CN114395059A - 聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层修饰方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚多巴胺‑两性离子聚合物抗黏附涂层修饰方法，将被修饰物置入三羟甲基氨基甲烷、多巴胺盐酸盐、两性离子聚合物和强电解质溶液的混合溶液中浸泡形成抗黏附涂层，用抗细胞黏附的方式来减轻异物反应，不需引入药物即可获得长期稳定的抗纤维化效果。先形成聚合物，再将聚合物接枝到电极表面，而不是在电极表面直接引发聚合，使得在接枝前充分透析去除毒性小分子，确保了良好的生物相容性。利用两性离子反聚电解质效应，在涂层溶液中加入电解质，可增加两性离子聚合物的溶解度，保证了高接枝密度。

Description

聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层修饰方法及其应用

技术领域

本发明涉及高分子材料和医用植入物领域，具体涉及两性离子聚合物的制备及其应用于医用植入器械。

背景技术

近年来，植入医疗器械在临床上大量应用，如血管介入、骨科植入和人工器官等。但是医疗器械在体内会引起不同程度的异物反应，且随着植入时间的延长，植入体周围会形成纤维囊鞘，严重影响了远期效果。

以人工耳蜗为例，植入电极通常会被宿主免疫系统认为是“异物”，在蜗内产生严重的异物反应，电极周围会形成厚厚的纤维囊鞘，不仅会影响电刺激的传导，而且增加了耗电量，严重影响了使用效果。抗植入后异物反应有多种抑制策略，比如针对局部、全身给予免疫抑制剂、改良术式、使用短电极、电极载药等方式，尽管会在一定程度上抑制急性期的异物反应，但无法抗长期慢性的异物反应。目前广泛应用的聚乙二醇(PEG)涂层，具有亲水性好，生物相容性佳等特点，但聚乙二醇在体内易氧化降解，稳定性欠佳，且随着植入时间延长，仍会导致严重的异物反应，甚至会产生聚乙二醇抗体，影响再次植入。还有，如中国专利文献CN110300615A公开了一种用于耳蜗植入的含地塞米松的硅树脂涂层的电极。采用地塞米松修饰电极虽然可以抗电极植入术后的急性期异物反应，但在药物释放完毕后，难以达到抗长期慢性的异物反应的效果。

研究表明，非特异性蛋白在植入物界面的黏附是异物反应的“启动环节”，随之黏附的巨噬细胞则主导了异物反应。对植入物表面进行修饰，提高其亲水性，可以增加其抗黏附能力，继而减少植入后的异物反应。通过进一步研究发现，首先，两性离子材料如磷酸胆碱(PC)、磺基甜菜碱(SB)和羧基甜菜碱(CB)等，具有等量的阴、阳离子，整体呈电中性。两性离子材料可以通过带电端基官能团的溶剂化作用和氢键作用形成致密、稳定的水化层，比不带电荷的PEG仅通过氢键相互作用形成的水化层更强。植入物表面紧密的水化层对蛋白质、细胞的黏附产生了物理及能量上的障碍，进而减少了表面的蛋白、细胞黏附量。其次，受海洋生物贻贝启发的类黏附蛋白聚多巴胺(PDA)因其在表面改性上的普适性、简易性及生物相容性而备受关注。PDA的邻苯二酚官能团可与基底材料表面形成牢固的共价键和非共价键，这使其在任何材料上都具有的超强黏附性能。

因此，如若能够结合两种物质，研究出解决医用植入器械领域碰到的难以达到的长期抗异物反应，是可取的攻关路线。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种植入物表面稳定且安全、可降低非特异蛋白及细胞黏附、减少植入后异物反应的聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层的修饰方法及其应用。

为克服该技术缺陷，本发明采用的技术方案是：一种两性离子聚合物，其化学结构通式为：

式中，R为两性离子单体及其衍生物或及其混合物，X为卤素。

进一步地，所述两性离子单体为甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)、甲基丙烯酰乙基羧基甜菜碱(CBMA)、2－甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)或三甲胺-两性离子化合物(TMAO)。

还有，本发明采用的技术方案是：一种两性离子聚合物的制备方法，其特征在于：首先，将多巴胺盐酸盐、叔丁基二甲氯硅烷和咪唑溶解于第一溶剂中，在25℃氮气条件下反应，将浓缩的有机相溶液通过硅胶色谱法进行纯化，将剩余的溶液继续浓缩，干燥后得到中间产物；接着，将中间产物和三乙胺溶解于第二溶剂中，逐渐加入2-溴异丁酰溴搅拌反应，将浓缩的有机相溶液通过硅胶色谱法进行纯化，将剩余的溶液继续浓缩，干燥后得到引发剂；接着，两性离子单体、氯化铜、五甲基二乙烯三胺、抗坏血酸和引发剂在甲醇溶剂中搅拌溶解，在50℃氮气条件下反应，得到端基保护的两性离子聚合物；最后，将端基保护的两性离子聚合物溶解于四丁基氟化铵溶液中，透析后干燥得到酚羟基为端基的两性离子聚合物。

进一步地，所述两性离子单体选自甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)、甲基丙烯酰乙基羧基甜菜碱(CBMA)、2－甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)、三甲胺-两性离子化合物(TMAO)及其衍生物以及其混合物。

还有，本发明采用的技术方案是：一种聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层修饰方法，其特征在于：将被修饰物置入三羟甲基氨基甲烷、多巴胺盐酸盐、两性离子聚合物和强电解质溶液的混合溶液中浸泡形成抗黏附涂层；所述多巴胺盐酸盐与两性离子聚合物的质量比为1：0.5至1：5之间。

进一步地，所述混合溶液中还再加入硫酸铜和过氧化氢，聚合反应后在植入医疗材料表面形成抗黏附涂层。

进一步地，所述两性离子聚合物的结构通式为：

式中，R为两性离子单体及其衍生物或及其混合物，X为卤素。

还有，本发明采用的技术方案是：一种聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层的应用，其特征在于：用聚多巴胺作为中间粘合层，黏附于植入物基材的表面。

进一步地，所述基材包括金属、陶瓷、高分子材料或聚醚醚酮。

还有，本发明采用的技术方案是：一种聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层，其特征在于包括以下质量比组分：两性离子聚合物15～70％，多巴胺盐酸盐1～20％，缓冲液余量。

实施本发明技术方案，将聚多巴胺与两性离子的聚合物抗黏附涂层用于植入物，用抗细胞黏附的方式来减轻异物反应，不需引入药物即可获得长期稳定的抗纤维化效果。先形成聚合物，再将聚合物接枝到电极表面，而不是在电极表面直接引发聚合，使得在接枝前充分透析去除毒性小分子，确保了良好的生物相容性。利用两性离子反聚电解质效应，在涂层溶液中加入电解质，可增加两性离子聚合物的溶解度，保证了高接枝密度。

本发明的还有以下优点：

抗黏附性强。两性离子可以通过离子-偶极相互作用形成致密、稳定的水化层，比不带电荷的聚乙二醇通过氢键相互作用形成的水化层更强。极强的水化能力导致超低的非特异性蛋白质吸附、细胞粘附，使得两性离子成为聚乙二醇的优选替代品。

生物相容性好。采用接枝到主链法(grafting to)的接枝方式，在聚合完毕后，多次透析，充分去除毒性小分子，避免了直接在电极表面聚合而造成有生物毒性的引发剂残留。

稳定性佳。聚多巴胺的酚羟基官能团可与基底材料表面形成共价键或非共价键，使其具有超强黏附性，不易脱离电极。

附图说明

图1是用于抗黏附涂层的两性离子聚合物的反应过程图(以PSBMA为例)。

图2是细胞安全性实验评价图。L929成纤维细胞/Raw264.7巨噬细胞在两性离子涂层组与对照组上的细胞存活率无统计学差异，说明涂层的生物相容性好。

图3是涂层亲水性实验评价图。未涂层材料的水接触角为96.91°,两性离子涂层的水接触角为5.01°，证明两性离子涂层的亲水性高。

图4是抗蛋白黏附效果实验评价图。将材料浸泡于BSA-FITC(牛血清白蛋白-绿色荧光染料)2小时后，未涂层材料上有大量绿色荧光点，而两性离子涂层上无绿色荧光点，说明其能够抗蛋白黏附。

图5是抗L929成纤维细胞黏附实验评价图。将成纤维细胞分别接种在未涂层(左)和两性离子涂层(右)材料上，培养24h后，可见未涂层材料上有很多细胞黏附，而两性离子涂层上很少细胞黏附，说明其能够抗成纤细胞黏附。

图6是抗Raw264.7巨噬细胞黏附实验评价图。将抗巨噬细胞分别接种在未涂层(左) 和两性离子涂层(右)材料上，培养24h后，可见未涂层材料上有很多巨噬细胞，而两性离子涂层上很少细胞黏附，说明其能够抗巨噬细胞黏附。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1。本实施例以电极作为医用植入物，说明聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层修饰电极的方法：

1、在冰浴中，将多巴胺盐酸盐(DA·HCl)1.89g、叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMS)4.52g 和咪唑3.4g溶解于30ml二氯甲烷(DCM)溶液中。待反应停止放热后，撤冰浴。接着，在25℃氮气条件下继续反应2小时。离心去除反应后的混合溶液中的沉淀，提取上清并萃取分离出有机相，再用旋蒸法浓缩。浓缩后的溶液再通过硅胶色谱法(二氯甲烷：甲醇＝4： 1)进行纯化，再将纯化后的溶液进行浓缩，真空干燥8小时后得到中间产物，呈黄色油状液体。反应过程如下式：

2、将中间产物1.9g、三乙胺(TEA)0.61g溶解于15ml的二氯甲烷溶液中，再逐渐加入2-溴异丁酰溴1.38g，在冰水浴下搅拌1小时后，再在25℃条件下继续反应24小时。在溶液中加入20ml去离子水，萃取并分离出有机相，旋蒸浓缩后，浓缩溶液再通过硅胶色谱法(正己烷：乙酸乙酯＝4：1)进行纯化，再将纯化后的溶液进行浓缩，真空干燥8 小时后得到端基受保护的引发剂，呈白色结晶状固体。反应过程如下式：

3、将甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)30mmol、氯化铜0.2mmol、五甲基二乙烯三胺0.35mmol、抗坏血酸0.4mmol和引发剂0.3mmol在50ml的甲醇和水(v/v＝1:1)的溶剂中充分搅拌溶解后，再在50℃氮气条件下反应36小时，得到端基受保护的两性离子聚合物(T-PSBMA)。用甲醇溶液清洗三次将T-PSBMA析出后，用1000D的透析袋透析3天，透析液为加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)的去离子水。冷冻干燥后得到T-PSBMA粉末。反应过程如下式：

4、将第三步的产物溶解于1M四丁基氟化铵(TBAF)的四氢呋喃(THF)溶液中，搅拌24小时。之后，用1000D的透析袋透析3天，透析液为去离子水。冷冻干燥24小时后，最终得到酚羟基为端基的聚磺基甜菜碱甲基丙烯酸甲酯(PSBMA)。两性离子聚合物反应过程如下式：

5、将电极依次使用丙酮、异丙醇、去离子水超声清洗五分钟。配制三羟甲基氨基甲烷(TRIS)缓冲液(pH8.5，10mM)，并将多巴胺盐酸盐(DA·HCl)、两性离子聚合物(PSBMA)、氯化钠(NaCl)分别以1mg/ml、5mg/ml、9mg/ml的浓度在其中进行搅拌溶解。待充分搅拌溶解后，将电极于上述混合溶液中浸泡沉积24小时形成聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层。最后，用去离子水清洗未结合的分子，将涂层的电极储存于0.9％的生理盐水中。用聚多巴胺做中间粘合层，可在任何基材的医用植入器械上涂层，适用性广。只需将电极置于两性离子聚合物与多巴胺的混合碱性溶液中静置24小时，即可在电极表面形成涂层，工艺简单。涂层厚度仅数30纳米，不影响电极的机械性能，且植入后没有溶胀性变化，避免压迫人体内组织，避免导致二次损伤。多巴胺盐酸盐与两性离子聚合物的质量比为1： 0.5-1：5。实施例1所述完整的反应过程如图1所示。

实施例2。本实施例以聚醚醚酮(PEEK)作为医用植入物，说明聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层修饰PEEK表面的方法：

1、多巴胺盐酸盐(DA·HCl)2.27g、叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMS)5.42g和咪唑4.08g 溶解于30ml三氯甲烷溶液中，在0℃条件下反应。接着，在25℃氮气条件下继续反应2小时。离心去除反应后的混合溶液中的沉淀，提取上清并萃取分离出有机相，再用旋蒸法浓缩。浓缩后的溶液再通过硅胶色谱法(三氯甲烷：甲醇＝8：1)进行纯化，再将纯化后的溶液进行浓缩，真空干燥10小时后得到中间产物。反应过程如下式：

2、将中间产物2.85g、三乙胺(TEA)1.23g溶解于另一份的25ml三氯甲烷溶液中，再逐滴加入2-溴异丁酰溴2.07g，在冰水浴下搅拌2小时后，再在25℃条件下继续反应 24小时。在溶液中加入40ml去离子水，萃取并分离出有机相，旋蒸浓缩后，浓缩溶液再通过硅胶色谱法(正己烷：乙酸乙酯＝8：1)进行纯化，再将纯化后的溶液进行浓缩，真空干燥10小时后得到端基受保护的引发剂。反应过程如下式：

3、将甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)30mmol、硫酸铜0.1mmol、五甲基二乙烯三胺0.5mmol、抗坏血酸0.7mmol和引发剂0.3mmol在50ml的甲醇和水(v/v＝2:1)的溶剂中充分搅拌溶解后，再在50℃氮气条件下反应24小时，得到端基受保护的两性离子聚合物(T-PSBMA)。用甲醇溶液清洗三次将T-PCBMA析出后，用2000D的透析袋透析3天，透析液为加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)的去离子水。冷冻干燥后得到T-PSBMA粉末。反应过程如下式：

4、将第三步的产物溶解于四丁基氟化铵(TBAF)溶液中，搅拌24小时。之后，用2000D 的透析袋透析3天，透析液为去离子水。冷冻干燥24小时后，最终得到酚羟基为端基的聚磺基甜菜碱甲基丙烯酸甲酯(PSBMA)。两性离子聚合物反应过程如下式：

5、将聚醚醚酮(PEEK)依次使用丙酮、异丙醇、去离子水超声清洗五分钟。配制三羟甲基氨基甲烷(TRIS)缓冲液(pH8.5，50mM)，并将多巴胺盐酸盐(DA·HCl)、两性离子聚合物(PSBMA)、氯化钾(KCl)分别以1mg/ml、5mg/ml、9mg/ml的浓度比中进行搅拌溶解。待充分搅拌溶解后，再在体系中加入19.6mM硫酸铜CuSO₄和5mM过氧化氢H₂O₂，加速聚合。将聚醚醚酮于上述混合溶液中浸泡沉积1小时形成多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层，见下式：

6、最后，用去离子水清洗未结合的分子，将涂层的聚醚醚酮储存于PSB缓冲液中。多巴胺盐酸盐与两性离子聚合物的浓度比例为：1：5或2：1或2：5。体系加速聚合中的硫酸铜也可以采用硝酸银或氯化铜代替。

上述两个实施例说明了聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层能够修饰电极和PEEK，当然，还能够修饰金属(不锈钢、钴、铬、钽、钛合金等)、陶瓷、玻璃、高分子材料以及医用植入物(血管支架、耳蜗、探针等)。

为了验证聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层修饰方法的可靠性，采用如下实验过程显示生物相容性和抗蛋白黏附能力。

设置无干预手段的对照组，聚多巴胺-两性离子聚合物复合涂层组及未加入细胞的空白组。材料在使用前70％乙醇浸泡30min，紫外线灭菌20min。L929成纤维细胞和Raw264.7 巨噬细胞分别以5000个/孔的密度接种在96孔板上，将涂层材料加入培养基中与细胞共培养。24小时后，加入CCK-8试剂。于细胞培养箱孵育2小时后，在450nm测定吸光度。按照公式，计算细胞存活率＝[(实验组-空白组)/(对照组-空白组)]×100％。如图2所示，由此实验可说明本发明的涂层生物相容性良好。如图3所示，涂层后水接触角变小，显示亲水性高。

将灭菌后的材料在0.5mg/ml的荧光标记牛血清白蛋白(BSA-FITC)溶液中浸泡2小时，以使蛋白质吸附在材料表面。然后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)轻轻清洗五次，以除去未结合紧密的蛋白质分子。使用共聚焦激光扫描显微镜拍摄材料表面的荧光图像，如图4 所示，通过对比未涂层组与聚多巴胺-两性离子聚合物复合涂层组的荧光强度，可说明本发明的涂层在不同的蛋白浓度下都具有很强的抗蛋白黏附能力。

将灭菌后的材料铺在孔板底部，密度为50000/ml的成纤维细胞L929和巨噬细胞RAW264.7接种在上面。培养24小时后，用1ml的PBS洗涤细胞2次，洗去黏附不紧密的细胞。固定打孔后，用1％w/v牛血清白蛋白(BSA)封闭两小时，再用1％v/v鬼笔环肽 (phalloidin)染色60分钟，洗去后用DAPI封片。使用共聚焦激光扫描显微镜观察黏附细胞的数量，如图5和图6所示，此实验可说明本发明的涂层有良好的抗细胞黏附的能力，且在体内减轻异物反应。

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种两性离子聚合物，其化学结构通式为：

式中，R为两性离子单体及其衍生物或及其混合物，X为卤素。

2.根据权利要求1所述的两性离子聚合物，其特征在于：所述两性离子单体为甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)、甲基丙烯酰乙基羧基甜菜碱(CBMA)、2－甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)或三甲胺-两性离子化合物(TMAO)。

3.一种两性离子聚合物的制备方法，其特征在于：首先，将多巴胺盐酸盐、叔丁基二甲氯硅烷和咪唑溶解于第一溶剂中，在25℃氮气条件下反应，将浓缩的有机相溶液通过硅胶色谱法进行纯化，将剩余的溶液继续浓缩，干燥后得到中间产物；

接着，将中间产物和三乙胺溶解于第二溶剂中，逐渐加入2-溴异丁酰溴搅拌反应，将浓缩的有机相溶液通过硅胶色谱法进行纯化，将剩余的溶液继续浓缩，干燥后得到引发剂；

接着，两性离子单体、氯化铜、五甲基二乙烯三胺、抗坏血酸和引发剂在甲醇溶剂中搅拌溶解，在50℃氮气条件下反应，得到端基保护的两性离子聚合物；

最后，将端基保护的两性离子聚合物溶解于四丁基氟化铵溶液中，透析后干燥得到酚羟基为端基的两性离子聚合物。

4.根据权利要求3所述的两性离子聚合物的制备方法，其特征在于：所述两性离子单体选自甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)、甲基丙烯酰乙基羧基甜菜碱(CBMA)、2－甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)、三甲胺-两性离子化合物(TMAO)及其衍生物以及其混合物。

5.一种聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层修饰方法，其特征在于：将被修饰物置入三羟甲基氨基甲烷、多巴胺盐酸盐、两性离子聚合物和强电解质溶液的混合溶液中浸泡形成抗黏附涂层；所述多巴胺盐酸盐与两性离子聚合物的质量比为1：0.5至1：5之间。

6.根据权利要求5所述的聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层修饰方法，其特征在于：所述混合溶液中还再加入硫酸铜和过氧化氢，聚合反应后在植入医疗材料表面形成抗黏附涂层。

7.根据权利要求5所述的聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层修饰方法，其特征在于，所述两性离子聚合物的结构通式为：

式中，R为两性离子单体及其衍生物或及其混合物，X为卤素。

8.一种聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层的应用，其特征在于：用聚多巴胺作为中间粘合层，黏附于植入物基材的表面。

9.根据权利要求5所述的聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层的应用，其特征在于：所述基材包括金属、陶瓷、高分子材料或聚醚醚酮。

10.一种聚多巴胺-两性离子聚合物抗黏附涂层，其特征在于包括以下质量比组分：两性离子聚合物15～70％，多巴胺盐酸盐1～20％，缓冲液余量。

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