CN114397452A - 新型冠状病毒Delta突变株或原型株检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体公开了一种新型冠状病毒Delta突变株或原型株检测试剂盒及其应用，包括两种新型冠状病毒抗体IMCAS72抗体、IMCAS364抗体。本发明为首次利用IMCAS72抗体、IMCAS364抗体作为捕获剂对新型冠状病毒Delta突变株S‑RBD蛋白不同位点进行捕获，可以快速获得检测结果，而且灵敏度高、特异性好。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及新型冠状病毒Delta突变株检测试剂盒及其应用。
背景技术
新型冠状病毒导致的综合症(COVID-19)大规模流行，经常需要对大量人群进行筛查，因此对检测或诊断试剂的需求极大。
例如，CN105624335A涉及基因检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒；CN111020064A涉及用于检测新型冠状病毒核酸的试剂盒； CN111088407A涉及检测冠状病毒RNA的试剂盒；CN110982944A涉及用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的LAMP引物；CN105624335B涉及利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术同时检测中东呼吸综合征冠状病毒UPE和N基因。而CN1177224C涉及检测SARS冠状病毒抗体的方法及试剂盒；CN100425991C涉及用于检测SARS抗体的免疫微球等。
而随着致病力强的Delta突变型病毒的出现，对检测要求更快和更迫切。目前对于新冠病毒的检测筛查方法还大多数为 PCR核酸检测和抗体检测。核酸检测过程60-120分钟不等，时间较长；且需要专业人员在PCR专业实验室中进行操作。因此，需要开发速度快、操作简便、特异性强且灵敏度稳定等优点，尤其是针对致病力强的Delta突变型的检测试剂及其制备方法。
发明内容
基于现有技术的需求，本发明利用全新抗体增扩引物构建康复病人抗体噬菌体展示库和完备的多种突变抗原表达形式，通过体外独特设计的筛选策略，获得多株结合在RBD不同表位对VOC实现广谱中和的全人源抗体。对其中IMCAS-72 、IMCAS-364两个表位不竞争的pM结合能力的广谱抗体开展配对检测，可以针对病毒表面抗原进行致病力强的Delta突变株实现快速检测，由此形成本发明。
本发明提供一种新型冠状病毒Delta突变株或原型株检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
作为第一种抗体的IMCAS-72抗体，和作为第二种抗体的IMCAS-364抗体；
所述第一种抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括的CDR1氨基酸序列是：SEQ ID NO.13：GFTFSSYG；CDR2氨基酸序列是：SEQ ID NO.14：ISYDGSDK；CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO.15：RDRDRFGDQGGWFDP；其轻链可变区包括的CDR1的氨基酸序列是： SEQ ID NO.16：QSISSY；CDR2的氨基酸序列是： SEQ ID NO.17：AAS；CDR3的氨基酸序列是： SEQ ID NO.18：QQSYSTPFT。
所述第二种抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括的CDR1氨基酸序列是：SEQ ID NO.27：GFTFSRYG；CDR2氨基酸序列是SEQIDNO.28：IWYDGSNK；CDR3氨基酸序列是SEQIDNO.29：AKQEGTYCSGGSCYSGLDY；轻链可变区包括的CDR1氨基酸序列是SEQIDNO.30：QSISSY；CDR2 氨基酸序列是SEQ ID NO.31：AAS；CDR3氨基酸序列是SEQ IDNO.32：QQSYSTPLT。
优选地，所述第一种抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示； 或所述第二种抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示。
更优选地，所述第一种抗体的重链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，轻链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述第二种抗体的重链的全长氨基酸序列如SEQID NO.24所示，轻链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。具体地，第一种抗体IMCAS-72抗体，第二种抗体为IMCAS364抗体。
进一步地，还包括：样品裂解液和/或采样拭子。其中裂解液可采用本领域知晓的裂解液，而优选地裂解液为含有0.05%-2% NaCl、20mM-200mM Tris缓冲液、0.05%-2%的Triton X-100或Tween20的缓冲液。曲拉通X-100和Tween20是一种常用的非离子型的去垢剂或表面活性剂，可溶解脂质，以增加细胞膜的通透性，利于病毒的释放和检测。通过摸索配制浓度，所选浓度，病毒能达到较好释放。
更具体地，所述试剂盒为免疫层析试剂盒、酶联免疫试剂盒或化学发光试剂盒。
对于免疫层析试剂盒，包括检测卡，检测卡包括：底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的底板上；结合垫喷涂有第一种抗体标记的示踪标志物，划线位置从吸水纸自加样孔方向依次为：T线和C线，其中C线固定鼠抗人IgG抗体，T线固定的抗体为第二种抗体。
优选地，所述底板为PVC板；结合垫为玻璃纤维材质；所述示踪标志物为胶体金、荧光微球、或荧光微球。
更优选地，所述试剂盒还包括外壳，检测卡组装在上壳和下壳扣合而成的外壳中，上壳上设置有加样孔和观察窗，加样孔对应于样品垫，观察窗对应于T线和C线。
另外优选地，第一种抗体的浓度为2-10μg/mL；第二种抗体的浓度为0.5～2.0 mg/mL。
对于化学发光试剂盒，包括中性亲和素或链霉亲和素偶联磁微球、生物素化抗体、吖啶酯标记的抗体、校准品、化学发光底物。
优选地，所述生物素化抗体为生物素化的第一种抗体、吖啶酯标记的抗体为第二种抗体，校准品为Delta突变株的RBD标准品；其中，第一种抗体的浓度为0.5-3μg/mL，第二种抗体的使用量为1-10μg/mL。
对于酶联免疫试剂盒，包括酶标板、第一种抗体、鼠抗人-HRP、显色液、终止液、稀释液、洗涤液、标准品；酶标板包被第二种抗体，其抗体浓度为1μg/ml-10μg/mL。
本发明提供一种利用所述的试剂盒进行非疾病诊断目的检测新型冠状病毒的方法。
具体地，检测样本为离体的上呼吸道样本或非呼吸道样本。
更具体地，所述上呼吸道样本为鼻浅、鼻咽、口咽、唾液，所述非呼吸道样本来自于环境采集。
优选地，其用于检测样本中是否存在新型冠状病毒原型株和/或Delta突变株。
在具体实施方式中，将已取样的拭子放入400μL-1000μL裂解液中，滴入2-3滴至采样孔中，室温反应10-15min，观察结果。
本发明还提供所述的试剂盒在制备检测新型冠状病毒的产品中的应用。具体地，所述产品用于检测样本中是否存在新型冠状病毒原型株和/或Delta突变株。
本发明解决的技术问题主要是检测不同样本源中是否存在原型株或Delta突变株，从而帮助医生对患者进行针对性用药。其中本发明提供检测试纸区分的原理如下：本发明利用对新型冠状病毒RBD不同表位进行结合且对不同表位具有不竞争性的两株抗体（具体实例为MCAS-72 、IMCAS-364抗体）作为新型冠状病毒RBD蛋白的捕获剂，同时配合显色或荧光发光等手段，可以直观快速的获得检测结果，以免疫层析试剂盒为例进行原理说明：待测样本中新型冠状病毒Delta突变株或原型株上RBD蛋白的一个表位被结合垫上胶体金-MCAS-72抗体捕获，并结合形成RBD-MCAS-72抗体-胶体金复合物，随着层析的持续进行，达到T检测线后，复合物上RBD蛋白另一表位与T检测线上的MCAS-364抗体结合，从而将复合物固定在T线位置，胶体金作为显色剂在T线处显示红色。
由此可以实现对新型冠状病毒Delta突变株或原型株进行快速检测。化学发光试剂盒和酶联免疫试剂盒利用的都是两株抗体结合在RBD蛋白的不同表位上，到达检测目的。经验证，本发明的试剂盒可以高灵敏度的检测新型冠状病毒Delta突变株或原型株。
附图说明
图1 本发明示例性公开的免疫层析试剂盒检测卡结构示意图。其中，标记分别是：1吸水纸、2硝酸纤维素膜、3结合垫、4样品垫、5 PVC底板。
图2为实施例示例性公开的采用本申请抗体制备的免疫层析试剂盒对新型冠状病毒不同抗原分型检测灵敏度评估，其中，A为WT-RBD；B为Delta型RBD；C为Omicron型RBD。
图3 纯化的IMCAS-72scfv蛋白的分子筛图谱和SDS-PAGE图。
图4 纯化的IMCAS-364scfv蛋白的分子筛图谱和SDS-PAGE图。
图5 抗体IMCAS-72和SARS-CoV-2 Prototype RBD蛋白的亲和力。
图6 抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Prototype RBD蛋白的亲和力。
图7 293F表达IMCAS-72全抗过Superdex200pg分子筛图和SDS-PAGE图。
图8 293F表达IMCAS-364全抗过Superdex200pg分子筛图和SDS-PAGE图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第四版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：广谱结合能力IMCAS-72和IMCAS-364抗体的获得
康复病人外周血淋巴细胞RNA提取与人源单链抗体噬菌体展示文库的建立
在12名感染新型冠状病毒且痊愈出院的人员知情同意下，各采集3-10mL 的血液，分离PBMCs，转入1.5mlEP管中。加入700mltrizol并放置5分钟，在上述EP管中，加入0.14ml氯仿，盖上EP管盖子，剧烈震荡15秒，室温静置3分钟，12000g（4℃）离心15分钟。取上层水相置于新EP管中，加入 0.5ml异丙醇，在室温下静置10分钟，12000g（4℃）离心10分钟。弃上清，加入1ml 75% 乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（4℃）离心5分钟，弃上清。让沉淀的RNA在室温在自然干燥。用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
通过HiScript-TS 5'/3' RACE Kit (Vazyme) 逆转录试剂盒，按说明书分别增扩VH、VL的DNA模板后，用2 × Taq Master Mix酶 (Vazyme)进行PCR，通过引物组合扩增抗体可变区序列，反应条件如下：95℃，2min；95℃，15s，58℃(重链/κ链/ λ链)，15s，72℃，30s，35个循环，72℃，7min。1.2％的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物，将400-500bp的条带切胶回收。等摩尔比将12个人VH混合一起，同法混合VL片段后，将混合后VH与VL进行等摩尔比混合后用PCR搭桥引物连接抗体基因的重链轻链可变区，使用2 × Taq Master Mix酶(Vazyme)进行PCR，反应条件如下：95℃，2min；95℃，15s，67℃，15s，72℃，30s，30个循环，72℃，7min增扩出完整的单链抗体scfv(VH-VL)，1.2％的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物，将750-800bp的条带切胶回收。将Overlapping后的产物与sfiI酶切后的pcomb3xss(addgene)质粒按照3：1的比例连接形成Phagemid，连接产物转化Top10感受态细胞，涂氨苄抗性平板（1：1000），37℃过夜培养后，将所有菌落收集大提质粒（先获得大量质粒文库，然后基于质粒每次按流程转换为噬菌体文库，以保证库均一性），得到5-10mg质粒文库。将20ug质粒使用电转仪(biorad)转化入TG1感受态细胞，1mlSOC37度1小时慢摇后，加入5ml氨苄抗性培养基，40分钟后加入5E7个辅助噬菌体，1小时后，转入125ml锥形瓶，加入氨苄西林和卡那霉素双抗LB，25ml，30度过夜，可增扩得到5E12pfu/ml 的噬菌体文库。
关键抗原制备
合成野生型新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域段（RBD）蛋白（氨基酸序列如SEQIDNO：1所示、核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示）Beta型新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域段（RBD）蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示、核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示）通过EcoRI与XhoI两个酶切位点构建到pCAGGS质粒载体上。其中蛋白编码区5‘端前置信号肽核苷酸序列ATGTTTGTGTTTCTTGTGCTTCTTCCTCTTGTGTCATCACAATGC，同时蛋白编码区的3’端连上6个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子。用含10%FBS的DMEM培养293T细胞。用质粒转染293T。转染4-6小时后给细胞换液成无血清的DMEM继续培养3天，收集上清，并补加DMEM，再培养4天，收集上清。收集的上清经过5000rpm离心30min后，与含有20mM磷酸钠(pH 8.0)的缓冲液等体积混合，经过0.22 μm滤膜过滤后，与His-trapExcel预装柱结合（5mL，GE Healthcare）。以10mM咪唑洗脱结合的蛋白。收集此蛋白浓缩后进行分子筛层析。目的峰通过SDS-PAGE确定Prototype新冠原型株RBD抗原目标蛋白和Beta新冠突变株RBD抗原正常表达。
人源单链抗体噬菌体展示文库筛选
取纯化的野生型新型冠状病毒RBD蛋白，用PBS（Ph7.4）溶液按5ng/ul，每孔100ul包被96孔板，置于4℃冰箱中过夜包被。过夜包被后，弃去各孔内的包被液用0.05%的PBST溶液洗去未吸附的抗原，每孔加入65ul浓度为0.5%的BSA封闭半小时，随后加入40ul 10%吐温-20室温下静置半小时30min后，弃去封闭液，0.05%的PBST洗板3次。取100ul纯化后的前述噬菌体溶入900ul 溶解buffer(0.5%的BSA0.05%的PBST)中混匀，用排枪向每孔中加入100ul，室温下孵育2h。弃去Elisa板中的噬菌体溶液，用0.05%的PBST洗板10次。用排枪向每孔内加入100ul洗脱液（pH=2.2,0.1M HCL），400rpm摇20min。将每10个孔内的洗脱液混合在一起，得到1000ul噬菌体。每管噬菌体加入200ul 终止液(1M Tris和0.5% BSA 1:1混合)，收集在2ml离心管内。取1管XLI-Blue感受态细胞（约100ul）接入5ml液体LB培养基中，摇至OD600介于0.6至0.8时停止。向5ml菌液中加入600ul前述噬菌体，转移至50ml无菌离心管中，37℃下220rpm摇菌半小时。向50ml管中加入1/1000的比例氨苄西林37℃下220rpm接菌，摇至OD值0.8左右。按1：1000的比例加入辅助噬菌体M13KO7（9×1012pfu/ml），37℃下220rpm摇菌半小时。随后转入到含有30ml 2YT培养基的锥形瓶，1：1000加入氨苄西林和卡那霉素。37℃下220rpm摇菌4小时，向锥形瓶中1:1000加入IPTG 30℃下过夜培养后或的5E12pfu噬菌体筛选文库。重复上述步骤三次后，将野生型新型冠状病毒RBD蛋白变化为突变新型冠状病毒beta-RBD蛋白开展第四轮筛选。将第四轮洗脱的噬菌体，20μl接入摇至OD600介于0.6至0.8时的XLI-Blue感染20分钟后，涂布LB平板，37度过夜静置后，挑选384个单克隆进行菌落PCR，使用2 × Taq Master Mix酶 (Vazyme)进行PCR，反应条件如下：95℃，2min；95℃，15s，67℃，15s，72℃，30s，30个循环，72℃，7min增扩。1.2％的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物，将850-1000bp的阳性条带切胶回收。
候选抗体 SS320原核细胞小规模表达与鉴定
测序并进行序列比对，将所ScFv序列重复数大于2的噬菌体质粒，利用电转技术转化进入SS320细胞，加入无抗培养基在37℃摇菌1h，涂1‰氨苄抗性平板，挑单克隆菌落到100ul含有氨苄的培养基中，37℃培养箱中过夜培养。次日，接入到1.5ml的含有1‰氨苄和20ml 1M MgCl2的SB培养基中,继续在400 rpm/min的37℃培养箱中培养8h后1：1000加入1M的IPTG 37℃过夜诱导。次日，将诱导完成的菌液收集，6500rpm，4℃，离心30min，收集上清后用0.22μm滤膜进行推滤。上清加入包被有野生型和Beta突变型、Omicron新型冠状病毒RBD蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示、核苷酸序列如SEQIDNO：6所示）的96孔板中进行ELISA实验，每孔按顺序加入100ul试表达溶液，每个样品加3个孔，室温下静置1h。100ul0.1%PBST溶液洗脱洗3次。按照1：2500的比例在0.1%的PBST中稀释一抗（兔抗HA），注意避光保存。用排枪向每孔中加入100μl一抗稀释液，室温下孵育1h。100μl 0.1%PBST溶液洗脱洗3次。二抗为羊抗兔IgG-HRP，孵育1h，100μl 0.1%PBST溶液洗脱洗3次。向每孔中加入50μl显色液TMB，37℃反应10-20min至显色适当时，立即加入50ul 2M浓HCl终止显色反应。
经筛选和验证，还得到高效中和新型冠状病毒，尤其是对Delta变异株具有高效中和能力抗体IMCAS-72，其SCFV形式（氨基酸序列如SEQIDNO.7所示、核苷酸序列如SEQIDNO.8所示）。
测序分析表明，其中重链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，轻链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，对应的重链的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，轻链的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
重链可变区序列为：SEQ ID NO.19：QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDRFGDQGGWFDPWGQGTLVTVSS，轻链可变区序列为：SEQ ID NO.20：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKR。
进一步分析可知，重链的CDR1：GFTFSSYG（SEQ ID NO.13）、CDR2：ISYDGSDK（SEQ IDNO.14）、CDR3：ARDRDRFGDQGGWFDP（SEQ ID NO.15）。轻链CDR1：QSISSY（SEQ ID NO.16）、CDR2：AAS（SEQ ID NO.17）、CDR3：QQSYSTPFT（SEQ ID NO.18）。
同时，经筛选和验证确认得到新型冠状病毒稀有广谱表位有非常强的结合能力的scfv为IMCAS-364，所述抗体SCFV形式（氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示、核苷酸序列如SEQID NO.21所示）。
测序分析表明，其中重链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，轻链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，对应的重链的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，轻链的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
重链可变区序列为：SEQ ID NO.33：QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDRFGDQGGWFDPWGQGTLVTVSSAS，轻链可变区序列为：SEQ ID NO.34：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKG。
进一步分析可知，重链的CDR1：GFTFSRYG（SEQ ID NO.27）、CDR2：IWYDGSNK（SEQ IDNO.28）、CDR3：AKQEGTYCSGGSCYSGLDY（SEQ ID NO.29）。轻链CDR1：QSISSY（SEQ ID NO.30）、CDR2：AAS（SEQ ID NO.31）、CDR3：QQSYSTPLT（SEQ ID NO.32）。
抗体 SS320原核细胞大规模表达
分别挑IMCAS-72和IMCAS-364单克隆SS320菌落到1ml含有氨苄的培养基中，37℃培养箱中过夜培养。次日，接入到10ml的含有1‰氨苄和20ml 1M MgCl2的SB培养基中,继续在180 rpm/min的37℃培养箱中培养8h后1：1000加入 1M的IPTG 37℃过夜诱导。次日，将诱导完成的菌液收集，6500rpm，4℃，离心30min，收集上清后用0.22μm滤膜进行真空抽滤。接着将上清用HisTrapTM HP亲和柱结合过夜，将目的蛋白用10%的(20 mM Tris, 150 mMNaCl，pH 8.0, 300 mM imidazole)从His柱上洗脱下来，并以10 KD蛋白浓缩管用缓冲液(20 mM Tris, 150 mM NaCl，pH 8.0)进行换液，以去除蛋白溶液里的咪唑浓度，并浓缩到体积小于500μl。将浓缩完成的蛋白溶液使用AKTA-purifier(GE)和superdex75 Increase10/300 GL分子筛(GE)，用(20 mM Tris, 150 mM NaCl，pH 8.0)平衡分子筛，500μl loop环上样，同时监测280 nm的紫外吸收值，收取目的蛋白，并通过SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。
目的蛋白的分子筛图谱和SDS-PAGE图表明获得了纯化后的IMCAS-72和IMCAS-364蛋白（分别如图3和图4所示）。
实施例2、表面等离子共振技术检测蛋白与抗体亲和力（biacore 8k）
利用表面等离子共振现象检测分子间相互作用，在 GE Healthcare集团生产的生物大分子相互作用分析系统Biacore 8K上完成。使用生物素-链霉亲和素偶联法（SA 芯片）捕获Prototype RBD，Alpha variant RBD，Beta variant RBD，Delta variant RBD,Lamdavariant RBD, Omicron variant RBD蛋白作为固定相，流动相为需要检测的IMCAS-364和IMCAS-72新冠中和抗体蛋白，之后通过 BIA evaluation 软件分析动力学参数并作图。
实验步骤：利用生物素-链霉亲和素的偶联作用，我们首先将Prototype RBD，Alpha variant RBD，Beta variant RBD，Delta variant RBD, Lamda variant RBD,Omicron variant RBD蛋白与生物素化试剂按比例室温放置30分钟，将蛋白进行生物素化标记，之后用浓缩管换液至 PBS，去除多余的生物素化试剂。将生物素化的抗原蛋白SARS-CoV-2 Prototype RBD，SARS-CoV-2 Alpha variant RBD，SARS-CoV-2 Beta variant RBD，SARS-CoV-2 Delta variant RBD, SARS-CoV-2 Lamda variant RBD, SARS-CoV-2Omicron variant RBD以10μg/ml的浓度固定在SA芯片（GE）上。
然后将浓度梯度为6.25nM，12.5nM，25nM，50nM和100 nM的抗体IMCAS-364和IMCAS-72分别注入芯片，分析在恒温25℃进行，使用的缓冲液是0.05%PBST。芯片表面的再生使用的是10mM PH = 1.7的Glynice溶液，结合曲线如图所示，不同浓度的曲线组成图示的动力学曲线。结合动力学常数的计算是利用BIA evaluation software version 3.2(Biacore, Inc.)软件进行的。
结果如图5所示，结果表明：抗体IMCAS-72和SARS-CoV-2 Prototype RBD蛋白的亲和力常数为0.39±0.05nM，抗体IMCAS-72和SARS-CoV-2 Alpha variant RBD蛋白的亲和力常数为6.37±0.25nM。抗体IMCAS-72和SARS-CoV-2 Delta variant RBD蛋白的亲和力常数为0.62±0.02nM，抗体IMCAS-72和冠状病毒RaTG13 RBD蛋白的亲和力常数为6.21±0.27nM，上述数据表明：抗体IMCAS-72与SARS-CoV2-RBD有很强的亲和力。
结果如图6所示，抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Prototype RBD蛋白的亲和力常数为1.04nM，抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Alpha variant RBD蛋白的亲和力常数为1.06nM。抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Beta variant RBD蛋白的亲和力常数为1.07nM；抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Delta variant RBD蛋白的亲和力常数为1.18nM，抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Gamma variant RBD蛋白的亲和力常数为1.17nM，抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Lamda variant RBD蛋白的亲和力常数为0.92nM，抗体IMCAS-364和SARS-CoV-2 Omicronvariant RBD蛋白的亲和力常数为2.19nM，上述数据表明：抗体IMCAS-364与SARS-CoV-RBD有很强的亲和力。同时抗体IMCAS-364和SARS-CoV RBD蛋白的亲和力常数为8.17nM，是一种具有泛SARS类冠状病毒结合能力的抗体。
实施例3、抗体IgG全抗构建和表达及纯化
抗体IgG全抗构建
为了获得人源抗体进行后续评价，设计了全抗IgG1构建。策略如下：
重链H：CMV promoter-EcoRI-信号肽(SP)-重链可变区(VH)-重链恒定区(CH)-Xhol；
轻链κ：CMV promoter-EcoRI-信号肽(SP)-轻链可变区(VK)-轻链恒定区(CLκ)-Xhol；
分别将轻重链可变区序列与相应的含由重链CH和轻链CLκ的恒定区的表达载体pCAGGS，通过同源重组连接，克隆至表达载体pCAGGS中，得到含有特定抗体轻、重链编码基因的重组质粒；其中，使用酶切位点ScaI和KpnI将轻重链可变区连入含有恒定区的载体中。
IMCAS-364和IMCAS-72全抗的表达及纯化
用IMCAS-364和IMCAS-72轻、重链编码基因的质粒按照重链：轻链1：1.5比例共转染密度3*10^6 293F细胞。用150mM NaCl稀释质粒1ml细胞加1μg质粒，用150mM NaCl稀释1mg/ml PEI 1ml 细胞加3ul，静置5min；上述二者混匀后静置20min，逐滴加入293F细胞。转染24h后按照1ml加0.035ml补料液，随后每48h加一次补料液。
转染5d后收上清，6500rpm离心30min去除细胞沉淀，与含有20mM磷酸钠(pH 7.4)等体积混合，经过0.22 um滤膜过滤后，与protein A预装柱结合（5mL, GE Healthcare）。以10mM甘氨酸(pH 3.0)洗脱结合的蛋白。收集此蛋白浓缩后进行分子筛层析。目的峰通过SDS-PAGE确定，结果如分别如图7和图8所示。
实施例4、免疫层析试剂盒的制备及其测试
一、免疫层析试剂盒的制备
采用得到的新型冠状病毒人源抗体制备新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒如图1所示，所述试剂盒包括检测卡、裂解液、采样拭子；
检测卡包括PVC底板5、样品垫4、结合垫3、硝酸纤维素膜2和吸水纸1，所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的PVC底板上，形成试纸板、切割；互相交错搭接的尺寸为2mm，PVC底板5的尺寸为80-300mm，切割尺寸为3-4mm宽，加干燥剂于常温下在铝箔袋中密封保存，得到所述的检测卡；其中，样品垫4，尺寸为20*300mm；吸水纸1，尺寸为28*300mm；结合垫3为玻璃纤维材质，喷涂抗体标记的胶体金，胶体金上标记有IMCAS-72抗体。
结合垫处理液：10mM Tris(PH7.5-8.5)，含1-2%BSA,0.9%NaCl,0.1-0.5% TritonX-100。
划线稀释液：10mM-50mM PH7.0-7.4 PB。
胶体金保存液为：0.05-5％BSA、1-30％蔗糖、1-30%海藻糖、0.05%-0.2％Tween-20的pH8.0-8.5的20mM-50mM Tris-HCl缓冲液。
所述的检试剂盒还包括外壳，切割的检测卡组装在由塑料制成的上壳和塑料制成的下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳上设置有加样孔和观察窗，加样孔对应于样品垫4，观察窗对应于检测线T线和质控线C线。
检测卡的具体制备方法如下：(1)结合垫浸泡在10mM Tris缓冲液(pH8.0)中，缓冲液含1％BSA、0.9％NaCl、0.5％Triton X-100，室温浸泡1h，60℃烘干1小时，将浓度2μg-10μg /mL 的IMCAS-72抗体标记的示踪标志物均匀喷涂在结合垫上，置于干燥箱中；采用现有的标记方法获得IMCAS-72抗体标记的胶体金；具体的，干燥箱为鼓风干燥箱，37℃烘干过夜；(2)T线划线液配制：用划膜缓冲液将IMCAS-364抗体稀释至0.5-2mg/mL，所述划膜缓冲液为0.01mol/L PBS溶液，pH7.0～7.4； (3)C线划线液配制：用划膜缓冲液将鼠抗人IgG稀释至1.5～2.0mg/mL，所述划膜缓冲液为0.01mol/L PBS溶液，pH7.0～7.4；(4)采用划膜仪，将C线抗体、T线抗体分别包被在固定于底板上的硝酸纤维素膜上，划液量：1μL/cm；划膜速度：50mm/s； (5)将划好的试纸板置于鼓风干燥箱中，37℃烘干4h，加入干燥剂封存备用。
所述的检测卡还包括外壳，切割的试纸条组装在由塑料制成的上壳和塑料制成的下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳上设置有加样孔和观察窗，加样孔对应于样品垫4，观察窗对应于检测线T线和质控线C线。
将检测卡、裂解液、采样拭子和说明书装盒即为新型冠状病毒检测的免疫层析试剂盒成品。
二、试剂盒的测试
1）试剂盒检测效果实验：
分别用裂解液梯度稀释WT-RBD(野生型)、delta-RBD、Omicron-RBD。其中裂解液为含有0.05%-2% NaCl、20mM-200mM Tris缓冲液、0.05%-2%的Triton X-100或Tween20的缓冲液。
使用实施例4获得的试剂盒对新型冠状病毒不同抗原分型进行检测，对灵敏度进行评估，对照组选取市售的两株抗新型冠状病毒RBD的鼠抗制备成的试剂盒进行检测。其中，实验组抗体浓度分别：IMCAS-364为1mg/mL，IMCAS-72为5μg/mL；对照组抗体浓度：T线抗体为1mg/mL，金标抗体2为5μg/mL。结果如表1、表2、图2所示（其中，A为WT-RBD；B为Delta型RBD；C为Omicron型RBD），IMCAS-364对野生型RBD检测灵敏度达到0.002μg/ml、对Delta型RBD的检测灵敏度达到0.002ug/ml，对Omicron型RBD未检出。该试剂盒对Delta型RBD检测灵敏度极高。
表1 本发明试剂盒检测结果
表中符合所代表含义如下(表2-6中的符号也具有下述含义)：
“+++”： 强阳（T线颜色很深）；
“++”： 中阳（T线颜色深）；
“+”： 阳性（T线颜色较深，且明显可见）；
“+-”： 弱阳（T线颜色淡，但清晰可见）；
“+--”： 临界阳性（T线颜色很淡，需要仔细观察可见）；
“-”： 阴性（T线不可见）。
对照组中，从检测结果表2中可以看出，对照组T检测Delta-RBD的最低检测限为0.031μg/mL,检测野生型-RBD的最低检测限为0.031μg/mL，检测Omicron-RBD的检测线为0.063 μg/mL。因此，该采用市售抗体制备的试剂盒对Omicron突变株和Delta突变株检测灵敏度较差。
表2 对照组：市售的两株鼠抗新型冠状病毒抗体
2）不同浓度抗体对新型冠状病毒检测效果的影响实验：分别用裂解液梯度稀释WT-RBD、delta-RBD、Omicron-RBD，采用实施例1）中的方法获取不同的试剂盒对新型冠状病毒不同抗原分型进行检测，检测结果如表3-表5所示。其中，表3所用抗体浓度分别：IMCAS-364为0.5mg/mL，IMCAS-72为2μg/mL；表4所用抗体浓度分别：IMCAS-364为1mg/mL，IMCAS-72为5μg/mL；表5所用抗体浓度分别：IMCAS-364为2mg/mL，IMCAS-72为10μg/mL。
表3不同浓度抗体对新型冠状病毒检测效果的影响（浓度一）
从表3中可以看出：T线对野生型RBD的最低检测限为0.002ug/mL、对Delta型RBD的最低检测限为0.002ug/mL、对Omicron型RBD未检出。因此，对野生型RBD和Delta型RBD，T线均呈现强的检测结果，故该抗体浓度，试纸盒可用于检测Delta突变株。
表4不同浓度抗体对新型冠状病毒检测效果的影响（浓度二）
从表4中可以看出：T线对野生型RBD的最低检测限为0.002ug/mL、对Delta型RBD的最低检测限为0.002μg/mL、对Omicron型RBD未检出。因此，该抗体浓度，试纸盒可用于检测Delta突变株。
表5不同浓度抗体对新型冠状病毒检测效果的影响（浓度三）
从表5中可以看出：T线对野生型RBD的最低检测限为0.02μg/mL、对Delta型RBD的最低检测限为0.002μg/mL、对Omicron未检出。因此，该浓度抗体，试纸盒可用于快速检测Delta突变株。
综上所述，从不同抗体浓度组合情况可以看出，在一定范围内随着抗体浓度增加，试纸盒灵敏度增加，继续增加将影响试纸盒的灵敏度。
实施例3：不同形式试剂盒对不同样本的检测实验
1）使用实施例2中获得的试剂盒用于对不同样本源新型冠状病毒进行检测，结果如表6；
2）化学发光试剂盒：包括中性亲和素或链霉亲和素偶联磁微球、生物素化的IMCAS-72抗体、吖啶酯标记的IMCAS-364抗体，校准品、样本稀释液和化学发光底物，其中IMCAS-72抗体的浓度为0.5-3μg/mL，IMCAS-364抗体的使用量为1-10μg/mL。在本实施例中制备试剂盒时，优选为：IMCAS-72抗体的浓度为2μg/mL，IMCAS-364抗体的使用量为5μg/mL；采用常规方法制备出化学发光试剂盒，并将该试剂盒用于对不同样本源新型冠状病毒分型进行检测，结果如表6；
3）酶联免疫试剂盒：包括酶标板、IMCAS-72抗体、鼠抗人-HRP、显色液、终止液、稀释液、洗涤液、标准品；酶标板包被IMCAS-364抗体，IMCAS-72抗体的浓度为1μg/ml- 5μg/mL，IMCAS-364抗体的浓度为1μg/ml-5μg/mL；制备试剂盒时，优选为：IMCAS-72抗体的浓度为2μg/mL，IMCAS-364抗体的浓度为2μg/mL；采用常规方法制备出酶联免疫试剂盒，并该试剂盒用于对不同样本源新型冠状病毒分型进行检测，结果如表6。
表6对不同样本源检测结果统计
通过表6可知，对不同样本源、不同的形式试剂盒针对Delta样本的检出率均明显优于对照组，适用于包括人鼻浅样本、鼻咽样本等，且可适用于冷藏食品表面等物体表面的样本检测。
以上已以较佳实施例公布了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采取等同替换或等效变换的方案所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
<110> 江苏美克医学技术有限公司；中国科学院微生物研究所
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<213>新型冠状病毒SARS-CoV-2
<400>4
MFVFLVLLPLVSSQCRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFHHHHHH 244
<210>5
<211>732
<212> DNA
<213>新型冠状病毒SARS-CoV-2
<400>5
ATGTTTGTGTTTCTTGTGCTTCTTCCTCTTGTGTCATCACAATGCAGAGTGCAACCTACAGAATCAATCGTGAGATTTCCTAACATCACAAACCTTTGCCCTTTCGACGAGGTGTTTAACGCAACAAGATTTGCATCAGTGTACGCATGGAACAGAAAGCGTATATCAAACTGCGTGGCAGATTACTCAGTGCTTTACAACTTAGCACCATTCTTTACGTTTAAATGCTACGGAGTGTCACCTACAAAGCTAAATGATCTTTGCTTTACAAACGTGTACGCAGATTCATTTGTGATCAGAGGAGATGAAGTGAGACAAATCGCACCTGGACAAACAGGAAAAATTGCCGATTACAACTACAAACTTCCTGATGATTTCACCGGCTGCGTGATCGCATGGAACTCAAACAAACTTGATTCAAAGGTAAGTGGTAATTATAATTATTTGTATAGGCTCTTTCGTAAGAGCAACTTAAAGCCATTTGAGCGAGATATCTCAACAGAAATCTACCAAGCAGGAAATAAACCTTGCAACGGAGTGGCAGGATTTAACTGCTACTTTCCTCTTCGATCATACTCATTTAGACCTACAAACGGAGTGGGACACCAACCTTACAGAGTGGTGGTGCTTTCATTTGAACTTCTTCACGCACCTGCAACAGTGTGCGGACCTAAGAAGAGCACGAACCTTGTGAAGAATAAGTGCGTGAACTTTCACCACCACCACCACCAC 732
<210>6
<211>244
<212>PRT
<213>新型冠状病毒SARS-CoV-2
<400>6
MFVFLVLLPLVSSQCRVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLRSYSFRPTNGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFHHHHHH 244
<210>7
<211>258
<212>PRT
<213>人
<400>7
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKGGSSRSSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDRFGDQGGWFDPWGQGTLVTVSSGSASAPTLTSGQAGQHHHHHH 258
<210>8
<211>774
<212>DNA
<213>人
<400>8
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTGATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGGGATAGATTTGGGGACCAAGGGGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTACTAGTGGCCAGGCCGGCCAGCACCATCACCATCACCAT 774
<210>9
<211>1422
<212> DNA
<213>人
<400>9
ATGGAGACGGATACGCTGCTCCTGTGGGTTTTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTGATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGGGATAGATTTGGGGACCAAGGGGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCAGCACCAAAGGCCCGAGCGTGTTTCCGCTGGCGCCGAGCAGCAAAAGCACCAGCGGCGGCACCGCGGCGCTGGGCTGCCTGGTGAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCGCTGACCAGCGGCGTGCATACCTTTCCGGCGGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCGAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTATATTTGCAACGTGAACCATAAACCGAGCAACACCAAAGTGGATAAACGCGTGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACTATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA 1422
<210> 10
<211> 474
<212>PRT
<213>人
<400> 10
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDRFGDQGGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 474
<210> 11
<211>708
<212>DNA
<213>人
<400> 11
ATGGAGACGGATACGCTGCTCCTGTGGGTTTTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGAACTGTGGCTGCACCAAGCGTGTTTATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTCTGTCTCCTGAACAACTTCTATCCCAGGGAGGCCAAGGTCCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAAAGCGGCAATAGCCAGGAGTCCGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGTCCAGCACCCTGACCCTCAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGCGAGGTGACCCATCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACAGGGGCGAATGCAGC 708
<210> 12
<211>236
<212>PRT
<213>人
<400> 12
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECS 236
<210> 13
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 13
GFTFSSYG 8
<210> 14
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 14
ISYDGSDK 8
<210> 15
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 15
ARDRDRFGDQGGWFDP 16
<210> 16
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 16
QSISSY 6
<210> 17
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 17
AAS 3
<210> 18
<211> 9
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 18
QQSYSTPFT 9
<210> 19
<211> 125
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 19
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDRFGDQGGWFDPWGQGTLVTVSSAS 125
<210>20
<211> 108
<212>PRT
<213>人工序列
<400>20
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKG 108
<210> 21
<211>819
<212> DNA
<213>人
<400> 21
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGATATCAAAGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGATATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATTTGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGTTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGACGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAACAGGAGGGGACATATTGTAGTGGTGGTAGCTGCTACAGTGGCCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCCGTCACTAGTGGCCAGGCCGGCCAGCACCATCACCATCACCATGGCGCATACCCGTACGACGTTCCGGACTACGCTTCT 819
<210> 22
<211>273
<212>PRT
<213>人
<400> 22
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIKGGSSRSSQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRADDTAVYYCAKQEGTYCSGGSCYSGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVTSGQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYAS 273
<210> 23
<211>1431
<212> DNA
<213>人
<400> 23
ATGGAGACGGATACGCTGCTCCTGTGGGTTTTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGATATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATTTGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGTTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGACGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAACAGGAGGGGACATATTGTAGTGGTGGTAGCTGCTACAGTGGCCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCAGCACCAAAGGCCCGAGCGTGTTTCCGCTGGCGCCGAGCAGCAAAAGCACCAGCGGCGGCACCGCGGCGCTGGGCTGCCTGGTGAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCGCTGACCAGCGGCGTGCATACCTTTCCGGCGGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCGAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTATATTTGCAACGTGAACCATAAACCGAGCAACACCAAAGTGGATAAACGCGTGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAAGGACACCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACTATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA 1431
<210> 24
<211> 477
<212> PRT
<213>人
<400> 24
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRADDTAVYYCAKQEGTYCSGGSCYSGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKGHLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 477
<210> 25
<211>708
<212>DNA
<213>人
<400> 25
ATGGAGACGGATACGCTGCTCCTGTGGGTTTTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGATCAAAGTGGATATCAAACGAACTGTGGCTGCACCAAGCGTGTTTATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTCTGTCTCCTGAACAACTTCTATCCCAGGGAGGCCAAGGTCCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAAAGCGGCAATAGCCAGGAGTCCGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGTCCAGCACCCTGACCCTCAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGCGAGGTGACCCATCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACAGGGGCGAATGCAGC 708
<210> 26
<211>236
<212>PRT
<213>人
<400> 26
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGIKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECS 236
<210> 27
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 27
GFTFSRYG 8
<210> 28
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 28
IWYDGSNK 8
<210> 29
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 29
AKQEGTYCSGGSCYSGLDY 19
<210> 30
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 30
QSISSY 6
<210> 31
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 31
AAS 3
<210> 32
<211> 9
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 32
QQSYSTPLT 9
<210> 33
<211> 128
<212>PRT
<213>人工序列
<400> 33
QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRADDTAVYYCAKQEGTYCSGGSCYSGLDYWGQGTLVTVSSAS 128
<210>34
<211> 108
<212>PRT
<213>人工序列
<400>34
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIKG 108
Claims (19)
1.一种新型冠状病毒Delta突变株或原型株检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
第一种抗体和第二种抗体；
所述第一种抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括的CDR1氨基酸序列是：SEQ ID NO.13：GFTFSSYG；CDR2氨基酸序列是：SEQ ID NO.14：ISYDGSDK；CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO.15：RDRDRFGDQGGWFDP；其轻链可变区包括的CDR1的氨基酸序列是：SEQ ID NO.16：QSISSY；CDR2的氨基酸序列是： SEQ ID NO.17：AAS；CDR3的氨基酸序列是：SEQ ID NO.18：QQSYSTPFT；
所述第二种抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括的CDR1氨基酸序列是：SEQ ID NO.27：GFTFSRYG；CDR2氨基酸序列是SEQIDNO.28：IWYDGSNK；CDR3氨基酸序列是SEQIDNO.29：AKQEGTYCSGGSCYSGLDY；轻链可变区包括的CDR1氨基酸序列是SEQIDNO.30：QSISSY；CDR2 氨基酸序列是SEQ ID NO.31：AAS；CDR3氨基酸序列是SEQ ID NO.32：QQSYSTPLT。
2.如权利要求1所述的新型冠状病毒Delta突变株或原型株检测试剂盒，其特征在于，
所述第一种抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示； 或
所述第二种抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：34 所示。
3.如权利要求2所述的新型冠状病毒Delta突变株或原型株检测试剂盒，其特征在于，所述第一种抗体的重链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，轻链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述第二种抗体的重链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，轻链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。
4.如权利要求1所述的新型冠状病毒Delta突变株或原型株检测试剂盒，其特征在于，还包括：样品裂解液和/或采样拭子。
5.如权利要求1-4任一项所述的新型冠状病毒Delta突变株或原型株检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为免疫层析试剂盒、酶联免疫试剂盒或化学发光试剂盒。
6.如权利要求5所述的新型冠状病毒Delta突变株或原型株检测试剂盒，其特征在于，所述免疫层析试剂盒包括检测卡，检测卡包括：底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的底板上；结合垫喷涂有第一种抗体标记的示踪标志物，划线位置从吸水纸自加样孔方向依次为：T线和C线，其中C线固定鼠抗人IgG抗体，T线固定的抗体为第二种抗体。
7.如权利要求6所述的新型冠状病毒Delta突变株或原型株检测试剂盒，其特征在于，所述底板为PVC板；结合垫为玻璃纤维材质；所述示踪标志物为胶体金、荧光微球、或荧光微球。
8.如权利要求6所述的新型冠状病毒Delta突变株或原型株检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括外壳，检测卡组装在上壳和下壳扣合而成的外壳中，上壳上设置有加样孔和观察窗，加样孔对应于样品垫，观察窗对应于T线和C线。
9.如权利要求6所述的新型冠状病毒Delta突变株或原型株检测试剂盒，其特征在于，第一种抗体的浓度为2-10μg/mL；第二种抗体的浓度为0.5～2.0 mg/mL。
10.如权利要求5所述的新型冠状病毒Delta突变株或原型株检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光试剂盒包括中性亲和素或链霉亲和素偶联磁微球、生物素化抗体、吖啶酯标记的抗体、校准品、化学发光底物。
11.如权利要求10所述的新型冠状病毒Delta突变株或原型株检测试剂盒，其特征在于，所述生物素化抗体为生物素化的第一种抗体、吖啶酯标记的抗体为第二种抗体，校准品为Delta突变株的RBD标准品；其中，第一种抗体的浓度为0.5-3μg/mL，第二种抗体的使用量为1-10μg/mL。
12.如权利要求5所述的新型冠状病毒Delta突变株或原型株检测试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒包括酶标板、第一种抗体、鼠抗人-HRP、显色液、终止液、稀释液、洗涤液、标准品；酶标板包被第二种抗体，第二种抗体的浓度为1μg/ml-10μg/mL。
13.一种利用权利要求1～12任一项所述的试剂盒进行非疾病诊断目的检测新型冠状病毒的方法。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，检测样本为离体的上呼吸道样本或非呼吸道样本。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述上呼吸道样本来自鼻浅、鼻咽、口咽、唾液，所述非呼吸道样本来自于环境采集。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，其用于检测样本中是否存在新型冠状病毒原型株和/或Delta突变株。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，将已取样的拭子放入400μL-1000μL裂解液中，滴入2-3滴至采样孔中，室温反应10-15min，观察结果。
18.权利要求1～12任一项所述的试剂盒在制备检测新型冠状病毒的产品中的应用。
19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述产品用于检测样本中是否存在新型冠状病毒原型株和/或Delta突变株。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN114907484A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-08-16 | 中国科学院微生物研究所 | 一种强效抗新冠突变株包括奥密克戎四种亚型的双特异人源抗体 |
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