CN114404437A - 没食子酰芍药苷在制备gabaa受体抑制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了没食子酰芍药苷在作为GABAA受体抑制剂中的应用，属于GABAA受体抑制剂领域，所述没食子酰芍药苷能够和GABAA受体结合，结合率为59.97±12.72％，从而抑制GABAA受体与GABA结合产生的内向电流。上述实验结果为其在神经系统的药理作用机制提供直接证据，没食子酰芍药苷能够用于制备治疗神经系统疾病的药物。
Description
技术领域
本发明属于GABAA受体抑制剂领域，尤其涉及没食子酰芍药苷在制备GABAA受体抑制剂中的应用。
背景技术
中医中提到女子以血为本，肝藏血而调畅情志，故肝失疏泄在临床上女性患者远高于男性，且与月经周期联系密切，常见于月经前烦躁易怒或抑郁寡欢，并伴随躯体症状。现代研究发现PMDD患者临床表现为情绪及躯体症状，与月经规律密切相关，症状常于月经前出现，在月经后消失，该病严重影响了患者的健康及生活，故中医中的肝失疏泄与现代研究中的经前焦虑障碍症(PMDD)的表现一致。目前国际普遍认为γ-氨基丁酸(GABA)的功能异常导致卵巢激素波动不正常是PMDD发病的主要原因，临床治疗PMDD的药物有很多，其中以氟西汀最为常用。氟西汀可以选择性地对五羟色胺(5-HT)转运体起到抑制作用，阻断神经元突触前膜对5-HT摄取，使脑内5-HT功能提高，达到抗抑郁作用。但是口服氟西汀治疗PMDD的缺点是起效慢，作用时间长，副作用明显。地西泮和氟硝西泮是苯二氮
(BZ)类药物，能够发挥抗焦虑、镇静、抗惊厥和改善认知过程的效果，且GABAA受体有BZ位点。尽管BZS是最广泛使用的抗焦虑药，但BZS的有效性受到其长期不良效应的严重限制。目前，急待开发一种作用迅速且副作用小的治疗PMDD的药物。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供没食子酰芍药苷在制备GABAA受体抑制剂中的应用；没食子酰芍药苷能够抑制GABAA受体，抑制率为59.97±12.72％，其能做为GABAA受体抑制剂，有用于治疗PMDD的前景。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了没食子酰芍药苷在制备GABAA受体抑制剂中的应用。
优选的，所述GABAA受体抑制剂为液体制剂，所述GABAA受体抑制剂中没食子酰芍药苷的浓度为100～1000μmol/L。
优选的，所述没食子酰芍药苷的纯度≥99％。
优选的，所述GABAA受体抑制剂还包括细胞外液，所述细胞外液以超纯水为溶剂，包括以下浓度的组分：NaCl 120～130mmol/L、MgCl21.5～2.5mmol/L、KCl 1.5～2.5mmol/L、NaHCO325～27mmol/L、KH2PO41.0～1.5mmol/L、CaCl21.5～2.5mmol/L和葡萄糖8～12mmol/L。
优选的，所述细胞外液以超纯水为溶剂，包括以下浓度的组分：NaCl125mmol/L、MgCl22.0mmol/L、KCl 2.0mmol/L、NaHCO326mmol/L、KH2PO41.25mmol/L、CaCl22.0mmol/L和葡萄糖10mmol/L。
优选的，所述细胞外液的pH值为7.3～7.5。
本发明提供了没食子酰芍药苷在制备治疗神经系统疾病的药物中的应用。
优选的，所述神经系统疾病包括女性经前烦躁易怒PMDD。
本发明的有益效果：本发明提供了没食子酰芍药苷在制备GABAA受体抑制剂中的应用，所述没食子酰芍药苷能够和GABAA受体结合，没食子酰芍药苷和GABAA受体结合率达到59.97±12.72％，其能做为GABAA受体抑制剂，有用于治疗PMDD的前景。
附图说明
图1为化合物没食子酰芍药苷对GABAA型受体电流抑制作用；其中A为不同浓度没食子酰芍药苷(Galloylpaeoniflorin)对GABA诱发GABAA型受体电流的影响；B为不同浓度没食子酰芍药苷(Galloylpaeoniflorin)对GABA诱发GABAA型受体电流抑制作用统计图；
图2为内源性配体GABA对GABAA型受体电流的激动作用及其恢复时间曲线，其中A为灌流不同浓度GABA对GABAA型受体电流的影响；B为拟合曲线；C为不同洗脱时间对电流的影响；D为不同洗脱时间电流变化折线图。
具体实施方式
本发明提供了没食子酰芍药苷在制备GABAA受体抑制剂中的应用。在本发明中，所述GABAA受体抑制剂在应用时优选为液体制剂；在本发明中，所述GABAA受体抑制剂中没食子酰芍药苷的浓度优选为100～1000μmol/L，具体为100μmol/L、300μmol/L和1000μmol/L。在本发明中，所述没食子酰芍药苷的纯度优选的≥99％；所述没食子酰芍药苷优选的购自南京广润生物制品有限公司，批号为GR-136-190429。在本发明中，所述GABAA受体抑制剂优选还包括细胞外液，所述细胞外液以超纯水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分：NaCl 120～130mmol/L、MgCl21.5～2.5mmol/L、KCl1.5～2.5mmol/L、NaHCO325～27mmol/L、KH2PO41.0～1.5mmol/L、CaCl21.5～2.5mmol/L和葡萄糖8～12mmol/L，更优选的包括以下浓度的组分：NaCl125mmol/L、MgCl22.0mmol/L、KCl 2.0mmol/L、NaHCO326mmol/L、KH2PO41.25mmol/L、CaCl22.0mmol/L和葡萄糖10mmol/L。在本发明中，所述细胞外液的pH值优选为7.3～7.5，更优选为7.4。在本发明中，优选的采用NaOH对所述细胞外液的pH值进行调节。在本发明中，用所述细胞外液溶解活性成分没食子酰芍药苷。
本发明还提供了没食子酰芍药苷在制备治疗神经系统疾病的药物中的应用。在本发明中，所述没食子酰芍药苷GABAA受体抑制剂能够治疗神经系统疾病；所述神经系统疾病优选的包括女性经前烦躁易怒PMDD。本发明对所述药物的剂型和辅料没有特殊限定，采用本领域常规的剂型和辅料，能够发挥活性成分没食子酰芍药苷的作用即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
没食子酰芍药苷单体成分(纯度99％，购自南京广润生物制品有限公司批号GR-136-190429)。
细胞外液：以超纯水为溶剂，包括以下浓度的组分：NaCl 125mmol/L、MgCl22.0mmol/L、KCl 2.0mmol/L、NaHCO326mmol/L、KH2PO41.25mmol/L、CaCl22.0mmol/L和葡萄糖10mmol/L。用NaOH调节所述细胞外液的pH值为7.4。
细胞膜片钳实验数据
实验方法
原代神经元细胞培养
1)在超净工作台0.1％明胶(Gelatin)处理玻片，使用前采用无血清培养基清洗3遍，放入3.5cm培养皿备用；
2)出生24h内乳鼠(济南朋悦实验动物繁育有限公司(许可证号：SCXK(鲁)2014-0007))无菌操作，75％乙醇消毒头部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出大脑放入预冷的ACSF(人工脑脊液)平衡盐溶液(即细胞外液)中；
3)在解剖显微镜下除去脑膜，分离并取出胚胎大脑皮层(3-4对大脑皮层)。
4)将皮层转移至另外一个盛有1mlACSF溶液的干净小培养皿中，剪碎组织成约1mm3大小。
5)加入2ml 0.25％胰酶-EDTA消化液，并放入37℃水浴内消化5min；
6)取出消化液，加入接种培养基终止消化，放入37℃培养箱。接种培养基制备方法：22.5mL Neurobasal培养基过滤，加入2.5mL胎牛血清，0.5mLB-27，0.25L-Glutamine，混匀。
7)未消化完成部分重复3)、4)、5)步骤3～4次。
8)将几次消化的组织块和细胞混合液经70μm筛网过滤至新的培养皿中；
9)将过滤后的细胞悬液合并转移至15ml离心管中，于800rpm离心5min，弃上清，管内加入新鲜培养基5～10ml，并轻轻吹打成单细胞悬液；
10)细胞计数，调整细胞密度按1×106/ml种入含玻片的培养皿中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。24h后更换为维持培养基。维持培养基制备：25mLNeurobasal培养基过滤，0.5mL B-27，0.25L-Glutamine，混匀。
11)培养7天后，用于膜片钳实验记录。
膜片钳实验
1)将没食子酰芍药苷溶液用细胞外液梯度稀释为100μmol/L、300μmol/L、1000μmol/L，阳性对照药荷包牡丹碱溶液用细胞外液稀释至30μmol/L，抑制率为50.74±2.63％(n＝26)。
2)室温条件下(25℃)，取一个玻片，用细胞外液清洗两次，放置于倒置显微镜载物台上。
3)采用全细胞吸破式膜片钳技术，硼硅玻璃微电极尖端电阻为2～6MΩ，在Gap-free模式下，将膜电位钳制在-60mV，钳制完成后在细胞外液中稳定记录1min，细胞旁灌流给药后当GABAA电流幅值变小开始出现脱敏时，被认为药物作用达到稳态。操作中保证实验中膜电阻大于1,000MΩ，漏电流少于离子通道电流的10％。
数据分析
原始数据使用Clampex 10.7记录，数据采集和分析使用pCLAMP 10.7软件程序。选取加入化合物前电流峰值，计算峰值平均值，作为对照电流幅值。选取加入化合物后电流峰值，计算峰值平均值，作为电流被抑制后的幅值。待测化合物对GABA-AR电流的抑制率依据以下方程进行计算：％抑制率＝{1-(电流剩余幅值)/(对照电流幅值)}×100依据上述计算方法得到待测化合物对GABA-A型受体电流的抑制率(平均值±标准误)，实验结果如下所示。
实验结果
灌流GABA可诱发出明显的内向电流，依次灌流1、3、10、30、100μmol/L的GABA可以梯度激活GABAA型受体电流，拟合曲线可知，EC50为3.95±10.63μmol/L，本实验中均选择30μmol/L GABA所诱导出电流为Control。GABAA型受体为配体门控离子通道，为确定脱敏后恢复时间，分别给药30μmol/L的GABA后洗脱1、2、3、4、5min，再次给予30μmol/L GABA，比较第二次给药与第一次电流大小，可知5min可以完全洗脱，见图2。
GABAA受体为氯离子通道，当灌流GABA时使其产生内向电流。当没食子芍药苷对GABAA受体产生作用时，可以拮抗掉部分GABA的效果，使内向电流减小。灌流30μmol/L GABA可诱发出明显的内向电流，同时灌流30μmol/L GABA与化合物没食子酰芍药苷(100/300/1000μmol/L)诱发出的电流明显减少，见图1。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.没食子酰芍药苷在制备GABAA受体抑制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GABAA受体抑制剂为液体制剂，所述GABAA受体抑制剂中没食子酰芍药苷的浓度为100～1000μmol/L。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述没食子酰芍药苷的纯度≥99％。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述GABAA受体抑制剂还包括细胞外液，所述细胞外液以超纯水为溶剂，包括以下浓度的组分：NaCl120～130mmol/L、MgCl21.5～2.5mmol/L、KCl 1.5～2.5mmol/L、NaHCO325～27mmol/L、KH2PO41.0～1.5mmol/L、CaCl21.5～2.5mmol/L和葡萄糖8～12mmol/L。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞外液以超纯水为溶剂，包括以下浓度的组分：NaCl 125mmol/L、MgCl22.0mmol/L、KCl2.0mmol/L、NaHCO326mmol/L、KH2PO41.25mmol/L、CaCl22.0mmol/L和葡萄糖10mmol/L。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞外液的pH值为7.3～7.5。
7.没食子酰芍药苷在制备治疗神经系统疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述神经系统疾病包括女性经前烦躁易怒PMDD。
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