CN114392323A - 抗糖化的中药提取物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种中药提取物，通过以下原料制备得到：茯苓、蒺藜、白蔹、芍药、白术、白芨和白鲜皮，其中茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮的重量比为1:1‑4:4‑10:8‑10:1‑4:1‑4:1‑4。本发明还涉及包含所述中药提取物与多元醇的组合物以及所述中药提取物的冻干产品。

Description

抗糖化的中药提取物
技术领域
本发明涉及天然药物化学领域和化妆品领域，具体涉及一种具有抗糖化、祛黄、美白、提亮肤色功效的中药提取物，该中药提取物的制备方法以及应用。
背景技术
中医药越来越受到世界人民的关注和重视。但由于传统中医药理论与现代科学理论脱节以及中药研究手段相对落后，使中药资源的开发和利用受到极大的影响和限制。中药的开发目前主要局限于从现有中药中寻找有效成分，并发展各种提取的手段富集和优化有效成分。而以现有中药资源为基础提升中药的开发潜力、应用效率和新的应用场景，目前尚未引起人们的广泛重视，特别是将传统中药的优势与现代化妆品组方技术相结合，实现中药的现代化是促进中药发展的重要手段。
现代中草药化妆品以其秉承中医智慧，处处体现整体观念，采用的符合中草药组分不仅加强了中草药化妆品的功能性，还使得其具有一专多能的特性，并且具有天然属性安全性高，毒副作用小、易于利用吸收等特点具有广阔的开发应用前景。随着社会的进步和科技的发展，人们对肌肤的问题的认识不断加深，如衰老的机制、美白的机制、敏感的机制等，人们对抗衰老，永葆青春容颜的愿望也日趋强烈。
当今研究的热点非酶糖基化衰老学说，该学说又称为美拉德反应衰老学说，该学说认为肌肤内还原性糖(葡萄糖、半乳糖、乳糖、木糖、果糖)与蛋白质、核酸、脂质发生的非酶反应形成席夫碱(Schiff)结构的糖基化氨 (glycosylamine)，进一步发生复杂的重排反应变成羟基类化合物，与胶原蛋白的氨基酸相结合，最后形成糖基化终产物(AdvancedGlycation End Products，AGEs)。糖基化终产物(AGEs)呈棕褐色、不可逆、交联、不怕酶破坏、不易降解、有特别的吸收光谱及荧光特性、逐渐累积，可与许多细胞膜特异性受体结合发挥生物学效应。AGEs是导致胶原蛋白交联至衰老过程中的重要影响因素，糖基化会造成蛋白质的交联损伤，能使正常的蛋白结构转变成老年蛋白的结构，还会造成结构蛋白的硬化，皮肤也会因此变得脆弱，皮肤弹性大幅下降。AGEs也会抑制成纤维细胞的增殖，减少胶原蛋白的生成，是皮肤衰老的重要影响因素，紫外线又利用AGEs的特性促进氧化应激反应，造成肌肤氧化损伤，加速光老化等，皱纹形成并不断加深，导致皮肤各种衰老问题。
中医理论体系与分子生物学虽然属于两种不同的思想体系，但研究生命活动的物质基础是一致的，是人类关于生命与健康在不同程度上的认识和探索的产物。比如中医理论认为衰老机理是“气血不和，百病乃变化而生”的观点，即气虚血瘀是衰老的根本原因。现在医学认为气虚血瘀表现为微循环不畅、血液流动性不佳、肌肤内部的代谢不佳造成的。因此，从分子水平研究中医理论及中医药，并将中医理论及现代中医药的其他新成果应用到现代生物学技术中去，对推动中西医结合、促进医药在美容护肤方面的发展具有重要的意义。从现代医学研究来看，中草药中含有丰富的蛋白质、脂质、氨基酸、多糖类、果胶、维生素、微量元素、有机酸、生物碱、皂苷等营养物质，具有促进细胞增殖代谢，改善皮肤微循环，增强机体抗氧化能力，抗击紫外线损伤，抑制羰基化反应，保湿和皮肤屏障修护等护肤功效。中医的观点则对中草药调理阴阳平衡，调理气血津液，调理脏腑和延缓衰老等功能，故中草药应用于化妆品开发的社会和经济效益前景广阔。
本发明意外地发现，包含茯苓、蒺藜、白蔹、芍药、白术、白芨、白鲜皮的中药提取物具有优异的抗糖化作用，能够作为功效添加剂应用于化妆品中。
发明内容
一方面，本发明提供了一种中药提取物，通过以下原料制备得到：茯苓、蒺藜、白蔹、芍药、白术、白芨和白鲜皮，其中茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮的重量比为1:1-4:4-10:8-10:1-4:1-4:1-4。
在优选的实施方式中，中药提取物具有抗糖化作用。
在优选的实施方式中，中药提取物通过溶剂提取制备得到。在优选的实施方式中，所述溶剂提取采用水提醇沉方法。在优选的实施方式中，所述溶剂提取采用醇溶剂进行提取。在优选的实施方式中，茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮的重量比为1:1-2:4-8:8-10:1-4:1-4:1-2。
另一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含本发明的中药提取物以及多元醇。在优选的实施方式中，多元醇选自：甘油、双甘油、丁二醇、戊二醇、丙二醇、乙基己基甘油、聚乙二醇、山梨糖醇或它们的组合。在优选的实施方式中，多元醇是重量比为1-9:1-9的丁二醇和乙基己基甘油的混合物。
又一方面，本发明涉及中药提取物的冻干产品，所述冻干产品是无定形粉末。
又一方面，本发明涉及所述中药提取物、所述组合物、或所述冻干产品在皮肤抗糖化中的应用。
又一方面，本发明涉及一种皮肤外用剂，所述皮肤外用剂包含所述中药提取物、所述组合物、或所述冻干产品。
附图说明
下面结合附图进一步说明本发明。
图1显示了实施例4中药提取物的PGG的HPLC图谱。
图2是免疫组化检测结果。采用倒置Olympus显微镜，型号CKX41，放大倍数为40x。
图3显示了经萃取、浓缩、纯化处理后的中药提取物与多元醇混合样品。从左到右分别为实施例43，实施例121，实施例126的图片。
具体实施方式
本发明目的基于中药古方复合物，在协同搭配提升功效的同时，经过萃取工艺提高活性成分含量，改善中药复合物的特殊气味和颜色，改善中药复合物的生物利用度，并与现代化妆品学技术相结合，提供一种具有较好的抗肌肤糖化作用的中药复合产物，可直接用于皮肤，也可作为功效添加剂加入到化妆品配方中使用，大幅提升化妆品应用的功效，且成本较低。
本发明根据多部古书籍和现代中草药学的研究成果，对多个中药古方进行复合得到较优复合中医配伍理论的美容方剂。本发明采用茯苓、蒺藜、白蔹、芍药、白术、白芨和白鲜皮得到中药提取物。
本发明利用现代中草药萃取方法和工艺对中药古方进行前处理。在优选的实施方式中，本发明中药提取物在溶剂提取之前包括将中草药原料进行粉碎。例如，可以采用高速万能粉碎机(FW100型)粉碎中草药原料的混合物。
本发明还利用浓缩、纯化等工艺，改善和提升中药复合物提取物中活性物含量。在一些实施方式中，采用中药材提取浓缩罐(TNH型)实现浓缩。
本发明利用化妆品技术，进一步改善肌肤对于中草药活性成分的生物利用度，实现抑制肌肤糖基化反应终端产物AGEs的效果。
除非另有定义，否则本文使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。另外，将本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献以引用方式并入本文中。除非另有指明，否则百分比是指重量百分比。
中草药药材
芍药为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall的干燥根，含有根含芍药甙(Paeoniflorin)、牡丹酚(Paeonol)、芍药花甙(Paeonin)，苯甲酸、挥发油、脂肪油、树脂、鞣质、糖、淀粉、粘液质、蛋白质、β-谷甾醇和三萜类等。
白蔹为葡萄科植物白蔹Ampelopsis japonica(Thunb.)Makino的干燥块根，根块含粘质和淀粉。
蒺藜为蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果实。根和叶含皂甙，甙元有薯蓣皂甙元(Diosgenin)、芰脱皂甙元(Gitogenin)、绿莲皂甙元(Chlorogenin)、罗斯考皂甙元(Ruscogenin)。叶尚含山柰酚(Kaempferol) 和多种山柰酚甙。
白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koldz.的干燥根茎，含挥发油1.4％，主要成分为苍术醇(Atractylol)、苍术酮(Atractylon)等，并含有维生素A。
茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，含β -茯苓聚糖(β-Pachyman)约占干重93％和三萜类化合物乙酰茯苓酸 (Pachymic acid)、茯苓酸(Tumulosic acid)、3β-羟基羊毛甾三烯酸[3β -Hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oil acid]。此外，尚含树胶、甲壳质、蛋白质、脂肪、甾醇、卵磷脂、葡萄糖、腺嘌呤、组氨酸、胆碱、β-茯苓聚糖分解酶、脂肪酶、蛋白酶等。
白鲜为芸香科植物白鲜Dictamnus dasycarpus Turcz.的干燥根皮，含白鲜碱(Dictamnine)、白鲜内酯(Dictamnolactone,Obaculactone,Limonin)、谷甾醇(Sitosterol)、黄柏酮酸(Obacunonic acid)、胡芦巴碱(Trigonelline)、胆碱 (Choline)、梣皮酮(Fraxinellone)。尚含菜油甾醇(Campesterol)、茵芋碱 (Skimmianin)、γ-崖椒碱(γ-Fagarin)、白鲜明碱(Dasycarpamin)。地上部分含有补骨脂素(Psoralen)和花椒毒素(Xanthotoxin)。
白芨为兰科植物白及Bletilla striafa(Thunb.)Reichb.f.的干燥块茎，其新鲜块茎含水分14.6％、淀粉30.48％，葡萄糖1.5％。又含挥发油、粘液质。根含白及甘露聚糖(Bletilla mannan)，是由4份甘露糖和1份葡萄糖组成的葡配甘露聚糖。
遵循中药美容古方配伍的组方思路，仍然以阴阳共养之物为底，即芍药(Paeonialactiflora Pall)、白蔹(Ampelopsis japonica(Thunb Vlakino) 为君药；臣药则分别配伍温煦之蒺藜(Tribulus terrestris L)、白术 (Atractylodes macrocephala Koidz)中草药；另加佐药茯苓(Poria cocos (Schw.)Wolf)、白鲜(Dictamnus dasycarpus Turcz)；使药为白芨(Bletilla striata Thunb Reichb.f.)。参考2015版《中国药典》一部，与中国植物志等内容进行鉴定。组方尽量精简，组成平衡美肌之简方，以符合后期提取、纯化技术等工艺需求。
中药提取物
本申请首次将茯苓、蒺藜、白蔹、芍药、白术、白芨和白鲜皮组合进行提取物，得到的复方中药提取物中各味药之间相辅相成，以达到抗糖化、祛黄、美白、提亮肤色的功效。
在一些实施方式中，本发明的中药提取物中原料茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮的重量比为1:1-4:4-10:8-10:1-4:1-4:1-4。在一个具体的实施方式中，本发明的中药提取物中原料茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮的重量比为1:4:10:10:1:4:4。在一个具体的实施方式中，本发明的中药提取物中原料茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮的重量比为1:2:8:10:4:1:2。在一个具体的实施方式中，本发明的中药提取物中原料茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮的重量比为1:1:10: 10:4:1:1。在一个具体的实施方式中，本发明的中药提取物中原料茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮的重量比为1:1:4:10:4:1:1。在一个具体的实施方式中，本发明的中药提取物中原料茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮的重量比为1:1:4:10:2:1:1。在一个具体的实施方式中，本发明的中药提取物中原料茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮的重量比为1:2:4:8:4:1:2。
本发明的中药提取物可以作为功效添加剂加入到化妆品中使用，以达到抗糖化、祛黄、美白、提亮肤色的功效。
提取方法
本发明的中药提取物通过溶剂提取法制备。常见提取溶剂包括但不限于：水(例如去离子水)、有机溶剂(例如乙醇)。还有其他的提取方式，包括微波提取、超临界二氧化碳提取、超声波提取、酶提取法等。
在一些实施方式中，本发明的中药提取物采用水提醇沉进行制备。例如，本发明的中药提取物采用去离子水煮沸提取，然后进行醇沉，获取滤液，得到所需的中药提取物。在一个具体的实施方式中，醇沉过程采用乙醇。在一些实施方式，水提醇沉的提取过程持续1-24小时。在一些实施方式，水提醇沉的提取过程持续12-16小时。
在一些实施方式中，本发明的中药提取物采用醇作为提取溶剂。例如，本发明的中药提取物可以采用乙醇提取。在优选的实施方式中，提取过程在煮沸条件下(例如80±10℃)进行。在优选的实施方式中，可以采用70体积％的乙醇进行提取。在一些实施方式中，醇提取过程持续2-4小时。
中药提取物与多元醇的组合物
本发明还涉及包含的中药提取物和多元醇的组合物。
本发明所用术语“多元醇”是指分子中具有2个及以上羟基的水溶性多元醇，包括但不限于：甘油、双甘油、丁二醇、戊二醇、丙二醇、乙基己基甘油、聚乙二醇、山梨糖醇等。多元醇在化妆品中常用作保湿剂，从环境中吸收水分，补充到肌肤中，增加皮肤表面的含水量。多元醇可以单独使用，或者它们可以组合使用。例如，可以将2种或更多种多元醇组合使用。
在一些实施方式中，将本发明的中药提取物与重量比为9:1的戊二醇和丙二醇的混合物进行组合。在一些实施方式中，将本发明的中药提取物与重量比为5:5的聚乙二醇和辛甘醇的混合物进行组合。
从软化细胞膜层和角质层角度看，丁二醇，戊二醇，乙基己基甘油是优选的。因此，在优选的实施方式中，将中药提取物与重量比为9:1的丁二醇和乙基己基甘油的混合物进行组合。
冻干产品
本发明还涉及中药提取物的冻干产品。在一些实施方式中，冻干产品可以的无定形粉末。
在一些实施方式中，采用北京博医康实验仪器有限公司的真空冷冻干燥机FD-2型进行冻干。
在一些实施方式中，冷冻干燥设置-80～-40℃，真空度1～30Pa，时间 8小时，升华干燥设置-20～+20℃，真空度1～30Pa，时间6小时，含水量控制在0～6％之间，解析干燥设置-10～+20℃，真空度1～30Pa，时间3 小时，含水量控制在0～6％之间。
皮肤外用剂
本发明还涉及一种皮肤外用剂，该皮肤外用剂包含本发明的中药提取物、中药提取物与多元醇的组合物、或中药提取物的冻干产品，以及化妆品、皮肤病学或药学上可接受的赋形剂。
在一些优选的实施方式中，以所述皮肤外用剂的总重量计，中药提取物的用量为0.001-50％(w/w)，优选为1-20％(w/w)，更优选为2-10％(w/w)，最优选为3-8％(w/w)。
或者，中药提取物的冻干产品也可以单独使用。
所述皮肤外用剂组合物是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念，例如可以是化妆料组合物或药学组合物。所述化妆料组合物中可以是基础化妆料、面部妆容化妆料、身体用化妆料、头发护理用化妆料等，对其剂型无特殊限制，根据不同目的可合理选择。
这种皮肤外用剂可以配制成任何合适的产品形式。这类产品形式包括，但不限于气溶胶型喷雾剂、霜剂、乳液、固体、液体、分散体、泡沫、凝胶、化妆水、摩丝、软膏、粉剂、贴剂、润发油、溶液、手按泵型喷雾剂、棒状物、面膜和湿纸巾。可以这种皮肤外用剂通过本领域众所周知的各种方法便利地用于制备或作为化妆品、皮肤病学或药物局部施用产品。
本发明的皮肤外用剂组合物可以包括一种或多种下列成分：抗过敏剂、抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、着色剂去色素剂、润肤剂、乳化剂、表皮脱落剂、成膜剂、香料、保湿剂、昆虫驱避剂、润滑剂、药物活性剂、增湿剂、耐光剂、防腐剂、护肤剂、皮肤渗透增强剂、防晒剂、稳定剂、表面活性剂、增稠剂、粘度调节剂、维生素或其任意组合。
可以用于本发明皮肤外用剂组合物的化妆品、皮肤病学或药学上可接受的赋形剂为水相、油相、凝胶、水包蜡型乳液、水包油型乳液或油包水型乳液的形式。水相为一种或多种水溶性或分散性组分的混合物，其在室温(25℃)下可以为液体、半固体或固体。赋形剂包括或可以为在水或水- 醇赋形剂中的混悬液、分散液或溶液的形式，其可以含有增稠剂或凝胶剂。本领域技术人员可以基于本领域技术人员掌握的知识选择合适的产品形式，其中包含的组分。
所述的组合物可以包括水相，该水相可以含有水或水与至少一种亲水性有机溶剂的混合物，所述的亲水性有机溶剂诸如醇，尤其是含有2-5个碳原子的直链或支链低级一元醇，如乙醇或丙醇；多元醇，如丙二醇、山梨醇、甘油、泛醇或聚乙二醇及其混合物。
当发明的组合物为乳液形式时，该组合物还可以任选包含表面活性剂。
所述的组合物还可以包含成膜聚合物，如聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸均聚物或共聚物、聚酯、基于烃的树脂和/或硅氧烷树脂。可以将聚合物溶于或分散于化妆品可接受的赋形剂中并且任选与增塑剂合并。
本发明的组合物还可以包含油相，所述的油相含有在室温(25℃)下为液体的油溶性或油分散性组分和/或在室温下为油状或蜡状的物质，如蜡、半固体、树胶及其混合物。该油相还可以含有有机溶剂。
通常在室温下为液体，合适的油性物质包括：来源于动物的基于烃的油，如全氢化角鲨烯；基于烃的植物油，如液体的C4-10脂肪酸的甘油三酯类，例如庚酸或辛酸甘油三酯类，或油，例如向日葵油、玉米油、大豆油、葡萄籽油、蓖麻油、鳄梨油、辛酸/癸酸甘油三酯类、霍霍巴油；矿物或合成来源的直链或支链烃类，例如液体石蜡及其衍生物、凡士林；合成酯类和醚类，特别是脂肪醇的酯类，例如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸2-乙基己酯、硬脂酸2-辛基十二烷基酯、异硬脂酸异硬脂醇酯；羟基化酯类，例如乳酸异硬脂醇酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛基十二烷基酯、脂肪醇的庚酸酯类、辛酸酯类和癸酸脂类；多元醇酯类，例如丙二醇二辛酸酯、新戊二醇二庚酸酯、二甘醇二异壬酸酯和季戊四醇酯类；含有C12-26的脂肪醇类，例如辛基十二烷醇、2-丁基辛醇、2-己基癸醇、2-十一烷基十五烷醇、油醇；基于部分烃的氟油和/或氟硅油，硅油，在室温下为液体或半固体的挥发性或非挥发性的直链或环状聚甲基硅氧烷，例如环状聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷，其任选包含苯基，例如苯基三甲基硅氧烷、硅氧烷及其混合物。
本发明的组合物可以进一步包含常用于化妆品领域中的任何组分。这些组分包括防腐剂、水相增稠剂(提取物生物聚合物、合成聚合物)和脂肪相增稠剂、芳香剂、亲水性和亲脂性活性剂及其混合物。
本发明的组合物还可以包含另外的颗粒相，所述的颗粒相可以为化妆品组合物中使用的颜料和/或珠光剂和/或填充剂。
颜料可以存在于组合物中，合适的无机颜料包括氧化钛、氧化锆和氧化铈以及氧化锌、氧化铁和铁蓝；合适的有机颜料包括钡、锶、钙和铝色淀和碳黑。
珠光剂可以存在于组合物中，合适的珠光剂包括涂覆了氧化钛、氧化铁或天然颜料的云母。
填充剂可以存在于组合物中，合适的填充剂包括滑石粉、二氧化硅、硬脂酸锌、云母、高岭土、尼龙粉末、聚乙烯粉末、特氟龙、淀粉、一氮化硼、共聚物微球，例如硅氧烷树脂微珠。
本发明组合物的油相可以包含一种或多种蜡、树胶或其混合物。蜡包括基于烃的蜡、氟蜡和/或硅氧烷蜡，并且可以来源于植物、矿物、动物和/ 或合成来源。合适的蜡包括蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、石蜡、微晶蜡、地蜡；合成蜡包括聚乙烯蜡、含有C16-45的硅氧烷蜡。树胶一般为聚二甲基硅氧烷或羧甲基纤维素钠或提取物类，并且半固体物质一般为基于烃的化合物，如羊毛脂及其衍生物。
可以将本发明的组合物配制成任何合适的产品形式。这类产品形式包括，但不限于气溶胶型喷雾剂、霜剂、乳液、固体、液体、分散体、泡沫、凝胶、化妆水、摩丝、软膏、粉剂、贴剂、润发油、溶液、手按泵型喷雾剂、棒状物、面膜和湿纸巾。可以将本发明的组合物通过本领域众所周知的各种方法便利地用于制备或作为化妆品、皮肤病学或药物局部施用产品。
本发明的皮肤外用剂组合物可以包括一种或多种下列成分：抗过敏剂、抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、着色剂去色素剂、润肤剂、乳化剂、表皮脱落剂、成膜剂、香料、保湿剂、昆虫驱避剂、润滑剂、药物活性剂、增湿剂、耐光剂、防腐剂、护肤剂、皮肤渗透增强剂、防晒剂、稳定剂、表面活性剂、增稠剂、粘度调节剂、维生素或其任意组合。
下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是，应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。
以下实施例中采用的药材原材料均购自“安徽亳州京皖中药饮片厂”，来料形态为“中草药饮片”；采用的生物试剂均购自上海家化生物科技有限公司。
以下实施例中采用的实验仪器如下：
1.固定搅拌器(IKA RW20)
2.恒温水浴锅上海一恒科学仪器有限公司HWS 28型
3.称量天平METTLER TOLEDO PL602-S
4.电热恒温CO2培养箱(Thermo,150i)
5.冰箱
6.Waters 2690HPLC，Waters 2487双波长吸收检测器
7.高速万能粉碎机(FW100型)
8.中药材提取浓缩罐(TNH型)
9.紫外可见分光光度仪(赛默飞)
10.真空冷冻干燥机，型号FD-2型，北京博医康实验仪器有限公司
11.超净工作台(苏州安泰，SW-CJ-IF)
12.酶标仪(BioTek,Epoch)
13.倒置显微镜(Olympus,CKX41)
14.正置显微镜(Olympus,BX53)
实施例1：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:4: 10:10:1:4:4，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入体积浓度70％的乙醇，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例2：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:2: 8:10:4:1:2，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度 70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例3：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:1: 10:10:4:1:1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例4：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:1: 4:10:4:1:1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度 70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例5：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:1: 4:10:2:1:1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度 70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例6：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:2: 4:8:4:1:2，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度 70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例7：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:4: 10:10:1:4:4，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例8：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:2: 8:10:4:1:2，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例9：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:1: 10:10:4:1:1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例10：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:1: 4:10:4:1:1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例11：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:1: 4:10:2:1:1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例12：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:2: 4:8:4:1:2，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例13：中药提取物的制备(对比例)
称取茯苓经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例14：中药提取物的制备(对比例)
称取蒺藜经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例15：中药提取物的制备(对比例)
称取白蔹经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例16：中药提取物的制备(对比例)
称取芍药经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例17：中药提取物的制备(对比例)
称取白术经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例18：中药提取物的制备(对比例)
称取白芨经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例19：中药提取物的制备(对比例)
称取白鲜皮经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例20：中药提取物的制备(对比例)
称取茯苓经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例21：中药提取物的制备(对比例)
称取蒺藜经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例22：中药提取物的制备(对比例)
称取白蔹经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例23：中药提取物的制备(对比例)
称取芍药经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例24：中药提取物的制备(对比例)
称取白术经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例25：中药提取物的制备(对比例)
称取白芨经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例26：中药提取物的制备(对比例)
称取白鲜皮经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例27：中药提取物的制备(对比例)
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:0: 10:10:1:4:4，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例28：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:2: 0:10:4:1:2，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度 70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例29：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:1: 10:0:4:1:1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度 70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例30：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:1: 4:10:0:1:1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度 70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例31：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:1: 4:10:2:0:1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度 70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例32：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:2: 4:8:4:1:0，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度 70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例33：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝0:2: 4:8:4:1:0，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度 70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例34：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:0: 10:10:1:4:4，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例35：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:2: 0:10:4:1:2，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例36：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:1: 10:0:4:1:1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例37：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:0: 4:10:0:1:1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例38：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:0: 4:10:2:0:1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例39：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝1:2: 0:8:4:1:0，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例40：中药提取物的制备
按重量比例称取茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮＝0:2: 0:8:4:1:0，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加10kg乙醇溶液(70％体积浓度)于提取浓缩罐中煮沸，保持温度80℃持续2小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
测试例1：活性物含量检测
取实施例1-40中药提取物分别检测其中活性物含量。
药物活性成分的化学结构是药物经皮渗透的关键。脂溶性的药物易于透过角质层和皮肤屏障、细胞膜，但在活性表皮中由于水分含量相对较高从而扩散较慢。而水溶性成分药物通过角质层细胞膜及皮肤屏障的速度较慢，但在活性表皮中扩散却较快。一般在选用功能性药物活性成分中，注重成分的分子结构，尽可能选择用油/水分配适中的药物成分，或者水溶性和脂溶性成分配合使用，往往能得到较好的效果。
1,2,3,4,6-O-没食子酰葡萄糖(PGG)是一种多酚类化合物，由5个没食子酸与1个葡萄糖通过酯键结合而成，相对分子量940，具有较好的亲水和亲油性，具有较强的生理活性，如抗多种肿瘤、抗氧化、抗白血病、抗过敏、降血糖等功能，存在于多种中药材中。
高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验采用C18通用型Eclipse XDB-C18(4.6x 250mm,5μm)色谱柱；以乙腈-0.1％稀磷酸(25:75)为流动相；梯度洗脱后，检测波长为230nm；柱温为35℃；流速为0.8mL/min；进样量为10μL。理论板数按照1,2,3,4,6-O-没食子酰葡萄糖(PGG)峰值计算应不低于200000。
对照品溶液的制备，精密称取干燥至恒重的PGG对照品，加入甲醇制成每1mL含0.2mg的混合溶液，摇匀即得。
待测样品制备，取实施例1-40的中药提取物各1mL，精密称定，置5mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
测定，分别精密吸取对照品溶液和待测样品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，记录HPLC图谱，得到图1。
测定实施例1-40含量结果如下表1所示。
表1：实施例1-40中药提取物中PGG含量
Figure BDA0003445730310000211
Figure BDA0003445730310000221
结果显示，经过不同的提取工艺，实施例1～6中药提取物获得了较高的PGG获得量，尤其以实施例2为最，达到了0.7913mg/ml，相比较实施例6高出了96％。对于实施例7～12而言，醇提的工艺即便是同样的中草药的配伍比例，在活性成分PGG的含量上，整体偏低，尤其是同样配比的实施例8，相较于实施例2来说，含量约低13.7％；同样地，在实施例1～ 6的水提醇沉工艺中，即便是同样的比例和配伍，整体的PGG含量高于实施例7～12醇提工艺。
对比不同配比的提取物，尤其是删减7味中草药材中的1味或多味的情况下，水提醇沉或者醇提工艺制备获得的PGG含量普遍低于7味药材共同存在的情况，如实施例14，甚至出现了未检出PGG的情况。将实施例2 与实施例13～40中获得的PGG含量进行比较，基本在2-100倍之间；总体而言，通过不同比例配伍获得的7种不同的中药材，不同的配伍和比例之间有较大的活性物含量的差异，而且对于不同的提取工艺，也存在着活性物含量的较大差异。
实施例41～80：中药提取物的后处理
分别将实施例1～40中药提取物1kg，分散在10kg丁二醇：乙基己基甘油混合液体(重量比9:1)中，搅拌至均匀混合，备用。
实施例81～120：中药提取物的后处理
分别将实施例1～40提取物1kg，冷冻干燥设置-80～-40℃，真空度1～ 30Pa，时间8小时，升华干燥设置-20～+20℃，真空度1～30Pa，时间6小时，含水量控制在0～6％之间，解析干燥设置-10～+20℃，真空度1～30Pa，时间3小时，含水量控制在0～6％之间，得淡黄色至黄棕色疏松多孔、海绵状无定型粉末，备用。
测试例2：抗糖化功效(检测指标AGEs)对比
获取ExVivo组织(由广东博溪生物科技有限公司提供)，去除皮下脂肪组织是采用常用工具辊轴取皮刀，将离体皮肤组织块脂肪端削薄以达到目的。去除皮下脂肪后的皮肤组织块低温(-20℃)贮藏冻存备用。
在含有双抗的PBS溶液解冻。青霉素-链霉素(10,000U/ml)混合液又称为双抗，即含有10000单位/ml青霉素和10000μg/ml链霉素的溶液，生产商为赛默飞世尔科技(中国)有限公司，即配制100ml的PBS溶液加入双抗溶液1ml，目的是起到联合抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的作用，防止皮肤组织块受到细菌污染。磷酸盐缓冲溶液(PBS)是一种平衡盐溶液，生产商为北京索莱宝科技有限公司，P1020-500ml 1xPBS缓冲液 (pH7.2-7.4)。
取直径4～6mm的组织块，在液氮和37℃水浴锅中反复冻融5次。将离体皮肤组织块置于24孔板中，加1ml含有双抗的PBS，CO2孵育18±2h。
糖化反应按照以下步骤进行：
1)取新的24孔板，加入0.5mM浓度甲基乙二醛，1ml/孔；
2)按照10J/cm2UVA辐照剂量进行辐照。UVA辐照采用的是UVA紫外线光疗仪，生产商上海SIGMA高技术有限公司，按照辐照剂量10J/cm2 UVA进行辐照，每次72小时；
3)辐照结束后，将孔板转移至45℃烘箱进行糖化反应72h；
4)72h之后，吸取并倒弃糖化反应工作液(糖化反应工作液为甲基乙二醛工作液，即按照1:13000的比例，用含双抗的PBS溶液稀释至0.5mM，甲基乙二醛生产商为Sigma,M0252型号)，加入新配制的糖化反应工作液，即3mM浓度的氨基胍硫酸盐作为阳性对照，3重量％实施例1～120获得的提取物、后处理物或后处理物的水溶液，重复步骤2)至4)；
5)UVA辐照进行3次，第4次后，清洗离体皮肤后转移至新的糖化反应工作液，重复步骤3)和4)，共计持续21天。
6)糖化反应结束后，将离体皮肤组织转移至1.5mL EP管中，用4％多聚甲醛固定，进行包埋，切片，AGEs免疫组化染色。
对于免疫组化(IHC)过程，主要分为：
—采用4％多聚甲醛对离体皮肤组织块进行固化24小时，多聚甲醛生产商为国药集团，AR级分析纯。
—将皮肤组织块进行梯度酒精脱水，75％酒精1h，85％酒精1h，95％酒精1h，95％酒精1h，无水乙醇I1h，无水乙醇II 1h，二甲苯I1h，二甲苯II 1h。以上试剂均为分析纯，使用前未进一步处理。
—采用蜡包埋机对脱水处理后的皮肤组织进行包埋，于-20℃进行冷却，待蜡凝固后取出在切片机上进行切片；包埋机生产商为徕卡HistoCore Arcadia包埋机，切片机为徕卡CM1520型切片机。
—将新鲜的切片置于玻片上，滴加少量PBS缓冲液以防止干化及蛋白交联。PBS缓冲液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，型号eBioscience IHC溶液。
—采用SP试剂盒(福州迈新公司生产，型号E-EL-0067C)说明书进行免疫组化染色检测皮肤组织中的AGE(DAB染色)，在倒置Olympus 显微镜下对每张切片选择3个视野观察计算数据。
AGEs数据＝相对IOD值/Area平均值
使用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用 t-test统计分析。
相对改善率(％)＝(阴性对照—实施例相对平均值)/阴性对照x 100％
表2：实施例1-120抗糖化功效(检测指标AGEs)结果
Figure BDA0003445730310000251
Figure BDA0003445730310000261
Figure BDA0003445730310000271
Figure BDA0003445730310000281
Figure BDA0003445730310000291
中药化妆品的核心功效的发挥首先需要研究的就是活性成分的透皮吸收和利用的问题。当皮肤角质层中含水量低于10％后，角朊细胞排列状态更加紧密，减少了皮肤有效透入面积和物质透皮的空间，从而降低了药物的透皮吸收程度和效率。在这种皮肤环境下，即使加大药物用量，效果并无太大改善，所以功能性化妆品，首先要做的是把皮肤的含水量恢复到正常水平或处于水润状态，角质层含水10％或以上，表皮中其他各层10％～ 47％，当表皮中含水量达到10％～50％时，使得紧密的角朊细胞形成多孔和饱满状态，增加了皮肤的有效面积和接触的横截面，药物的透皮吸收速度大大提高，在皮肤保湿的环境下药物会发挥更好的作用。给皮肤补充水分及锁住水分的有效方法有很多，比如在配方中添加天然保湿剂(NMF)、透明质酸、卵磷脂、神经酰胺和胆固醇、多元醇等。但神经酰胺和胆固醇对细胞的屏蔽作用较大，从而影响药物的吸收与利用；透明质酸(HA)由于分子量较大，其分子筛效应不利于药物活性成分的渗透和吸收利用，特别是配方体系pH≤5时，会增强透明质酸分子的网状交联，增加药物扩散的阻力。肌肤中糖化反应的发生在表皮层的深处及真皮层，任何功效活性物质如果无法通过皮肤屏障是无法到达糖化部位而起到实际的功效发挥。本申请的提取物能够实现透皮吸收，帮助美白物质渗透被肌肤细胞利用而达到抗糖化的效果。
对比了相同浓度下的提取物及其不同后处理方式和工艺产物对抑制 AGEs的效果差异。
从实施例1～40的结果来看(见表2)，提取物绝大部分具有抗糖化的功效，从相对改善率维度来看，7种中草药组合经过水提醇沉提取工艺获得的提取物整体改善在6.5％以上，相比较醇提工艺来说，后者平均的改善率在3～7％之间，说明该制备工艺获得的提取物整体功效略弱，这与相同实施例提取物中PGG的含量也是有正相关性的；水提醇沉工艺获得的实施例1～6中，以实施例1改善率达到10.59％为最高，而其次为实施例5的改善率为9.41％。
对于后继删减1味中草药或者多味中草药的实施例，即便采用相同的水提醇沉或者醇提的制备工艺，其抗糖化的改善率也是大幅度地降低，甚至出现了负值，如实施例21，实施例22，实施例39；但也有例外的情况，即实施例29，抗糖化改善率达到了12.35％，为较高的改善性能。但是单味中草药的提取液，不论是水提醇沉还是醇沉制备工艺，获得的提取物的抗糖化改善率均不高。
从实施例41～46为实施例1～6提取物的后处理产物，通过与特定的多元醇类组合复配，较大幅度地提升了实施例1～6提取物通过水提醇沉工艺制得的提取物在抑制AGEs方面的改善率，比如实施例43提升到了 28.82％，实施例42提升到了25.29％，实施例41提升到了24.12％，实施例44提升到了19.41％，平均的提升比例超过了10％，说明采用选定的两种醇类物质进行复配组合对后处理能较大程度提高了中药提取物的抗糖化功效。
对比两种多元醇同比例下的自身的抗糖化能力，基本来说没有任何的抗糖化功效，说明多元醇组合对中草药复合物的活性物在抗糖化功效的发挥具有较大的促进作用。
与此同时，与实施例1～6提取物后处理产物与前述较高含量的PGG 有一定的相关性，多元醇的加入可以极大地提升中草药活性成分被细胞的利用率是可能的工作机制。
从实施例47～52为实施例7～12提取物的后处理工艺产物，同样通过与特定的多元醇组合复配，也较大幅度地提升了实施例7～12提取物通过醇提工艺制得的提取物在抑制AGEs方面的改善率，比如实施例47也提升到了19.41％，实施例48提升到了17.06％，实施例51提升到了17.65％，较实施例7～12提取物提升超过了10％。说明在醇提工艺下，通过加入丁二醇及乙基己基甘油可以较大幅度地提升活性物的抗糖化功效。
从实施例53～80，对比考察了删减1味或者多味中草药材的组合物之间，水提醇沉工艺制备提取物采用丁二醇和乙基己基甘油复配后处理获得的产物在抑制AGEs方面的效果，从提取物本身的较低的抗糖化抑制效果来看，通过多元醇处理后抑制的效果虽然后提升，但是整体提升的比例不大。说明只有7味中草药按照特定的配伍比例组合后，才能发挥较好的抑制糖化反应的效果，另外在7味中草药按照特定的配伍比例组合后，采用丁二醇和乙基己基甘油才能获得更好的抑制糖基化反应的效率提升，因为中药配伍理论始载于一千九百多年前的本草鼻祖——《神农本草经》：“有单行者，有相须者，有相使者，有相畏者，有相恶者，有相反者，有相杀者，凡此七情，合和时视之”。简言之，本发明中的中药组合出现了类似的协同作用。
中草药复方添加剂里面的主要功效物质为黄酮、多酚、多糖等，具体的组分的分布和含量多数依赖于萃取方法和手段，而且因为多数物质不易保存，储存不当易发生氧化、分解、挥发、变质等问题而导致功效物质的损失。制备工艺后期采用了先进的冻干技术，使得提取物中的活性成分能够较好的保留，可以在更大程度上保留活性成分的原汁原味，特别是热敏性的活性成分，另外，因在真空无氧下操作，因此，一些易氧化的活性成分(如油脂类)也可以得到保护。在真空和低温下操作，微生物的生长和酶作用受到抑制，常温下能长久储存，而且不需添加任何防腐剂，减少微生物的侵蚀,延长产品的保质期。通过冻干技术处理实施例1～40获得了实施例81～120的冻干后处理产物，最大化地避免活性成分由于各种可能的原因储存不当而导致的活性物质的损失，从而影响抗击糖化反应的效果。
对冻干处理产物，即实施例81～120的抑制AGEs进行了抑制糖基化 AGEs的实验，从表2的结果改善率来看，总体来说与提取物本身的测试结果相当，个别的实施例的测试结果有升高，如实施例85提升对AGEs的改善率到18.24％，实施例102提升对AGEs的改善率到15.88％，呈现了一定程度的增长。说明从提取物到经冻干工艺处理后，在整个提取物的储存过程中能够较好地保留提取物本身的活性和抑制糖基化AGEs的效果。
图2显示了实施例42和实施例43的实验样品平行三个相同实验的结果。与空白对照相比较，阴性对照呈现出-70％的负向改善，从图中看出糖基化反应程度及颜色呈现了较黯沉的颜色。阳性对照相较于阴性对照改善 22.94％，但是对于实验样品实施例42，实施例43，图片颜色呈现明显的浅色，说明该两例实施例的抑制AGEs的效果较好，分别达到了25.29％和 28.82％。
综上所述，按照中医智慧思想配伍的实施例1～5获得的提取物经过特定多元醇组合配比后得到的实施例41～45具有更好的抑制肌肤糖基化反应终端产物AGEs的效果，在此基础上，对比不同的多元醇组合物及其不同的比例情况下，再次进行抑制糖基化反应终端产物AGEs的对比。
实施例121～125：中药提取物的后处理(对比例)
分别将实施例1～5提取物1kg，分散在10kg戊二醇：丙二醇混合液体(重量比9:1)中，搅拌至均匀混合，备用。
实施例126～130：中药提取物的后处理(对比例)
分别将实施例1～5中药提取物1kg分散在10kg聚乙二醇：辛甘醇(重量比5:5)中，搅拌至均匀混合，备用。
实施例131：多元醇组合配比(对比例)
按照重量比9:1配制丁二醇：乙基己基甘油混合液体，搅拌均匀混合，备用。
实施例132：多元醇组合配比(对比例)
按照重量比9:1配制戊二醇：丙二醇混合液体，搅拌均匀混合，备用。
实施例133：多元醇组合配比(对比例)
按照重量比5:5配制聚乙二醇：辛甘醇混合液体，搅拌均匀混合，备用。
测试例3：抗糖化功效(检测指标AGEs)对比
获取ExVivo组织(由广东博溪生物科技有限公司提供)，去除皮下脂肪组织是采用常用工具辊轴取皮刀，将离体皮肤组织块脂肪端削薄以达到目的。去除皮下脂肪后的皮肤组织块低温(-20℃)贮藏冻存备用。
在含有双抗的PBS溶液解冻。青霉素-链霉素(10,000U/ml)混合液又称为双抗，即含有10000单位/ml青霉素和10000μg/ml链霉素的溶液，生产商为赛默飞世尔科技(中国)有限公司，即配制100ml的PBS溶液加入双抗溶液1ml，目的是起到联合抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的作用，防止皮肤组织块受到细菌污染。磷酸盐缓冲溶液(PBS)是一种平衡盐溶液，生产商为北京索莱宝科技有限公司，P1020-500ml 1xPBS缓冲液 (pH7.2-7.4)。
取直径4～6mm的组织块，在液氮和37℃水浴锅中反复冻融5次。将离体皮肤组织块置于24孔板中，加1ml含有双抗的PBS，CO2孵育18±2h。
糖化反应按照以下步骤进行：
1)取新的24孔板，加入0.5mM浓度甲基乙二醛，1ml/孔；
2)按照10J/cm2UVA辐照剂量进行辐照。UVA辐照采用的是UVA紫外线光疗仪，生产商上海SIGMA高技术有限公司，按照辐照剂量10J/cm2 UVA进行辐照，每次72小时；
3)辐照结束后，将孔板转移至45℃烘箱进行糖化反应72h；
4)72h之后，吸取并倒弃糖化反应工作液(糖化反应工作液为甲基乙二醛工作液，即按照1:13000的比例，用含双抗的PBS溶液稀释至0.5mM，甲基乙二醛生产商为Sigma,M0252型号)，加入新配置的糖化反应工作液，即3mM浓度的氨基胍硫酸盐作为阳性对照，3重量％实施例121～133获得的提取物或者后处理物，重复步骤2)至4)；
5)UVA辐照进行3次，第4次后，清洗离体皮肤后转移至新的糖化反应工作液，重复步骤3)和4)，共计持续21天。
6)糖化反应结束后，将离体皮肤组织转移至1.5mL EP管中，用4％多聚甲醛固定，进行包埋，切片，AGEs免疫组化染色。
对于免疫组化(IHC)过程，主要分为：
—采用4％多聚甲醛对离体皮肤组织块进行固化24小时，多聚甲醛生产商为国药集团，AR级分析纯。
—将皮肤组织块进行梯度酒精脱水，75％酒精1h，85％酒精1h，95％酒精1h，95％酒精1h，无水乙醇I1h，无水乙醇II 1h，二甲苯I1h，二甲苯II 1h。以上试剂均为分析纯，使用前未进一步处理。
—采用蜡包埋机对脱水处理后的皮肤组织进行包埋，于-20℃进行冷却，待蜡凝固后取出在切片机上进行切片；包埋机生产商为徕卡HistoCore Arcadia包埋机，切片机为徕卡CM1520型切片机。
—将新鲜的切片置于玻片上，滴加少量PBS缓冲液以防止干化及蛋白交联。PBS缓冲液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，型号eBioscience IHC溶液。
—采用SP试剂盒(福州迈新公司生产，型号E-EL-0067C)说明书进行免疫组化染色检测皮肤组织中的AGE(DAB染色)，在倒置Olympus 显微镜下对每张切片选择3个视野观察计算数据。
AGEs数据＝相对IOD值/Area平均值
使用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用 t-test统计分析。
相对改善率(％)＝(阴性对照—实施例相对平均值)/阴性对照x 100％。
表3：实施例121～133抗糖化功效(检测指标AGEs)结果
样品名称 相对平均值 SD 相对改善率/％
空白对照 1.00 0.10 -
阴性对照 1.70 0.03 -
阳性对照 1.31 0.03 22.94
实施例121 1.36 0.05 20.00
实施例122 1.41 0.05 17.06
实施例123 1.38 0.04 18.82
实施例124 1.31 0.05 22.94
实施例125 1.39 0.04 18.24
实施例126 1.41 0.06 17.06
实施例127 1.40 0.06 17.65
实施例128 1.41 0.01 17.06
实施例129 1.47 0.01 13.53
实施例130 1.40 0.01 17.65
实施例131 1.69 0.03 0.59
实施例132 1.72 0.02 -1.18
实施例133 1.67 0.04 1.76
表4：实施例1～5提取物及不同的后处理产物抑制AGEs的改善率比较
Figure BDA0003445730310000351
Figure BDA0003445730310000361
对比相同浓度下的实施例1～5中药提取物经过不同处理产物对抑制 AGEs的效果差异，其中实施例121～125为戊二醇+丙二醇的后处理产物，实施例126～130为聚乙二醇+辛甘醇的后处理产物，与水提醇沉制备工艺获得的提取物在抑制糖基化反应终端产物AGEs上面的横向对比见表4。从表中可以看出，采用丁二醇+乙基己基甘油的组合对实施例1～5的后处理获得的产物对糖基化反应终端产物AGEs的改善率最高。
采用戊二醇+丙二醇，及聚乙二醇+辛甘醇组合一定程度提高了中药提取物的抗糖化功效，说明不同的多元醇组合也对中草药复合物的活性物在抗糖化功效的发挥具有促进作用。与前述较高含量的PGG有一定的相关性的同时，不同种类多元醇的加入也引起了中草药活性成分被细胞的利用率的差异。
皮肤外用剂优选为化妆品组合物，例如化妆水、精华液、乳霜等。所述复合提取物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.001％-50％(w/w)。优选的重量百分比为1％-20％(w/w)。更优选的重量百分比为2％-10％(w/w)。最优选的重量百分比为3％-8％(w/w)。
以下是中药提取物在皮肤外用剂中的具体应用的实施例，及其这些剂型的配方和制备方法。以下各表中“-”表示无添加。
应用例1：面霜的制备
Figure BDA0003445730310000362
Figure BDA0003445730310000371
应用例2：乳液的制备
Figure BDA0003445730310000372
Figure BDA0003445730310000381
应用例3：啫喱的制备
Figure BDA0003445730310000382
应用例4：化妆水的制备
Figure BDA0003445730310000383
Figure BDA0003445730310000391
应用例5：精华液的制备
Figure BDA0003445730310000392
应用例6：面膜的制备
Figure BDA0003445730310000401
应用例7：眼霜的制备
Figure BDA0003445730310000402
Figure BDA0003445730310000411
应用例8：沐浴露的制备
Figure BDA0003445730310000412
应用例9：洗面奶的制备
Figure BDA0003445730310000421
本发明中的实施例82～121也可以作为低温冷冻干燥产品单独使用。
利用本发明的组合物制得的上述化妆品取得与市售的产品相当或更好的使用效果。
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (12)

1.一种中药提取物，通过以下原料制备得到：茯苓、蒺藜、白蔹、芍药、白术、白芨和白鲜皮，其中茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮的重量比为1:1-4:4-10:8-10:1-4:1-4:1-4。
2.如权利要求1所述的中药提取物，所述提取物具有抗糖化作用。
3.对如权利要求1或2所述的中药提取物，所述提取物通过溶剂提取制备得到。
4.如权利要求3所述的中药提取物，其中，所述溶剂提取采用水提醇沉方法。
5.如权利要求3所述的中药提取物，其中，所述溶剂提取采用醇溶剂进行提取。
6.如权利要求4-5中任一项所述的中药提取物，其中，茯苓：蒺藜：白蔹：芍药：白术：白芨：白鲜皮的重量比为1:1-2:4-8:8-10:1-4:1-4:1-2。
7.一种组合物，所述组合物包含如权利要求4-5所述的中药提取物以及多元醇。
8.如权利要求7所述的组合物，其中，所述多元醇选自：甘油、双甘油、丁二醇、戊二醇、丙二醇、乙基己基甘油、聚乙二醇、山梨糖醇或它们的组合。
9.如权利要求7所述的组合物，其中，所述多元醇是重量比为1-9:1-9的丁二醇和乙基己基甘油的混合物。
10.如权利要求1-6中任一项所述的中药提取物的冻干产品，所述冻干产品是无定形粉末。
11.如权利要求1-6中任一项所述的中药提取物、如权利要求7-9中任一项所述的组合物、或如权利要求10所述的冻干产品在皮肤抗糖化中的应用。
12.一种皮肤外用剂，所述皮肤外用剂包含如权利要求1-6中任一项所述的中药提取物、如权利要求7-9中任一项所述的组合物、或如权利要求10所述的冻干产品。
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