(GSC3)。GSC2和GSC3组的病毒载量与对照组没有显著性差异。本实验表明聚氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸的摩尔比优选为1:400～500。后文的实验均采用实施例1制备的聚氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸的摩尔比为1:400～500的GSC进行。

2、丙三醇的使用

2.1实验方法

(1)MDCK上皮细胞接种于96孔板中(NEST，中国)，1*10⁴个/孔，培养基DMEM-高糖(Gibco，美国)中培养过夜。

(2)弃培养上清，分别加入实施例1中配制的GSC(2.5mg/mL，以聚氨基葡萄糖浓度计)、SC(2.5mg/mL，以聚氨基葡萄糖浓度计，不含丙三醇成分)或G(用NS配制的0.233％的丙三醇)。NS对照组仅加入生理盐水(NS，normal saline)。50μL/孔，37℃孵育1h。

(3)加入200TCID₅₀/mL的流感病毒APR8溶液，25μL/孔，37℃培养1h。

(4)弃去上清液，加入细胞培养基DMEM，200μL/孔，37℃培养72h。

(5)收集细胞和培养基上清液。

(6)用病毒RNA提取试剂盒(Qiagen，德国)，提取步骤(5)的细胞和培养基上清液的RNA。

(7)用逆转录试剂盒(TaKaRa，日本)将步骤(6)的RNA逆转录成cDNA。

(8)用合成的HA质粒作为标准曲线的模版，使用步骤(7)的cDNA作为待测样本模版，进行绝对定量qPCR。引物序列、HA的基因序列和qPCR反应体系实验例1的1.1.2第(5)步的记载。

2.2实验结果

实验结果显示(图2)，在有本发明实施例1制备的复合物(GSC)存在的情况下，收集的细胞和培养上清中无感染细胞复制的病毒(拷贝数低于检测下限58copies)。非GSC处理样本中，NS处理组APR8病毒拷贝数达到6.78*10⁶copies，SC处理组APR8病毒拷贝数达到1*10³copies，G组(丙三醇组)的APR8病毒拷贝数达到2*10⁶copies。结果显示GSC和SC均有阻断流感病毒APR8对MDCK上皮细胞的感染而扩增的效果，但GSC的阻断作用较SC明显增强。

即是说，丙三醇(G)单独使用没有明显阻断病毒感染的作用，但丙三醇加入聚氨基葡萄糖-N-乙酰神经氨酸的复合物(CS)中，得到的GSC对病毒的阻断效果远高于聚氨基葡萄糖-N-乙酰神经氨酸复合物(CS)的效果，说明本发明将丙三醇(G)与聚氨基葡萄糖-N-乙酰神经氨酸(SC)复合使用取得了协同增效抗病毒的作用。

3、聚氨基葡萄糖分子量的筛选

聚氨基葡萄糖分子量的选择是依据人体呼吸道粘膜上皮细胞表面粘液层的理化特性、喷雾时形成的雾状颗粒大小和形成的膜的流体状态综合而定。分子量越大粘稠度越高，与粘液层的相容性和亲和力越低，雾状颗粒大或难以形成雾状颗粒，膜的成型差；相反，分子量越低粘稠度越小，流动性高，难以在粘液层的表面形成保护性的膜。我们在体外对不同分子量大小的聚氨基葡萄糖溶液在贴壁细胞表层的分散和附着情况进行了观测，并结合喷雾形成的颗粒大小(以5-10μm大小颗粒主要散落在鼻咽部为宜)，选择了分子量为317000-370000Dalton的聚氨基葡萄糖。这个分子量大小范围内，现有商品化的聚氨基葡萄糖脱乙酰度均在≥75％左右。

实验例2、本发明复合物的抗病毒感染作用

1、不同浓度的本发明复合物GSC阻断流感病毒感染上皮细胞MDCK的效果以及与对比例复合物的比较

1.1实验方法：参照实验例1的2.1部分所述，步骤(2)中加入的药物为不同浓度(0.61mg/ml、0.97mg/ml、1.56mg/ml、2.5mg/ml、4mg/ml)的GSC或等同浓度的对比例1复合物。

1.2实验结果：如图3所示，随浓度的增加，GSC阻断病毒感染MDCK细胞的能力逐渐增强，在1.8mg/ml及以上的浓度条件下即可100％阻断病毒的感染；而对比例的“唾液酸寡糖-壳聚糖复合体”在浓度等于或低于1.56mg/ml的浓度条件下对病毒感染没有阻断作用，在最高测试浓度(4mg/ml)的条件下仅能阻断50％的病毒感染。结果表明本发明复合物对病毒感染的阻断作用明显高于现有技术报道的“唾液酸寡糖-壳聚糖”复合物。

2、本发明复合物GSC保护BALB/c小鼠免受流感病毒APR8感染

2.1实验方法

2.1.1动物实验设计

(1)实验组：在感染病毒前1天和前30分钟，鼻腔给予GSC 50μL/只小鼠，共10只小鼠；对照组：鼻腔给予生理盐水50μL/只小鼠，共10只小鼠；空白组：不感染病毒，鼻腔给予GSC 50μL/只小鼠，共10只小鼠。

(3)每天记录小鼠体重。

(4)在感染第4天，每组分别安乐死处理5只小鼠。左肺组织称重匀浆，用于检测肺组织中的病毒载量。

(5)在感染第10，安乐死处理每组剩余的5只小鼠。左肺组织经固定后用于组织切片进行HE染色，观察组织病理变化。。

2.1.2测定肺组织中的APR8病毒载量

(1)将肺组织加入M型组织匀浆管(gentleMACS^TM,Miltenyi)，加入500μL冷的无菌PBS，用组织处理机gentleMACS^TM Octo Dissociator)匀浆，选用程序“RNA_02_01(Duration：83s)”。

(2)离心：4℃，500g，5min。在生物安全柜中，将上清液分装于无菌冻存管，200μL/管，共2管，置于-80℃保存。

(3)取其中一管，用病毒RNA提取试剂盒(Qiagen，德国)提取RNA。

(4)用逆转录试剂盒(TaKaRa，日本)将步骤3)的RNA逆转录成cDNA。

(5)用步骤(4)的cDNA作为样待测本模版，方法同实施例1中1.1.2部分的步骤(5)进行qPCR。

2.1.3肺组织切片HE染色

(1)将小鼠左肺置于5mL福尔马林固定过夜。

(2)组织脱水：将组织块从固定液中取出，PBS中漂洗1h，然后组织脱水，程序如下：70％乙醇浸泡30min，80％乙醇浸泡30min，90％乙醇浸泡30min，95％乙醇Ⅰ浸泡30min，95％乙醇Ⅱ浸泡30min，无水乙醇Ⅰ浸泡30min，无水乙醇Ⅱ浸泡30min，无水乙醇Ⅲ浸泡30min，二甲苯Ⅰ浸泡30min，二甲苯Ⅱ浸泡30min。

(3)包埋。

(4)切片，切片厚度为5μm，连续切片。

(5)烤片：65℃，烤片过夜。

(6)脱蜡复水：二甲苯Ⅰ浸泡10min，二甲苯Ⅱ浸泡10min，无水乙醇Ⅰ浸泡5min，无水乙醇Ⅱ浸泡5min，95％乙醇Ⅰ浸泡5min，95％乙醇Ⅱ浸泡5min，75％乙醇浸泡5min，水浸泡5min。

(7)在完成脱蜡复水的切片上，滴加适量的苏木素使其覆盖组织表面，染核5min，自来水冲掉残余的染液。

(8)快速使用1％盐酸酒精分化，用自来水冲洗。

(9)滴加适量伊红于组织表面，染色30s，用自来水冲洗。

(10)脱水封片。

2.2实验结果

图4显示小鼠在感染第4天肺组织中流感病毒APR8的拷贝数。图中，GSC处理组的APR8拷贝数显著低于非GSC处理组。从肺组织中病毒载量水平，可以看出GSC处理可显著减少肺组织中病毒载量。

图5以小鼠的体重变化反映感染病毒后的病情。图中，空白组体重始终维持正常，实验组(GSC+APR8)在接种病毒后的第一天有小幅度的体重下降，第二天基本回复正常。而对照组(APR8)从第3天起体重持续下降，在第10天体重下降达到原体重的70％。我们终止体重显著下降小鼠的实验，对小鼠进行安乐死处理。小鼠体重变化说明本发明GSC有阻断APR8感染小鼠和引起的功效，且GSC无明显的毒副作用。

图6以组织学观察反映病毒感染后小鼠肺的病理变化。接种病毒后，实验组(GSC+APR8)肺组织结构完整，未见淋巴细胞等验证细胞浸润，未见充血和水肿。而对照组(APR8)肺组织充血，大量淋巴和单核细胞浸润，毛细血管和支气管壁增厚，可见淋巴和单核细胞聚集，肺泡结构塌陷，肺泡间隔增厚，表现为典型的病毒感染性炎症变化。实验结果显示，GSC能保护小鼠免受病毒感染。

综上图4～图6结果表明，本发明复合物GSC可阻断流感病毒通过鼻腔粘膜感染而进入下呼吸道导致组织病理性炎症。

3、GSC阻断呼吸道合胞病毒感染BALB/c小鼠

3.1实验方法

3.1.1动物实验设计

(1)实验组：在感染病毒前1天和前30分钟，鼻腔给予GSC 50μL/只小鼠，共5只小鼠；对照组：鼻腔给予生理盐水50μL/只小鼠，共5只小鼠；空白组：鼻腔给予GSC 50μL/只小鼠，共5只小鼠。

(2)感染RSV病毒。实验组和对照组均给予1*10⁸pfu/mL的RSV，50μL/只小鼠；空白组：鼻腔给予生理盐水50μL/只小鼠。

(3)每天记录小鼠体重。

(4)在感染第4天，记录小鼠体重后，对小鼠进行安乐死处理。取小鼠左肺组织称重匀浆，用于检测肺组织中的病毒载量。

3.1.2测定肺组织中RSV含量。

(1)将肺组织加入M型组织匀浆管(gentleMACS^TM,Order no：130-093-236)，加入500μL冷的无菌PBS，用组织处理机(gentleMACS^TM Octo Dissociator)匀浆，选用程序“RNA_02_01(Duration：83)”。

(3)取其中一管，用病毒RNA提取试剂盒(Qiagen，德国)提取RNA。

(4)用逆转录试剂盒(TaKaRa，日本)将步骤(3)的RNA逆转录成cDNA。

(5)用合成的RSV-N质粒作为标准曲线的模版，使用步骤(4)的cDNA作为待测样本模版，进行绝对定量qPCR。引物序列为：

正向引物(SEQ ID NO.4)：AGGATTGTTTATGAATGCCTATGGT；

反向引物(SEQ ID NO.5)：GCTTTTGGGTTGTTCAATATATGGTAG；

所述RSV-N的基因序列(SEQ ID NO.6)为：

GGATTGTTTATGAATGCCTATGGTGCAGGGCAAGTAATGCTACGGTGGGGAGTCTTAGCAAAATCAGTTAAAAATATTATGTTAGGACATGCTAGTGTGCAAGCAGAAATGGAACAAGTTGTTGAGGTTTATGAATATGCCCAAAAATTGGGTGGAGAAGCAGGATTCTACCATATATTGAACAACCCAAAAGCA，质粒载体为PUC57。

qPCR反应体系

3.1.3实验结果

如图7所示，GSC处理的实验组RSV拷贝数显著低于未用GSC处理的对照组。从肺组织中RSV病毒载量水平，可以看出GSC处理可显著减少肺组织中RSV病毒载量。说明GSC不仅可以阻止流感病毒从鼻粘膜入侵呼吸道，还可以阻挡RSV随呼吸进入呼吸道。证明GSC是通过物理方式阻挡呼吸道病毒，对呼吸道病毒具有广谱的阻挡作用。

综上，本发明提供了一种生物相容性好，无明显不良反应的鼻粘膜保护剂，可附着于鼻粘膜表面，形成透气性佳、附着力强、结构稳定的纳米孔状凝胶膜结构，可有效阻断呼吸道病毒对鼻粘膜上皮细胞的感染，并以物理阻挡的形式组织呼吸道病毒感染引起的呼吸道炎症，从而预防呼吸道病毒引起的疾病；同时可润泽鼻粘膜，避免干燥带来的鼻粘膜损伤，具有很好的推广应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种抗病毒感染的复合物及其制备方法和用途

<130> GY026-2021P0114454CC

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 正向引物1

<400> 1

tggagccatt gccggtttta 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 反向引物1

<400> 2

ctgcatagcc tgatccctgt 20

<210> 3

<211> 253

<212> DNA

<213> HA基因序列

<400> 3

agtgcccaaa atacgtcagg agtgccaaat tgaggatggt tacaggacta aggaacattc 60

cgtccattca atccagaggt ctatttggag ccattgccgg ttttattgaa gggggatgga 120

ctggaatgat agatggatgg tacggttatc atcatcagaa tgaacaggga tcaggctatg 180

cagcggatca aaaaagcaca caaaatgcca ttaacgggat tacaaacaag gtgaactctg 240

ttatcgagaa aat 253

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 正向引物2

<400> 4

aggattgttt atgaatgcct atggt 25

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 反向引物2

<400> 5

gcttttgggt tgttcaatat atggtag 27

<210> 6

<211> 195

<212> DNA

<213> RSV-N基因序列

<400> 6

ggattgttta tgaatgccta tggtgcaggg caagtaatgc tacggtgggg agtcttagca 60

aaatcagtta aaaatattat gttaggacat gctagtgtgc aagcagaaat ggaacaagtt 120

gttgaggttt atgaatatgc ccaaaaattg ggtggagaag caggattcta ccatatattg 180

aacaacccaa aagca 195

Claims

1.一种抗流感病毒APR8和/或呼吸道合胞病毒感染的组合物，其特征在于，它由如下摩尔份数的原料组成：聚氨基葡萄糖1份、N-乙酰神经氨酸400~500份、丙三醇4000~5000份。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述聚氨基葡萄糖的分子量为317000-370000 Dalton。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述聚氨基葡萄糖脱乙酰度≥75%。

4.一种抗流感病毒APR8和/或呼吸道合胞病毒感染的复合物，其特征在于，它是权利要求1~3任一项所述的组合物与药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

5.如权利要求4所述的复合物，其特征在于，所述制剂为液体制剂，所述液体制剂组合物的浓度不低于1.5mg/ml。

6.如权利要求5所述的复合物，其特征在于，所述液体制剂pH为2~5.4。

7.权利要求5或6所述的复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）聚氨基葡萄糖加入含有1~3%的酸的水中，溶解均匀后，加碱调节pH至2~5.4，得聚氨基葡萄糖溶液；

（2）加入N-乙酰神经氨酸，混合均匀，得N-乙酰神经氨酸-聚氨基葡萄糖复合物溶液；

（3）加入丙三醇，混合均匀，即得。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）还包括如下步骤：将聚氨基葡萄糖溶液通过0.4~0.5μm的过滤器过滤。

9.权利要求1~3任一项所述的组合物，或者权利要求4~6任一项所述的复合物在制备抗流感病毒APR8和/或呼吸道合胞病毒感染的药物中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述药物是阻断流感病毒APR8和/或呼吸道合胞病毒感染鼻粘膜上皮细胞，和/或阻挡流感病毒APR8和/或呼吸道合胞病毒诱发呼吸道炎症的药物。