CN114395621B - Adad2基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用 - Google Patents
Adad2基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114395621B CN114395621B CN202210192293.2A CN202210192293A CN114395621B CN 114395621 B CN114395621 B CN 114395621B CN 202210192293 A CN202210192293 A CN 202210192293A CN 114395621 B CN114395621 B CN 114395621B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- adad2
- obstructive azoospermia
- sequence
- application
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种非梗阻性无精子症的检测试剂盒,所述试剂盒包括检测与非梗阻性无精子症相关的遗传标记的引物对,所述遗传标记的核苷酸序列是ADAD2基因的序列,所述序列的突变位点选自c.C981G、p.F327L、c.1283‑1G>A中的一个或多个。本发明还提供了检测试剂盒在诊断非梗阻性无精子症的应用。以及ADAD2基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用。本发明提供了ADAD2基因的新的用途,从而提供了一种有效的进行非梗阻性无精子症基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径,应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行ADAD2基因突变位点的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于医学基因诊断领域,涉及遗传病非梗阻性无精子症的致病基因ADAD2突变位点及其在基因诊断中的应用。
背景技术
非梗阻性无精子症(NOA)通常被认为是男性不育的一个非医学可控制的原因。这些患者占所有不育男性的10%,他们的无精子症的原因是精子发生异常。以卵胞浆内单精子注射(ICSI)为标准治疗方式的体外受精技术的建立,使这些男性中的许多人通过手术从睾丸中取出精子成功地养育了一个孩子。
双脱氧链终止法即Sanger测序:反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)、双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)、测序引物及DNA聚合酶等。测序反应的核心就是其使用的ddNTP:由于缺少3'-OH基团,不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力,这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。此外,这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团,因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。
早期基于Sanger法的测序设置了四个平行的测序反应,每一个反应中分别包括目标片段、DNA聚合酶、测序引物、四种dNTP和一种特定类型荧光(或放射性同位素)标记的ddNTP(即不同的反应中分别为ddATP、ddGTP、ddCTP及ddTTP)。通过这样的配置,在不同的反应中DNA链将会分别在A、G、C及T位中止,并形成不同长度的DNA片断。这些片断随后可被凝胶电泳分开并显示出来。变性丙烯酰胺电泳有四个泳道,每个泳道对应一种碱基。电泳结束后通过放射自显影或紫外显影可读出X光片或凝胶影像。图像中的每一个暗带表示一个双脱氧核苷酸(ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP)掺入后链终止的DNA片段的结果。四个泳道之间的不同暗带的相对位置可以用来读取(从底部到顶部)DNA序列,从而得到该目标片断的碱基排列顺序。随着Sanger测序技术的发展,ddNTP的标记技术有了很大的提高。不同种类的ddNTP可以被不同荧光基团所标记,而这些荧光基团具有相同的激发波长和不同的发射波长,因而在光学上表现为不同的颜色。因此,测序反应可以在一个体系中进行,满足了业界对测序速度、自动化及通量不断提高的要求。
Sanger操作简便,因此被广泛使用,在其基础上衍生出荧光自动测序技术等。基于荧光标记和双脱氧链终止法的荧光自动测序仪被广泛使用,用于人类基因组计划等项目。基于毛细管电泳技术,Sanger测序现在已经可以在高度自动化的测序仪中进行,商用的产品包括Life Technologies的3130xL、3730xL、3500Dx与3500Dx xL测序仪及Beckman的GeXP遗传分析系统等。这类系统最长可测定600-1000bp的DNA片段,且对重复序列和多聚序列的处理较好,序列准确性高。
中国专利文献CN 105112501 A,公开了一种非梗阻性无精子症的检测试剂盒,包括检测与非梗阻性无精子症相关的遗传标记的引物对,遗传标记的核苷酸序列是DAX-1基因的序列,所述序列的突变位点选自c.152G>A、c.312C>G、c.725C>T、c.766G>C、c.1153G>T、c.1279A>G和c.162G>A中的一个或多个;所述引物对选自primer 1、primer 2、primer 3或primer 4引物对。通过大规模测序在非梗阻性无精子症病人中筛选出了DAX-1基因7个新的突变位点,研究表明DAX-1的上述突变可能导致非梗阻性无精子症的发生,从而能够通过使用本发明的试剂盒检测该突变来实现对男性不育症(尤其是非梗阻性无精子症)的诊断检测。
而目前关于ADAD2突变位点及其在非梗阻性无精子症基因诊断中还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是,针对现有技术中的不足,提供一种非梗阻性无精子症的检测试剂盒。
本发明的第二个目的是,检测试剂盒的用途。
本发明的第三个目的是,ADAD2基因的用途。
为实现上述第一个目的,本发明采取的技术方案是:一种非梗阻性无精子症的检测试剂盒,所述试剂盒包括检测与非梗阻性无精子症相关的遗传标记的引物对,所述遗传标记的核苷酸序列是ADAD2基因的序列,所述序列的突变位点选自c.C981G、p.F327L、c.1283-1G>A中的一个或多个。
作为一个优选例,所述引物对,选自primer 1、primer 2引物对,其中,所述primer1引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示,其下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示;所述primer 2引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示,其下游引物的序列如SEQ IDNO:4所示。
为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:检测试剂盒在诊断非梗阻性无精子症的应用。
为实现上述第三个目的,本发明采取的技术方案是:ADAD2基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用。
本发明优点在于:本发明提供了ADAD2基因的新的用途,从而提供了一种有效的进行非梗阻性无精子症基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径,应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行ADAD2基因突变位点的快速检测。优生优育,早期诊断疾病,辅助临床治疗决策,实现个体化精准治疗,减轻患者经济负担,对实现健康中国的发展方针有促进作用。
附图说明
图1是ADAD2基因突变患者家系图。
图2是ADAD2基因突变患者及其父母Sanger测序峰图。
图3是ADAD2基因突变患者睾丸组织HE染色。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.外周血DNA提取(TIANamp Genomic DNA Kit,DP:304)
1)在符合国家相关政策规定,并在取样对象同意的基础上,抽取第一个家系成员外周静脉血2-5ml,放入EDTA抗凝管内,-80℃冻存备用;
2)取200ul冻存血液,加入20ul Proteinase K溶液,混匀
3)加入200ul缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放置10min,溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4)4.加人200μl无水乙醇,充分振荡混匀15sec,此时可能会出现絮状沉淀,简短离心以去除管盖内壁的水珠。
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm(13,400×g)离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(13,400×g)离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(13,400×g)离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
8)重复加入600ul漂洗液PW操作一次。
9)将吸附柱CB3放回收集管中,12,000rpm(13,400×g)离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加40ul去离子水,室温放置2-5min,12,000rpm(13,400×g)离心2min,将溶液收集到离心管中。
PCR扩增目的片段:反应条件与反应体系:
反应体系(50ul)
扩增程序:PCR反应条件:94℃5min;94℃30sec,55℃30se,72℃30sec,30-35cycles;72℃10min。
3.Sanger测序检测基因突变位点
PCR产物测序:应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序,在该家系中验证了ADAD2基因:NM_001145400:exon6:c.C981G:p.F327L;exon8:c.1283-1G>A。在GnomAD中,NM_001145400:exon6:c.C981G:p.F327L在东亚人群突变频率为0.02;NM_001145400:exon8:c.1283-1G>未发现人群相同位点突变频率。分别应用Mutation Taster和SPIDEX对两个突变未见进行预测发现,两个突变均为damaging。多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的。在200例正常当地人群及该家系中正常人的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查,未发现该突变。
引物列表:
ADAD2基因突变患者家系图件图1。Ⅱ1为先证者,携带ADAD2复合杂合突变(c.C981G:p.F327L;c.1283-1G>A),父母为杂合携带者,遗传方式为常染色体隐性遗传。
取ADAD2基因突变患者及其父母外周血,进行Sanger测序验证,结果显示父亲为ADAD2基因突变(c.C981G:p.F327L)杂合携带者,母亲为ADAD2基因突变(c.1283-1G>A)杂合携带者,符合家系遗传共分离。见图2,ADAD2基因突变患者及其父母Sanger测序峰图。
取该ADAD2基因突变患者睾丸组织,4%PFA固定,石蜡包埋,切片后HE染色,结果显示生精阻滞病理表型。见图3,ADAD2基因突变患者睾丸组织HE染色。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市第一人民医院
<120> ADAD2基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用
<130> /
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgatagcagc cttcgccagg ac 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtagcacaca ggcttcagct g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cagctgaagc ctgtgtgcta c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttctcacttg gccttcacac g 21
Claims (2)
1.检测ADAD2基因突变的引物在制备非梗阻性无精子症的诊断试剂盒中的应用,其特征在于,所述ADAD2基因的核苷酸序列是NM_001145400,所述ADAD2基因突变位点选自c.C981G、和/或c.1283-1G>A。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述引物选自primer1和/或primer2引物对,其中,所述primer1引物对的上游引物的序列如SEQ IDNO:1所示,其下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示;所述primer2引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示,其下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210192293.2A CN114395621B (zh) | 2022-02-28 | 2022-02-28 | Adad2基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210192293.2A CN114395621B (zh) | 2022-02-28 | 2022-02-28 | Adad2基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114395621A CN114395621A (zh) | 2022-04-26 |
CN114395621B true CN114395621B (zh) | 2023-05-02 |
Family
ID=81234565
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210192293.2A Active CN114395621B (zh) | 2022-02-28 | 2022-02-28 | Adad2基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114395621B (zh) |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3049535B1 (en) * | 2013-09-27 | 2021-12-01 | The Regents of the University of California | Method to estimate the age of tissues and cell types based on epigenetic markers |
CN105176976B (zh) * | 2014-09-02 | 2018-09-25 | 深圳市第二人民医院 | 一种检测与非梗阻性无精子症相关的遗传标记的引物对 |
-
2022
- 2022-02-28 CN CN202210192293.2A patent/CN114395621B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114395621A (zh) | 2022-04-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109207579B (zh) | 一种检测恶性高热易感基因的多重检测试剂盒及其用途 | |
DK2351858T3 (da) | Påvisning af føtale kromosomabnormiteter ved anvendelse af tandem-enkeltnukleotid-polymorfismer | |
JPH04502862A (ja) | 核酸配列上の一個の塩基を迅速に検出および/または同定する方法とその応用 | |
CN108913757B (zh) | 一种染色体非整倍体数目异常的引物组与检测试剂盒及其应用 | |
WO2002068685A2 (en) | Diagnostic test for the detection of chromosomal abnormalities in a fetus | |
EP0648222B1 (en) | Methods of single nucleotide primer extension to detect specific alleles and kits therefor | |
CN106755399B (zh) | 一种i型神经纤维瘤病致病突变基因及基于此突变基因的病因学诊断试剂 | |
CN104711345A (zh) | Cyp2c19*2基因型快速检测试剂盒及其方法 | |
JP2002510962A (ja) | 男性不妊y欠失検出器具 | |
CN114395621B (zh) | Adad2基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用 | |
JP4926079B2 (ja) | 一塩基多型を含む乳癌に関連したポリヌクレオチド、それを含むマイクロアレイ及び診断キット、並びにそれを利用した乳癌の診断方法 | |
CN114438194B (zh) | Hfm1基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用 | |
JP6053681B2 (ja) | イヌの緑内障を診断する方法及びキット | |
Prior et al. | A model for molecular screening of newborns: simultaneous detection of Duchenne/Becker muscular dystrophies and cystic fibrosis | |
EP1716255A2 (en) | A polynucleotide associated with a colon cancer comprising single nucleotide polymorphism, microarray and diagnostic kit comprising the same and method for diagnosing a colon cancer using the polynucleotide | |
CN113584156A (zh) | 一种HCN4突变基因及突变体、以及Brugada综合征检测试剂盒 | |
CN111411149A (zh) | 一种检测肥厚型心肌病基因突变的引物组、试剂盒和方法 | |
CN110951858A (zh) | 用于指导格列苯脲药物个体化用药相关基因检测的引物探针组合及试剂盒及应用 | |
CA2400543C (en) | The involvement of the bdnf gene in mood disorders | |
CN107446921B (zh) | Thsd7a基因序列及表达改变检测及其在冠心病预测中的应用 | |
JP6516128B2 (ja) | 抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定するための検査方法及び判定用キット | |
CN113637739B (zh) | 一种SCN5A突变基因、应用以及Brugada综合征检测试剂盒 | |
Arinami et al. | Failure to find associations of the CA repeat polymorphism in the first intron and the Gly− 63/Glu− 63 polymorphism of the neurotrophin-3 gene with schizophrenia | |
US6727354B2 (en) | Compositions and methods for TIGR genotyping assays | |
CN107419028B (zh) | 一种用于检测可变性红斑角化病的试剂盒及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |