CN114381399A - 一种伯克霍尔德菌及其在黑翅土白蚁生物防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种伯克霍尔德菌及其在黑翅土白蚁生物防治中的应用，该伯克霍尔德菌命名为Burkholderia caballeronis，株号为T9，已于2021年11月11日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 20211398。本发明的伯克霍尔德菌能够显著抑制鸡枞菌的生长，通过饲喂黑翅土白蚁混合该伯克霍尔德菌的食料，使抑制鸡枞菌生长的物质经由白蚁肠道进入菌圃内，最终达到抑制鸡枞菌小白球在菌圃上生长的目的，使黑翅土白蚁的食料来源缺失、巢群无法正常存续。

Description

一种伯克霍尔德菌及其在黑翅土白蚁生物防治中的应用

技术领域

本发明涉及黑翅土白蚁的生物防治技术领域，尤其涉及一种伯克霍尔德菌及其在黑翅土白蚁生物防治中的应用。

背景技术

白蚁繁殖能力强、危害性大，且活动隐蔽不易被发现，被国际昆虫生理生态研究中心(ICTPE)列为世界性五大害虫之一。全世界每年用于防治白蚁至少花费200亿美元，其中我国逾3.5亿美元，且我国每年因白蚁危害造成的经济损失达2-3亿美元。白蚁造成的危害主要集中在房屋建筑物危害、水利堤坝危害、管线设施危害和农林植物危害这四个方面。

鸡枞菌与白蚁有着特殊的共生关系。鸡枞的孢子往往通过气流或依靠白蚁的频繁活动进入蚁巢内。蚁巢的温度，湿度及营养物质，均为孢子的萌发、菌丝的繁殖生长提供了适宜的条件。菌丝大量繁殖之后，便相互扭结成绳索状菌丝体，穿出蚁巢上方的土层，在地上形成子实体一一鸡枞。蚁巢中孕育鸡枞菌丝的部分称做菌圃，是工蚁用消化和半消化的食物与其他复杂成分，再加上鸡枞菌丝建造而成的。菌圃是一种海绵状的特殊结构，其中含有大量的木质素和纤维素。对白蚁来说，菌圃是贮存“粮食”的基地，同时又能保持较高的温度，有利于蚁卵孵化，而对鸡枞来说，又是最理想的培养基。这样，菌圃就促成了白蚁和鸡枞之间生死与共的“共生关系”。

黑翅土白蚁广泛分布在我国南部多个省市区中，其日常活动及筑巢繁殖对各地的堤坝造成了危害的严重，而现下最为普遍的堤坝白蚁防治方法是药物屏障法和挖巢法。而在城市中，婚飞季节大量聚集性出现的黑翅土白蚁也造成了大范围的舆论压力。

公开号为CN107079750A的中国专利文献公开了一种白蚁的防治方法，该防治方法包括农业防治、生物防治、物理防治和化学防治。农业防治是以鸡纵菌为参照物，在防治区寻找白蚁巢穴并挖巢除蚁。生物防治是向防治区引进白蚁的天敌捕食白蚁。物理防治包括：于防治区外围设置诱集杀虫灯驱赶白蚁，于防治区设置白蚁诱集盒、毒饵或油茶饼。化学防治是于防治区喷洒灭蚁农药。

公开号为CN113303338A的中国专利文献公开了一种含百里酚的白蚁防治药物，它含有百里酚和昆虫病原线虫。为了加强白蚁的生物防治，提高昆虫病原线虫在白蚁防治中的应用，利用低毒、可再生及不易产生抗性的植物源活性物质作为干扰抑制剂，联合昆虫病原线虫防控有害白蚁。

现有的白蚁防治方法实施起来成本高、收效较低。故当前，如何开展绿色、安全、高效的黑翅土白蚁防治工作已成为急需研究的课题。

发明内容

本发明提供了一株从蚁巢中分离出的、对鸡枞菌有强抑制性的伯克霍尔德菌(Burkholderia caballeronis)菌株，可用于对黑翅土白蚁进行生物防治。

本发明的技术方案如下：

一种伯克霍尔德菌，命名为Burkholderia caballeronis，株号为T9，已于2021年11月11日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M20211398。

所述的伯克霍尔德菌分离自黑翅土白蚁菌圃。

所述的伯克霍尔德菌能够显著抑制鸡枞菌的生长。由于该伯克霍尔德菌Burkholderia caballeronis分离自黑翅土白蚁菌圃内，白蚁未对接种过该细菌的食料表现出拒食现象，由于黑翅土白蚁菌圃由黑翅土白蚁的粪便组成，故该细菌生成的、能够抑制鸡枞菌生长的物质可顺利到达菌圃内，从而抑制菌圃上鸡枞菌“小白球”的生长。由于黑翅土白蚁的正常生长离不开菌圃上的鸡枞菌“小白球”，在鸡枞菌“小白球”数量减少后，依靠取食“小白球”的幼年工蚁和老年工蚁将缺失食物来源，且菌圃内氮源食物将大大缺失，不利于黑翅土白蚁巢群的正常存续。

基于此，本发明还提供了所述的伯克霍尔德菌在黑翅土白蚁生物防治中的应用。

本发明还提供了一种生防菌剂，所述的生防菌剂的活性成分为所述的伯克霍尔德菌。

本发明还提供了所述的生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：将所述的伯克霍尔德菌接种于培养液中进行培养，培养至球形菌体出现其菌液变黄，获得所述的生防菌剂。培养条件为：26℃黑暗条件下进行培养。

所述的培养液为玉米麸皮培养液，1000ml培养液中包含：玉米粉20g，麸皮10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5克，余量为水。

所述的玉米麸皮培养液的制备方法为：将玉米粉和麸皮混合并用水煮沸，过滤后向滤液中加入1g磷酸二氢钾和0.5g硫酸镁，最后用水定容至1000ml。

本发明还提供了一种黑翅土白蚁的生物防治方法，将所述的生防菌剂添加到黑翅土白蚁的食料中，引诱黑翅土白蚁取食。

所述的食料为木屑。优选的，所述的食料包括桂花木屑、广玉兰木屑、樟树木屑，三者比例为1:1:1。

优选的，每周换一次食料即可。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明经筛选分离到一株伯克霍尔德菌，命名为Burkholderia caballeronis，株号为T9，已于2021年11月11日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 20211398。该菌株能够显著抑制鸡枞菌的生长，通过饲喂黑翅土白蚁混合该伯克霍尔德菌的食料，使抑制鸡枞菌生长的物质经由白蚁肠道进入菌圃内，最终达到抑制鸡枞菌小白球在菌圃上生长的目的，使黑翅土白蚁的食料来源缺失、巢群无法正常存续。

(1)黑翅土白蚁喜食混合细菌菌液的食料，且食料外有白蚁蚁道包裹，白蚁正常取食该食料，无拒食、避食现象；

(2)黑翅土白蚁在取食混合细菌菌液的食料30天后，上层新菌圃上的小白球数量及大小发生显著变化，表现为数量和体积均有所减少；

(3)黑翅土白蚁在取食混合细菌菌液的食料30天后，上层菌圃中的菌圃内依靠取食“小白球”为生的幼年工蚁和老年工蚁活动痕迹减少；

(4)本发明采用的生防菌株取自自然，对环境友好、绿色安全且对人畜无毒害作用。

附图说明

图1为T9菌株的菌落形态图；

图2为T9菌株发酵菌液对蚁巢伞生长的影响；

图3为对黑翅土白蚁饲喂混合T9菌株发酵菌液的自然枯枝对菌圃的影响；A：饲喂前菌圃；B：饲喂后菌圃；C：对照组；

图4为对黑翅土白蚁饲喂混合T9菌株发酵菌液的自然枯枝对菌圃直径的影响；注：**表示与对照相比极显著(P<0.01)。

具体实施方式

实施例1菌种纯化分离

分离培养基制备：本试验采用寡营养培养基如1/5LB固体培养基和1/10LB固体培养基作为菌圃细菌分离培养基。1/5LB固体培养基配方：胰蛋白胨2g、酵母提取物1g、氯化钠(NaCl)2g、琼脂粉14g、用蒸馏水定容至1L，调整pH＝5；1/10LB培养基配方：除琼脂粉外其余物质依照1/5LB固体培养基配方减半，调整pH＝5。

制备菌圃悬液：镊子高温灭菌后夹取实验室饲养的黑翅土白蚁菌圃的上、中、下层各0.05g后得到混合菌圃块。取0.01g混合菌圃置于灭菌后的2mL离心管中，加入1mL无菌水，涡旋三次，每次涡旋30s。将涡旋完成后的菌圃悬液静置5min后，吸取上清液，进行系列梯度稀释，得到浓度梯度为10^-1、10^-2、10^-3的菌圃悬液。

分离菌圃细菌：各取300μL浓度为10^-1、10^-2、10^-3的菌圃悬液，分别置于加入抗生素后的1/5LB固体培养基与1/10LB固体培养基中，用灭菌后的玻璃棒均匀涂布，每浓度梯度设3组重复。置于28℃培养箱中，黑暗条件培养2-3d，待细菌菌落出现，且菌落直径达到1-3mm时，划线分离纯化2次后于4℃冷藏保存。

T9菌株在LB固体培养基上生长形态如1所示，呈乳白色圆形固体，有轻微土腥味。

实施例2菌种分子鉴定

分子鉴定：使用DNA提取试剂盒(天根生物)提取目的细菌菌株DNA，选取通用引物27F和1492R扩增分离细菌16s rRNA基因片段，PCR仪扩增条件如下：为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30次循环；72℃5min。所得PCR产物经凝胶电泳检测出现目的条带后，送浙江尚亚生物技术有限公司测序，测序结果通过BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线比对，对分离菌株进行鉴定，并对分离出微生物于NCBI进行在线登记。

最终得到T9菌株与登记号为KF366439菌株Burkholderia caballeronis的序列相似度为100％，确定为Burkholderia caballeronis，T9菌株登记号为MW786731。该T9菌株已于2021年11月11日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 20211398。

实施例3

将菌株在LB固体培养基上划线分离，选长势好的斜面进行移管纯化，纯化后的菌种留作母种。

LB固体培养基的配制：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，琼脂10g，用水定容至1000ml，高压灭菌后倒入玻璃管中用于菌种培养与纯化。

玉米麸皮液体培养基的配制：玉米粉20g，麸皮10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5克，蒸馏水1000ml。先将玉米粉和麸皮混合并用水煮沸5min，4层纱布过滤后，滤液中加入1g磷酸二氢钾和0.5g硫酸镁，最后用水定容至1000ml，高压灭菌后倒入锥形瓶中用于菌种培养与纯化。

伯克霍尔德菌Burkholderia caballeronis T9菌株菌液的获得：用酒精灯烧红后冷却的接种针轻点LB固体培养基上的细菌菌落，加入到玉米麸皮液体培养基中，于26℃黑暗条件下摇床中，以150r/min摇培5天后得到T9菌株菌液母液。

T9菌株发酵菌液的获得：取菌液母液，以1:100加入到玉米麸皮液体培养基中，于26℃黑暗条件下摇床中，以150r/min摇培5天后获得发酵菌液，此时菌液中有颗粒状菌体，且菌液呈金黄至土黄色。

于培养皿(D＝55mm)中加入5mL高温高压灭菌后细菌发酵菌液，再加入5mL预热至100℃的玉米麸皮双倍琼脂固体培养基(玉米粉20g、麸皮10g、K₂HPO₄ 1g、MgSO₄·7H₂O0.5g、琼脂粉28g，蒸馏水定容至1L，pH＝5)，小心快速摇晃至培养基均匀凝固。取鸡枞菌饼(D＝5mm)接入玉米麸皮细菌菌液固体培养基中，28℃避光培养20d，设3组重复。其中，对照替换为经高温高压灭菌的玉米麸皮纤维素液体培养基。

如图2所示，在玉米麸皮固体培养基中加入Burkholderia caballeronis T9菌株细菌发酵液后，鸡枞菌几乎无法生长，菌丝层几乎消失。

实施例4

生防食料制作：采集三种以上的树木枝条，用粉碎机打碎成木屑，加入T9菌株发酵菌液，将食料浸润。食料与菌液的质量比约为4:1，用力挤食料时无菌液滴落视为合适。

生防食料投放：将上述食料制备完成后，放置在蚁巢边或蚁路周边，引诱白蚁取食，每周换一次食料即可。

饲喂混有T9菌株细菌发酵液的枯枝30天后，实验组中上层菌圃中的小白球数量、体积均明显减小，推测发酵菌液中的次生物质抑制了蚁巢伞菌丝生长，引起小白球数量减少、体积变小。同时，实验组的下层菌圃逐渐消失，菌圃整体体积逐渐减小，推测是由于小白球减少后，引起白蚁食物短缺，故其转向取食菌圃导致菌圃体积不断缩小。同时可以看到，对照组的“小白球”体积虽有所减少，但数量仍较多，且菌圃中下层保存完好，菌圃并未出现显著缩小。

如图3和图4所示，饲喂混有T9菌株细菌发酵液的自然枯枝30天后，实验组中的黑翅土白蚁菌圃直径均有所减小，平均减小值达到了0.77±0.38cm；饲喂混有蒸馏水的自然枯枝30天后，对照组中的菌圃直径有所增大，平均增大值达到了0.28±0.10cm，且两者呈显著性差异(P<0.01)(，说明T9发酵菌液加入枯枝后再饲喂白蚁能在一定程度缩减菌圃直径，从而抑制巢群扩张。

按照以上方法对黑翅土白蚁进行防治，不仅可以在一定程度上抑制其繁殖，而且绿色无污染、对环境友好。

以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种伯克霍尔德菌及其在黑翅土白蚁生物防治中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1402

<212> DNA

<213> 伯克霍尔德菌(Burkholderia caballeronis)

<400> 1

gtggtgacgt cctccttgcg gttagactag ccacttctgg caaaacccac tcccatggtg 60

tgacgggcgg tgtgtacaag acccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt 120

actagcgatt ccagcttcac gcagtcgagt tgcagactgc gatccggact acgatcggtt 180

ttctgggatt ggctccccct cgcgggttgg cgaccctctg ttccgaccat tgtatgacgt 240

gtgaagccct acccataagg gccatgagga cttgacgtca tccccacctt cctccggttt 300

gtcaccggca gtctccctgg agtgctcttg cgtagcaact agggacaagg gttgcgctcg 360

ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acagccatgc agcacctgtg 420

tgatggctcc ctttcgggca cgcccaactc tcatcgggct tccatccatg tcaagggtag 480

gtaaggtttt tcgcgttgca tcgaattaat ccacatcatc caccgcttgt gcgggtcccc 540

gtcaattcct ttgagtttta atcttgcgac cgtactcccc aggcggtcaa cttcacgcgt 600

tagcttcgtt actaaggaaa tgaatcccca acaaccagtt gacatcgttt agggcgtgga 660

ctaccagggt atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg tgcatgagcg tcagtattgg 720

cccagggggc tgccttcgcc atcggtgttc ctccacatct ctacgcattt cactgctaca 780

cgtggaattc cacccccctc tgccatactc gagcaatgca gtcaccaatg cagttcccag 840

gttgagcccg gggatttcac atcggtctta catcaccgcc tgcgcacgct ttacgcccag 900

taattccgat taacgctcgc accctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg 960

gtgcttattc ttccggtacc gtcatccccc tccggtatta tcggagggga tttctttccg 1020

gacaaaagtg ctttacaacc cgaaggcctt cttcacacac gcggcattgc tggatcaggc 1080

ttgcgcccat tgtccaaaat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc 1140

agtcccagtg tggctggtcg tcctctcaga ccagctacgg atcgtcgcct tggtaggcct 1200

ttaccccacc aactagctaa tccgccatcg gccaccccaa tagcgcgagg cctttcggtc 1260

ccccgctttc atccatggat cgtatgcggt attaatccgg ctttcgccgg gctatccccc 1320

actactggac atgttccgat gtattactca cccgttcgcc actcgccgcc agggttgccc 1380

ccgcgctgcc gtccgacttg ca 1402

Claims (10)

1.一种伯克霍尔德菌，其特征在于，命名为Burkholderia caballeronis，株号为T9，已于2021年11月11日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 20211398。

2.如权利要求1所述的伯克霍尔德菌在黑翅土白蚁生物防治中的应用。

3.一种生防菌剂，其特征在于，所述的生防菌剂的活性成分为如权利要求1所述的伯克霍尔德菌。

4.如权利要求3所述的生防菌剂，其特征在于，所述的生防菌剂的制备方法包括以下步骤：将所述的伯克霍尔德菌接种于培养液中进行培养，培养至球形菌体出现其菌液变黄，获得所述的生防菌剂。

5.如权利要求4所述的生防菌剂，其特征在于，培养条件为：26℃黑暗条件下进行培养。

6.如权利要求4所述的生防菌剂，其特征在于，所述的培养液为玉米麸皮培养液，1000ml培养液中包含：玉米粉20g，麸皮10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5克，余量为水。

7.如权利要求5所述的生防菌剂，其特征在于，所述的玉米麸皮培养液的制备方法为：将玉米粉和麸皮混合并用水煮沸，过滤后向滤液中加入1g磷酸二氢钾和0.5g硫酸镁，最后用水定容至1000ml。

8.一种黑翅土白蚁的生物防治方法，其特征在于，将如权利要求3所述的生防菌剂添加到黑翅土白蚁的食料中，引诱黑翅土白蚁取食。

9.如权利要求8所述的黑翅土白蚁的生物防治方法，其特征在于，所述的食料为木屑。

10.如权利要求8所述的黑翅土白蚁的生物防治方法，其特征在于，所述的食料包括桂花木屑、广玉兰木屑、樟树木屑，三者比例为1:1:1。

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