CN114377021B - 一种光响应一氧化氮递送/光热协同材料的制备及其应用 - Google Patents
一种光响应一氧化氮递送/光热协同材料的制备及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种光响应一氧化氮递送/光热协同材料的制备及其应用，首先涉及一种多功能性的一氧化氮给体分子，具有下式I所示的结构：本发明提供的一氧化氮给体分子与两亲性聚合物共同溶解于有机溶剂中，通过纳米闪沉的方式共组装得到稳定的纳米粒子，即为聚合物组装体，能够在白光照射下可控释放一氧化氮，提高了一氧化氮的稳定性，同时在808nm激光下具有高效的光热效果，实现协同治疗。
Description
技术领域
本发明属于一氧化氮供体化合物技术领域，尤其涉及一种光响应一氧化氮递送/光热协同材料的制备及其应用。
背景技术
抗生素的滥用导致许多病原体产生了耐药性。近几十年来，多重耐药细菌已成为较为常见的难治性感染的病因。多重耐药菌的耐药性一方面是浮游细菌的结构转化或基因突变造成的；另一方面包括生物膜的保护，细菌细胞包裹在由胞外多糖、蛋白质、酶和细胞外细菌DNA组成的自制胞外聚合物物质(EPS)中。EPS作为一种保护屏障，可以抵御抗生素的渗透和宿主固有免疫细胞的细胞攻击。
为了解决耐药细菌感染，目前已经提出很多策略，不仅包括使用抗生素，抗菌肽和季铵盐化合物等化学方法，还包括如光动力疗法(PDT)、光热疗法(PTT)等。光热疗法通过物理热破坏生物膜的结构，杀灭细菌，与化学方法相比，光热疗法在治疗生物膜引起的感染方面具有巨大的优势。700～1100nm的近红外光具有良好的组织穿透能力，对健康组织的损伤最小，是光热治疗最有利的波长区域。基于近红外光照射的细菌感染光热治疗已得到广泛应用。然而，在光热治疗过程中，高激光功率导致的高局部温度会破坏周围的正常细胞/组织。
一氧化氮(NO)是生物体内一种重要的内源性气体分子，具有诸多生理作用，包括伤口修复、血管舒张、血小板聚集和黏附、免疫反应和癌变等方面。除此之外，低浓度的一氧化氮可有效抑制生物膜的生长，对于成熟的生物膜可以起到分散作用；高浓度的一氧化氮在分散生物膜的同时可直接破坏细菌的DNA，从而杀死细菌。因此，NO/PTT协同治疗可以实现高效杀灭耐药菌，同时降低局部温度过热的风险。
目前，外源性的一氧化氮供体化合物主要包括有机硝酸盐、有机亚硝酸盐、硫代亚硝基硫醇、二氮烯二醇衍生物(NONOates)以及金属-亚硝基络合物等。研究较多的是二氮烯二醇衍生物，但其合成过程要求比较严格，需要高压条件，同时二氮烯二醇衍生物一般具有短的半衰期，且在生理条件下不稳定。硫代亚硝基硫醇也有类似的特点，除此之外，硫代亚硝基硫醇对光照、金属离子及还原剂等都有响应。为了提高一氧化氮的可控释放，研究者制备了几种过渡金属-亚硝基配合物，它们含有低能量的金属-亚硝基键作为可见光吸收色团，用于可见光可控释放一氧化氮。然而，由于过渡金属的存在，含金属的一氧化氮释放物往往表现出较强的细胞毒性。因此，安全、可控释放一氧化氮显得尤为重要。
其中，通过光触发释放一氧化氮可以达到可控释放的目的，光响应释放一氧化氮的化合物主要包括硝基苯的衍生物和N-亚硝胺的衍生物，然而，硝基苯的衍生物的触发需要较大强度的光照，而高强度的辐照会对生物体造成较大的伤害。相比之下，N-亚硝胺的衍生物在低辐照强度下就可以触发N-N键断裂而释放一氧化氮。
发明内容
本发明的目的在于提供一种光响应一氧化氮递送/光热协同材料的制备及其应用。本发明提供的一氧化氮给体分子可通过与两亲性聚合物共组装得到稳定的纳米粒子，在白光照射下可控释放一氧化氮，同时在808nm激光下具有高效的光热效果，从而实现协同治疗。
本发明首先提供一种多功能性的一氧化氮给体分子，具有下式I所示的结构：
式I中，R具有下式II所示结构；R1具有下式III所示结构，R2为氢或甲氧基；R3具有下式IV所示结构，R4为氢或硝基。
在本发明的一些实施例中，式I中的R具有式II所示结构。式II中的曲折短线代表连接键合位置。式II中，苯环上不饱和碳原子与N和N杂五元环连接，两者的连接位置不做特殊限制。式I中的R1具有式III所示结构。式III中的曲折短线也代表连接键合位置。式III中，R2为氢或甲氧基，曲折短线的另一端连接aza-Bodipy结构。式I中的R3具有式IV所示结构，曲折短线的另一端连接aza-Bodipy结构，R4为氢或硝基，连接位置不做特殊限制。
具体地，R可以选自以下式1～3所示基团中的任意一种：
R3可以选自以下式4～6所示基团中的任意一种：
本发明提供的式I所示的一氧化氮给体分子也称为一氧化氮供体分子。所述一氧化氮给体分子结构中，主要含有N-亚硝胺基团和相连的BF2-氮杂氟硼二吡咯主体结构(aza-Bodipy)，经修饰后可在可见光照下触发可控释放一氧化氮。
本发明还提供了所述一氧化氮给体分子的制备方法，首先对aza-Bodipy的结构进行修饰，通过在无水乙醇和无水THF混合溶剂(1：1，v/v)中aza-Bodipy(1eq)与苯甲醛衍生物(式7)中的醛基(10eq)反应，生成席夫碱；接着在冰浴条件下采用氰基硼氢化钠(5eq)作为还原剂在无水THF中进行席夫碱还原反应，最后在冰浴条件下于THF/醋酸溶液(1：1，v/v)中加入亚硝酸钠(6eq)进行亚硝化反应，得到可在白光照射下释放一氧化氮的基础化合物，即为式I所示的一氧化氮给体分子。上述合成过程简单，操作方便。
式7中R5基团为氢或硝基，连接位置不做特殊限制。
本发明光响应一氧化氮递送/光热协同材料的制备方法，是以所述一氧化氮给体分子与两亲性聚合物共同溶解于有机溶剂中，通过纳米闪沉的方式共组装得到稳定的纳米粒子，即为聚合物组装体。
所述两亲性聚合物包括PEG113-b-PCL60、PEG113-b-PLA67等。
所述聚合物组装体的直径为10nm～100nm。该组装体通过调控一氧化氮给体负载比例可分别得到具有高效释放一氧化氮(负载比例为0.2mg一氧化氮供体和10mg聚合物)、具有优异光热性质(负载比例为1mg一氧化氮供体和10mg聚合物)或一氧化氮递送/光热协同材料(负载比例为0.5mg一氧化氮供体和10mg聚合物)。
在一个优选实施方式中，所述聚合物纳米粒子水分散液按照如下步骤形成：将所述两亲性聚合物和一氧化氮给体溶解在作为共溶剂的有机溶剂中，在常温、搅拌条件下加入到净化水(例如超纯水)中，然后在常温下用透析的方式除去有机溶剂；具体是将所得的聚合物纳米粒子放置在透析袋(MWCO：11000Da)中，以透析除去所述有机溶剂，从而获得所述聚合物纳米粒子水分散液(其中包括几十到一百多纳米尺寸的纳米粒子)。本发明实施例采用共溶剂，以闪沉的方式组装，可以使用多种有机溶剂(包括但不限于二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环、四氢呋喃)作为共溶剂，均可以得到不同粒径的稳定的纳米级别聚合物组装体。
本发明光响应一氧化氮递送/光热协同材料的应用，是用于制备NO/PTT协同治疗高分子药物。
进一步地，所述光响应一氧化氮递送/光热协同材料用于制备抗菌药物。
更进一步，所述抗菌药物的适用菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
本发明所述一氧化氮给体分子具有多功能性，除通过白光触发可控释放一氧化氮外，将其负载于两亲性聚合物中后，一氧化氮给体分子表现出优异的J-聚集性质，紫外吸收谱图显示J-聚集后的一氧化氮给体吸收峰值从711nm红移至820nm，在808nm激光照射下材料表现出优异的光热效应，同时一氧化氮释放效率得到显著提高。
此外，组装体经白光光照释放一氧化氮后，组装体自身的最大荧光发射波长红移，可以间接反映一氧化氮的释放情况，无需再加入其它探针证明一氧化氮的释放；伴随着一氧化氮供体的荧光变化同步跟踪一氧化氮的释放，起到示踪作用，实时监测一氧化氮的释放。
本发明提供的一氧化氮给体分子可通过组装得到稳定的纳米粒子，能够在白光照射下可控释放一氧化氮，提高了一氧化氮的稳定性，同时在808nm激光下具有高效的光热效果，实现协同治疗。
附图说明
图1示出了本发明实施例1中的一氧化氮供体的核磁共振氢谱、碳谱、氟谱、硼谱。其中：a)一氧化氮供体核磁共振氢谱，b)一氧化氮供体核磁共振碳谱，c)一氧化氮供体核磁共振硼谱，d)一氧化氮供体核磁共振氟谱。
图2示出了本发明实施例1中的分子一氧化氮供体的ESI-MS谱图。
图3示出了本发明实施例1中的分子一氧化氮供体的高效液相色谱图。
图4示出了本发明实施例1中的两亲性嵌段聚合物PEG113-b-PCL60的核磁共振氢谱。
图5示出了本发明实施例1中的两亲性嵌段聚合物PEG113-b-PCL60的凝胶渗透色谱图。
图6示出了本发明实施例1中的两亲性嵌段聚合物PEG113-b-PCL60的临界胶束浓度。
图7示出了本发明实施例1中的NP-1、NP-2、NP-3的动态光散射曲线及透射电子显微镜照片。其中：a)NP-1光照前后动态光散射曲线；b)NP-2光照前后动态光散射曲线；c)NP-3光照前后动态光散射曲线；d)NP-1光照前后透射电子显微镜照片；e)NP-2光照前后透射电子显微镜照片；f)NP-3光照前后透射电子显微镜照片。
图8示出了本发明实施例1中的NP-1、NP-2、NP-3的紫外-可见光吸收光谱图，其中NP-3ˊ为NP-3稀释一倍后光谱。
图9示出了本发明实施例1中的NP-1、NP-2在白光光照下紫外-可见光吸收光谱中最大吸收波长随时间变化图。其中：a)NP-1紫外-可见光吸收光谱随白光照射变化；b)NP-2紫外-可见光吸收光谱随白光照射变化。
图10示出了本发明实施例1中的NP-2、NP-3在808nm激光照射下光热效果。其中：a)不同功率808nm激光器下NP-2光热效果；b)不同功率808nm激光器下NP-3光热效果。
图11示出了本发明实施例4中的NP-1、NP-2在白光光照前后荧光光谱变化。其中：a)NP-1、NP-2荧光光谱；白光照射后b)NP-1、NP-2荧光光谱。
图12示出了本发明实施例4中的NP-1、NP-2、NP-3对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及耐甲氧基林金黄色葡萄球菌的抗菌效果。
图13示出了本发明使用的白光LED灯的波长分布。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本发明提供的多功能性的一氧化氮给体分子、聚合物及其制备方法和应用进行具体地描述。
实施例1：
第一步，制备一氧化氮释放基元，通过醛基与氨基反应生成席夫碱，接着进行席夫碱还原，最后通过亚硝化反应得到一氧化氮释放基元。该合成过程简单，操作容易。为了更清楚的帮助理解，以下主要选择式I其中一个结构化合物举例说明，具体反应式如下所示：
一氧化氮给体制备方法：
A(250mg，0.381mmol，1eq)与邻硝基苯甲醛(1.174g，7.722mmol，20eq)加入无水乙醇和无水THF混合溶剂(1：1，30mL)，90℃回流反应。反应24h后旋蒸除去溶剂，加入乙醇超声洗涤，抽滤，乙醇洗涤烘干，得到220mg深蓝色粉末B(71.8％)。
B(220mg，0.241mmol，1eq)溶解于THF(30mL)后后加入甲醇(10mL)，冰浴下加入氰基硼氢化钠(75mg，1.204mmol，5eq)，冰浴搅拌30min；柱层析，沉淀至正己烷，抽滤，烘干，得到150mg紫色粉末C(67.9％)。
将C(85mg，0.093mmol，1eq)溶于10mLTHF和2mL乙酸，冰浴条件下滴加2mL亚硝酸钠(39mg,0.556mmol,6eq)水溶液。2h后旋干溶剂，DCM溶解，饱和食盐水水洗3次，无水硫酸钠干燥，柱层析，沉淀至正己烷，抽滤，烘干，得到深蓝色固体44mg(48.9％)。
聚合物纳米粒子制备方法：
通过上述得到的一氧化氮供体分子和PEG113-b-PCL60组装得到纳米粒子。采用共溶剂，纳米闪沉的方式组装，所用共溶剂可进行选择，不仅限于1,4-二氧六环、二甲基亚砜以及N,N-二甲基甲酰胺等；最终得到的纳米粒子粒径为10nm-100nm。具体如下：
将0.2mg一氧化氮供体分子和10mg PEG113-b-PCL60溶解于1mL四氢呋喃中，室温高速搅拌条件下闪沉于6mL纯净水中，将闪沉结束后的组装体放置于透析袋中(MWCO：11000Da)，室温透析于水中，透析12小时后除尽有机溶剂。得到纳米组装体(NP-1)，TEM结果证实为直径大小约20nm的纳米粒子，图7(d)示出了所得纳米粒子的TEM表征结果，图8示出了NP-1的紫外吸收谱图。
将0.5mg一氧化氮供体分子和10mg PEG113-b-PCL60溶解于1mL四氢呋喃中，室温高速搅拌条件下闪沉于6mL纯净水中，将闪沉结束后的组装体放置于透析袋中(MWCO：11000Da)，室温透析于水中，透析12小时后除尽有机溶剂。得到纳米组装体(NP-2)，TEM结果证实为直径大小约20nm的纳米粒子，图7(e)示出了所得纳米粒子的TEM表征结果，图8示出了NP-2的紫外吸收谱图。
将1.0mg一氧化氮供体分子和10mg PEG113-b-PCL60溶解于1mL四氢呋喃中，室温高速搅拌条件下闪沉于6mL纯净水中，将闪沉结束后的组装体放置于透析袋中(MWCO：11000Da)，室温透析于水中，透析12小时后除尽有机溶剂。得到纳米组装体(NP-3)，TEM结果证实为直径大小约20nm的纳米粒子，图7(f)示出了所得纳米粒子的TEM表征结果，图8示出了NP-3的紫外吸收谱图。
实施例2：白光触发释放一氧化氮及808nm激光光照产生光热效果
通过紫外-可见光吸收光谱确定NP-1、NP-2一氧化氮的释放：使用白光LED灯光(62.6mW/cm2)照上述得到的纳米粒子组装体NP-1或NP-2，跟踪其紫外-可见光吸收光谱变化。测试结果表明：随着光照时间的延长，聚合物纳米粒子在711nm处吸收峰快速下降，对应在780nm处的新吸收峰快速增强，最终趋于平衡，说明该聚合物纳米粒子具有光响应性，且加入Giress试剂后溶液颜色变紫，说明释放一氧化氮，在光照的同时聚合物纳米粒子的表观颜色由最初蓝色变为紫色。图9示出了所得纳米粒子光照条件下紫外-可见光吸收光谱变化及两种纳米粒子光照条件下在711nm处吸收峰与780nm处吸收峰随时间变化曲线。
使用808nm激光器光照上述得到的NP-2、NP-3，跟踪其温度变化测试结果表明：随着光照时间的延长，NP-2和NP-3均表现出优异的光热性能，测试结果显示于图10。
实施例3：NP-1、NP-2白光光照前后荧光的变化
使用白光LED(62.6mW/cm2)灯光照上述得到的纳米粒子组装体，在光照12min后进行荧光发射光谱测试。测试结果表明：随着光照时间的延长，荧光发射光谱中825nm处的荧光增强，760nm处的荧光变弱(激发波长为633nm)，因此可以间接反映一氧化氮的释放，测试结果显示于图11。
实施例4：NP-1、NP-2、NP-3用于杀灭细菌
具体实验如下：
在96孔板中将100微升浓度为5*105CFU/mL的细菌菌液与50微升不同浓度NP-1混合后在黑暗条件下37摄氏度培养20min，白光(62.6mW/cm2)照射12min,稀释100倍后取20微升菌液涂于培养板上，在细菌培养箱37摄氏度培养10h后计数。
在96孔板中将100微升浓度为5*105CFU/mL的细菌菌液与50微升不同浓度NP-2混合后在黑暗条件下37摄氏度培养20min，白光(62.6mW/cm2)照射12min后808nm激光(1.04W/cm2)光照5min，稀释100倍后取20微升菌液涂于培养板上，在细菌培养箱37摄氏度培养10h后计数。
在96孔板中将100微升浓度为5*105CFU/mL的细菌菌液与50微升不同浓度NP-3混合后在黑暗条件下37摄氏度培养20min，808nm激光(1.04W/cm2)光照5min，稀释100倍后取20微升菌液涂于培养板上，在细菌培养箱37摄氏度培养10h后计数。
实验结果如图12所示，相比没有加入组装体和加组装体但没有进行光照的对照组来说，加入组装体并进行光照的实验组对细菌均有较好杀灭作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于使本技术领域的专业技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，是能够实现对这些实施例的多种修改的，而这些修改也应视为本发明应该保护的范围。
Claims (3)
1.一种光响应一氧化氮递送/光热协同材料的应用，其特征在于：
所述光响应一氧化氮递送/光热协同材料用于制备NO/PTT协同治疗抗菌药物；
所述光响应一氧化氮递送/光热协同材料是将一氧化氮给体分子与两亲性聚合物共同溶解于有机溶剂中，通过纳米闪沉的方式共组装得到稳定的纳米粒子，即为聚合物组装体；
所述两亲性聚合物包括PEG113-b-PCL60、PEG113-b-PLA67；
所述一氧化氮给体分子具有下式I所示结构：
其中：
R选自下式1～3所示基团中的任意一种：
R1具有下式III所示结构，R2为氢或甲氧基；
R3选自下式4～6所示基团中的任意一种：
R4为氢或硝基。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述聚合物组装体的直径为10nm～100nm。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述抗菌药物的适用菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
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