CN114394951A - 具有粘度传感性质的可靶向多种细胞器的近红外荧光探针 - Google Patents

具有粘度传感性质的可靶向多种细胞器的近红外荧光探针 Download PDF

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Abstract

本发明公布了四个具有粘度传感性质的可靶向多种细胞器的近红外荧光探针的制备方法及其在生物成像方面的应用，属于化学分析检测技术领域，其结构及检测机理为：
Figure DDA0003304940660000011
探针对粘度具有优异的检测性能，随着粘度的增加，由于碳碳单键旋转受阻，探针最大发射峰处的荧光强度逐渐增加。荧光强度变化最明显的探针增加了约453倍，荧光量子产率也从0.051增加到了0.681。探针还可同时靶向多种细胞器，最多的可达到四种。由于极好的多细胞器定位能力，探针还可用于检测溶酶体内粘度变化。此外探针还具有低细胞毒性、良好抗干扰性和稳定性等优点，为研究粘度信号发生改变的细胞器活动提供了简单有效的工具。

Description

具有粘度传感性质的可靶向多种细胞器的近红外荧光探针
技术领域
本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及四个具有粘度传感性质的能靶向多种细胞器的近红外荧光探针的制备方法及其在生物成像方面的应用。
背景技术
细胞器如线粒体、溶酶体、内质网、高尔基体等，构成细胞的基本结构，对维持细胞的正常工作起着至关重要的作用。粘度是细胞微环境中的一个重要参数[Inoue,T.；Maekawa,H.；Inagi,R.Kidney Int 2019,95,1318-1325.Cohen,S.；Valm,A.M.；Lippincott-Schwartz,J.Curr Opin Cell Biol 2018,53,84-91.Courchaine,E.M.；Lu,A.；Neugebauer,K.M.EMBOJ2016,35,1603-1612.Chen,Q.；Fang,H.；Shao,X.；Tian,Z.；Geng,S.；Zhang,Y.；Fan,H.；Xiang,P.；Zhang,J.；Tian,X.；Zhang,K.；He,W.；Guo,Z.；Diao,J.NatCommun 2020,11,6290.]。细胞内黏度在促进细胞内生物分子与化学信号的相互作用以及促进代谢产物在活细胞中的扩散方面起着至关重要的作用[Bui,A.T.；Grichine,A.；Duperray,A.；Lidon,P.；Riobe,F.；Andraud,C.；Maury,O.JAm Chem Soc 2017,139,7693-7696.Tan,H.；Zhou,K.；Yan,J.；Sun,H.；Pistolozzi,M.；Cui,M.；Zhang,L.SensorsandActuatorsB:Chemical2019,298.Robson,J.A.；Kubankova,M.；Bond,T.；Hendley,R.A.；White,A.J.P.；Kuimova,M.K.；Wilton-Ely,J.Angew Chem Int Ed Engl2020,59,21431-21435.Ludwanowski,S.；Samanta,A.；Loescher,S.；Barner-Kowollik,C.；Walther,A.AdvSci(Weinh)2021,8,2003740.]。细胞器中异常的粘度将直接造成细胞器功能障碍进而导致许多疾病的产生，如溶酶体储存疾病、细胞恶性肿瘤、帕金森病、糖尿病和阿尔茨海默氏病等[Sun,W.；Shi,Y.-D.；Ding,A.-X.；Tan,Z.-L.；Chen,H.；Liu,R.；Wang,R.；Lu,Z.-L.Sensors andActuatorsB:Chemical2018,276,238-246.Sun,M.；Wang,T.；Yang,X.；Yu,H.；Wang,S.；Huang,D.Talanta2021,225,121996.Zhao,M.；Zhu,Y.；Su,J.；Geng,Q.；Tian,X.；Zhang,J.；Zhou,H.；Zhang,S.；Wu,J.；Tian,Y.JMater Chem B 2016,4,5907-5912.Ren,M.；Zhou,K.；Wang,L.；Liu,K.；Lin,W.Sensors andActuatorsB:Chemical2018,262,452-459.]。因此，设计和开发具有粘度传感性质的可靶向多种细胞器的工具是非常必要的。
与传统的机械粘度计相比，荧光探针具有无创性、响应速度快、操作简单、灵敏度高和选择性好等优点，为体内粘度检测提供了一种有效的方法[Gao,Y.；Hu,Y.；Liu,Q.；Li,X.；Li,X.；Kim,C.Y.；James,T.D.；Li,J.；Chen,X.；Guo,Y.Angew Chem Int Ed Engl 2021,60,10756-10765.Tian,X.；Murfin,L.C.；Wu,L.；Lewis,S.E.；James,T.D.Chem Sci 2021,12,3406-3426.Piazzolla,F.；Mercier,V.；Assies,L.；Sakai,N.；Roux,A.；Matile,S.Angew Chem Int Ed Engl 2021,60,12258-12263.]。在这些探针中，近红外荧光探针因其背景干扰小、组织穿透力强、斯托克斯位移大能够减少自吸收和自发荧光的干扰等优点而受到广泛关注[Reja,S.I.；Minoshima,M.；Hori,Y.；Kikuchi,K.Chem Sci 2020,12,3437-3447.Chin,J.；Kim,H.-J.Coordination Chemistry Reviews 2018,354,169-181.]。到目前为止，许多检测粘度的荧光探针已经被开发出来，但是它们大多都只能单一地靶向一种细胞器或者荧光发射未到达近红外区[Wang,Y.N.；Zhang,X.Q.；Qiu,L.H.；Sun,R.；Xu,Y.J.；Ge,J.F.JMater Chem B 2021,9,5664-5669.Wang,X.；Fan,L.；Wang,S.；Zhang,Y.；Li,F.；Zan,Q.；Lu,W.；Shuang,S.；Dong,C.Anal Chem 2021,93,3241-3249.Zhang,Y.；Li,Z.；Hu,W.；Liu,Z.Anal Chem 2019,91,10302-10309.]。因此迫切地需要开发出一种具有近红外发射的可靶向多种细胞器的粘度敏感探针，为检测体内细胞器粘度变化提供有效方法。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明目的在于提供基于扭曲分子内电荷转移理论，四种可靶向多种细胞器的黏度敏感近红外荧光探针的合成方法，以及其在探索受黏度影响的细胞器之间的生物成像方面的应用。
本发明中的荧光探针，其分子结构如下：
Figure BDA0003304940640000021
本发明中的荧光探针通过以下反应制备，合成过程如下：
Figure BDA0003304940640000031
具体合成方法如下：用移液枪移取2’-羟基苯乙酮(1mmol，120μL)并准确称取4’-二甲基氨基苯乙酮(2mmol，326.44mg)溶于乙酸中，之后向反应瓶中缓慢滴加1.8mL的70％高氯酸，将温度升至110℃反应12h。反应结束后冷却至室温，将溶液滴加到蒸馏水中使其有沉淀析出。将沉淀物抽滤后放入真空干燥箱干燥即可得到深红棕色固体C1(240mg，90.9％)。
称取4’-氨基-2’-羟基苯乙酮(453.48mg，3mmol)、K2CO3(414.63mg，3mmol)和7.5mLCH3I溶于4mL乙醇中，加热至55℃回流36h。待溶液冷却后，浓缩溶液，加入硅胶过柱纯化(V石油醚:V乙酸乙酯＝1:1)，得白色产物D1(280mg，产率52.2％)。
称取二甲氨基苯乙酮(161.2mg，1mmol)和D1(179.1mg，1mmol)溶于1.5mL醋酸中，逐滴滴加1.8mL的高氯酸，滴加过程中溶液颜色由棕色逐渐变为暗红色。反应液加热至110℃，回流12h。溶液冷却至室温后，倒入50mL冰水中，产生大量红色沉淀。过滤沉淀物，用少量乙酸乙酯进行洗涤。干燥得到红色固体产物C2(160mg，产率39.4％)。
将化合物C1(0.5mmol，132mg)和4-(二甲氨基)水杨醛(0.65mmol，107.4mg)溶于8mL的无水甲醇中，将温度缓慢升至76℃反应12h。反应完成后冷却至室温，有固体析出并进行抽滤，之后用少量乙醚洗涤滤饼干燥得到棕黑色固体产物(72mg，38.0％)，即探针DMPC。
将化合物C1(0.5mmol，132mg)和4-(二乙氨基)水杨醛(0.65mmol，125.6mg)溶于8mL的无水甲醇中，将温度缓慢升至76℃反应12h。反应完成后冷却至室温，加入大量乙醚使其析出沉淀，抽滤得到黑色固体(86mg，39.0％)，即探针DEPC。
称取4-(二甲氨基)水杨醛(62.8mg，0.38mmol)和C2(107mg，0.346mmol)溶于5mL无水甲醇中，加热至78℃，回流36h，待溶液冷却后，加入适量乙醚，析出红色固体，抽滤干燥得红色固体产物(109mg，产率69.3％)，即探针DHDM。
称取4-(二乙氨基)水杨醛(77.2mg，0.4mmol)和C2(80mg，0.2mmol)溶于5mL无水甲醇中，加热至78℃，回流36h，待溶液冷却后，加入适量乙醚，析出红色固体，抽滤干燥得红色固体产物(75mg，产率64.5％)，即探针DHDV。
本发明的荧光探针的检测机制如下：
Figure BDA0003304940640000041
荧光探针在低粘度溶液中由于碳碳单键自由旋转消耗能量导致探针荧光强度弱，荧光量子产率低。而在高粘度溶剂中，碳碳单键因旋转受阻，非辐射跃迁的几率降低，导致探针的荧光强度和荧光量子产率都得到增强。此外酸性条件下，粘度受到影响，使得探针的荧光强度得到增强。
本发明的荧光探针对高粘度溶剂(甘油)具有良好的选择性，且在不同溶剂中均有较大的摩尔消光系数和斯托克斯位移。
本发明的荧光探针可以对不同比例PBS和甘油中甘油含量的增加做出有规律的变化。在95％比例的甘油溶液与纯PBS溶液中相比，DMPC、DEPC、DHDM、DHDV的荧光强度分别增大了约92倍、89倍、260倍和453倍。在黏度对数值为0.83-2.07的范围内时，本发明的四种荧光探针检测粘度线性较好，线性相关系数分别为：DMPC R＝0.9906，DEPC R＝0.9978，DHDMR＝0.9971，DHDV R＝0.9918。
本发明的荧光探针具有良好的抗干扰性，如在活性生物小分子：Ca2+,Cu2+,Fe2+,Fe3+,K+,Mg2+,Mn2+,Na+,Zn2+,F-,Cl-,S2-,ClO-,CO3 2-,HSO3 -,Cys,GSH,H2O2。
本发明的荧光探针具有良好的细胞毒性。
本发明所述的荧光探针对细胞器如线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体具有优异的靶向能力。
附图说明
图1为本发明的四种荧光探针DMPC、DEPC、DHDM和DHDV的设计思路及合成路线。
图2为本发明的四种荧光探针检测溶液粘度的机理。
图3为本发明的四种荧光探针在几种常见的溶剂中的紫外可见吸收光谱。探针浓度：10μM。
图4为本发明的四种荧光探针在几种常见的溶剂中的荧光发射光谱。探针浓度：10μM。
图5为本发明的四种荧光探针在几种常见的溶剂中的荧光量子产率。
图6为本发明的四种荧光探针在不同比例PBS缓冲溶液(pH＝7.4)和甘油的混合溶液中的紫外可见吸收光谱。探针浓度：10μM。
图7为本发明的四种荧光探针DMPC、DEPC、DHDM和DHDV在不同比例PBS缓冲溶液(pH＝7.4)和甘油的混合溶液中的荧光发射光谱以及最大荧光强度对数值(logI)与粘度对数值logη的线性关系。探针浓度：10μM。
图8为本发明的四种荧光探针DMPC、DEPC、DHDM和DHDV对部分生物小分子的抗干扰性，如Ca2+,Cu2+,Fe2+,Fe3+,K+,Mg2+,Mn2+,Na+,Zn2+,F-,Cl-,S2-,ClO-,CO3 2-,HSO3 -,Cys,GSH,H2O2。探针浓度：10μM。
图9为本发明的荧光探针DMPC和DHDV在不同pH值环境下，在纯PBS溶液中以及含量为95％甘油与5％PBS混合溶液中的荧光强度变化，以及不同比例PBS和甘油混合溶液在不同pH值环境下荧光强度变化。探针浓度：10μM。
图10为本发明的四种荧光探针的细胞毒性实验。
图11为本发明的四种荧光探针和多种商用细胞器定位染料(细胞核、线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体)在HeLa细胞中的共聚焦成像。
图12为本发明的荧光探针DMPC、DEPC和DHDM与溶酶体商用染料在地塞米松存在前后在溶酶体中共聚焦成像。
图13为本发明的荧光探针DMPC与溶酶体商用染料随着溶酶体中加入不同浓度氯喹的共聚焦成像。
具体实施实例
实施例1：化合物C1的合成
用移液枪移取2’-羟基苯乙酮(1mmol，120μL)并准确称取4’-二甲基氨基苯乙酮(2mmol，326.44mg)溶于乙酸中，之后向反应瓶中缓慢滴加1.8mL的70％高氯酸，将温度升至110℃反应12h。反应结束后冷却至室温，将溶液滴加到蒸馏水中使其有沉淀析出。将沉淀物抽滤后放入真空干燥箱干燥即可得到深红棕色固体C1(240mg，90.9％)。
实施例2：化合物D1的合成
称取4’-氨基-2’-羟基苯乙酮(453.48mg，3mmol)、K2CO3(414.63mg，3mmol)和7.5mLCH3I溶于4mL乙醇中，加热至55℃回流36h。待溶液冷却后，浓缩溶液，加入硅胶过柱纯化(V石油醚:V乙酸乙酯＝1:1)，得白色产物D1(280mg，产率52.2％)。
实施例3：化合物C2的合成
称取二甲氨基苯乙酮(161.2mg，1mmol)和D1(179.1mg，1mmol)溶于1.5mL醋酸中，逐滴滴加1.8mL的高氯酸，滴加过程中溶液颜色由棕色逐渐变为暗红色。反应液加热至110℃，回流12h。溶液冷却至室温后，倒入50mL冰水中，产生大量红色沉淀。过滤沉淀物，用少量乙酸乙酯进行洗涤。干燥得到红色固体产物C2(160mg，产率39.4％)。
实施例4：探针DMPC的合成
将化合物C1(0.5mmol，132mg)和4-(二甲氨基)水杨醛(0.65mmol，107.4mg)溶于8mL的无水甲醇中，将温度缓慢升至76℃反应12h。反应完成后冷却至室温，有固体析出并进行抽滤，之后用少量乙醚洗涤滤饼干燥得到棕黑色固体产物(72mg，38.0％)，即探针DMPC。
实施例5：探针DEPC的合成
将化合物C1(0.5mmol，132mg)和4-(二乙氨基)水杨醛(0.65mmol，125.6mg)溶于8mL的无水甲醇中，将温度缓慢升至76℃反应12h。反应完成后冷却至室温，加入大量乙醚使其析出沉淀，抽滤得到黑色固体(86mg，39.0％)，即探针DEPC。
实施例6：探针DHDM的合成
称取4-(二甲氨基)水杨醛(62.8mg，0.38mmol)和C2(107mg，0.346mmol)溶于5mL无水甲醇中，加热至78℃，回流36h，待溶液冷却后，加入适量乙醚，析出红色固体，抽滤干燥得红色固体产物(109mg，产率69.3％)，即探针DHDM。
实施例7：探针DHDV的合成
称取4-(二乙氨基)水杨醛(77.2mg，0.4mmol)和C2(80mg，0.2mmol)溶于5mL无水甲醇中，加热至78℃，回流36h，待溶液冷却后，加入适量乙醚，析出红色固体，抽滤干燥得红色固体产物(75mg，产率64.5％)，即探针DHDV。
实施例8：探针DMPC、DEPC、DHDM和DHDV检测溶液中粘度及其生物应用。
溶液中粘度检测：图3、图4为四种探针在不同溶剂中的紫外可见吸收和荧光发射光谱图，两图说明了四种探针对高粘度溶剂甘油有响应；图5为四种探针在不同溶剂中的荧光量子产率，结果表明在高粘度溶剂中探针荧光量子产率明显高于低粘度溶剂，与荧光发射光谱相吻合；图7为四种探针在不同比例PBS和甘油混合溶剂中(0％-95％甘油)的荧光发射光谱，以及最大荧光强度对数值与粘度对数值线性关系，结果表明随着粘度的增加，探针荧光强度逐渐增强，且在粘度对数值为0.83-2.07内，探针荧光强度对数值与粘度对数值呈良好的线性关系；图8为四种探针对部分生物相关活性小分子的抗干扰性，结果表明四种探针对Ca2+,Cu2+,Fe2+,Fe3+,K+,Mg2+,Mn2+,Na+,Zn2+,F-,Cl-,S2-,ClO-,CO3 2-,HSO3 -,Cys,GSH,H2O2具有较好的抗干扰性；图9为在不同pH值环境下，探针DMPC和DHDV在PBS和95％甘油(含5％PBS)中荧光强度变化，以及探针DMPC和DHDV在不同粘度混合溶液中随pH值环境变化的荧光强度变化。结果表明，酸性环境下，粘度受到影响。从而使探针荧光强度发生变化。
粘度检测生物应用：图10表明探针具有较高的细胞存活率；在较高细胞存活率基础上，如图11所示，我们对四种探针定位细胞器的能力进行了研究。结果表明，四种探针均具有同时靶向多种细胞器的能力，其中探针DMPC可靶向溶酶体和内质网，探针DEPC可靶向溶酶体、内质网和高尔基体，探针DHDM可靶向细胞核、线粒体和内质网，探针DHDV可同时靶向线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体四种细胞器；图12为探针DMPC、DEPC和DHDV在溶酶体中加入地塞米松前后共聚焦成像，结果表明探针DMPC、DEPC和DHDV均能对溶酶体内粘度变化做出响应；图13为溶酶体中，探针DMPC随着不同浓度氯喹加入的共聚焦成像。氯喹是一种常见的溶酶体抑制剂，不仅能抑制溶酶体内酶活性，还能降低溶酶体内的酸度。结果表明，随着溶酶体中氯喹含量的增加，探针的荧光强度增强，这表明粘度增强对探针荧光强度的影响要大于酸性环境下粘度受到的影响。
综上所述：利用简单的有机合成方法，我们得到了四种能够靶向多种细胞器的具有粘度传感性质的近红外荧光染料。制备的探针具有较强的粘度响应特性，且在高粘度溶剂中具有较大的荧光量子产率。细胞实验表明所制备的探针具有较低的细胞毒性，拥有很好地细胞器定位效果，为探索溶酶体内粘度变化引起的相关疾病的病理研究开辟了道路。

Claims (4)

1.四种具有粘度传感性质的可靶向多种细胞器的近红外荧光探针DMPC，DEPC，DHDM和DHDV，其结构通式为：
Figure FDA0003304940630000011
其中R1分别为
Figure FDA0003304940630000012
R2分别为
Figure FDA0003304940630000013
四种探针具体结构为：
Figure FDA0003304940630000014
所述荧光探针对粘度检测机理为：
Figure FDA0003304940630000015
基于扭曲的分子内电荷转移(TICT)理论，我们设计并合成了四种对粘度具有传感性质的近红外荧光探针。四种探针在低粘度溶液中因碳碳单键能自由旋转而消耗能量，而在高粘度溶剂中探针因碳碳单键旋转受阻进而减少了非辐射跃迁的发生几率，导致探针的荧光强度和荧光量子产率增强；此外酸性条件下，粘度受到影响，使得探针的荧光强度得到增强。
2.所述探针DMPC、DEPC、DHDM和DHDV的制备步骤如下：
用移液枪移取2’-羟基苯乙酮(1mmol，120μL)并准确称取4’-二甲基氨基苯乙酮(2mmol，326.44mg)溶于乙酸中，之后向反应瓶中缓慢滴加1.8mL的70％高氯酸，将温度升至110℃反应12h。反应结束后冷却至室温，将溶液滴加到蒸馏水中使其有沉淀析出。将沉淀物抽滤后放入真空干燥箱干燥即可得到深红棕色固体C1(240mg，90.9％)。
称取4’-氨基-2’-羟基苯乙酮(453.48mg，3mmol)、K2CO3(414.63mg，3mmol)和7.5mLCH3I溶于4mL乙醇中，加热至55℃回流36h。待溶液冷却后，浓缩溶液，加入硅胶过柱纯化(V石油醚:V乙酸乙酯＝1:1)，得白色产物D1(280mg，产率52.2％)。
称取二甲氨基苯乙酮(161.2mg，1mmol)和D1(179.1mg，1mmol)溶于1.5mL醋酸中，逐滴滴加1.8mL的高氯酸，滴加过程中溶液颜色由棕色逐渐变为暗红色。反应液加热至110℃，回流12h。溶液冷却至室温后，倒入50mL冰水中，产生大量红色沉淀。过滤沉淀物，用少量乙酸乙酯进行洗涤。干燥得到红色固体产物C2(160mg，产率39.4％)。
将化合物C1(0.5mmol，132mg)和4-(二甲氨基)水杨醛(0.65mmol，107.4mg)溶于8mL的无水甲醇中，将温度缓慢升至76℃反应12h。反应完成后冷却至室温，有固体析出并进行抽滤，之后用少量乙醚洗涤滤饼干燥得到棕黑色固体产物(72mg，38.0％)，即探针DMPC。
将化合物C1(0.5mmol，132mg)和4-(二乙氨基)水杨醛(0.65mmol，125.6mg)溶于8mL的无水甲醇中，将温度缓慢升至76℃反应12h。反应完成后冷却至室温，加入大量乙醚使其析出沉淀，抽滤得到黑色固体(86mg，39.0％)，即探针DEPC。
称取4-(二甲氨基)水杨醛(62.8mg，0.38mmol)和C2(107mg，0.346mmol)溶于5mL无水甲醇中，加热至78℃，回流36h，待溶液冷却后，加入适量乙醚，析出红色固体，抽滤干燥得红色固体产物(109mg，产率69.3％)，即探针DHDM。
称取4-(二乙氨基)水杨醛(77.2mg，0.4mmol)和C2(80mg，0.2mmol)溶于5mL无水甲醇中，加热至78℃，回流36h，待溶液冷却后，加入适量乙醚，析出红色固体，抽滤干燥得红色固体产物(75mg，产率64.5％)，即探针DHDV。
具体的反应合成路线如下：
Figure FDA0003304940630000031
3.如权利要求1所述的四种探针DMPC、DEPC、DHDM和DHDV，在二甲亚砜(DMSO)、乙腈(CH3CN)、乙醇(EtOH)、二氯甲烷(DCM)、氯仿(CHCl3)和甘油(Glycerol)等溶剂中荧光发射均位于近红外区，并且在不同溶剂中均有较大的摩尔消光系数和斯托克斯位移。四种探针对高粘度溶剂(如甘油)具有良好的选择性，四种探针均可以对不同比例PBS和甘油混合溶液中甘油含量的增加做出有规律的变化。当甘油含量达到95％时，DMPC、DEPC、DHDM、DHDV的荧光强度分别增大了约92倍、89倍、260倍和453倍，荧光量子产率也分别从0.008增加到0.237，从0.006增加到0.219，从0.012增加到0.636，从0.051增加到0.681，具体参数如下表所示。
Figure FDA0003304940630000041
本发明的四种荧光探针检测粘度线性较好，在黏度对数值为0.83-2.07的范围内时，四种探针检测粘度线性相关系数分别为：DMPC R＝0.9906，DEPC R＝0.9978，DHDM R＝0.9971，DHDV R＝0.9918。此外，酸性环境下，粘度受到影响，从而使得探针的荧光强度得到增强。
4.如权利要求1所示的四种探针DMPC、DEPC、DHDM和DHDV能同时靶向多种细胞器，如细胞核、线粒体、溶酶体、内质网、高尔基体等。其中探针DMPC可同时靶向溶酶体和内质网，其相应皮尔逊共定位系数分别为0.92和0.93；探针DEPC可同时靶向溶酶体、内质网和高尔基体共三种细胞器，其相应皮尔逊共定位系数分别为0.81、0.94和0.87；探针DHDM可同时靶向细胞核、线粒体和内质网共三种细胞器，其相应皮尔逊共定位系数分别为0.80、0.83和0.89；探针DHDV可同时靶向线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体共四种细胞器，其相应皮尔逊共定位系数分别为0.89、0.81、0.90和0.84。当细胞器内粘度增强时，四种探针能对细胞器内粘度变化做出响应，即荧光强度显著增强。由于溶酶体内为酸性环境，粘度会受到影响，这导致探针的荧光强度除了受到溶酶体内粘度变化的影响外，还会受到pH的影响，但实验结果表明粘度变化的影响要远远大于酸性环境的影响。
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