CN117414473A - 一种基于手性与多肽的细胞选择性粘附三维支架及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于手性与多肽的细胞选择性粘附三维支架及其制备方法和应用，涉及医疗用品领域，三维支架为层叠的、三维有序结构，每层包括有序排列的若干聚电解质多层膜软载体，相邻两层的聚电解质多层膜软载体呈夹角；每层的聚电解质多层膜均为接枝有特异性识别基团的带正电荷的手性分子和带负电荷的超分子聚电解质交替在软载体上通过多次沉积后再修饰多肽形成的聚电解质多层膜；相邻的聚电解质多层膜中的两种多肽不同并分别用于促进不同细胞的特异性粘附。本发明提供的三维支架具有特异性粘附作用，从而避免了细胞在错误位置的过量增殖，有助于避免出现人工血管再损伤、狭窄等问题。
Description
技术领域
本发明涉及医疗用品的技术领域，具体涉及一种基于手性与多肽的细胞选择性粘附三维支架及其制备方法和应用。
背景技术
组织工程支架可为细胞生长提供外部支持和物质与能量间交换的平台。然而，由于工艺技术、生物相容性和表面特异性修饰等方面的限制，如何在支架内部构建具有化学和生物特异性的三维支架，并模拟其在生物体内的生长环境，已成为该领域的重要挑战。
以往的研究发现，具有特定序列或手性分子的多肽可以特异性调节细胞粘附。然而，大多数研究都局限于二维平面或薄膜材料的表面改性。因此，人们迫切需要开发一种实验条件温和、制作简单、材料通用的策略来实现细胞的选择性粘附，即通过在支架的特定位置引入活性位点来进行三维立体培养和细胞选择性粘附。
心血管疾病是当今威胁人类生命健康的一大杀手，直径小于4mm的人工血管在植入后常出现再狭窄、栓塞等损伤，导致植入失败。这些损伤通常是由于细胞在错误位置过度增殖引起的，其中血管内壁内皮细胞和平滑肌细胞之间的竞争是主要原因。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
发明目的
为解决现有技术中容易错误增殖的问题，本发明的目的在于提供一种基于手性与多肽的细胞选择性粘附三维支架及其制备方法和应用。
本发明通过修饰两种多肽(如REDV与VAPG)，同时又引入手性分子(如PDL)，通过多肽促进细胞粘附与手性分子抑制细胞粘附的协同作用，在同一个三维支架内实现促进内皮细胞而抑制平滑肌细胞生长、或促进平滑肌细胞而抑制内皮细胞的生长，防止细胞在错误位置过度增殖，对组织工程支架的发展具有重要意义。
解决方案
为实现本发明目的，第一方面，本发明提供了一种基于手性与多肽的细胞选择性粘附三维支架，其为层叠的、三维有序结构，每层包括有序排列的若干聚电解质多层膜软载体，相邻两层的聚电解质多层膜软载体呈夹角；每层的聚电解质多层膜软载体均为接枝有特异性识别基团的带正电荷的手性分子和带负电荷的超分子聚电解质交替在软载体上通过多次沉积后再修饰多肽形成的聚电解质多层膜；
相邻的聚电解质多层膜中的两种多肽不同并分别用于促进不同细胞的特异性粘附；
相邻两层的聚电解质多层膜中的两种特异性识别基团不同并分别为能实现超分子自组装连接的一对主客体相互作用基团。
进一步地，所述多肽在聚电解质多层膜中采用简单吸附、点击化学反应或叠氮和巯基反应接枝接枝。
进一步地，所述软载体包括掺杂了磁性纳米粒子的软材料，可选地，所述软材料选自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)、甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)和胶原蛋白中的一种或几种。
进一步地，所述聚电解质选自经C＝C双键基团修饰的透明质酸、经C＝C双键基团修饰的羧化壳聚糖中的一种或几种；可选地，用于C＝C双键基团修饰的原料为甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸、丙烯酸酐中的一种或几种。
进一步地，还包括基底，用于承载聚电解质多层膜，所述基底为接枝有特异性识别基团的带正电荷的手性分子和带负电荷的超分子聚电解质依次交替在基板上通过多次循环沉积的聚电解质多层膜，所述基板材料选自石英、硅、钛金属中的一种或几种。
进一步地，所述特异性识别基团包括主客体相互作用基团；可选地，主客体相互作用基团选自β-环糊精、葫芦脲、金刚烷、偶氮苯、胆固醇和蒽中的一种或几种；可选地，β-环糊精为主体基团(可选地采用的原料为6-NH2-β-CD)，对应的客体基团为金刚烷(可选地采用的原料为金刚烷乙酸)、偶氮苯或胆固醇；可选地，葫芦脲为主体基团，对应的客体基团为蒽。
进一步地，所述手性分子为多聚右旋赖氨酸，可选地，所述手性分子的分子量为7～15万。
进一步地，所述聚电解质多层膜为修饰有双键基团和特异性识别基团的带正电荷的手性分子、带负电荷的超分子聚电解质在软载体上交替沉积n或n+0.5个周期形成的聚电解质多层膜；其中，一个周期为带正电荷的手性分子和负电荷的超分子聚电解质分别沉积一次，可选地n为整数，可选地n≥35，可选地n≥40，可选地n+0.5为在第n个周期的基础上再沉积一层带正电荷的手性分子；可选地，相邻两层的聚电解质多层膜的n独立地选自n≥35的整数；
可选地，相邻两层的聚电解质多层膜的最外层膜分别为接枝有特异性识别基团的带正电荷的手性分子和带负电荷的超分子聚电解质，用于使相邻两层的聚电解质多层膜通过正、负电荷连接；
和/或，多层膜软载体包括至少两种，分别为沉积有主客体相互作用基团的主体、客体的聚电解质，且这两种多层膜软载体的沉积周期分别为n、n+0.5；
可选地，所述聚电解质多层膜选自进一步修饰有多肽的(PDL/MA-HA-Ad)40、(PDL/MA-HA-CD)40.5的多层膜PDMS中的一种或几种；
可选地，所述聚电解质多层膜选自(PDL/REDV-HA-Ad)40、(PDL/VAPG-HA-CD)40.5的多层膜PDMS中的一种或几种；
可选地，还包括基底，所述基底为修饰有(PDL/CCS-CD)40.5的石英片。
进一步地，多肽包括REDV多肽、VAPG多肽、GFOGER多肽、PAP多肽、KHI多肽、IKVAV多肽中的一种或几种。
进一步地，细胞包括人脐静脉内皮细胞和兔主动脉平滑肌细胞、人骨髓间充质干细胞与小鼠单核巨噬细胞白血病细胞、或人神经祖细胞与星胶质细胞的特异性粘附中的一对或几对；
进一步地，第一层为修饰有(PDL/REDV-HA-Ad)40多层膜的PDMS，第二层为修饰了(PDL/VAPG-HA-CD)40.5多层膜的PDMS，第三层为修饰了(PDL/REDV-HA-Ad)40多层膜的PDMS。
第二方面，提供一种基于手性与多肽的细胞选择性粘附三维支架的制备方法，包括如下步骤：
1)制备带有主客体相互作用基团和C＝C双键的带负电荷的超分子聚电解质，主客体相互作用基团的主体、客体分别修饰在不同的聚电解质上；
2)将软载体依次在带正电荷的手性分子溶液、步骤1)的带负电荷的超分子聚电解质溶液中沉积成膜，循环n或n+0.5个周期，制备(手性分子/带有主客体相互作用基团和C＝C双键的聚电解质)n的多层膜软载体，其中，一个周期为带正电荷的手性分子和带负电荷的超分子聚电解质依次沉积一次，可选地n为整数，可选地n≥35，可选地n≥40，可选地n+0.5为在第n个周期的基础上再沉积一层带正电荷的手性分子；
其中，多层膜软载体包括至少两种，两种多层膜软载体的超分子聚电解质分别为修饰有主客体相互作用基团的主体基团和客体基团的超分子聚电解质，且这两种多层膜软载体的沉积周期分别为n、n+0.5；
3)将步骤2)的多层膜软载体分别通过简单吸附、叠氮和巯基反应或点击化学反应接枝多肽，制得聚电解质多层膜；
4)将能通过主客体相互作用的多层膜软载体搭建三维支架，相邻的多层膜软载体中的多肽、聚电解质主客体相互作用基团不同。
进一步地，步骤1)中，所述聚电解质选自经C＝C双键基团修饰的透明质酸、经C＝C双键基团修饰的羧化壳聚糖中的一种或几种；可选地，用于C＝C双键基团修饰的原料为甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸、丙烯酸酐中的一种或几种；可选地，聚电解质的浓度为0.5～2g/L，可选地为0.5～2g/L。
和/或，步骤1)中，所述特异性识别基团包括主客体相互作用基团；可选地，主客体相互作用基团选自β-环糊精、葫芦脲、金刚烷、偶氮苯、胆固醇和蒽中的一种或几种；可选地，β-环糊精为主体基团(可选地采用的原料为6-NH2-β-CD)，对应的客体基团为金刚烷(可选地采用的原料为金刚烷乙酸)、偶氮苯或胆固醇；可选地，葫芦脲为主体基团，对应的客体基团为蒽。
和/或，步骤2)中，所述手性分子为多聚右旋赖氨酸；可选地，手性分子的浓度为0.1～1g/L，可选地为0.5～1g/L。
可选地，步骤2)中，多层膜软载体为(PDL/MA-HA-Ad)40、(PDL/MA-HA-CD)40.5的多层膜PDMS中的一种或几种。
可选地，步骤3)中，多肽包括REDV多肽、VAPG多肽、GFOGER多肽、PAP多肽、KHI多肽、IKVAV多肽中的一种或几种；可选地，多肽的浓度为0.5～2g/L，可选地为1～2g/L。
可选地，步骤3)中，所述聚电解质多层膜选自(PDL/REDV-HA-Ad)40、(PDL/VAPG-HA-CD)40.5的多层膜PDMS。
进一步地，还包括基底，用于承载聚电解质多层膜，所述基底为接枝有特异性识别基团的带正电荷的手性分子和带负电荷的超分子聚电解质依次交替在基板上通过多次循环沉积的聚电解质多层膜，所述基板材料选自石英、硅、钛金属中的一种或几种，可选地，所述基底为修饰有(PDL/CCS-CD)40.5的石英片
第三方面，提供一种第一方面所述的基于手性与多肽的细胞选择性粘附三维支架或第二方面所述的制备方法制备的基于手性与多肽的细胞选择性粘附三维支架在制备软体组织修复产品、骨再生装置和/或神经修复产品中的应用，可选地软体组织修复产品包括人工血管支架。
上述第一方面、第二方面或第三方面中，相邻的聚电解质多层膜中的多肽分别为REDV多肽和VAPG多肽；可选地，所述REDV多肽为CREDV多肽，用于促进特异性粘附的细胞为内皮细胞；可选地，VAPG多肽为CVAPG多肽，用于促进特异性粘附的细胞为平滑肌细胞。
有益效果
(1)本发明通过PDL手性分子与多肽的相互协同作用，实现多种细胞的三维选择性粘附。聚电解质多层膜的正电手性分子(如PDL)与负电分子聚电解质(例如MA-HA-Ad/MA-HA-CD)通过静电作用层层吸附形成了多层膜，然后在聚电解质上的双键通过点击化学接枝多肽(也可以通过其它接枝方式)，这样就在三维支架软载体表面修饰了手性分子(如PDL)、主客体相互作用分子(如CD、Ad)与多肽(如REDV与VAPG)。
(2)本发明修饰了两种或两种以上多肽(REDV与VAPG等)，同时又引入PDL手性分子，通过多肽促进细胞粘附与手性分子抑制细胞粘附的协同作用，在同一个三维支架内实现促进内皮细胞而抑制平滑肌细胞生长、或促进平滑肌细胞而抑制内皮细胞的生长。
(3)本发明提供的三维支架，包括软载体、包覆于软载体表面的手性分子、聚电解质、设于软载体表面的生物相容性主客体以及通过点击化学反应接枝在软载体表面的REDV多肽和VAPG多肽，使得本发明提供的三维支架对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和兔主动脉平滑肌细胞(CCC-SMC-1)有特异性粘附作用，从而避免了细胞在错误位置的过量增殖，有助于避免出现人工血管再损伤、狭窄等问题。并且，该支架制备简单、成本低、使用条件温和，具有重要的临床价值与经济、社会效益。本发明提供的上述三维支架的制备方法，工艺简单、操作方便，适于推广应用。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1是本发明实施例8的三维组织工程支架的结构模拟图，其中，1为第一层(PDL/REDV-HA-Ad)40多层膜PDMS，2为第二层的(PDL/VAPG-HA-CD)40.5多层膜的PDMS，3为第三层的(PDL/REDV-HA-Ad)40多层膜的PDMS。
图2是本发明实施例8的三维组织工程支架的搭建过程简图。
图3是本发明实验例1的MA-HA-CD、MA-HA-Ad的生物相容性实验结果。
图4是本发明实验例2的细胞粘附性的实验结果，其中a为内皮细胞在不同聚电解质多层膜上48h内的粘附；b为平滑肌细胞在不同聚电解质多层膜上48h内的粘附。
图5是本发明实验例2的细胞活性的实验结果。
图6是本发明实验例3的三维支架中细胞活性的实验结果，a为内皮细胞在三维支架上培养48h粘附的示意图和荧光图；b为平滑肌细胞在三维支架上培养48h粘附的示意图和荧光图；c为内皮细胞和平滑肌细胞在三维支架上共培养48h粘附的示意图和荧光图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
实施例1磁性PDMS、PEGDA或GelMA三维支架软基底的制备
本实施例以PDMS作为三维支架软基底：称取10g PDMS预聚液、1g固化剂(SYLGARDTM184Silicone Elastomer Curing Agent，商购获得，用于与PDMS配套使用)和100mg Fe3O4磁性纳米颗粒，混合搅拌20min后抽真空30min，结束后将其夹在两端各一个200μm厚的盖玻片组成的两个玻璃片之间，65℃加热固化4h，得到200μm厚的PDMS薄膜。
将上述的PDMS薄膜用刀切成2mm×2mm×200μm大小，包埋在树脂中冷冻，用冷冻切片机切成2mm×200μm×100μm大小的三维支架软载体(以下简称软载体)，用于搭建三维支架。
实施例2甲基丙烯酸酯化透明质酸(MA-HA)的合成：
将N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与去离子水以1:2的体积比配制成混合溶剂，再将1g透明质酸(HA)与100mL混合溶剂充分溶解，置于4℃冰水浴中，用5M氢氧化钠调节溶液pH在8-9之间，得HA混合溶液。
向HA混合溶液中缓慢滴加7.4mL甲基丙烯酸酐(MA)，在4℃冰水浴中搅拌反应12h后室温继续搅拌反应12h。
反应结束后用截留分子量为3500Da的透析袋渗析5天。
将渗析后的溶液冷冻干燥得到白色絮状产物MA-HA。
实施例3接枝有环糊精的羧化壳聚糖(CCS-CD)的合成：
将500mg羧化壳聚糖(CCS)用100mL的磷酸盐缓冲溶液(PB，pH＝7.2)溶解。
再用25mL的PB缓冲溶液(pH＝7.2)溶解289.15mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和172.95mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，并将溶液快速滴加到上述CCS溶液中，室温搅拌反应30min。
最后用100mL的PB缓冲溶液(pH＝7.2)溶解1136.35mg的6-氨基-β-环糊精(6-NH2-β-CD)，将溶液滴加入上述混合液中，室温下搅拌继续反应12h。
反应结束后用截留分子量为3500Da的透析袋渗析5天。
将渗析后的溶液冷冻干燥得到白色絮状产物CCS-CD。
实施例4接枝有环糊精的甲基丙烯酸酯化透明质酸(MA-HA-CD)的合成：
将500mg上述合成的MA-HA用100mL的PB缓冲溶液(pH＝7.4)溶解，得MA-HA混合溶液。
再用25mL的PB缓冲溶液(pH＝7.4)溶解838.5mg的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和501.5mg的NHS(N-羟基丁二酰亚胺)，并将溶液快速滴加入上述MA-HA混合溶液，室温下搅拌30min。
最后用50mL的PB缓冲溶液(pH＝7.4)溶解2.5g 6-NH2-β-CD，并将其缓慢滴入上述溶液中，室温下搅拌反应24h。
反应结束后用截留分子量为3500Da的透析袋渗析5天。
将渗析后的溶液冷冻干燥得到白色絮状产物MA-HA-CD。
实施例5接枝有金刚烷的甲基丙烯酸酯化透明质酸(MA-HA-Ad)的合成：
将3.0g MA-HA用150mL去离子水完全溶解，得MA-HA溶液。
在上述MA-HA溶液中加入9.0g阳离子交换树脂Dowex 50w×8，搅拌30min，抽滤除去树脂，用四丁基氢氧化铵(TBA-OH)水溶液调节滤液的pH在7.02-7.05之间，冷冻干燥滤液得到MA-HA-TBA。
称取2.50g上述合成的MA-HA-TBA、2.04g的金刚烷乙酸和0.32g的4-二甲氨基吡啶，加入125mL的无水DMSO搅拌至完全溶解，并用N2吹扫30min。
在充分扫除瓶内空气后，在上述溶液中滴加350μL二碳酸二叔丁酯(BOC2O)，在45℃下反应20h，随后加水终止反应。
反应结束后用截留分子量为3500Da的透析袋渗析3天后抽滤透析袋中的沉淀，将抽滤得到的澄清滤液继续渗析5天。
将渗析后的溶液冷冻干燥得到白色絮状产物MA-HA-Ad。
实施例6聚电解质多层膜的制备：
配置食人鱼溶液(H2SO4：H2O2＝7:3v/v)，并将石英片逐片放入食人鱼洗液中浸泡2h。
将处理后的石英片表面清洗干净，N2吹干后浸泡在0.5g/L的多聚右旋赖氨酸(PDL，分子量7～15万，Sigma-Aldrich，商购获得)溶液中12h。结束后用去离子水清洗，并除去多余水分。
将上述处理过的多个石英片分别进行如下处理：
1)将石英片浸泡在0.5g/L的PDL溶液中5min，在去离子水中清洗后除去多余水分，再将石英片浸泡在1g/L的MA-HA-Ad溶液中5min，在去离子水中清洗后除去多余水分，作为第一个循环；再次将该石英片浸泡在0.5g/L的PDL溶液中5min，在去离子水中清洗后除去多余水分，再浸泡在1g/L的MA-HA-Ad溶液中5min，在去离子水中清洗后除去多余水分，作为第二个循环……。重复上述循环40次，最终得到表面修饰有(PDL/MA-HA-Ad)40的石英片40表示聚电解质交替沉积40个周期，最外层为MA-HA-Ad。
2)制备表面修饰有(PDL/MA-HA-CD)40的石英片：与上述1)的区别在于将1g/L的MA-HA-Ad溶液更换为1g/L的MA-HA-CD溶液，参照上述1)的循环操作方法获得表面修饰有(PDL/MA-HA-CD)40的石英片，40表示聚电解质交替沉积40个周期，最外层为MA-HA-CD。
3)制备表面修饰有(PDL/CCS-CD)40.5的石英片：将石英片浸泡在0.5g/L的PDL溶液中5min，并在去离子水中清洗后除去多余水分，再将石英片浸泡在1g/L的CCS-CD溶液中5min，作为第一个循环；再次将该石英片浸泡在0.5g/L的PDL溶液中5min，在去离子水中清洗后除去多余水分，再浸泡在1g/L的CCS-CD溶液中5min，在去离子水中清洗后除去多余水分，作为第二个循环……。重复上述循环40.5次，最终得到表面(PDL/CCS-CD)40.5的石英片，40.5表示聚电解质交替沉积40.5个周期，最外层为PDL。
将实施例1制备的PDMS软载体按上述方法分别制备修饰有(PDL/MA-HA-Ad)40(最外层为MA-HA-Ad)、(PDL/MA-HA-CD)40.5的PDMS(最外层为PDL)。
实施例7在多层膜上接枝REDV多肽与VAPG多肽、GFOGER多肽与PAP多肽或KHI多肽与IKVAVA多肽，以REDV多肽与VAPG多肽为例：
以pH＝9的PB缓冲溶液为溶剂，分别配制1g/L的光引发剂2959(Ig 2959)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、CREDV(购自合肥国肽生物)、CVAPG(购自合肥国肽生物)溶液。
将表面已经修饰上(PDL/MA-HA-Ad)40多层膜的石英片放入24孔板中，每个孔内加入1mL的CREDV多肽溶液、150μL的TCEP溶液、30μL的Ig 2959溶液。
将表面已经修饰上(PDL/MA-HA-CD)40多层膜的石英片放入24孔板中，每个孔内加入1mL的CVAPG多肽溶液、150μL的TCEP溶液、30μL的Ig 2959溶液。
将浸泡在上述反应液中的石英片放置在365nm波长的紫外灯下照射10min，使双键与巯基的点击化学反应充分发生，反应结束得到接枝有多肽的(PDL/REDV-HA-Ad)40或(PDL/VAPG-HA-CD)40多层膜石英片(其中，MA-HA-CD中MA的双键与VAPG多肽的巯基通过点击化学反应，使VAPG接枝在MA-HA-CD上，得到VAPG-HA-CD)。
将实施例6制备的修饰有(PDL/MA-HA-Ad)40、(PDL/MA-HA-CD)40.5的PDMS软载体，利用同样的方法得到接枝有REDV多肽的(PDL/REDV-HA-Ad)40多层膜PDMS和接枝有VAPG多肽(PDL/VAPG-HA-CD)40.5多层膜PDMS。
用去离子水清洗石英片或PDMS，除去多余水分后使用N2吹干。
实施例8宏观超分子组装(MSA)和磁场辅助定位策略制备三维组织工程支架：
将修饰了(PDL/REDV-HA-Ad)40多层膜的PDMS构筑基元在水中通过磁场显微操作，将其放置在实施例6的(PDL/CCS-CD)40.5的石英基板上。
将实施例7中修饰了(PDL/VAPG-HA-CD)40.5多层膜的PDMS作为第二层，将其与第一层垂直对齐放置。
再将实施例7中修饰了(PDL/REDV-HA-Ad)40多层膜的PDMS作为第三层，将其与第二层呈45°偏转放置，在搭建过程中要保证各层构筑基元平行排列，彼此分布均匀，如图1、2所示。
将修饰有不同多层膜的支架使用75％医用酒精和紫外光杀菌处理。
实验例1生物相容性实验
主客体聚电解质MA-HA-CD、MA-HA-Ad的生物相容性
首先将培养瓶中铺展面积达80％以上的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和兔主动脉平滑肌细胞(CCC-SMC-1)从培养箱中取出，高温灭菌后用于细胞培养的pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗培养瓶中细胞表面产生的代谢废物与杂质。
用胰蛋白酶处理贴壁细胞使其重悬，加入专用培养基终止消化。离心移去上层液体并将细胞配制为2.5×104cells/mL的悬液。
以200μL/孔的比例加入到96孔板中，此外以同样的比例另设一列不含细胞的孔，将孔板放入培养箱中培养20h。
接下来将实施例4、5合成的药品MA-HA-CD、MA-HA-Ad分别用紫外光杀菌30min。杀菌完毕后，以新鲜配制的HUVEC专用生长培养基(购自MeisenCTCC)为溶剂稀释MA-HA-CD，采用CCC-SMC-1专用生长培养基(购自Gibco)为溶剂稀释MA-HA-Ad，MA-HA-CD、MA-HA-Ad的配制浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.2g/L的溶液。
吸去孔板中旧培养基，加入200μL的药品溶液，其中不含细胞的孔为调零组，另外再设置一组药品浓度为0的对照组，对照组培养基的加入量同样为200μL，加入完毕后将96孔板放回培养箱中继续培养24h。
以PBS为溶剂配制5g/L的噻唑蓝(MTT)溶液，MTT完全溶解后，通过0.22μm的除菌滤膜过滤。
细胞培养24h后，在每孔中加入20μL MTT溶液，继续放回培养箱中培养5h。
培养完成后，移去孔中所有溶液，并以150μL/孔的比例向每个孔中加入无水二甲基亚砜(DMSO)，待MTT还原形成的甲瓒完全溶解后，检测570nm处吸光度。
结果如图3所示，对于HUVEC和CCC-SMC-1两种细胞来说，细胞活性均大于等于80％，这一结果说明了合成的两种主客体聚电解质生物相容性优异，可以用来构筑多层膜，并进行细胞培养。
实验例2细胞粘附性及活性实验
多肽结合聚电解质修饰石英片上的细胞粘附性及活性
首先将实施例6制备的修饰有(PDL/MA-HA-CD)40多层膜的石英片以及实施例7制备的接枝有REDV的石英片(PDL/REDV-HA-Ad)40或接枝有VAPG多肽的石英片(PDL/VAPG-HA-CD)40分别置于24孔板中，向放有石英片的孔中加入1mL 75％医用酒精进行材料表面的杀菌操作，同时打开紫外灯。
杀菌结束后，移去酒精，并用高温灭菌过的PBS清洗3遍，最后分别加入DMEM高糖基础培养基孵育石英片，浸泡12h。
取出铺展面积达到80％且生长状态良好的HUVEC或CCC-SMC-1，使用胰蛋白酶对其进行消化，使之变为重悬状态。随后加入HUVEC或CCC-SMC-1专用生长培养基终止消化，离心移去上清液，加入新鲜培养基并将含有细胞的溶液稀释至5×104cells/mL的浓度。
将孔板中的基础培养基移去，并向每孔中加入1mL上述浓度的细胞悬液，周围每孔加入1mL的PBS溶液。
将孔板放入培养箱中进行细胞培养，分别培养12、24和48h。
以无水DMSO为溶剂配置浓度为1g/L的钙黄绿素(Calcein-AM)储存液；另以高温灭菌的去离子水为溶剂配置浓度为1g/L的碘化丙啶(PI)储存液。
量取10μL的Calcein-AM储存液和15μL的PI储存液，将其一起稀释在4mL高温灭菌后的PBS中。
把孔板中的培养基吸去,并用PBS清洗石英片上残留的液体及废物，而后在每个孔内加入1mL溶液，继续培养15min。
最后取出石英片，在显微镜下观察细胞染色情况。
再使用CCK-8检测盒检验细胞活性。
将HUVEC或CCC-SMC-1专用生长培养基与CCK-8试剂盒以体积比为100:1的比例配制工作液，并在振荡器上振荡3min使之混合均匀。
在新的24孔板中每孔加入1mL工作液，并将石英片小心的转移至工作液中。同时设置仅含有工作液不放置石英片的孔作为调零组，排除培养基对实验结果的影响，继续培养2h。
以150μL/孔的比例将溶液转移至96孔板，检测溶液在450nm处的吸光度。
结果如图4所示，接枝REDV多肽后的石英片(PDL/REDV-HA-Ad)40的HUVEC粘附量显著增加，接枝VAPG多肽后的石英片(PDL/VAPG-HA-CD)40的CCC-SMC-1的粘附量显著增加。内皮细胞和平滑肌细胞培养在经REDV和VAPG肽修饰的石英基质上(二维)，内皮细胞在不同多层膜上48h内的粘附行为。以未修饰多肽的多层膜为对照组，如图4a所示。附着细胞数量较少，细胞未发生增殖，说明PDL的右手性抑制了细胞的粘附，VAPG肽对内皮细胞的生长无影响。相比之下，我们可以明显看到修饰多肽多层膜上内皮细胞的附着数量增加，细胞发生增殖，条件良好，这证明了PDL与REDV肽共同作用可以促进内皮细胞的粘附(REDV促进内皮细胞粘附为主要作用)。此外，这些多层膜几乎没有死细胞，具有良好的生物相容性。同样，我们研究了平滑肌细胞在不同多层上的粘附行为，如图4b所示。与内皮细胞相反，REDV肽在右手手性抗粘附作用下不能促进平滑肌细胞的粘附。而经VAPG肽培养48h后，平滑肌细胞生长良好，增殖显著。结果表明，VAPG肽与抗黏附底物PDL协同作用可促进平滑肌细胞特异性黏附。
所有修饰的多层膜均含有PDL和聚电解质。PDL单独作用时是抗细胞粘附的。PDL与多肽共同作用时，多肽促进细胞粘附起到了主导作用，因此细胞在多层膜上的粘附与否取决于修饰多肽的类型，如REDV修饰的位点促进内皮细胞的粘附、VAPG修饰的位点促进平滑肌细胞的粘附。我们通过PDL和修饰不同位置的多肽，在支架的不同区域可以促进多种细胞的选择性粘附。
细胞活性方面，结果如图5所示，两种细胞在修饰了(PDL/REDV-HA-Ad)40多层膜的PDMS或(PDL/VAPG-HA-CD)40.5多层膜的PDMS上与空白石英基质上的细胞活性相似甚至更高。证明手性分子与多肽的协同作用可以实现对特定细胞的选择性粘附。
实验例3细胞选择性粘附性实验
实施例8三维组织工程支架上细胞选择性粘附
使用抗粘附多层膜(PDL/CCS-CD)40.5修饰的石英片作为支架的底物，以防止细胞在非目标位置生长。
将修饰了(PDL/REDV-HA-Ad)40多层膜的PDMS构筑基元作为第一层支架；再将修饰了(PDL/VAPG-HA-CD)40.5多层膜的PDMS作为第二层，将其与第一层垂直对齐放置；最后将修饰了(PDL/REDV-HA-Ad)40多层膜的PDMS作为第三层，将其与第二层呈45°偏转放置。
以无水DMSO为溶剂配置2mM 3,3’-双十八烷基氧杂碳菁氯酸盐(DiO)储存液和3mM1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiL)储存液。
以PBS为溶剂，将上述DiO和DiL储存液分别稀释为25μM和15μM的工作液。
选用铺展面积达到80％且生长状态良好的HUVEC或CCC-SMC-1，经清洗、消化、离心后以1mL工作液染色1×106个细胞的比例对细胞进行染色。其中DiO染色CCC-SMC-1细胞25min，DiL染色HUVEC细胞5min。
染色结束后，离心去除染液，用专用生长培养基分别将两种细胞配制为5×104cells/mL浓度的细胞悬液。
向三维支架上接种两种细胞，任由两种细胞自由生长，每孔内加入每种细胞悬液500μL，放回培养箱中共培养两种细胞12、24、48h。
达到培养时间后，用PBS清洗表面杂质，并在荧光显微镜下进行观察培养结果。
结果如图6所示，修饰了REDV多肽的第一层与第三层上，HUVEC大量粘附，内皮细胞密度显著高于第二层；修饰了VAPG多肽的第二层上，CCC-SMC-1大量粘附，平滑肌细胞密度显著高于第一层和第三层。且两种细胞中死亡细胞数量均较少，体现了支架具有良好的生物相容性。
因此，通过简单地结合多肽和手性分子，结合精准磁操控辅助方法，我们实现了基于MSA策略的细胞在三维有序结构中所需位置的选择性粘附。
本发明可以将上述使用REDV多肽与VAPG多肽作为人工血管支架应用进一步推广，使用GFOGER多肽与PAP多肽或KHI多肽与IKVAVA多肽等，应用于骨再生工程与神经修复装置等。本发明可以将上述使用水凝胶材料PDMS、PEGDA等作为三维支架材料进一步推广，使用硬质材料Si和Ti等，多种材质的支架材料可以分别应用于，软体组织，如脂肪、皮肤或血管的修复；硬组织，如软骨或颌骨修复。本发明可实现复合材质的三维支架内细胞的选择性粘附，应用于复杂组织颅颌面的修复和再生。本发明所提出的支架可作为一个研究细胞与物质之间相互作用的平台，可适用于人工血管、骨再生和神经修复装置等多个领域。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种基于手性与多肽的细胞选择性粘附三维支架，其特征在于，其为层叠的、三维有序结构，每层包括有序排列的若干聚电解质多层膜软载体，相邻两层的聚电解质多层膜软载体呈夹角；每层的聚电解质多层膜均为接枝有特异性识别基团的带正电荷的手性分子和带负电荷的超分子聚电解质交替在软载体上通过多次沉积后再修饰多肽形成的聚电解质多层膜；
相邻的聚电解质多层膜中的两种多肽不同并分别用于促进不同细胞的特异性粘附；
相邻两层的聚电解质多层膜中的两种特异性识别基团不同并分别为能实现超分子自组装连接的一对主客体相互作用基团。
2.根据权利要求1所述的细胞选择性粘附三维支架，其特征在于，所述多肽在聚电解质多层膜中采用简单吸附、点击化学反应或叠氮和巯基反应接枝。
3.根据权利要求1或2所述的细胞选择性粘附三维支架，其特征在于，所述软载体包括掺杂了磁性纳米粒子的软材料，可选地，所述软材料选自聚二甲基硅氧烷、聚乙二醇双丙烯酸酯、甲基丙烯酸酐化明胶和胶原蛋白中的一种或几种；
和/或，还包括基底，用于承载聚电解质多层膜，所述基底为接枝有特异性识别基团的带正电荷的手性分子和带负电荷的超分子聚电解质依次交替在基板上通过多次循环沉积的聚电解质多层膜，所述基板材料选自石英、硅、钛金属中的一种或几种。
4.根据权利要求1至3任一所述的细胞选择性粘附三维支架，其特征在于，所述聚电解质选自经C＝C双键基团修饰的透明质酸、经C＝C双键基团修饰的羧化壳聚糖中的一种或几种；可选地，用于C＝C双键基团修饰的原料为甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸、丙烯酸酐中的一种或几种；
和/或，所述特异性识别基团包括主客体相互作用基团；可选地，主客体相互作用基团选自β-环糊精、葫芦脲、金刚烷、偶氮苯、胆固醇和蒽中的一种或几种；可选地，β-环糊精为主体基团，对应的客体基团为金刚烷、偶氮苯或胆固醇；可选地，葫芦脲为主体基团，对应的客体基团为蒽；
和/或，所述手性分子为多聚右旋赖氨酸，可选地，所述手性分子的分子量为7～15万。
5.根据权利要求1至4任一所述的细胞选择性粘附三维支架，其特征在于，所述聚电解质多层膜为修饰有双键基团和特异性识别基团的带正电荷的手性分子、带负电荷的超分子聚电解质在软载体上交替沉积n或n+0.5个周期形成的聚电解质多层膜；其中，一个周期为带正电荷的手性分子和带负电荷的超分子聚电解质分别沉积一次，可选地n为整数，可选地n≥35，可选地n≥40，可选地n+0.5为在第n个周期的基础上再沉积一层带正电荷的手性分子；可选地，相邻两层的聚电解质多层膜的n独立地选自n≥35的整数；
可选地，相邻两层的聚电解质多层膜的最外层膜分别为接枝有特异性识别基团的带正电荷的手性分子和带负电荷的超分子聚电解质，用于使相邻两层的聚电解质多层膜通过正、负电荷连接；
和/或，多层膜软载体包括至少两种，分别为沉积有主客体相互作用基团的主体、客体的聚电解质，且这两种多层膜软载体的沉积周期分别为n或n+0.5；
可选地，所述聚电解质多层膜选自进一步修饰有多肽的(PDL/MA-HA-Ad)40、(PDL/MA-HA-CD)40.5的多层膜PDMS中的一种或几种；
可选地，所述聚电解质多层膜选自(PDL/REDV-HA-Ad)40、(PDL/VAPG-HA-CD)40.5的多层膜PDMS中的一种或几种；
可选地，还包括基底，所述基底为修饰有(PDL/CCS-CD)40.5的石英片。
6.根据权利要求1至5任一所述的细胞选择性粘附三维支架，其特征在于，多肽包括REDV多肽、VAPG多肽、GFOGER多肽、PAP多肽、KHI多肽、IKVAV多肽中的一种或几种；
和/或，细胞包括人脐静脉内皮细胞和兔主动脉平滑肌细胞、人骨髓间充质干细胞与小鼠单核巨噬细胞白血病细胞、或人神经祖细胞与星胶质细胞的特异性粘附中的一对或几对；
可选地，第一层为修饰有(PDL/REDV-HA-Ad)40多层膜的PDMS，第二层为修饰了(PDL/VAPG-HA-CD)40.5多层膜的PDMS，第三层为修饰了(PDL/REDV-HA-Ad)40多层膜的PDMS。
7.一种基于手性与多肽的细胞选择性粘附三维支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备带有主客体相互作用基团和C＝C双键的带负电荷的超分子聚电解质，主客体相互作用基团的主体、客体分别修饰在不同的聚电解质上；
2)将软载体依次在步骤1)的带正电荷的手性分子溶液、带负电荷的超分子聚电解质溶液中沉积成膜，循环n或n+0.5个周期，制备(手性分子/带有主客体相互作用基团和C＝C双键的聚电解质)n的多层膜软载体，其中，一个周期为正电荷的手性分子和带负电荷的超分子聚电解质依次沉积一次，可选地n为整数，可选地n≥35，可选地n≥40，可选地n+0.5为在第n个周期的基础上再沉积一层带正电荷的手性分子；
其中，多层膜软载体包括至少两种，两种多层膜软载体的超分子聚电解质分别为修饰有主客体相互作用基团的主体基团和客体基团的超分子聚电解质，且这两种多层膜软载体的沉积周期分别为n、n+0.5；
3)将步骤2)的至少两种多层膜软载体分别通过简单吸附、叠氮和巯基反应或点击化学反应接枝多肽，制得聚电解质多层膜；
4)将能通过主客体相互作用的多层膜软载体搭建三维支架，相邻的多层膜软载体中的多肽、聚电解质主客体相互作用基团不同。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述聚电解质选自经C＝C双键基团修饰的透明质酸、经C＝C双键基团修饰的羧化壳聚糖中的一种或几种；可选地，用于C＝C双键基团修饰的原料为甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸、丙烯酸酐中的一种或几种；可选地，聚电解质的浓度为0.5～2g/L，可选地为0.5～2g/L；
和/或，步骤1)中，所述特异性识别基团包括主、客体相互作用基团；可选地，主体相互作用基团选自β-环糊精、葫芦脲、金刚烷、偶氮苯、胆固醇和蒽中的一种或几种；可选地，β-环糊精为主体基团，对应的客体基团为金刚烷、偶氮苯或胆固醇；可选地，葫芦脲为主体基团，对应的客体基团为蒽；
和/或，步骤2)中，所述手性分子为多聚右旋赖氨酸；可选地，手性分子的浓度为0.1～1g/L，可选地为0.5～1g/L；
可选地，步骤2)中，多层膜软载体为(PDL/MA-HA-Ad)40、(PDL/MA-HA-CD)40.5的多层膜PDMS中的一种或几种；
可选地，步骤3)中，多肽包括REDV多肽、VAPG多肽、GFOGER多肽、PAP多肽、KHI多肽、IKVAV多肽中的一种或几种；可选地，多肽的浓度为0.5～2g/L，可选地为1～2g/L；
可选地，步骤3)中，所述聚电解质多层膜选自(PDL/REDV-HA-Ad)40、(PDL/VAPG-HA-CD)40.5的多层膜PDMS；
和/或，还包括基底，用于承载聚电解质多层膜，所述基底为接枝有特异性识别基团的带正电荷的手性分子和带负电荷的超分子聚电解质依次交替在基板上通过多次循环沉积的聚电解质多层膜，所述基板材料选自石英、硅、钛金属中的一种或几种，可选地，所述基底为修饰有(PDL/CCS-CD)40.5的石英片。
9.一种权利要求1至6任一所述的基于手性与多肽的细胞选择性粘附三维支架或权利要求7至8任一所述的制备方法制备的基于手性与多肽的细胞选择性粘附三维支架在制备软体组织修复产品、骨再生装置和/或神经修复产品中的应用，可选地软体组织修复产品包括人工血管支架。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，相邻的聚电解质多层膜中的多肽分别为REDV多肽和VAPG多肽；可选地，所述REDV多肽为CREDV多肽，用于促进特异性粘附的细胞为内皮细胞；可选地，VAPG多肽为CVAPG多肽，用于促进特异性粘附的细胞为平滑肌细胞。
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